MESACUP Desmoglein TEST Dsg1
|
|
- Μωσῆς Διδασκάλου
- 9 χρόνια πριν
- Προβολές:
Transcript
1 MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 Cat. No. 7680E: 48 wells Cat. No. 7680E: 48 puits Art.-Nr. 7680E: 48 Auftragsstellen Cat No 7680E: 48 wells Cat. No. 7680E: 48 pocillos Cat. n. 7680E: 48 pozzetti Cat. Nº 7680E: 48 poços Aρ. Κατ. 7680E: 48 βυθισμάτων MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. KDX Nagoya Sakae Bldg. 10F Sakae, Naka-Ku, Nagoya, Aichi, Japan Tel: Fax : URL
2 - CONTENTS - - CONTENU - - INHALTSVERZEICHNIS - INHOUD - - CONTENIDO - - CONTENUTI - - CONTENDO - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - English 1 Français 8 Deutsch 15 Nederlands 22 Espaňol 29 Italiano 36 Português Ελληνικά 44 Symbols/Symboles/Symbole/ symbolen /Símbolos /Simboli/ Simbolos/Σύμβολα/ 52
3 English English INTENDED USE The MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 is a semi-quantitative enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of anti-desmoglein1 antibodies in human serum. The MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 is intended for in vitro diagnostic use as an aid in the differential diagnosis of certain pemphigus diseases. SUMMARY AND EXPLANATION Desmoglein 1 (Dsg1) is a desmosomal cadherin expressed in stratified squamous epithelia and the target antigen in pemphigus foliaceus (PF) [1,2]. PF is an autoimmune blistering disease of skin and characterized clinically by small flaccid blisters and scaly, crusted erosions, and histologically by intraepidermal blister formation due to loss of cell adhesion of keratinocytes. Anti-Dsg1 IgG autoantibodies are detected in sera from patients with PF and play a pathogenic role in blister formation in PF. Anti-Dsg1 IgG is also detected in about 60% of patients with pemphigus vulgaris (PV) ; another type of pemphigus. Amagai et al. have produced a recombinant human Dsg1 (rdsg1) using a baculovirus expression system [3]. rdsg1 is designed as a secreted protein consisting of the entire extracellular domain of Dsg1. rdsg1 is capable of immunoadsorbing pathogenic autoantibodies in PF patients' sera, preventing blister formation in a neonatal mouse model of pemphigus. These findings indicate that rdsg1 expresses most, if not all, conformational epitopes of the native antigens critical in the pathogenesis of pemphigus. Currently, diagnosis of pemphigus largely relies on immunofluorescence testing (IF) utilizing sectioned normal human skin or monkey esophagus. However, there are several disadvantages in the current immunofluorescence. (a) IF requires an experienced technician and a subjective determination of antibody titer. (b) Antibody against any cell surface protein makes false positive. (c) Similar staining pattern in IF makes it difficult to distinguish between PV and PF. To overcome the problems of IF, ELISA has been developed using rdsg1 as a sensitive and specific assay for the diagnosis of pemphigus [4]. The MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 is for measuring anti-desmoglein1 IgG autoantibodies with high sensitivity. PRINCIPLE The MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 measures anti-dsg1 antibodies present in the serum by ELISA. Calibrators and patient sera are added to microwell coated with Dsg1, allowing anti-dsg1 antibodies to react with the immobilized antigen (Sample incubation). After washing to remove any unbound serum proteins, horseradish peroxidase conjugated anti-human IgG monoclonal antibody is added and incubated (Conjugate incubation). Following another washing step, the peroxidase substrate is added and incubated for an additional period of time (Substrate incubation). Acid solution is then added to each well to terminate the enzyme reaction and to stabilize the color development. The assay can be quantified by measuring the reaction photometrically. BRIEF ASSAY PROCEDURE <Sample incubation> (20-25 C) 60 min. <Conjugate incubation> (20-25 C) 60 min. Add 100 µl of diluted sample (1:101) to each well of microwell plate. Wash Add 100 µl of conjugate solution to each well. 1
4 English <Substrate incubation> (20-25 C) 30 min. Wash Add 100 µl of substrate to each well. Add 100 µl of stop solution to each well. Read absorbance Interpretation of result REAGENTS AND STORAGE 1) Dsg-1 MICROWELL STRIPS MICROWELL STRIPS (6 x 8 wells) coated with recombinant purified Dsg-1 antigen, the breakaway strips packed in a strip holder and sealed in a foil envelope with desiccant, are stable at 2-8 C until labeled expiration date. 2) Calibrator 1 (0 U/ml) One vial containing 1.5 ml of normal human serum with Assay Diluent including 0.09% sodium azide. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 3) Dsg-1 Calibrator 2 (100 U/ml) One vial containing 1.5 ml of anti Dsg-1 antibody positive human serum with Assay Diluent including 0.09% sodium azide. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 4) Conjugate Reagent (101x) One vial containing 0.3 ml of horseradish peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-human IgG at a 101x concentration. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 5) Conjugate Diluent One vial containing 24 ml of HEPES and bovine serum albumin. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 6) Assay Diluent One vial containing 50 ml of Tris buffer, bovine serum and 0.09% sodium azide. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 7) Wash Concentrate (10x) One vial containing 100 ml of PBS and Tween 20 as a 10x concentrate. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 8) Substrate One vial containing 20 ml of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride /hydrogen peroxide (TMB/ H 2 O 2 ). Stable at 2-8 C until labeled expiration date. 2
5 English 9) Stop Solution One vial containing 20 ml of 1.0N sulfuric acid. Stable at 2-8 C until labeled expiration date. PRECAUTIONS (1) This product is for in vitro diagnostic use only. (2) Do not use kit components beyond the stated expiration dates. (3) Avoid contact of reagents with eyes, skin and clothing. Reagents on skin must be washed away with plenty of water. TMB contains irritant and Stop Solution consists of a 1N sulfuric acid, which is a poison and corrosive. (4) Calibrators are derived from human serum, in which HBs antigen, HCV antibody HIV-1 and HIV-2 antibodies have not been detected. No test method, however, can guarantee the absence of these or any other infectious agents. These reagents and all patient samples should be handled as if they are capable of transmitting AIDS, hepatitis or any other infectious diseases. (5) Calibrator 1, Calibrator 2 and Assay Diluent contain sodium azide (0.09%) as a preservative and must be handled with caution - do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. Sodium azide may react with copper or lead in plumbing system to form explosive metal azides. Therefore, always flush with plenty of water when disposing materials containing sodium azide into a drain. (6) Some kit components contain animal origin materials, which are from non-infectious animals. These components, however, should be treated as potential biohazards in use and for disposal. (7) Matching lot numbers of Microwell strips, Conjugate and Calibrator 2 must be used together in the assay. Do not substitute reagents from other kits. (8) All reagents must be brought to room temperature (20-25 C) before starting the assay. (9) Do not expose the kit to direct sun during assay and storage. (10) Avoid microbial and cross contamination of reagents or samples. (11) Incubation temperatures above or below normal room temperature (20-25 C), shorter or longer time periods of incubation and inaccurate dilution may give erroneous results. (12) The wells must be rinsed with Wash Solution properly enough to avoid false positive. (13) Carefully pipette not to foam each sample and reagent to avoid cross contamination between microwells. (14) All microwell strips, which are not immediately required, should be returned to the zip lock pouch, which must be carefully resealed to avoid moisture absorption. (15) Wash concentrate may become turbid at 2-8 C, which does not cause inconsistent results. (16) Implement used for the test should be disposed or treated as shown below. Soak in 2% final conc. glutaraldehyde solution for more than 1 hour or soak in 0.5% Sodium hypochlorite solution (available chlorine: approx. 5,000 ppm) for more than 1 hour or autoclave at 121 C for more than 20 minutes. (17) The Dsg-1 antibodies value obtained from this assay are an aid to diagnosis only. Each physician must interpret these results in light of the patient s history, physical findings, and other diagnostic procedure. 3
6 English MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Microplate reader(wavelength: 450 nm, 620 nm/reference) Multichannel micropipette (e.g. 100 µl 300 µl) Single channel pipette (e.g. 10 µl & 100 µl) Reagent reservoir Autowasher or wash bottle Deionized or distilled water One liter graduated cylinder for preparation of wash solution Test tubes for patient sample dilutions (e.g. 1,000 µl) Disposable pipette tips Paper towels Basin and disinfectant Microplate cover PROCEDURE PREPARATION OF REAGENTS Bring all assay materials to room temperature (20-25 C) prior to use. Microwell Strips: Remove required microwell strip from pouch and place them in the frame. Promptly return unused strips to refrigerated storage. Wash Solution: The Wash Concentrate must be diluted prior to use. Dilute the Wash Concentrate 1:10 by adding 100 ml of the concentrate to 900 ml of distilled water. The diluted wash solution is stable for 2 weeks at 2-8 C. Conjugate Solution: The conjugate reagent must be diluted prior to use. Dilute Conjugate 1:101 with Conjugate Diluent. The diluted conjugate solution must be used within a day. Use disposable reservoir to avoid contamination. Do not dilute the other kit components which are ready- to-use. PREPARATION OF SAMPLES Use fresh patient sera. If storage is needed, they should be aliquot and frozen below -20 C for up to one month, below -70 C for any longer storage. Do not repeat freezing and thawing. *In case of being stored below -20 C for more than 6 months or freezing and thawing repeatedly, nonspecific results are obtained because of IgG denaturation. Dilute each patient serum 1:101 by adding 10 µl of serum to 1 ml of Assay Diluent. *Diluted samples may be stored up to 3 days if refrigerated. *Diluted samples can be also used for MESACUP Desmoglein TEST Dsg 3. ASSAY PROCEDURE STEP 1. (SAMPLE INCUBATION) Using the multichannel micropipette, transfer 100 µl of Calibrator 1, Dsg-1 Calibrator 2 and each diluted sample into the appropriate microwells of the antigen test plate. (Do not dilute Calibrators.) * Incubation starts on pipetting to the antigen-coated microwells. Pipetting should be completed as quickly as possible. Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-25 C) for 60 minutes. 4
7 English STEP 2. (WASHING) Aspirate or discard the well contents. Fill the well with Wash Solution and then completely aspirate or discard the contents. Wash 4 times. Tap the plate on a paper towel to remove any remaining Wash Solution. When autowasher is used, wash 4 times. * Each laboratory is recommended to confirm its own appropriate washing times and other conditions. * Washing Solution should be used at C. STEP 3. (CONJUGATE INCUBATION) Pour Conjugate Solution into a reservoir. Add 100 µl of the working Conjugate Solution to each well with multichannel micropipette. Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-25 C) for 60 minutes. STEP 4. (WASHING) Wash the microplate following STEP 2 procedure. STEP 5. (SUBSTRATE INCUBATION) Pour substrate into a reservoir. Add 100 µl of the substrate to each well with multichannel micropipette. *This reservoir should be different from the one, which was used for pouring conjugate solution. A new disposable reservoir should be used because substrate is easily oxidized by metal ion. Cover wells with a plate sealer and incubate at room temperature (20-25 C) for 30 minutes. STEP 6. (STOP REACTION) Pour Stop solution into a reservoir. Add 100 µl of the solution to each well with multichannel micropipette. READING Read the absorbance of each well at 450 nm. If a dual wave length plate reader is available, set the test wavelength at 450 nm and the reference at 620 nm. *Reading should be done as quickly as possible after stopping the reaction. *Ensure that the bottom of the plate is clean and dry, and that no bubbles are present on the surface of the liquid of the wells before reading the plate. CALCULATION OF RESULTS ( A 450 <Sample> - A 450 <Calibrator 1>) Unit value (U/ml) = x 100 (A 450 <Calibrator 2> - A 450 <Calibrator 1>) *A450 is abbreviation of absorbance value at 450 nm. *An international reference material for anti Dsg-1 antibodies is not available, the assay is calibrated in relative arbitrary units. QUALITY CONTROL Each assay result should meet the following criteria. A 450 of Calibrator1: A 450 of Dsg1 Calibrator2: If any of these are not met, the results are invalid and the test should be repeated. Before repeating assay, check the following procedure. Incubation Temperature 5
8 English Incubation Time Washing TEST INTERPRETATION AND EXPECTED VALUE The following is intended only as a guide for interpretation. Each laboratory is recommended to establish its own criteria for test interpretation based on sample populations typically encountered. Anti-Dsg1 value (U/ml) Interpretation 20 Positive 20> - 14 Indeterminate 14 > Negative The above value was established with assaying 179 normal serums, 60 Pemphigus Foliaceus (PF) patient serums and patient serums other than PF. When it is interpreted as Indeterminate, a closer look at transition of the disease is recommended. This reagent shows antibody titer as assay value. A transition of antibody titer is thought to reflect disease activity of patient, but there is a possibility that the change of the antibody titer is not caught clearly when the antibody value is higher than 150 U/ml. The change of the antibody titer can be caught more clearly by measuring the specimen by a higher dilution (ex.1: 2,020 dilution). LIMITATIONS As with other diagnostic test procedures, the results obtained with the MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 TEST serve only as an aid to diagnosis and should not be interpreted as diagnostics in themselves. PERFORMANCE CHARACTERISTICS CLINICAL SPECIFICITY AND CLINICAL SENSITIVITY Disease Positive sample Positive rate Pemphigus foliaceus (PF) 31/ % Pemphigus vulgaris (PV) 27/ % Bullous pemphigoid (BP) 0/45 0.0% Normal Serum 0/ % PRECISION Repeatability was demonstrated by testing 3 samples in sextuple. Reproducibility was determined by testing 3 samples on 5 different days (day-to-day) and by testing 3 samples in 3 lots (lot-to-lot). %CV values for reproducibility and repeatability were below 15% for each sample. ASSAY RANGE The assay range of this kit is from 5 U/ml to 150 U/ml. When the assay result exceeds 150 U/ml should report over 150 U/ml. INTERFERING SUBSTANCES Hemoglobin (up to 490 mg/dl), Bilirubin F (up to 18.2 mg/dl), Bilirubin C (up to 22 mg/dl), chyle (up to 2,800 unit as Formazine) and/or Rheumatoid factor (up to 480 IU/ml) are not affective on the assay result, but avoid using highly hemolysed samples or highly lipemic samples. 6
9 English REFERENCES 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
10 Français Français BUT DU DOSAGE Le MESACUP Desmogléine TEST Dsg1 est une trousse de dosage semi-quantitative ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) pour la détection d anticorps anti-desmogléine-1 dans le sérum humain. Le but du MESACUP Desmogléine TEST Dsg1 est situé dans le diagnostic in vitro comme moyen de diagnostic différentiel de certaines maladies pemphigus. RESUME ET EXPLICATION La desmogléine-1 est une cadhérine desmosomiale exprimée dans l épithélium squameux stratifié et constitue l antigène cible du pemphigus foliacé (PF) [1, 2]. Le PF est une maladie auto-immune cutanée caractérisée cliniquement par la formation de petites bulles flaccides et squameuses, de croûtes et histologiquement par la formation de bulles intraépidermiques dues à la perte de l adhésion cellulaire par les kératinocytes. Des autoanticorps anti Dsg1 sont détectés dans le sérum des patients atteints de PF et ils jouent un rôle pathogène dans la formation des bulles. On détecte également Dsg1 chez 60% des patients atteints de pemphigus vulgaire (PV) ; un autre type de pemhigus. Amagai et al. ont produit du Dsg1 recombinant (rdsg1) utilisant un système d expression baculovirus [3]. Il s agit d une forme secrétée formée du domaine extracellulaire de Dsg1. rdsg1 peut adsorber les autoanticorps pathogènes des patients atteints de PF, empêchant la formation de bulles chez un modèle murin de pemphigus néonatal. Ceci montre que Dsg1 recombinant exprime la majorité, si ce n est même la totalité des épitopes conformationnels des antigènes natifs impliqués dans la pathogénicité du PF. Le diagnostic de PF se fait de façon courante en Immunofluorescence (IF) sur des coupes de peau humaine saine ou sur œsophage de singe. Cependant ces méthodes présentent les inconvénients des tests en IF. (a) L IF nécessite un personnel très expérimenté et constitue une méthode subjective de détermination du titre en anticorps. (b) Les anticorps dirigés contre les protéines de surface donnent des faux positives. (c) Les aspects de réactivité du PF et du PV sont identiques en IF et il est donc difficile d établir un diagnostic différentiel. Le test ELISA Dsg1 permet de surmonter les difficultés des tests en IF. Il utilise de la Dsg1 recombinante et constitue une méthode sensible et spécifique pour établir le diagnostic de PF [4]. Le MESACUP Desmogléine TEST Dsg1 est fait pour la mesure d auto-anticorps anti-desmogléine-1 IgG avec une haute sensibilité. PRINCIPE DU TEST La trousse ELISA Dsg1 permet de mesurer la concentration en anticorps anti Dsg1 présents dans le sérum. Des sérums calibrateurs et des sérums de patients sont ajoutés dans des micro-puits sensibilisés avec Dsg1. Les anticorps anti-dsg1 vont se lier aux molécules de Dsg1 immobilisés (Étape d incubation avec l antigène). Après une étape de lavage permettant d éliminer les protéines non liées, un anticorps monoclonal anti IgG humain conjugué à la peroxydase est ajouté (Étape d incubation du conjugué). Après une deuxième étape de lavage, du substrat peroxydase est ajouté et incubé pour une période supplémentaire (Étape d incubation du substrat). Puis une solution d arrêt (acide sulfurique) est ajoutée dans chaque puits pour arrêter le développement de la réaction et pour stabiliser le développement des couleurs. Ce test peut être quantifié en mesurant l intensité de la réaction au spectrophotomètre. PROTOCOLE SIMPLIFIE <Incubation de l échantillon> (20-25 C) 60 min. Ajouter dans les micro-puits sensibilisés à Dsg1: Echantillon dilué au 1 : 101 (100 µl) Laver 8
11 Français <Incubation du conjugué> (20-25 C) 60 min. <Incubation du substrat> (20-25 C) 30 min. Solution de conjugué (100 µl) Laver Substrat (100 µl) Solution d arrêt (100 µl) Lecture de l absorbance à 450 nm Calculer la valeur index REACTIFS FOURNIS ET STOCKAGE 1) Micro Plaque 6 Barrettes de 8 micropuits sensibilisés avec Dsg1 recombinant, les bandes de séparation emballées dans un porte-bandes et cachetées dans une enveloppe de papier aluminium avec du dessicant, sont stables à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 2) Calibrateur 1 (0 U/ml) Un flacon avec 1,5 ml de sérum humain normal avec du diluant sérum comprenant 0,09% d azide de sodium. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 3) Dsg1 Calibrateur 2 (100 U/ml) Un flacon avec 1,5 ml de sérum humain positif d anticorps anti Dsg1 avec du diluant sérum comprenant 0,09% d azide de sodium. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 4) Conjugué 101 x Anticorps monoclonaux anti-igg humains couplés à de la peroxydase (1x0,3 ml) à une concentration 101x. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 5) Diluant Conjugué Un flacon avec 24 ml d HEPES et de l albumine bovine. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 6) Diluant Sérum Un flacon avec 50 ml de tampon Tris, du sérum bovin et 0,09% d azide de sodium. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 7) Solution de lavage 10 X Un flacon avec 100 ml de PBS et de Tween 20 comme un concentré 10x. Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 9
12 Français 8) Substrat Un flacon avec 20 ml de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride /peroxide d hydrogène (TMB/ H 2 O 2 ). Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. 9) Solution d arrêt Acide sulfurique 1 N (1x20 ml). Stable à 2-8 C jusqu à la date d expiration indiquée. PRECAUTIONS (1) Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. (2) Ne pas utiliser les éléments de la trousse après la date de péremption indiquée. (3) Eviter tout contact des réactifs avec les yeux, la peau ou les vêtements. En cas de contact des réactifs avec la peau, laver avec beaucoup d eau. TMB contient des matières irritantes et la Solution d arrêt consiste en un acide sulfurique 1N, qui est toxique et corrosif. (4) Les calibrateurs sont préparés à partir de sérums humains, qui ont été testés négatifs pour l antigène HBs, les anticorps anti-hcv, HIV-1 et HIV-2. Aucune méthode ne pouvant garantir l absence de ces virus ou d autres virus pathogènes. Ces réactifs et tous les échantillons des patients doivent être manipulés comme s ils étaient capables de transmettre le SIDA, l hépatite ou d autres maladies infectieuses. (5) Les calibrateurs (1&2) et le diluant sérum contiennent 0,09% d azide de sodium comme conservateur et doivent être manipulés avec précaution ne pas ingérer ou permettre du contact avec la peau ou avec les membranes muqueuses. L azide peut provoquer des réactions explosives dans les conduites en fer ou cuivre. Faire couler l eau en abondance lorsqu on se débarrasse de ces produits. (6) Certains composants de la trousse contiennent des matières d origine animale, provenant d animaux non-infectés. Cependant, ces composants doivent être manipulés comme des dangers biologiques potentiels, lors de l utilisation ainsi que lors du traitement des déchets. (7) Utiliser obligatoirement les mêmes lots de barrettes de micro puits, de solution de conjugué et de Calibrateurs. Ne pas substituer des réactifs d autres trousses. (8) Ramener tous les composants de la trousse à température ambiante (20-25 C) avant emploi. (9) Ne pas exposer les éléments de la trousse à la lumière pendant son utilisation ou sa conservation. (10) Eviter la contamination croisée et microbienne des réactifs ou des échantillons. (11) Une température d incubation en deçà ou au-delà de la température ambiante (20-25 C) ainsi que des temps d incubation augmentés ou raccourcis ou des dilutions imprécises peuvent donner des résultats erronés. (12) Les puits doivent être lavés de façon correcte et suffisante avec la solution de lavage pour éviter d obtenir des résultats faux positives. (13) Pipeter de façon à éviter la formation de bulles dans les échantillons et les réactifs pour éviter la contamination croisée entre les micro-puits. (14) Remettre dans le sachet à fermeture éclair les barrettes de micro puits non utilisées, bien refermer cet étui pour empêcher une hydratation des réactifs. (15) La solution de lavage concentrée peut être trouble à 2-8 C, sans pour autant influencer la qualité des résultats obtenus. Avant de préparer la solution de lavage, bien agiter la solution concentrée. (16) Le matériel utilisé pour le test doit être jeté ou traité comme indiqué ci-dessous. Tremper dans une solution glutaraldéhyde à concentration finale 2% pendant plus d une heure ou tremper dans une solution sodium hypochlorite 0,5% (chlorine disponible: approx ppm) 10
13 Français pendant plus d une heure ou autoclaver à 121 C pendant plus de 20 minutes. (17) Les valeurs d anticorps Dsg1 obtenus par ce test ne sont qu un moyen de diagnostic. Chaque médecin doit interpréter ces résultats dans le cadre de l histoire du patient, des constats médicaux et d autres procédures diagnostiques. MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI Lecteur de micro plaque (longueur d onde: 450 nm, 620 nm/référence) Micropipette multicanaux (p.e. 100 µl 300 µl) Pipette automatique (p.e. 10 µl & 100 µl) Réservoir des réactifs Laveur de micro plaque ou flacon pour le tampon de lavage Eau désionisée ou destillée Verre gradué d un litre pour la préparation de la solution de lavage Eprouvettes pour la dilution des échantillons du patient (p.e µl) Pointes de pipette jetables Serviettes en papier Bassin et désinfectant Couverture de micro-plaque PROCEDURE PREPARATION DES REACTIFS Amener tous les réactifs à température ambiante (20-25 C) avant utilisation. Micro plaque: Retirer le nombre de barrettes nécessaire du sachet et les placer dans le support. Remettre immédiatement au réfrigérateur les barrettes non utilisées. Solution de lavage: La solution de lavage concentrée doit être diluée avant emploi. Diluer au 1 : 10 en ajoutant 100 ml de la solution de lavage 10 X à 900 ml d eau distillée. La solution de lavage diluée est stable pendant 2 semaines à 2-8 C. Conjugué: Le conjugué doit être dilué avant emploi Diluer au 1 : 101 avec le diluant conjugué. La solution de conjugué dilué doit être utilisée le jour même. Utiliser un récipient à usage unique pour éviter les contaminations. Ne pas diluer d autres composants de la trousse qui sont prêts à utiliser. PREPARATION DES PRELEVEMENTS Utiliser des sérums fraîchement prélevés. Si les échantillons ne sont pas utilisés immédiatement, aliquoter et congeler à 20 C pour un mois ou à 70 C pour une plus longue période. Eviter les étapes de congélation-décongélation. *En cas de stockage au-dessous de -20 C pendant plus de 6 mois ou en cas de congélation-décongélation successive, des résultats non-spécifiques sont obtenus à cause de la dénaturation d IgG. Diluer chaque sérum de patient au 1 : 101 en ajoutant 10 µl de sérum à 1 ml de diluant sérum. *Des échantillons dilués peuvent être gardés jusque 3 jours s ils sont réfrigérés. *Ces dilutions peuvent également servir pour le MESACUP Desmoglein TEST Dsg 3. 11
14 Français PROTOCOLE PHASE 1. (INCUBATION DE L ECHANTILLON) Transférer, en utilisant la micropipette multicanaux, 100 µl du Calibrateur 1, du Dsg1 Calibrateur 2 et de chacun des échantillons dilués dans les puits respectifs de la plaque de microtitration tapissée de l'antigène. (Ne pas diluer les Calibrateurs.) * L incubation démarre au moment où les échantillons sont déposés dans les micro-puits. Procéder le plus rapidement possible à cette étape. Recouvrir les puits avec un cachet et incuber à température ambiante (20-25 C) pendant 60 minutes. PHASE 2. (LAVAGE) Aspirer ou éliminer le contenu des puits. Remplir les puits avec la solution de lavage et aspirer complètement ou éliminer le liquide. Faire 4 lavages. * On recommande à chaque laboratoire d établir ses propres conditions de lavage (mise en place et temps). * La solution de lavage doit être à température ambiante (20-25 C) PHASE 3. (INCUBATION DU CONJUGUE) Transférer la solution de conjugué dans le réservoir. Pipeter 100 µl de la solution de conjugué dans chaque puits à l aide d une micropipette multicanaux. Recouvrir les puits avec un cachet et incuber à température ambiante (20-25 C) pendant 60 minutes. PHASE 4. (LAVAGE) Laver la micro-plaque selon la procédure de la PHASE 2. PHASE 5. (INCUBATION DU SUBSTRAT) Transférer la solution de substrat dans un réservoir. Pipeter 100 µl de la solution de substrat dans chaque puits à l aide d une micropipette multicanaux. *Ce réservoir doit être différent de celui utilisé pour la solution de conjugué. Un réservoir neuf doit être utilisé car la solution de substrat est facilement oxydée par la présence d ions métalliques. Recouvrir les puits avec un cachet de plaque et incuber à température ambiante (20-25 C) pendant 30 minutes. PHASE 6. (ARRET DE LA REACTION) Transférer la solution d arrêt dans un réservoir. Pipeter 100 µl de cette solution dans chaque puits avec une micropipette multicanaux. LECTURE Lire l absorbance de chaque puits à 450 nm. Si on utilise un lecteur avec un double faisceau, lire les puits à 450 nm et la référence à 620 nm. *la lecture doit être effectuée aussi vite que possible après avoir arrêté la réaction. *Vérifier si le fond de la plaque est propre et sec, et s il n y a pas de bulles à la surface de la liquide des puits avant de lire la plaque. CALCUL DES RESULTATS Valeur Index = *DO 450 nm est la valeur de l absorbance à 450 nm. DO 450 nm Ech - DO 450 nm Cal. 1 DO 450 nm Cal. 2 - DO 450 nm Cal. 1 x 100 *Il n y a pas de données de référence internationales pour des anticorps anti-dsg1 ; le test est calibré 12
15 Français en unités relativement arbitraires. CONTRÔLE DE QUALITE Pour valider le test, tenir compte des indications suivantes : La D.O 450 nm du Calibrateur 1 doit être 0,100. La D.O 450 nm du Calibrateur 2 doit être 0,700 Si une de ces conditions n est pas remplie, les résultats sont non valables et le test doit être répété. Avant de répéter le test, vérifier la procédure suivante. Température d Incubation Délai d Incubation Lavage INTERPRETATION ET VALEURS ATTENDUES Les données suivantes sont fournies afin de faciliter l interprétation. On recommande à chaque laboratoire d élaborer ses propres critères pour l interprétation du test basés sur des populations d échantillons typiques. Valeur Anti-Dsg1 (U/ml) Interprétation 20 Positif 20> - 14 Indeterminé 14 > Negatif La valeur si-dessus a été établie en étudiant 179 sérums normaux, 60 sérums de patients de Pemphigus Foliaceus (PF) et des sérums de patients non PF. En cas d interprétation indéterminée, on recommande une étude approfondie de la transition de la maladie. Ce réactif montre le titre d anticorps comme une valeur de test. On pense que la transition du titre d anticorps reflète l activité de la maladie du patient, mais il existe une possibilité que le changement du titre d anticorps n est pas vu clairement si la valeur d anticorps dépasse 150 U/ml. Le changement du titre d anticorps peut être vu plus clairement en mesurant le spécimen avec une dilution plus forte (ex. dilution 1: 2,020). LIMITATIONS Comme dans d autres procédures de test diagnostiques, les résultats obtenus avec le MESACUP Desmogléine TEST Dsg1 TEST ne peuvent être qu un moyen diagnostique qui ne peut pas être interprété lui-même comme un diagnostic. PERFORMANCES SPECIFICITE ET SENSIBILITE CLINIQUE Maladie Echantillon positif Valeur Positive Pemphigus foliaceus (PF) 31/31 100,0% Pemphigus vulgaris (PV) 27/39 69,2% Pemphigoïde bulleuse (BP) 0/45 0,0% Sérum normal 0/180 0,0% 13
16 Français PRECISION La répétabilité a été démontrée en testant 3 échantillons en sextuple. La réproductibilité a été déterminée en testant 3 échantillons à 5 jours différents (jour-à-jour) et en testant 3 échantillons en 3 lots (lot-à-lot). Valeurs %CV pour réproductibilité et répétabilité étaient au-dessous des 15% pour chaque échantillon. PORTEE DU TEST La portée de cette trousse va de 5 U/ml à 150 U/ml. Si le résultat du test dépasse 150 U/ml, mentionner plus de 150 U/ml". INTERFERENCES L Hémoglobine (jusque 490 mg/dl), la Bilirubine F (jusque 18,2 mg/dl), la Bilirubine C (jusque 22 mg/dl), le chyle (jusque 2800 unités comme Formazine) et/ou le facteur Rheumatoïde (jusque 480 IU/ml) n influencent pas le résultat du test, mais éviter d utiliser des échantillons très hémolysés ou lipémiques. BIBLIOGRAPHIE 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
17 Deutsch Deutsch VERWENDUNGSZWECK MESACUP Desmoglein TEST [Dsg1] ist ein semi-quantitativer Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Nachweis von Desmoglein 1-Autoantikörpern in Humanserum. Der MESACUP Desmoglein TEST [Dsg1] dient zum Einsatz in-vitro als Hilfestellung bei der diagnostischen Abklärung gewisser Pemphiguserkrankungen. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG Desmoglein 1 (Dsg1) ist ein desmosomales Protein. Es ist im verhornten Plattenepithel der Epidermis exponiert und das Zielantigen bei Pemphigus foliaceus (PF; 1,2). PF ist eine sehr schwere bullöse Autoimmunerkrankung der Haut, selten Schleimhaut, mit Neigung zur Generalisation oder Übergang zu großlamellöser Schuppung. Histologisch stehen intraepidermale Blasen im Vordergrund, hervorgerufen durch den Verlust der Adhäsion zwischen den Keratinozyten. IgG-Autoantikörper gegen Dsg1 spielen eine pathogenetische Rolle bei der Blasenbildung und sie können im Serum von Patienten mit PF nachgewiesen werden. Diese Antikörper kommen auch bei rund 60% der Patienten mit Pemphigus vulgaris (PV) vor, einer anderen Pemphigus-Erkrankung. Amagai et al haben anhand der Expression in einem Baculovirussystem rekombinantes humanes Dsg1 (rdsg1) hergestellt (3). Vom Design her ist rdsg1 ein frei zirkulierendes Protein mit der kompletten extrazellulären Domain von Dsg1. rdsg1 kann pathogenetische Autoantikörper in Seren von Patienten mit einer PF immunologisch binden und in einem neonatalen Pemphigus-Mausmodell die Blasenbildung verhindern. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis dafür, dass rdsg1 die Mehrzahl, vielleicht sogar alle in der Pemphigus-Pathogenese kritischen Konfirmationsepitope des nativen Antigens exprimiert. Gegenwärtig beruht die Pemphigus-Diagnostik weitgehend auf den Autoantikörper-Nachweis mittels indirekter Immunfluoreszenz (IF) unter Verwendung von menschlichen Haut- oder Affenösophagusschnitten. Dieses Nachweisverfahren hat jedoch mehrere Nachteile. (a) Die Auswertung der IF-Muster erfordert entsprechend geschultes Personal; die Bestimmung des Autoantikörpertiters ist subjektiv. (b) Falsch positive Ergebnisse werden von Antikörpern gegen Proteine auf der Zelloberfläche verursacht. (c) Aufgrund von sich überschneidenden IF-Mustern gestaltet sich eine Trennung zwischen PV und PF schwierig. Um die mit der IF verbundenen Probleme zu überbrücken, wurde unter Verwendung von rdsg1 ein ELISA für die Pemphigus-Diagnostik entwickelt (4). Der MESACUP Desmoglein TEST [Dsg1] 1-IgG-Autoantikörpern im Humanserum. ist ein sehr sensitiver ELISA zum Nachweis von Desmoglein TESTPRINZIP Mit MESACUP Desmoglein TEST [Dsg1] werden Autoantikörper gegen Desmoglein 1 (Dsg1) in Serum mittels ELISA bestimmt. Kalibratoren und Patientenseren werden den mit Dsg1-Antigen beschichteten Vertiefungen in einer Mikrotiterplatte hinzugefügt. Im Folgenden reagieren die Autoantikörper mit dem Antigen an der Festphase (Probeninkubation). Nach einem Waschschritt, zur Entfernung nicht gebundener Serumproteine, werden mit Meerrettichperoxidase markierte monoklonale Mausantikörper gegen Human-IgG hinzugefügt. Im Folgenden reagieren sie mit den an der Festphase gebundenen Autoantikörpern (Konjugatinkubation). Nach einem zweiten Waschschritt wird das Peroxidasesubstrat hinzugefügt. Es folgt die Substratinkubation. Dann wird Säure in die Vertiefungen gegeben, um die Enzymreaktion abzustoppen und die Farbentwicklung zu stabilisieren. Anschließend werden die Vertiefungen photometriert und die Ergebnisse in quantitativen Einheiten ermittelt. 15
18 Deutsch KURZFASSUNG DER TESTDURCHFÜHRUNG <Probeninkubation> In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte (20-25 C) 60 Min. 100 µl verdünnte Probe (1:101) hinzufügen Waschen <Konjugatinkubation> In jede Vertiefung 100 µl Konjugat geben (20-25 C) 60 Min. Waschen <Substratinkubation> In jede Vertiefung 100 µl Substrat geben (20-25 C) 30 Min. In jede Vertiefung 100 µl Stopplösung geben Photometrieren Ergebnisse auswerten REAGENZIEN UND IHRE LAGERUNG 1) MIKROTITERSTREIFEN 6 Mikrotiterstreifen mit jeweils 8 Vertiefungen, einzeln abbrechbar, beschichtet mit rekombinantem Dsg1-Protein. Die Streifen mit Halterahmen sind in einem Folienbeutel mit Trockenmittel verpackt. Sie sind bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Nach dem Öffnen können nicht benötigte Streifen im wieder versiegelten Beutel bei 2-8 C für 60 Tage gelagert werden. 2) KALIBRATOR 1 (0 U/ml) Ein Fläschchen mit 1,5 ml normalem Humanserum und Probendiluent. Enthält 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig. Nicht verdünnen! Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 3) KALIBRATOR 2 (100 U/ml) Ein Fläschchen mit 1,5 ml Humanserum, positiv für Dsg1-Autoantikörper, und Probendiluent. Enthält 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig. Nicht verdünnen! Bei 2-8 C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 4) KONJUGAT (101x) Ein Fläschchen mit 0,3 ml mit Meerrettichperoxidase markierten monoklonalen Mausantikörpern gegen Human-.IgG. Konzentrat (101x). Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. Flasche zur Herstellung der gebrauchsfertigen Konjugatlösung wird mitgeliefert. 5) KONJUGATDILUENT Eine Flasche (24 ml) mit HEPES und BSA. Gebrauchsfertig. Bei 2-8 o C 16
19 Deutsch bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 6) PROBENDILUENT Eine Flasche (50 ml) mit Tris-Puffer, Rinderserum und 0,09% Natriumazid. Gebrauchsfertig. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 7) KONZENTRIERTE WASCHLÖSUNG (10X) Eine Flasche (100 ml) mit PBS und Tween 20; Konzentrat (10x). Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 8) SUBSTRATLÖSUNG Eine Flasche (20 ml) mit 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid/Wasserstoffperoxid (TMB/H 2 O 2 ). Gebrauchsfertig. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. 9) STOPPLÖSUNG Eine Flasche (20 ml) mit 1 N Schwefelsäure. Gebrauchsfertig. Bei 2-8 o C bis zum angegebenen Verfallsdatum haltbar. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN (1) Nur für in-vitro Diagnostik. (2) Die Bestandteile eines Testkits nicht über ihr Verfallsdatum hinaus verwenden. (3) Berührung der Reagenzien mit Augen, Haut und Bekleidung vermeiden. Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser spülen. TMB ist ein Reizmittel und die Stopplösung enthält 1 N Schwefelsäure, einen giftigen und ätzenden Stoff. (4) Die Kalibratoren, positiven und negativen Kontrollseren sind aus Humanseren hergestellt, die mit negativem Ergebnis auf HBs-Antigen, HCV- sowie HIV 1 und HIV 2-Antikörper untersucht wurden. Indes kann kein Testverfahren gewährleisten, dass diese oder andere infektiöse Erreger nicht vorhanden sind. Diese Reagenzien und alle Patientenproben sollten daher so behandelt werden, als könnten sie AIDS, Hepatitis oder andere Infektionskrankheiten übertragen. (5) Die Kalibratoren, positiven und negativen Kontrollseren und der Probendiluent enthalten Natriumazid (0,09%) als Konservierungsstoff. Sie müssen mit Vorsicht behandelt werden. Nicht einnehmen und nicht mit Haut und Schleimhäuten in Berührung bringen. Natriumazid kann mit Kupfer- oder Bleirrohren unter Ausbildung explosiver Metallazide reagieren. Falls Natriumazid-haltige Lösungen in den Ausguss entsorgt werden, sollte daher mit viel Wasser gespült werden. (6) Einige Bestandteile des Kits enthalten Materialien aus nicht-infizierten Tieren. Trotzdem sollten diese Bestandteile als potentiell biogefährlich gehandhabt und entsorgt werden. (7) Nur die Mikrotiterstreifen zusammen mit den Kalibratoren aus Kits der gleichen Charge verwenden. Die Reagenzien aus unterschiedlichen Kitchargen nicht gegenseitig austauschen. (8) Vor Gebrauch müssen alle Reagenzien auf Raumtemperatur (20-25 C) gebracht werden. (9) Während der Lagerung und Testdurchführung den Kit und seine Reagenzien vor der Sonne schützen. (10) Reagenzien und Proben vor Verunreinigung durch Mikroorganismen und gegenseitigen Kontakt schützen. (11) Entgegen den Empfehlungen in der Testanleitung veränderte Inkubationstemperaturen, Inkubationszeiten und Verdünnungen können die Ergebnisse verfälschen. 17
20 Deutsch (12) Die Vertiefungen müssen sorgfältig mit der Waschlösung gewaschen werden, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. (13) Beim Pipettieren der Proben und Reagenzien Schaumbildung vermeiden, um einer Verschleppung auf benachbarte Vertiefungen vorzubeugen. (14) Nicht benötigte Mikrotiterstreifen müssen sofort wieder in den Folienbeutel gelegt und dieser sorgfältig versiegelt werden, damit kein Kondenswasser gebildet wird. (15) Das Waschlösungskonzentrat kann bei 2-8 C trüb werden. Für die Ergebnisse ist das unerheblich. (16) Im Test benutzte Gefäße etc. sollten wie folgt behandelt werden: 1 Stunde in eine Glutaraldehyd-Lösung (2 % Endkonzentration) legen oder länger als 1 Stunde mit einer 0,5%igen Natriumhypochloritlösung (verfügbarer Chlorgehalt ca ppm) behandeln oder länger als 20 Minuten bei 121 C autoklavieren. (17) Die mit diesem Test ermittelten Dsg1-Autoantikörperspiegel sind nur als Hilfestellung zur Diagnosefindung zu betrachten. Bei der Beurteilung der Ergebnisse muss der Arzt die anamnestische Erhebung, die Befunde der körperlichen Untersuchung und die Daten anderer diagnostischer Verfahren berücksichtigen. BENÖTIGTE, ABER NICHT GELIEFERTE MATERIALIEN Mikrotiterplatten Reader (Wellenlänge: 450 nm, 620 nm/referenzfilter) Multikanal Mikropipette (z.b. 100 µl 300 µl) Pipette (z.b. 10 µl und 100 µl) Gefäße für Reagenzien Waschgerät oder Spritzflasche Entionisiertes oder destilliertes Wasser Messzylinder (1 Liter) zur Herstellung der Waschlösung Röhrchen für die Probenverdünnungen (z.b 1000 µl) Einmal-Pipettenspitzen Papierhandtücher Schüssel und Desinfektionsmittel Klebefolie TESTDURCHFÜHRUNG HERSTELLUNG DER REAGENZIEN Vor Gebrauch alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur (20-25 C) bringen. Mikrotiterstreifen: Benötigte Streifen dem Folienbeutel entnehmen und im Halterahmen verankern. Beutel mit den nicht benötigten Streifen sofort wieder versiegeln und im Kühlschrank aufbewahren. Waschlösungskonzentrat 1:10 verdünnen (z.b. 100 ml Waschlösungskonzentrat in 900 ml Aqua dest. geben). Die gebrauchsfertige Waschlösung ist 2 Wochen bei 2-8 C haltbar. Konjugatlösung: Das Konjugat muss vor Gebrauch 1: 101mit dem Konjugatdiluent verdünnt werden (z.b. 10 µl Konjugat und 1 ml Konjugatdiluent). Die verdünnte Konjugatlösung muss binnen einem Tag verwendet werden. Zum Verdünnen ein sauberes (Einweg-)Gefäß benutzen, um eine Kontamination zu vermeiden. Die anderen Bestandteile des Testkits (Kalibratoren, Probendiluent, Substrat und Stopplösung) sind gebrauchsfertig. Sie dürfen nicht verdünnt werden. 18
21 Deutsch HERSTELLUNG DER PROBEN UND KONTROLLSEREN Wenn möglich, sollten frisch gewonnene Patientenseren verwendet werden. Sie können einen Monat bei 20 C oder länger bei 70 C gelagert werden. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist zu vermeiden. *Wiederholtes Einfrieren und Auftauen oder Lagerung bei 20 C über einen längeren Zeitraum als 6 Monate kann die Ergebnisse verfälschen, weil IgG in den Proben denaturiert wird. Die Patientenseren sowie die negativen und positiven Kontrollseren 1:101 verdünnen (z.b. 10 µl Serum in 1 ml Probendiluent pipettieren). *Die verdünnten Seren können 3 Tage in einem Kühlschrank aufbewahrt werden. * Die verdünnten Seren können auch im MESACUP Desmoglein 3 TEST [Dsg3] verwendet werden. TESTABLAUF 1. SCHRITT (PROBENINKUBATION) Mit einer Multikanal Mikropipette werden je 100 µl von Kalibrator 1, Kalibrator 2 und den verdünnten Patientenseren in die entsprechenden Vertiefungen der Antigen Testplatte pipettiert. (Verdünnen Sie die Kalibratoren nicht.) * Das Pipettieren sollte zügig durchgeführt werden, damit sich die Inkubationszeiten für die einzelnen Vertiefungen sich nicht allzu sehr unterscheiden. Streifen mit Klebefolie abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 2. SCHRITT (WASCHEN) Inhalt in den Vertiefungen absaugen oder auskippen. Mit Waschlösung füllen und vollständig absaugen oder auskippen. Insgesamt viermal waschen. Abschließend Streifen gegen Papierhandtücher ausklopfen, um die letzten Reste an Waschlösung zu entfernen. Bei Einsatz eines automatischen Waschgeräts viermal waschen. * Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Waschzeiten und bedingungen festlegt. * Die Waschlösung sollte vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20-25 C) gebracht werden. 3. SCHRITT (KONJUGATINKUBATION) Gebrauchsfertige Konjugatlösung in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 µl Konjugat in jede Vertiefung pipettieren. Mit Klebefolie abdecken und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 4. SCHRITT (WASCHEN) Die Streifen wie im 2. SCHRITT beschrieben waschen. 5. SCHRITT (SUBSTRATINKUBATION) Substratlösung in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 µl in jede Vertiefung pipettieren. * Nicht die selbe Wanne wie jene für das Konjugat verwenden. Am besten eignet sich eine neue Einwegwanne, weil das Substrat leicht durch Metallionen oxidiert wird. * Ggf. in der Wanne übrig gebliebenes Substrat darf nicht in die Substratflasche zurückgeführt werden. Mit Klebefolie abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 C) inkubieren. 6. SCHRITT (ABSTOPPEN) Die Stopplösung in eine Wanne geben. Mit einer Multikanal Mikropipette 100 µl in jede Vertiefung pipettieren. 19
22 Deutsch PHOTOMETRIEREN Die Extinktion jeder Vertiefung bei 450 nm messen. Bei Verwendung eines Photometers mit zwei Wellenlängen erfolgt die Extinktionsmessung bei 450 nm, die Referenzmessung bei 620 nm. *Die Vertiefungen sollten sofort nach dem Abstoppen photometriert werden. *Die Unterseite der Streifen muss sauber und trocken sein. Die Vertiefungen dürfen beim Photometrieren keine Luftblasen enthalten. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE (A450<Probe> - A450<Kalibrator 1>) Arbiträre Einheiten = x 100 (A450<Kalibrator 2> - A450<Kalibrator 1>) *A 450 bedeutet: Extinktion bei 450 nm *Da eine internationale Referenzpräparation für Dsg1-Autoantikörper nicht verfügbar ist, ist der Test in relativen arbiträren Einheiten kalibriert. QUALITÄTSKONTROLLE Bei jedem Testansatz müssen folgende Kriterien erfüllt sein: A 450 vom Kalibrator-1: 0,100 A 450 vom Kalibrator-2: 0,700 Wird einer dieser Werte nicht erreicht, sind die Ergebnisse ungültig. Der Testlauf sollte wiederholt werden. Ehe der Testlauf wiederholt wird, sind folgende Parameter der Testdurchführung zu überprüfen: Inkubationstemperatur Inkubationszeiten Waschverfahren BEURTEILUNG DER ERGEBNISSE UND ERWARTETE WERTE Die folgenden Daten dienen nur der Orientierung. Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Grenzwerte auf der Grundlage der von ihm betreuten Patientenpopulationen erstellt. Dsg1-Ak (U/ml) Beurteilung < 14 Negativ für Dsg1-Ak 14 bis <20 20 Grenzwertig Positiv für Dsg1-Ak Die obigen Werte wurden anhand von 179 Seren von einem Normalkollektiv, 60 Seren von Patienten mit Pemphigus foliaceus und 246 Seren von Patienten mit anderen Pemphigus-Erkrankungen erstellt. Bei grenzwertigen Seren sollte besonders sorgfältig auf ein Frühstadium der Erkrankung hin untersucht werden. Der Messwert widerspiegelt den Autoantikörper-Titer und damit die Krankheitsaktivität. Bei Messwerten von größer als 150 U/ml können Titer-Veränderungen nicht mehr genau nachgewiesen werden. Solche Seren sollten daher in einer höheren Verdünnung (z.b. 1:2020) nochmals gemessen werden. 20
23 Deutsch GRENZEN DES VERFAHRENS Wie bei anderen diagnostischen Verfahren, so sind die mit MESACUP Desmoglein TEST [Dsg1] ermittelten Ergebnisse nur eine Hilfestellung bei der Diagnostik und nicht diagnostisch an sich zu werten. LEISTUNGSMERKMALE KLINISCHE SPEZIFITÄT UND SENSITIVITÄT PRÄZISION Erkrankung Positive Proben Positivrate Pemphigus foliaceus (PF) 31/31 100% Pemphigus vulgaris (PV) 27/39 69,2% Bullöses Pemphigoid (BP) 0/45 0% Normalkollektiv 0/180 0% Zur Bestimmung der Präzision wurden 3 Proben in sechsfacher Bestimmung getestet: an 5 verschiedenen Tagen (Präzision von Tag zu Tag) und mit 3 verschiedenen Chargen (Präzision in der Serie). Die Werte der Variationskoeffizenten (% VK) lagen bei sämtlichen Proben unter 15%. MESSBEREICH Der Messbereich dieses Kits erstreckt sich von 5 U/ml bis 150 U/ml. Ergebnisse außerhalb des höchsten Kalibrators sind als größer 150 U/ml anzugeben. INTERFERENZEN Hämoglobin (bis 490 mg/dl), Bilirubin F (bis 18,2 mg/dl), Bilirubin C (bis 22 mg/dl), Chylus (bis Formazin-Einheiten) und / oder Rheumafaktoren (bis 480 IU/ml) beeinträchtigen die Testergebnisse nicht. Stark hämolytische und stark lipämische Proben sollten aber vermieden werden. LITERATUR 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
24 Nederlands Nederlands GEBRUIK De MESACUP Desmogleïne TEST Dsg1 is een semi-quantitatieve enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor de detectie van anti-desmogleïne antilichamen in human serum. De MESACUP Desmogleïne TEST Dsg1 is ontworpen voor in vitro diagnostisch gebruik en als hulp in de differentiaal diagnose van bepaalde pemphigus ziekten. SAMENVATTING EN UITLEG Desmogleïne 1 (Dsg1) is een desmosomaal cadherine dat tot expressie komt op gestratifieerd squameus epitheel en is het doelwit-antigen in pemphigus foliaceus (PF) [1,2]. PF is een autoimmune blaarziekte van de huid en wordt klinisch gekarakteriseerd door kleine slappe blaren en schilferende, korstende erosies. Histologisch wordt de ziekte gekarakteriseerd door intraepidermale blaarvorming ten gevolge van verminderde celadhesie van de keratinocyten. Anti-Dsg1 IgG auto-antilichamen worden gedetecteerd in sera van patiënten met PF en spelen een pathogenische rol in de blaarvorming bij PF. Anti-Dsg1 IgG wordt ook gedetecteerd in ongeveer 60% van de patiënten met pemphigus vulgaris (PV), een andere type pemphigus. Amagai et al. hebben een recombinant humaan Dsg1 (rdsg1) geproduceerd door het gebruik van een baculovirus expressie systeem [3]. rdsg1 is ontwikkeld als een gesecreteerd proteïne dat bestaat uit het volledige extracellulair domein van Dsg1. rdsg1 is in staat tot immunoadsorbtie van de pathogene auto-antilichamen in de sera van PF patiënten en voorkomt blaarvorming in een neonatal muismodel voor pemphigus. Deze bevindingen tonen aan dat rdsg1 de meeste - zoniet alle conformationele epitopen van de natieve antigenen die cruciaal zijn in de pathogenese van pemphigus tot expressie brengt. Op heden, steunt de diagnosestelling van pemphigus voornamelijk op immunofluorescentie (IF) testen die gebruik maken van normale humane huid of aapoesophagus. Er zijn echter verschillende nadelen aan de huidige immunofluorescentietechniek. (a) IF vereist een ervaren labotechnicus en een subjectieve bepaling van de antilichaamtiter. (b) Antilichamen tegen om het even welk oppervlakte-eiwit induceren valspositieven. (c) Gelijkaardige kleuringspatronen bij IF maken het moeilijk een onderscheid te maken tussen PV en PF. Om deze problemen van IF te overkomen, werd een ELISA ontwikkeld als een gevoelige en specifieke test voor de diagnose van pemphigus, die gebruik maakt van het rdsg1 [4]. De MESACUP Desmogleïne TEST Dsg1 is ontwikkeld voor het meten van anti-desmogleïne 1 IgG auto-antilichamen met een hoge sensitiviteit. PRINCIPE De MESACUP Desmogleïne TEST Dsg1 meet de anti-dsg1 antilichamen aanwezig in het serum door middel van ELISA. Calibratoren en patiëntensera worden toegediend aan met Dsg1 antigen gecoate microwells, zodat de anti-dsg1 antilichamen kunnen reageren met het geïmmobiliseerde antigen (staalincubatie). Na een wasstap om ongebonden serumeiwitten te verwijderen, wordt een horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-humaan IgG antilichaam toegevoegd en geïncubeerd (conjugaat-incubatie). Na een volgende wasstap, wordt het peroxidase substraat toegevoegd en geïncubeerd (substraat incubatie). Een zure oplossing wordt dan aan iedere well toegevoegd om de enzymatische reactie stop te zetten en de kleurontwikkeling te stabiliseren. De assay kan gequantificeerd worden door de reactie fotometrisch te analyseren. SAMENGEVATTE ASSAY PROCEDURE <Staal incubatie> Voeg 100 l van het verdunde staal (1:101) toe aan iedere well. (20-25 C) 60 min Was 22
25 Nederlands <Conjugaat incubatie> Voeg 100 l van de conjugaatoplossing toe aan iedere well. (20-25 C) 60 min. Was <Substraat incubatie> Voeg 100 µl van het substraat toe aan iedere well. (20-25 C) 30 min Voeg 100 µl van de stopoplossing toe aan iedere well. Lees absorptie. Interpretatie van het resultaat REAGENTIA en BEWARING 1) Dsg-1 MICROWELL STRIPS MICROWELL STRIPS (6 x 8 wells) gecoat met het gezuiverd recombinant Dsg-1 antigen. De individuele strips zitten in een striphouder en zijn verpakt in een gesloten aluminium envelop met droogproduct, en blijven tot aan de vervaldatum stabiel bij 2-8 C. 2) Calibrator 1 (0 U/ml) Een vial bevat 1.5 ml normal human serum met Assay Diluent, met daarin 0.09% natriumazide. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 3) Dsg-1 Calibrator 2 (100 U/ml) Een vial bevat 1.5 ml anti Dsg-1 antilichaam positief human serum met Assay Diluent, met daarin 0.09% natriumazide. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 4) Conjugaat Reagens (101x) Een vial bevat 0.3 ml horseradish peroxidase geconjugeerd monoclonaal muis anti-humaan IgG, aan een 101x concentratie. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 5) Conjugaat Diluent Een vial bevat 24 ml HEPES en bovine serum albumine. Stabiel tot aan vervaldatum bij 2-8 C. 6) Assay Diluent Een vial bevat 50 ml Tris buffer, bovine serum albumine en 0.09% natriumazide. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 7) Was Concentraat (10x) Een vial bevat 100 ml PBS en Tween 20 onder de vorm van een 10X concentraat. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 23
26 Nederlands 8) Substraat Een vial bevat 20 ml 3,3,5,5 -tetramethylbenzidine dihydrochloride/waterstofperoxide (TMB/H 2 O 2 ). Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. 9) Stop Oplossing Een vial bevat 20 ml 1.0N zwavelzuur. Stabiel tot aan de vervaldatum bij 2-8 C. VOORZORGSMAATREGELEN (1) Dit product is enkel geschikt voor in vitro diagnostisch gebruik. (2) Gebruik de verschillende componenten van de kit niet langer dan de aangeduide vervaldatum. (3) Vermijd contact van de reagentia met ogen, huid en kledij. Reagentia op de huid dienen weggewassen met overvloedig water. TMB bevat irriterende bestanddelen en de Stop Oplossing bevat 1N zwavelzuur, dat giftig en corrosief is. (4) De Calibratoren zijn afkomstig van humaan serum, waarin noch HBs antigenen, noch HCV, HIV-1 en HIV-2 antilichamen gedetecteerd werden. Geen enkele test kan echter de afwezigheid van deze of andere infectieuze agentia garanderen. Deze reagentia en alle patiëntenstalen moeten behandeld worden alsof ze in staat zouden zijn AIDS, hepatitis of een andere infectieuze ziekte over te brengen. (5) Calibrator 1, Calibrator 2 en het Assay Diluent bevatten natriumazide (0.09%) als preservatief en moeten met voorzichtigheid behandeld worden. Niet inslikken en ieder contact met de huid en muceuze membranen vermijden. Natriumazide kan reageren met koper en lood in het afvoersysteem en zo explosieve metaalaziden vormen. Wanneer materialen die natriumazide bevatten verwijderd worden via de afvoer, altijd doorspoelen met een overmaat water. (6) Sommige componenten van de kit bevatten materiaal van dierlijke oorsprong, afkomstig van niet-infectieuze dieren. Deze componenten moeten echter in gebruik en verwijdering behandeld worden als potentiële biohazards. (7) Overeenkomstige lotnummers van de Microwell strips, Conjugaat en Calibrator 2 moeten samen in de assay gebruikt worden. Vervang ze niet door reagentia van andere kits. (8) Alle reagentia moeten op kamertemperatuur (20-25 C) gebracht worden vooraleer de assay te starten. (9) Stel de kit tijdens bewaring en de assay niet bloot aan direct zonlicht. (10) Vermijd microbiële contaminatie en crosscontaminatie van reagentia of stalen. (11) Incubatietemperaturen hoger of lager dan normale kamertemperatuur (20-25 C), kortere of langere incubatietijden en onnauwkeurige verdunningen kunnen foutieve resultaten voortbrengen. (12) De wells moeten goed gespoeld worden met de Was Oplossing om vals positiviteit te voorkomen. (13) Pipetteer ieder staal en reagens voorzichtig, zonder schuimvorming om crosscontaminatie tussen de microwells te voorkomen. (14) Alle microwell strips die niet onmiddellijk gebruikt worden, moeten terug in het hersluitbaar zakje geplaatst worden, die zorgvuldig gesloten moet worden om vochtabsorptie te vermijden. (15) Het wasconcentraat kan bij 2-8 C troebel worden. Dit veroorzaakt geen onnauwkeurige resultaten. (16) Materiaal dat wordt gebruikt voor deze test moet behandeld worden zoals hieronder vermeld: Laat weken in 2% finale concentratie glutaaraldehyde oplossing gedurende meer dan 1 uur of in 0.5% natriumhypochloriet oplossing (beschikbaar chlorine: ongeveer 5000 ppm) gedurende meer dan 1 uur of autoclaveer op 121 C gedurende meer dan 20 minuten. (17) De waarde van de Dsg-1 antilichamen die in deze test verkregen worden, zijn slechts een hulp in de 24
27 Nederlands diagnosestelling. Iedere arts moet deze resultaten interpreteren, rekening houdend met de medische geschiedenis van de patiënt, fysische tekens, en andere diagnostische procedures. NODIG MATERIAAL NIET BIJGELEVERD Microplaat lezer (golflengte: 450 nm, 620 nm/referentie) Multikanaalmicropipet (bvb. 100 µl 300 µl) Single channel pipet (bvb. 10 µl & 100 µl) Reagens reservoir Autowasser of wasfles Gedeïoniseerd of gedistilleerd water Maatcilinder met 1 liter inhoud, voor de bereiding van de wasoplossing Testtubes voor de verdunning van de patiëntenstalen (bvb µl) Wegwerp tips voor de pipetten Papieren doekjes Kom en disinfectant Microplaat deksel PROCEDURE BEREIDING VAN DE REAGENTIA Breng al het materiaal nodig voor de assay op kamertemperatuur (20-25 C) voor gebruik. Microwell strips: Neem de nodige microwell strips uit het zakje en plaats ze in het frame. Plaats de niet gebruikte strips onmiddelijk in een gekoelde bergruimte. Was Oplossing: Voor gebruik moet het Was Concentraat verdund. Verdun het Was Concentraat 1/10 door 100 ml van het concentraat toe te voegen aan 900 ml gedistilleerd water. De verdunde Was Oplossing is stabiel bij 2-8 C gedurende 2 weken. Conjugaat Oplossing: Het Conjugaat Reagens moet verdund voor gebruik. Verdun het Conjugaat 1/101 met het Conjugaat Diluent. De verdunde Conjugaat Oplossing moet dezelfde dag gebruikt. Gebruik een beschikbaar reservoir om contaminatie te voorkomen. Verdun de andere componenten van de kit die klaar voor gebruik zijn niet. BEREIDING VAN DE STALEN Gebruik verse patiëntensera. Indien bewaring nodig is, moeten deze gealiquoteerd worden en ingevroren worden onder -20 voor bewaring tot maximaal 1 maand en onder -70 C voor langere bewaring. Niet herhaaldelijk invriezen en ontdooien. *In het geval van bewaring onder -20 C gedurende meer dan 6 maand of herhaaldelijk invriezen en ontdooien kunnen niet-specifieke resultaten bekomen worden door denaturatie van het IgG. Ieder patiëntenserum dient 1/101 verdund door 10 µl serum toe te voegen aan 1 ml Assay Diluent. *Verdunde stalen kunnen maximaal 3 dagen bewaard worden, indien gekoeld. *Verdunde stalen kunnen eveneens gebruikt worden voor de MESACUP Desmogleïne TEST Dsg3. ASSAY PROCEDURE STAP 1. (STAAL INCUBATIE) Doe met behulp van de multikanaalmicropipet 100 µl van Calibrator 1, Dsg-1 Calibrator 2 en elk 25
28 Nederlands verdunde staal in de betreffende microwells van de antigeentestplaat. (Calibratoren niet verdunnen.) *De incubatie start bij het pipetteren in de antigen-gecoate microwells. Het pipetteren moet zo snel verlopen. Sluit de wells met een plaat deksel en incubeer gedurende 60 minuten op kamertemperatuur. STAP 2. (WASSTAP) Aspireer of verwijder de inhoud van de wells. Vul de well met de Was Oplossing en aspireer of verwijder de inhoud volledig. Was 4X op deze manier. Dep de plaat op een papieren doekje om de overblijvende Was Oplossing te verwijderen. Was 4 keer indien een autowasser gebruikt wordt. *Ieder laboratorium wordt aangeraden zijn eigen wastijden en andere wascondities te valideren. *Was Oplossing dient gebruikt bij C. STAP 3. (CONJUGAAT INCUBATIE) Breng het Conjugaat over in een reservoir. Voeg 100 µl van de Conjugaat Werkoplossing toe aan iedere well met een multikanaalmicropipet. Sluit de wells af met een plaat deksel en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur (20-25 C). STAP 4. (WASSTAP) Was de microplaat volgens stap 2 van de procedure. STAP 5. (SUBSTRAAT INCUBATIE) Breng het substraat over in een reservoir. Voeg 100 µl van het substraat toe aan iedere well met een multikanaalmicropipet. *Dit reservoir dient een ander te zijn dan diegene voor de Conjugaat Oplossing. Een nieuw beschikbaar reservoir moet gebruikt worden, aangezien het substraat door metaalionen snel oxideert. Sluit de wells met een plaat deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (20-25 C). STAP 6. (STOP REACTIE) Breng de Stop Oplossing over in een reservoir. Voeg 100 µl van de Stop Oplossing toe aan iedere well met een multikanaalmicropipet. AFLEZEN Lees de absorptie van iedere well bij 450 nm. Indien een plaatlezer met dubbele golflengte beschikbaar is, wordt de test golflengte ingesteld op 450 nm en de referentie op 620 nm. *Het aflezen zo snel mogelijk na de stopreactie gebeuren. *Zorg voor het lezen dat de onderkant van de plaat proper en droog is, en dat er geen luchtbelletjes aanwezig zijn aan het oppervlak van de vloeistof in de wells. BEREKENING VAN HET RESULTAAT ( A450<Staal> - A450<Calibrator 1>) Unit waarde (U/ml) = x 100 (A450<Calibrator 2> - A450<Calibrator 1>) *A 450 is de afkorting van de absorptiewaarde bij 450 nm. *Internationaal referentiemateriaal voor anti-dsg1 antilichamen is niet beschikbaar. De assay is gecalibreerd in relatieve arbitraire untits. 26
29 Nederlands KWALITEITSCONTROLE Ieder assay resultaat moet aan de volgende criteria voldoen: A 450 of Calibrator 1: A 450 of Dsg1 Calibrator 2: Indien aan één van deze criteria niet voldaan is, zijn de resultaten niet correct en dient de test herhaald. Controleer het volgende voor het herhalen van de test: Incubatietemperatur Tijdspanne van de incubatie Wassen TEST INTERPRETATIE EN VERWACHTE WAARDE Het volgende dient enkel als leidraad bij de interpretatie. Ieder laboratorium wordt aangeraden zijn eigen criteria voor de testinterpretatie op te stellen, op basis van een proefpopulatie. Anti-Dsg1 waarde (U/ml) Interpretatie 20 Positief 20> - 14 Niet bepaald 14 > Negatief Bovenstaande waarde werd bepaald door analyse van 179 normale sera, 60 Pemphigus Foliaceus (PF) patiëntensera en sera van andere dan PF patiënten. Wanneer de interpreatie leidt tot Niet bepaald, is het aanbevolen de transitie van de ziekte van nader te bekijken. Dit reagens toont de antilichaamtiter als de testwaarde. Een verandering in antilichaamtiter wordt verondersteld de ziekte activiteit van de patient te reflecteren. De mogelijkheid bestaat echter dat een verandering in de antilichaamtiter niet duidelijk vastgesteld kan worden wanneer deze meer is dan 150 U/ml. De verandering in antilichaamtiter kan duidelijker vastgesteld worden door het staal te meten na een hogere verdunning (bvb. 1:2,020 verdunning). BEPERKINGEN Zoals bij andere diagnostische testprocedures, dient het resultaat bekomen met de MESACUP Desmogleïne TEST Dsg1 enkel als hulp bij de diagnose en dient deze niet aanschouwd te worden als een diagnostica op zich. UITVOERINGSKARAKTERISTIEKEN KLINISCHE SPECIFICITEIT EN KLINISCHE SENSITIITEIT Ziekte Positief Staal Positief percentage Pemphigus foliaceus (PF) 31/ % Pemphigus vulgaris (PV) 27/ % Bullous pemphigoid (BP) 0/45 0.0% Normal Serum 0/ % 27
30 Nederlands NAUWKEURIGHEID De herhaalbaarheid werd aangetoond door 3 stalen te testen in zesvoud. Reproduceerbaarheid werd bepaald door 3 stalen op 5 verschillende dagen (dag tot dag) te analyseren en door 3 stalen in 3 loten (lot na lot) te analyseren. %CV waarden voor reproduceerbaarheid en herhaalbaarheid waren onder 15% voor ieder staal. ASSAY RANGE De assay range van deze kit gaat van 5 U/ml tot 150 U/ml. Wanneer het assay resultaat groter is dan 150 U/ml, moet dit gerapporteerd worden als boven 150 U/ml. INTERFERENDE SUBSTANTIES Hemoglobine (tot 490 mg/dl), Bilirubine F (tot 18.2 mg/dl), Bilirubine C (tot 22 mg/dl), gal (tot 2800 units als Formazine) and/or Rheumafactor (tot 480 U/ml) hebben geen invloed op het assay resultaat. Vermijd het gebruik van sterk gehemolyseerde stalen of sterk lipemische stalen. REFERENTIES 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
31 Espaňol Espaňol USO DEL KIT El MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 es un test semi-cuantitativo de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) para la determinación de anticuerpos anti-desmoglein1 en suero humano. El MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 está indicado para el diagnóstico in vitro, como una ayuda en el diagnóstico diferencial de ciertos pénfigos. RESUMEN Y EXPLICACION La Desmogleina 1 (Dsg1) es una cadherina desmosomal del epitelio escamoso estratificado y es el antígeno diana de los anticuerpos en el pénfigo foliáceo (PF) [1,2]. El PF es una enfermedad autoimmune que afecta a la piel y que cursa con la aparición de vesículas flácidas y escamosas y con formación de erosiones cutáneas que histológicamente se ponen de manifiesto por la formación de vesículas intra epidermales serosas debido a la falta de adhesión de los queratinocitos. Los anticuerpos anti-dsg1 IgG se detectan en el suero de los pacientes con PF y juegan un papel patogénico en la formación de las vesículas. Anti-Dsg1 IgG se detecta también en el 60% de los pacientes con Pénfigo Vulgar (PV), otro tipo de pénfigo. Amagai et al., sintetizaron Dsg1 (rdsg1) usando un báculovirus como sistema de expresión [3]. La proteína rdsg1 fue diseñada como una proteína de secreción en la cual el dominio extracelular completo se corresponde con Dsg1. La rdsg1 es capaz de immunoadsorber autoanticuerpos patógenos del suero de pacientes con PF, previniendo la formación de ampollas en un modelo de pénfigo murino neonatal. Estos hallazgos indican que en rdsg1 se expresan gran parte, si no la totalidad, de los epítopos conformacionales del antígeno nativo y que son críticos en la patogénesis del pénfigo. Normalmente el diagnóstico recae en técnicas de inmunofluorescencia (IF) usando secciones de piel humana normal o esófago de mono. Sin embargo el uso de la inmunofluorescencia tiene algunas desventajas. (a) La IF requiere de personal técnico cualificado, al tiempo que la determinación que la determinación de la fluorescencia es subjetiva. (b) Anticuerpos frente a cualquier proteína de la superficie celular produce falsos positivos. (c) Los patrones de tinción similares hacen que sea muy difícil diferenciar entre PV y PF. Para resolver los problemas que presenta la IF, se ha desarrollado el ELISA usando rdsg1 como un ensayo sensible y específico para el diagnóstico del pénfigo [4]. El MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 está indicado en la determinación de autoanticuerpos anti-desmoglein1 IgG con gran sensibilidad. PRINCIPIO El MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 mide anticuerpos anti-dsg1 presentes en el suero humano por ELISA. Calibradores y suero de pacientes se depositan en micropocillos que están recubiertos con Dsg1, permitiendo a los anticuerpos reaccionar con el antígeno inmovilizado (incubación de la muestra).después de lavar para eliminar las proteínas del suero que no se han unido, se añade un anticuerpo anti-igg humano conjugado con peroxidasa y se deja incubar (incubación del conjugado). Después de otro paso de lavado, añadimos el sustrato del conjugado con peroxidasa y volvemos a incubar por un periodo de tiempo adicional (incubación del sustrato). Finalmente se añade una solución ácida a cada pocillo, para finalizar la reacción enzimática y estabilizar el desarrollo del color. El ensayo puede entonces cuantificarse midiendo la reacción espectrofotométricamente. PROTOCOLO BREVE DEL ENSAYO <Incubación de la muestra> Añadir 100 l de muestra diluida (1:101) a cada uno de los (20-25 C) 60 min. micropocillos. 29
32 Espaňol <Incubación del conjugado> (20-25 C) 60 min. <Incubación del sustrato> (20-25 C) 30 min. Lavar Añadir 100 l de solución de conjugado a cada pocillo. Lavar Añadir 100 l de substrato a cada pocillo. Añadir 100 l solución de parada a cada pocillo. Leer la densidad óptica. Interpretación de resultados REACTIVOS Y ALMACENAMIENTO 1) Dsg-1 TIRAS DE MICROPOCILLOS TIRAS DE MICROPOCILLOS (6 x 8 pocillos) recubiertos con antígeno Dsg1 recombinante purificada. Los micropocillos en tiras rompibles almacenados en el envoltorio y cerrados con desecante, son estables a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 2) Calibrador 1 (0 U/ml) Un vial conteniendo 1,5 ml de suero normal humano con diluyente de ensayo con 0,09% azida sódica. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 3) Dsg-1 Calibrador 2 (100 U/ml) Un vial conteniendo 1,5 ml de suero humano positivo con anti Dsg-1 y diluyente de ensayo con 0,09% azida sódica. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 4) Reactivo de Conjugado (101x) Un vial conteniendo 0,3 ml de anticuerpo monoclonal de ratón IgG anti-humano conjugado con peroxidasa de rábano concentrado 101x. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 5) Diluyente de conjugado Un vial con 24 ml de HEPES y seroalbúmina bovina. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 6) Diluyente de ensayo Un vial conteniendo 50 ml de tampón Tris, seroalbúmina bovina y 0,09% azida sódica. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 7) Solución de lavado concentrada (10x) Un vial conteniendo 100 ml de PBS y Tween 20 concentrado 10x. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 30
33 Espaňol 8) Sustrato Un vial conteniendo 20 ml de 3',5,5'-tetrametilbenzidina dihidrocloruro /peróxido de hidrógeno (TMB/ H 2 O 2 ). Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. 9) Solución de parada Un vial conteniendo 20 ml de 1,0 N ácido sulfúrico. Estable a 2-8 C hasta la fecha de caducidad. PRECAUCIONES (1) Este producto es para diagnóstico in vitro exclusivamente. (2) No usar sus componentes después de su fecha de caducidad. (3) Evitar el contacto con los ojos, piel y ropas. En caso de contacto con la piel, se ha de lavar exhaustivamente con agua. El TMB contiene irritantes y la Solución de Parada contiene 1N ácido sulfúrico que es venenoso y corrosivo. (4) Los Calibradores derivan de suero humano, en los que los antígenos HBs, anticuerpos de VHC y de VIH-1 y VIH-2 no se detectaron. No obstante ningún método de análisis puede garantizar su ausencia o la ausencia de otros agentes infecciosos. Por ello todas las muestras y reactivos han de manipularse como potencialmente infecciosas y transmisoras de SIDA, hepatitis u otras enfermedades infecciosas. (5) El Calibrador 1, Calibrador 2 y Diluyente de Ensayo contienen azida sódica (0,09%) como conservante y han de ser manipulados con precaución no ingerir o permitir el contacto con la piel o mucosas. La azida sódica puede reaccionar con las cañerías de cobre o plomo, formando azidas metálicas explosivas. Por ello cuando sean eliminados por el fregadero dejar correr abundante cantidad de agua. (6) Algunos componentes de kit son de origen animal, los cuales se consideran sanos. Estos componentes, no obstante, han de ser tratados como biopeligrosos y eliminados como tales en contenedores adecuados. (7) Solamente usar para los ensayos tiras de micropocillos, Conjugado y Calibrador 2 que tengan el mismo número de lote. No intercambiar componentes del kit por reactivos de otros kits o números de lote. (8) Dejar que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente (20-25 C) antes de comenzar el ensayo. (9) No exponer el kit a la luz solar directa durante el ensayo, o durante su almacenaje. (10) Evitar la contaminación microbiana cruzada de las muestras. (11) Incubación a temperaturas menores o superiores de la ambiental (20-25 C), prolonga o acorta los periodos de incubación, al tiempo que una dilución inadecuada puede dar lugar a resultados erróneos. (12) Los pocillos han de aclararse con Solución de Lavado de forma exhaustiva para evitar falsos positivos. (13) Pipetear con cuidado para no formar espuma y para evitar la contaminación cruzada entre los pocillos de la microplaca. (14) Todas las tiras de micropocillos, que no se vayan a usar inmediatamente, han de guardarse en el estuche con auto cierre, el cual ha de sellarse bien para evitar la formación de humedad. (15) La solución de lavado concentrada puede aparecer turbia a 2-8 C, lo cual no afecta a los resultados. (16) Los utensilios usados en el ensayo ha de ser tratados como sigue. Ponerlos en una solución de glutaraldehído al 2% concentración final por más de 1 hora, o en una solución de hipoclorito sódico al 0,5% (cloro disponible: aprox ppm) por más de 1 hora o en 31
34 Espaňol autoclave a 121 C por más de 20 minutos. (17) Los anticuerpos Dsg-1 obtenidos en este ensayo son sólo una ayuda al diagnóstico. Cada médico ha de interpretar los resultados a la luz de la historia clínica del paciente y de otros hallazgos clínicos relevantes, así como de la información procedente de otros sistemas de diagnóstico. MATERIALES REQUERIDOS PERO NO SUMINISTRADOS Lector de microplacas (longitud de onda: 450 nm, 620 nm/referencia) Micropipeta multicanal (Ej. 100 µl 300 µl). Pipeta nono canal (Ej. 10 µl & 100 µl). Reservorio para reactivos. Botella lavadora. Agua desionizada o destilada. Erlenmeyer graduado de un litro para la preparación de la solución de lavado. Tubos de ensayo para diluir las muestras de paciente (E.j µl) Puntas desechables de pipeta Papel secante o toallitas de papel Cuenco y desinfectante Tapa de microplaca PROTOCOLO DE ENSAYO PREPARACION DE REACTIVOS Llevar todos los reactivos y materiales a temperatura ambiente (20-25 C) antes de su uso. Tiras de micropocillos: Sacar el número de tiras necesario de la bolsa y ponerlas en el marco. Dejar nuevamente en su bolsa las tiras que no se usen y ponerlas en el frigorífico para su conservación. Solución de Lavado: La solución de lavado concentrada ha de diluirse antes de ser usada. Diluirlas a 1:10 añadiendo 100 ml de la concentrada y 900 ml de agua destilada. La solución de Lavado diluida es estable durante 2 semanas a 2-8 C. Solución de Conjugado: El reactivo de conjugado ha de diluirse antes de ser usada. Diluir el conjugado 1:101 con diluyente de Conjugado. La solución de conjugado diluida ha de usarse en el mismo día. Usar un reservorio desechable para evitar contaminaciones. No diluir el resto de los componentes del kit, que están listos para su uso. PREPARACION DE MUESTRAS Usar sueros frescos de pacientes. Si se requiere su almacenamiento durante un mes, éstos han de alicuotearse y congelados a temperatura de -20 C, y temperatura de -70 C para periodos más largos. No repetir ciclos de congelado y descongelado *En caso de almacenamiento a -20 C por más de 6 meses o congelación descongelación repetida, pueden aparecer resultados inespecíficos, debido a la desnaturalización de las IgG. Diluir los sueros de pacientes 1:101 añadiendo a 10 µl de suero tampón de ensayo hasta completar 1 ml con diluyente de ensayo *Las muestras diluidas se pueden almacenar hasta 3 días en nevera. * Las muestras diluidas se pueden usar también para ser ensayadas en MESACUP Desmoglein TEST Dsg 3. 32
35 Espaňol PROCEDIMIENTO DE ENSAYO PASO 1. (INCUBACIÓN DE LA MUESTRA) Usando la micropipeta multicanal, transfiera 100 µl del Calibrador 1, Dsg-1 Calibrador 2 y cada una de las muestras diluidas a los pocillos correspondientes en la microplaca recubiertos con el antígeno. (No diluya los Calibradores.) * La incubación comienza con el pipeteo de la muestras en la placa recubierta con el antígeno. Por esta razón este pipeteo ha de ser rápido y limpio. Cubrir los pocillos con film sellador e incubar a temperatura ambiente (20-25 C) por 60 minutos. PASO 2. (LAVADO) Aspirar o descartar el contenido de los pocillos. Llenar los pocillos con solución de lavado y seguidamente aspirar o descartar el contenido. Lavar 4 veces. Golpear la placa sobre una toalla de papel para eliminar los restos de líquido. Cuando se usa lavador automático, repetir el ciclo de lavado 4 veces. *Se recomienda que cada laboratorio establezca el número óptimo de lavado y otras condiciones * La solución de lavado ha de usarse a C. PASO 3. (INCUBACIÓN DE CONJUGADO) Poner la solución de conjugado en un reservorio. Añadir 100 µl de la solución de trabajo Conjugada a cada pocillo usando una micropipeta multicanal. Cubrir los pocillos con film sellador e incubar a temperatura ambiente (20-25 C) durante 60 minutos. PASO 4. (LAVADO) Lavar la microplaca como se hizo en el paso 2. PASO 5. (INCUBACION DEL SUSTRATO) Colocar el sustrato en un reservorio. Añadir 100 µl del sustrato a cada uno de los pocillos usando una micropipeta multicanal. *El reservorio ha de ser diferente del que se usó anteriormente para poner el conjugado. Esto es importante, ya que el sustrato es rápidamente oxidado por los iones metálicos Cubrir los pocillos con film sellador e incubar a temperatura ambiente (20-25 C) durante 30 minutos. PASO 6. (PARADA DE LA REACCION) Colocar la solución de parada en un reservorio. Añadir 100 µl de la solución de parada a cada uno de los pocillos usando una micropipeta multicanal. LECTURA Leer la absorbancia de cada pocillo a 450 nm. En caso de usar un lector de doble haz, la lectura se efectúa a 450 nm, con haz de referencia de 620 nm. *La lectura ha de realizarse lo antes posible una vez parada la reacción. *Asegurarse de que el fondo de la placa está limpio y seco, y que no hay burbujas de aire en la superficie del líquido en el momento de efectuar la lectura de la microplaca. CALCULO DE LOS RESULTADOS ( A 450 <Muestra> - A 450 <Calibrador 1>) Unidades (U/ml) = x 100 (A 450 < Calibrador 2> - A 450 < Calibrador r 1>) *A450 es la abreviatura de la absorbancia a 450 nm. *Un material de referencia internacional para anticuerpos anti Dsg-1 no existe, por ello el ensayo está calibrado en unidades arbitrarias. 33
36 Espaňol CONTROL DE CALIDAD Cada resultado debe cumplir los siguientes criterios. A 450 de Calibrador1: A 450 de Dsg1 Calibrador2: Si alguno de estos no se cumple, los resultados son inválidos y han de repetirse. Antes de repetir el ensayo, comprobar los siguientes puntos. Temperatura de incubación Tiempo de incubación Lavado INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Y VALORES ESPERADOS Lo que a continuación se muestra es sólo una guía de interpretación. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios criterios de interpretación del test, basándose en la población de las muestras que se encuentran usualmente. Anti-Dsg1 valor (U/ml) Interpretación 20 Positivo 20> - 14 Indeterminado 14 > Negativo Los valores anteriores fueron establecidos ensayando 179 sueros normales, 60 sueros de pacientes con Pénfigo Foliáceo (PF) y sueros de pacientes con otras patologías que no eran PF. Cuando se interpreta como Indeterminado, se recomienda un seguimiento especial de la evolución de la enfermedad. Los reactivos muestran el título del anticuerpo como un valor del ensayo. Una transición en el título del anticuerpo, puede reflejar una actividad en la enfermedad del paciente, pero es posible que este cambio en el título del anticuerpo no se ponga de manifiesto de una forma clara cuando el valor de la concentración del anticuerpo sea superior a 150U/ml. En este caso el cambio del título de anticuerpo puede ponerse de manifiesto midiendo esta muestra a una dilución mucho mayor (Ej.1: 2,020 diluciones). LIMITACIONES Al igual que con otros test de diagnóstico, los resultados obtenidos con MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 TEST sirven sólo como una ayuda al diagnóstico y no deben se interpretados como un diagnóstico en sí mismo. PRESTACIONES CARACTERISTICAS ESPECIFICIDAD CLINICA Y SENSIBILIDAD CLINICA Enfermedad Muestra positiva Tasa positiva Pénfigo Foliáceo (PF) 31/ % Pénfigo vulgar(pv) 27/ % Bolo penfigoide (BP) 0/45 0.0% Suero Normal 0/ % 34
37 Espaňol PRECISION La Repetibilidad fue demostrada ensayando 3 muestra en sextuplicado. La reproducibilidad se determinó midiendo 3 muestras en 5 días diferentes (día-día) y probando 3 muestras en 3 lotes (lote-lote-lote). El del % CV para reproducibilidad y repetibilidad fue inferior a 15% para cada muestra. RANGO DE ENSAYO El rango de ensayo para el kit es de 5 U/ml a 150 U/ml. Cuando el ensayo excede de 150 U/ml debe ser indicado como superior a 150 U/ml. INTERFERENCIAS CON OTRAS SUSTANCIAS Hemoglobina (hasta 490 mg/dl), Bilirrubina F (hasta 18.2 mg/dl), Bilirrubina C (hasta 22 mg/dl), quelantes (hasta 2800 unidades como Formacina) y/o Factor Reumatoide (hasta 480 IU/ml) no afectan al ensayo, pero evitar las muestras hemolizadas y las hiperlipémicas. REFERENCIAS 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
38 Italiano Italiano USO PREVISTO MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 è un test immunoenzimatico (ELISA) per il rilevamento ed il dosaggio semi-quantitativo di anticorpi anti-desmogleina 1 nel siero umano. MESACUP Desmoglein TEST Dsg 1 è previsto per uso diagnostico in vitro come supporto nella diagnostica differenziale di alcune patologie bollose (Pemfigo). RIASSUNTO E SPIEGAZIONE Desmogleina 1 (Dsg1) è una caderina desmosomiale che viene espressa negli epiteli squamosi stratificati ed è l antigene bersaglio nel Pemfigo foliaceo, PF [1,2]. PF è una patologia autoimmune bollosa della pelle, caratterizzata clinicamente da piccole bolle ed erosioni con croste ed istologicamente dalla formazione a livello intraepidermale di bolle dovute alla perdita di adesione cellula-cellula dei cheratinociti. Autoanticorpi IgG anti-dsg1 sono trovati nel siero di pazienti con PF e rivestono un ruolo patogeno nella formazione delle bolle nel PF. Inoltre anti-dsg1 IgG sono trovate in circa il 60% dei pazienti con Pemfigo volgare (PV), un altro tipo di patologia bollosa. Amagai et al. hanno prodotto un antigene ricombinante che rappresenta Dsg1 umana (rdsg1) usando un sistema di espressione in baculovirus [3]. rdsg1 così ricavato consiste nell intero domain extracellulare di Dsg1. rdsg1 è capace di immunoassorbire gli autoanticorpi patogenici presenti nel siero di pazienti affetti da PF, prevenendo la formazione di bolle in un modello sperimentale animale (topo neonato) di Pemfigo. Queste evidenze indicano che rdsg1 esprime gran parte se non la totalità, degli epitopi conformazionali degli antigeni nativi implicati nella patogenesi del Pemfigo. Attualmente la diagnosi del Pemfigo è largamente basata su test in immunofluorescenza (IF) che utilizzano sezioni di cute umana o di esofago di scimmia. Peraltro la diagnosi per immunofluorescenza presenta diversi svantaggi: IF richiede esperienza tecnica ed una determinazione soggettiva del titolo anticorpale. Anticorpi contro proteine della superficie cellulare provocano dei falsi positivi. Patterns di colorazione simili in IF rendono difficile distinguere tra PV e PF. Per superare i problemi posti da IF, è stato sviluppato un test ELISA che impiega rdsg1, come sensibile e specifico test nella diagnosi del Pemfigo [4]. MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 è il test per misurare con alta sensibilità autoanticorpi anti-desmogleina 1 IgG. PRINCIPIO MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 misura gli anticorpi anti-dsg1 presenti nel siero umano attraverso un ELISA. I Calibratori ed i sieri dei pazienti sono aggiunti ai pozzetti sensibilizzati con Dsg1, permettendo agli anticorpi anti-dsg1 di reagire con l antigene immobilizzato (Incubazione del Campione). Dopo i lavaggi per rimuovere proteine sieriche non legate, viene aggiunto un anticorpo monoclonale anti IgG umane coniugato con horseradish perossidasi e si procede a nuova incubazione (Incubazione del Coniugato). Dopo ulteriori lavaggi viene aggiunto il substrato per l enzima perossidasi ed incubato ulteriormente (Incubazione del Substrato). Una soluzione acida è quindi aggiunta ad ogni pozzetto per stoppare la reazione enzimatica e stabilizzare lo sviluppo del colore. Il test può fornire dati quantitativi misurando la reazione fotometrica. BREVE DESCRIZIONE DEL METODO <Incubazione del Campione> Aggiungere 100 l di campione diluito (1:101) ad ogni (20-25 C) 60 min. pozzetto della piastra microtiter. 36
39 Italiano <Incubazione del Coniugato> (20-25 C) 60 min. <Incubazione del Substrato> (20-25 C) 30 min. Lavare Aggiungere100 l di Coniugato ad ogni pozzetto. Lavare Aggiungere 100 l di Substrato ad ogni pozzetto. Aggiungere 100 l di Sol. bloccante ad ogni pozzetto. Leggere l assorbanza Interpretare il risultato REAGENTI E LORO CONSERVAZIONE 1) Dsg-1 Strips di pozzetti microtiter 48 Pozzetti di piastre microtiter in Strips (6 x 8 pozzetti) coatati con antigene Dsg-1 ricombinante purificato. Le strips frazionabili, contenute in un apposito alloggio e confezionate in busta di alluminio con materiale dessiccante, sono stabili a 2-8 C. Le strips mantengono la loro stabilità per 60 giorni se conservate a 2-8 C una volta aperta e correttamente richiusa la busta. 2) Calibratore 1 (0 U/ml) Un flacone contenente 1.5 ml di siero umano normale con Diluente del test contenente sodiazide 0.09%. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 3) Dsg-1 Calibratore 2 (100 U/ml) Un flacone contenente 1.5 ml di siero umano positivo per gli anticorpi anti Dsg-1 con Diluente del test contenente sodiazide 0.09%. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 4) Coniugato (101x) Un flacone contenente 0.3 ml di anticorpo di topo monoclonale anti IgG umane coniugato con horseradish perossidasi, concentrato 101x. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 5) Diluente del Coniugato Un flacone contenente 24 ml di HEPES e albumina da siero bovino. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 6) Diluente del Test Un flacone contenente 50 ml di tampone Tris, albumina da siero bovino e 0.09% sodioazide. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 37
40 Italiano 7) Soluzione concentrata di Lavaggio (10x) Un flacone contenente 100 ml di PBS e Tween 20, concentrato 10x. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 8) Substrato Un flacone contenente 20 ml of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine dihydrochloride /hydrogen peroxide (TMB/ H 2 O 2 ). Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. 9) Soluzione bloccante Un flacone contenente 20 ml di 1.0N acido solforico. Stabile a 2-8 C fino alla data di scadenza indicata. PRECAUZIONI PER L USO (1) Questo prodotto è per solo uso diagnostico in vitro. (2) Non usare i componenti del kit oltre la data di scadenza riportata per ognuno. (3) Evitare il contatto dei reagenti con gli occhi, la pelle e gli indumenti. Se i reagenti vengono a contatto con la pelle, lavare immediatamente con acqua in abbondanza. TMB contiene sostanze irritanti e la Soluzione bloccante è composta da acido solforico 1N, velenoso e corrosivo. (4) I Calibratori derivano da siero umano negativo per l antigene HBs, gli anticorpi HIV (HIV-1 ed HIV-2) e gli anticorpi anti HCV. Peraltro nessun test può garantire in maniera certa l assenza di questi od altri agenti infettivi, dunque i reagenti e tutti i campioni dei pazienti devono essere trattati come potenzialmente capaci di trasmettere malattie infettive note (AIDS, HCV etc) o sconosciute. (5) Calibratore 1, Calibratore 2 e Diluente del test contengono come conservante, 0.09% sodio azide, dunque essi devono essere maneggiati con cura (non ingerire o far venire a contatto con mucose o pelle). La sodioazide può reagire con rame o piombo per formare azidi metalliche esplosive. Quindi, diluire con abbondante acqua prima di smaltire. (6) Alcune componenti dei kits contengono materiali di origine animale, derivanti da animali non infetti. Queste componenti dovrebbero essere trattate come pericolose per la salute sia al momento dell uso che a quello dello smaltimento. (7) Per effettuare il test devono essere usati componenti (Strips di pozzetti, Coniugato e Calibratore 2) contrassegnati dallo stesso numero di lotto. Non sostituire singoli reagenti con reagenti provenienti da altri kits. (8) Tutti i reagenti devono essere portati a temperatura ambiente (20-25 C) prima di iniziare il test. (9) Non esporre il kit alla diretta luce del sole durante l esecuzione del test e la conservazione. (10) Evitare inquinamento batterico e cross contaminazione dei reagenti o dei campioni. (11) Tempi di incubazione al di sopra o al di sotto della temperatura ambiente (20-25 C), periodi di incubazione più brevi o lunghi e non precise diluizioni possono dare comportare errori nei risultati. (12) I pozzetti devono essere lavati con Soluzione di Lavaggio accuratamente per evitare false positività. (13) Pipettare accuratamente senza provocare schiuma ogni campione e reagente per evitare cross contaminazione da pozzetto a pozzetto. (14) Se non immediatamente richiesto, tutte le strips devono essere riposte nella busta ed accuratamente sigillate per evitare assorbimento di umidità. (15) La Soluzione concentrata di Lavaggio può divenire torbida a 2-8 C, ma questo non causa danni al test. (16) Materiali impiegati per il test devono essere trattati come segue: 38
41 Italiano Bagnare in soluzione 2% Glutaraldeide per più di 1 ora o in soluzione 0.5% Sodio Ipoclorito per più di 1 ora o autoclavare a 121 C per più di 20 minuti. (17) Il valore di anticorpi anti Dsg-1 ottenuto da questo test è solo un aiuto per la diagnosi. Ogni medico deve interpretare i risultati alla luce della storia clinica del paziente, delle osservazioni e di ogni altra indagine diagnostica. MATERIALI RICHIESTI MA NON FORNITI Lettore di micropiastre (lunghezza d onda : 450 nm, 620 nm/riferimento) Micropipetta multicanale (p.e. 100 l 300 l) Micropipetta a singolo canale (p.e. 10 l & 100 l) Flaconi per reagenti Lavatore automatico o bottiglia per lavaggio Acqua deionizzata o distillata Cilindri graduati da 1 litro per la preparazione della Soluzione di Lavaggio Provette per la diluizione dei campioni dei pazienti (p.e l) Puntali usa e getta per la micropipette Carta Catinella e disinfettante Coperchio per piastra microtiter PROCEDURA PREPARAZIONE DEI REAGENTI Prima dell uso portare tutti i materiali necessari al test a temperatura ambiente (20-25 C). Strips di micropozzetti: Rimuovere i pozzetti richiesti e piazzarli in apposito alloggio. Riporre prontamente nella busta le strips non richieste per la corretta conservazione refrigerata. Soluzione di Lavaggio: La Soluzione concentrata deve essere diluita prima dell uso 1:10 aggiungendo 100 ml di Soluzione concentrata a 900 ml di acqua distillata. La Soluzione diluita è stabile per 2 settimane a 2-8 C. Coniugato: Il Coniugato deve essere diluito prima dell uso, 1:101, con Diluente del Coniugato. La soluzione di Coniugato diluito deve essere usata entro un giorno. Usare un contenitore usa e getta per evitare contaminazioni. Non diluire gli altri componenti del kit che sono pronti all uso. PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Usare sieri freschi di paziente. Se vi è necessità di conservazione, i sieri possono essere aliquotati e conservati congelati a 20 C fino ad un mese, a 70 C per più lunghi periodi. Non ripetere congelamenti e scongelamenti. *In caso di conservazione a 20 C per più di 6 mesi o ripetuti congelamenti e scongelamenti, risultati non specifici possono essere ottenuti in conseguenza di denaturazione delle IgG. Diluire ogni siero di paziente 1: 101 aggiungendo 10 l di siero a 1 ml Diluente del Test. *I campioni diluiti devono essere usati entro il terzo giorno se conservati a 4 C. *I campioni diluiti possono essere direttamente impiegati per MESACUP Desmoglein TEST Dsg 3. 39
42 Italiano PROCEDURA DEL TEST FASE 1. (INCUBAZIONE DEL CAMPIONE) Usando la micropipetta multicanale, trasferire 100 µl di Calibratore 1, Dsg-1 Calibratore 2 e di ognuno dei campioni diluiti negli appropriati pozzetti della piastra da microtitolo per il test dell'antigene. (Non diluire i Calibratori.) * L incubazione inizia quando il campione viene pipettato nel pozzetto. L operazione deve essere completata nel più breve tempo possibile. Coprire i pozzetti con un coperchio adesivo ed incubare a temperatura ambiente (20-25 C) per 60 minuti. FASE 2. (LAVAGGIO) Aspirare o scartare il contenuto dei pozzetti. Riempire ogni pozzetto con Soluzione di Lavaggio, quindi aspirare completamente o scartare il contenuto. Ripetere questa operazione di lavaggio 4 volte. Sbattere la micropiastra su un pezzo di carta per rimuovere ogni residuo di Soluzione di Lavaggio. Quando viene usato un lavatore automatico, lavare 4 volte. * Si raccomanda di stabilire per ogni laboratorio gli appropriati tempi di lavaggio e le altre condizioni. * La Soluzione di Lavaggio deve essere usata a C. FASE 3. (INCUBAZIONE DEL CONIUGATO) Versare la Soluzione di Coniugato in un flacone. Aggiungere 100 l del Coniugato ad ogni pozzetto con micropipetta multicanale. Coprire i pozzetti con un coperchio sigillante ed incubare a temperatura ambiente (20-25 C) per 60 minuti. FASE 4. (LAVAGGIO) Lavare la micorpiastra come nella Fase 2 precedentemente descritta. FASE 5. (INCUBAZIONE DEL SUBSTRATO) Versare il Substrato in un flacone. Aggiungere 100 l del Substrato ad ogni pozzetto con micropipetta multicanale. *Questo flacone deve essere diverso da quello usato per la Soluzione di Coniugato. Un nuovo flacone usa e getta deve essere usato, dato che il substrato tende facilmente ad essere ossidato da ioni metallo. Coprire i pozzetti con un coperchio adesivo ed incubare a temperatura ambiente (20-25 C) per 30 minuti. FASE 6. (REAZIONE BLOCCANTE) Versare Soluzione Bloccante in un flacone. Aggiungere 100 l della soluzione ad ogni pozzetto con una micropipetta multicanale. LETTURA Leggere l assorbanza di ogni pozzetto a 450 nm. Se è disponibile un lettore di micropiastre a doppia lunghezza d onda, regolare la lunghezza d onda per il test a 450 nm ed il riferimento a 620 nm. *La lettura deve essere fatta prima possibile una volta bloccata la reazione. *Prima della lettura della micropiastra, assicurarsi che il fondo della stessa sia pulito ed asciutto, e che non siano presenti sulla superficie del liquido contenuto nei pozzetti bolle d aria. CALCOLO DEI RISULTATI A 450 <Campione>- A 450 <Calibratore1> 40
43 Italiano Valore del Test (U/ml) = x 100 A 450 <Calibratore 2> - A 450 <Calibratore 1> *A450 significa valore di assorbanza a 450 nm. *Non essendo disponibile un materiale di riferimento internazionale per anticorpi anti Dsg-1, il dosaggio è espresso in Unità relative arbitrarie. CONTROLLO DI QUALITA I risultati di ogni dosaggio dovranno rispondere ai seguenti criteri. A 450 del Calibratore 1: A 450 del Dsg1 Calibratore 2: Se ognuno di questi dati non è rispettato, i risultati non sono validi ed il dosaggio deve essere ripetuto. Prima della ripetizione del dosaggio, verificare i seguenti parametri. Temperatura di Incubazione Tempi di Incubazione Lavaggi INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI E VALORI ATTESI Questa che segue deve essere intesa solo come una guida all interpretazione. Si raccomanda che ogni laboratorio stabilisca per l interpretazione del dosaggio un suo proprio criterio basato su un campione di popolazione normalmente analizzato. Anti-Dsg1 valore (U/ml) Interpretazione 20 Positivo <20-14 Indeterminato <14 Negativo I valori sopra riportati sono stati ricavati dal dosaggio su 179 sieri normali, 60 sieri di pazienti con Pemfigo Foliaceo (PF) e di pazienti con patologie diverse da PF. Quando l interpretazione è riportata come Indeterminato, si raccomanda una più stretta attenzione alla fase della malattia. Questo reagente mostra il titolo anticorpale come valore del dosaggio. Un cambiamento del titolo anticorpale è considerato riflettere l attività della malattia del paziente, ma vi è la possibilità che la variazione di titolo anticorpale non sia chiaramente collegata quando l valore anticorpale è maggiore di 150 U/ml. La variazione di titolo anticorpale può essere più chiaramente afferrato misurando il campione a diluizione iniziale più alta (esempio.1: 2,020). LIMITAZIONI Come vale per ogni altro test diagnostico, i risultati ottenuti con MESACUP Desmoglein TEST Dsg1 servono solo come aiuto diagnostico e non dovrebbero essere interpretati come un dato diagnostico di per sé. PRESTAZIONI DEL METODO SPECIFICITA E SENSIBILITA CLINICHE 41
44 Italiano Malattie Campioni Positivi Positività Pemfigo foliaceo (PF) 31/ % Pemfigo vulgaris (PV) 27/ % Pemfigoide Bolloso (BP) 0/45 0.0% Siero Normale 0/ % PRECISIONE La ripetibilità è stata dimostrata analizzando 3 campioni in sestuplo. La riproducibilità è stata determinata analizzando 3 campioni in 5 giorni diversi (day to day) ed analizzando 3 campioni con 3 lotti (lot to lot). I valori di CV in percentuale per riproducibilità e ripetibilità sono stati inferiori al 15% per ogni campione. VARIAZIONE DEL DOSAGGIO La variazione del dosaggio di questo kit è da 5 U/ml a 150 U/ml Quando il dosaggio risulta superiore a 150 U/ml deve essere riportato over 150 U/ml. SOSTANZE INTERFERENTI Emoglobina (superiore a 490 mg/dl), Bilirubina F (superiore a 18.2 mg/dl), Bilirubina C (superiore a 22 mg/dl), chilo (superiore a 2800 unit come Formazina) e/o fattore Reumatoide (superiore a 480 IU/ml) non influenzano il risultato del dosaggio, ma deve essere evitato l uso di campioni altamente emolizzati o campioni altamente lipemici. BIBLIOGRAFIA 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
45 Portugues Português 43
46 Ελληνικά Ελληνικά ΕΝΔΕΔΕΙΓΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ To MESACUP TEST Δεσμογλεΐνης Dsg 1 είναι μια ημι-ποσοτική ενζυματική ανοσοδεσμευτική μέθοδος ανάλυσης (ELISA) για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά Δεσμογλεΐνης 1 στον ανθρώπινο ορό. Το MESACUP TEST Δεσμογλεΐνης Dsg 1 προορίζεται για εργαστηριακή χρήση στην διαφορική διάγνωση ορισμένων νόσων του πέμφυγγος. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Η Δεσμογλεΐνη 1 (Dsg1) είναι μια δεσμοσωματική καδερίνη που εκφράζεται στο πολύστοιβο πλακώδες επιθήλιο και στο αντιγόνο- στόχο, στον φυλλώδη πέμφυγγα (PF) [1,2]. Ο φυλλώδης πέμφυγξ είναι μια αυτοάνοσος φλυκταινώδης νόσος του δέρματος, η οποία κλινικά χαρακτηρίζεται από άτονες φλύκταινες και φολιδωτές με κρούστα εξελκώσεις. Ιστολογικά, οι αλλοιώσεις του PF εμφανίζουν ενδοεπιδερμικό σχηματισμό φλυκταινών εξ αιτίας κυτταρικής πρόσφυσης των κερατινοκυττάρων. Αυτοαντισώματα IgG κατά της Dsg1 ανιχνεύονται σε ορούς ασθενών με φυλλώδη πέμφυγγα (PF) και ευθύνονται για την παθογένεση του σχηματισμού φλυκταινών στο φυλλώδη πέμφυγγα (PF). Αντισώματα IgG κατά Dsg 1 ανιχνεύονται επίσης σε περίπου 60% των ασθενών με κοινή πέμφυγγα (PV) έναν άλλο τύπο πέμφυγγος. Οι Amagai και συνεργάτες, έχουν παρασκευάσει μια ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Dsg1(rDsg1) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα έκφρασης βακιλοϊού [3]. Η rdsg1 έχει σχεδιαστεί ως εκκρινόμενη πρωτεΐνη αποτελούμενη από ολόκληρη την εξωκυττάρια περιοχή Dsg1. Η rdsg1 είναι ικανή για ανοσοαπορρόφηση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων στον ορό των ασθενών με PF, αποτρέποντας έτσι, τον σχηματισμό φλυκταινών σε μοντέλο πέμφυγγα νεογέννητων ποντικών. Αυτά τα ευρήματα καταδεικνύουν ότι η rdsg1 εκφράζει τους περισσότερους αν όχι όλους, τους επίτοπους των φυσικών αντιγόνων, οι οποίοι είναι κρίσιμοι για την παθογένεση του πέμφυγγος. Τελευταία, η διάγνωση του πέμφυγγος, κατά κύριο λόγο, στηρίζεται στην εξέταση του ανοσοφθορισμού με τη χρήση τομών φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος ή οισοφάγου πιθήκου. Ωστόσο, υπάρχουν αρκετά μειονεκτήματα στην τρέχουσα μέθοδο ανοσοφθορισμού: (α) Απαιτεί έναν έμπειρο τεχνικό και γίνεται με υποκειμενικό προσδιορισμό του τίτλου αντισωμάτων. (β) Τα αντισώματα έναντι οποιασδήποτε πρωτείνης της κυτταρικής επιφάνειας, δημιουργούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. (γ)ο παρόμοιος τύπος φθορισμού καθιστά δύσκολη την διάκριση μεταξύ κοινού πέμφυγγος (PV) και φυλλώδους πέμφυγγος (PF). Προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα ανωτέρω προβλήματα αναπτύχθηκε η ELISA χρησιμοποιώντας rdsg1, ως μια ευαίσθητη και ειδική ανάλυση για την διάγνωση του πέμφυγγος [4]. Το MESACUP TEST Δεσμογλεΐνης Dsg 1 είναι ένα αντιδραστήριο για την μέτρηση IgG, αυτοαντισωμάτων κατά Δεσμογλεΐνης 1 με μεγάλη ευαισθησία. ΑΡΧΗ Το MESACUP TEST Δεσμογλεΐνης Dsg1 μετρά τα παρόντα στον ορό αντισώματα με ELISA. Τα αντιδραστήρια βαθμονόμησης και οι οροί ασθενών προστίθενται στα μικροβυθίσματα με επίστρωση Dsg1, επιτρέποντας τα αντισώματα κατά Dsg1 να αντιδράσουν με το ακινητοποιημένο αντιγόνο (Επώαση αντιγόνου). Μετά την έκπλυση των μη συνδεδεμένων πρωτεϊνών ορού, προστίθεται σύζευγμα μονοκλωνικού αντισώματος αντιανθρώπινης IgG με υπεροξειδάση και επωάζεται (Επώαση συζεύγματος). Μετά από άλλο ένα στάδιο πλύσης, προστίθεται το υπόστρωμα υπεροξειδάσης και ακολουθεί επώαση για ένα επί πλέον χρονικό διάστημα.(επώαση υποστρώματος). Κατόπιν προστίθεται το διάλυμα οξέος σε κάθε βύθισμα για να σταματήσει η αντίδραση του ενζύμου και να σταθεροποιηθεί η χρώση. Η ανάλυση μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με φωτομέτρηση. 44
47 Ελληνικά ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ <Επώαση δείγματος > Πρόσθεση 100 l αραιωμένου δείγματος (1:101) σε κάθε βύθισμα της (20-25 C ) 60 λεπτά μικροπλάκας. Πλύση <Επώαση συζεύγματος > Πρόσθεση 100 l διαλύματος συζεύγματος σε κάθε βύθισμα (20-25 C) 60 λεπτά. Πλύση <Επώαση υποστρώματος > Πρόσθεση 100 l υποστρώματος σε κάθε βύθισμα. (20-25 C) 30 λεπτά. Πρόσθεση 100 l διαλύματος διακοπής σε κάθε βύθισμα. Ανάγνωση απορρόφησης Ερμηνεία του αποτελέσματος ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ 1) Dsg-1 ΤΑΝΙΕΣ ΒΥΘΙΣΜΑΤΩΝ 48 Ταινίες βυθισμάτων μικροπλάκας (6 x 8 βυθίσματα) με επίστρωση κεκαθαρμένου ανασυνδυασμένου αντιγόνου Dsg-1, οι αποσπώμενες ταινίες των 8 βυθισμάτων τοποθετημένες σε ειδικό πλαίσιο και σφραγισμένες σε φάκελο αλουμινίου με ξηραντικό, παραμένουν σταθερές σε 2-8 C. Οι αχρησιμοποίητες ταινίες παραμένουν σταθερές, εφ όσον αποθηκευτούν σε 2-8 C στον κατάλληλα επανασφραγιζόμενο φάκελο, επί 60 ημέρες. 2) Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 1 (0 U/ml) Ένα φιαλίδιο περιέχον 1.5 ml φυσιολογικού ανθρώπινου ορού με Διαλύτη Ανάλυσης, το οποίο περιέχει και 0.09% νατραζίδιο. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 3) Dsg-1 Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 2 (100 U/ml) Ένα φιαλίδιο περιέχον 1.5 ml θετικό ανθρώπινο ορό ελέγχου για αντισώματα κατά Dsg-1 με Διαλύτη Ανάλυσης, το οποίο περιέχει και 0.09% νατραζίδιο. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 4) Αντιδραστήριο Συζεύγματος (101x) Ένα φιαλίδιο περιέχον 0.3 ml σύζευγμα μονοκλωνικού αντισώματος αντιανθρώπινης IgG ποντικού με υπεροξειδάση συμπυκνωμένο x 101. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης.. 45
48 Ελληνικά 5) Διαλύτης Συζεύγματος Ένα φιαλίδιο περιέχον 24 ml HEPES και αλβουμίνη ορού βοός. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 6) Διαλύτης Ανάλυσης Ένα φιαλίδιο περιέχον 50 ml Tris buffer, βόειο ορό και 0.09% νατραζίδιο. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 7) Συμπυκνωμένο Πλυστικό (10x) Ένα φιαλίδιο περιέχον 100 ml of PBS και Tween 20 συμπυκνωμένο x 10. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 8) Υπόστρωμα Ένα φιαλίδιο περιέχον 20 ml of 3,3',5,5'-τετραμεθυλοβενζιδίνη διυδροχλωρική/ υπεροξείδιο υδρογόνου (TMB/ H 2 O 2 ). Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. 9) Διάλυμα διακοπής Αντίδρασης Ένα φιαλίδιο περιέχον 20 ml 1.0N θειικού οξέος. Σταθερό σε 2-8 C έως την αναγραφόμενη ημ/ νία λήξης. ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ (1) Αυτό το προϊόν προορίζεται μόνο για εργαστηριακή χρήση. (2) Μην χρησιμοποιείτε τα συστατικά του διαγνωστικού συνόλου πέρα από την αναγραφομένη ημερομηνία λήξης. (3) Αποφύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων με τα μάτια, το δέρμα και τα ρούχα. Τα αντιδραστήρια όταν έρχονται σε επαφή με το δέρμα πρέπει να πλένονται με άφθονο νερό. Το TMB περιέχει ερεθιστική ουσία και το Διάλυμα Διακοπής της αντίδρασης αποτελείται από 1N θειικού οξέος, το οποίο είναι δηλητήριο και διαβρωτικό. (4) Τα αντιδραστήρια παρασκευάζονται από τον ανθρώπινο ορό, στον οποίο δεν έχουν ανιχνευτεί αντιγόνα HBs, αντισώματα HCV και αντισώματα HIV1, HIV2. Καμία μέθοδος, όμως δεν μπορεί να εγγυηθεί την απουσία αυτών ή κάποιων άλλων μολυσματικών παραγόντων. Συνιστάται ο χειρισμός όλων των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων των ασθενών να είναι τέτοιος, ως εάν να ήταν δυνατόν να μεταδώσουν AIDS, ηπατίτιδα ή άλλες μολυσματικές νόσους. (5) Το αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 1, αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 2 και ο Διαλύτης Ανάλυσης περιέχουν νατραζίδιο ως (0.09%) ως συντηρητικό και πρέπει να χειρίζονται με προσοχή. Να μην απορροφηθεί ή να μην έρθει σε επαφή με το δέρμα ή βλεννώδεις μεμβράνες. Το νατραζίδιο μπορεί να αντιδράσει με τον χαλκό ή τον μόλυβδο του αποχετευτικού συστήματος και να δημιουργήσει εκρηκτικά μεταλλικά αζίδια. Ως εκ τούτου, κατά την απόρριψη υλικών με νατραζίδιο στην αποχέτευση ρίχνετε άφθονο νερό. (6) Κάποια συστατικά του συνόλου αντιδραστηρίων περιέχουν υλικά ζωικής προέλευσης τα οποία προέρχονται από μη μολυσμένα ζώα. Εντούτοις αυτά τα συστατικά πρέπει να χειρίζονται ως πιθανώς μολυσματικά κατά τη χρήση και κατά την απόρριψή τους. (7) Το Σύζευγμα, το Αντιδραστήριο βαθμονόμησης 2, και οι ταινίες βυθισμάτων πρέπει να προέρχονται από την ίδια παρτίδα παραγωγής. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλα διαγνωστικά σύνολα. (8) Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αφήνονται να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) πριν την έναρξη της ανάλυσης. 46
49 Ελληνικά (9) Μην αφήστε το διαγνωστικό σύνολο σε απ ευθείας έκθεση στον ήλιο κατά την ανάλυση και την αποθήκευση. (10) Αποφύγετε την μικροβιακή επιμόλυνση των αντιδραστηρίων ή των δειγμάτων. (11) Η επώαση σε θερμοκρασία μεγαλύτερη ή μικρότερη της θερμοκρασίας δωματίου (20-25 C), για μεγαλύτερα ή μικρότερα χρονικά διαστήματα καθώς και λανθασμένη αραίωση μπορεί να δώσουν λανθασμένα αποτελέσματα. (12) Τα βυθίσματα πρέπει να ξεπλένονται καλά με Διάλυμα Πλυστικού προς αποφυγή ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων. (13) Κάνετε προσεκτική διανομή των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων στα μικροβυθίσματα προς αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων και επιμόλυνσης μεταξύ των βυθισμάτων. (14) Όλες οι ταινίες των μικροβυθισμάτων, τα οποία δεν χρησιμοποιούνται άμεσα, πρέπει να επανασφραγίζονται προς αποφυγή απορρόφησης υγρασίας. (15) Το συμπυκνωμένο Πλυστικό μπορεί να θαμπώσει σε 2-8 C, κάτι που όμως, δεν επηρεάζει την ορθότητα των αποτελεσμάτων. (16) Τα χρησιμοποιηθέντα για την ανάλυση σκεύη πρέπει να έχουν τον ακόλουθο χειρισμό. Βυθίστε σε διάλυμα 2% τελικής συγκέντρωσης Γλουταραλδεΐδης επί, πλέον της 1 ώρας ή βυθίστε σε διάλυμα 0.5% υποχλωριώδους νατρίου (διαθέσιμη χλωρίνη: κατά προσέγγιση ppm) επί, πλέον της 1 ώρας ή τοποθετείστε στο αυτόκαυστο σε 121 C επί, πλέον των 20 λεπτών. (17) Η αποκτηθείσα, από αυτή την ανάλυση, τιμή αντισωμάτων Dsg-1 προορίζεται μόνο ως υποβοήθημα για τη διάγνωση. Κάθε αποτέλεσμα πρέπει να αξιολογηθεί υπό το φως, αφ ενός του κλινικού ιστορικού και κλινικής εικόνας του ασθενούς, και αφ ετέρου άλλων διαγνωστικών πληροφοριών. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΑ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ Συσκευή ανάγνωσης Μικροπλάκας (μήκος κύματος: 450 nm, με αναφορά τα 620 nm) Πολυκάναλης μικροπιπέτας (π.χ. 100 l 300 l) Μονοκάναλη πιπέττα (π.χ. 10 l & 100 l) Περιέκτης Αντιδραστηρίου Αυτόματο πλυστικό ή Φιάλη πλύσης Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό Κύλινδρος ενός λίτρου για την προετοιμασία του πλυστικού διαλύματος Δοκιμαστικοί σωλήνες για τις αραιώσεις των δειγμάτων των ασθενών (π.χ l) Ρύγχη πιπέττας μιας χρήσης Απορροφητικό χαρτί Λεκάνη και απολυμαντικό Κάλυμμα μικροπλάκας ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Αφήστε όλα τα υλικά ανάλυσης να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) πριν τη χρήση. Ταινίες μικροβυθισμάτων : Αφαιρέστε την απαιτούμενη ταινία από την θήκη και τοποθετείστε τα μέσα στο πλαίσιο. Επανατοποθετείστε αμέσως τις αχρησιμοποίητες ταινίες σε ψυχρό αποθηκευτικό χώρο. Διάλυμα πλυστικού: Το Συμπυκνωμένο Πλυστικό πρέπει να αραιωθεί πριν από τη χρήση. 47
50 Ελληνικά Αραιώστε το Συμπυκνωμένο Πλυστικό 1: 10 προσθέτοντας 100 ml του συμπυκνωμένου πλυστικού σε 900 ml αποσταγμένο νερό. Το αραιωμένο πλυστικό διάλυμα παραμένει σταθερό επί 2 εβδομάδες σε 2-8 C. Διάλυμα συζεύγματος: Το αντιδραστήριο συζεύγματος πρέπει να αραιωθεί πριν τη χρήση. Αραιώστε το σύζευγμα 1:101 με Διαλύτη Συζεύγματος. Το αραιωμένο διάλυμα συζεύγματος πρέπει να χρησιμοποιηθεί μέσα σε μια μέρα. Χρησιμοποιείστε περιέκτη αντιδραστηρίου μιας χρήσης προς αποφυγή επιμόλυνσης. Μην αραιώνετε τα έτοιμα-προς χρήση συστατικά του διαγνωστικού συνόλου. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Χρησιμοποιείστε φρέσκους ορούς ασθενών. Αν χρειάζεται να γίνει αποθήκευση, πρέπει να τοποθετηθούν σε ειδικά φιαλίδια και να συντηρηθούν σε κάτω από 20 C επί ένα μήνα, και κάτω από 70 C για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Μην ψύχετε και αποψύχετε επανειλημμένα. *Σε περίπτωση αποθήκευσης χαμηλότερα από 20 C επί πλέον των 6 μηνών, ή επανειλημμένης ψύξης και απόψυξης τα αποκτώμενα αποτελέσματα είναι μη ειδικά εξ αιτίας της αλλοίωσης της IgG. Αραιώστε κάθε ορό ασθενούς 1: 101 προσθέτοντας 10 l ορού σε 1 ml Διαλύτη Ανάλυσης. *Τα αραιωμένα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν στο ψυγείο έως και 3 ημέρες. *Τα αραιωμένα δείγματα μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν για την εξέταση Δεμογλεΐνης Dsg3. MESACUP ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΣΤΑΔΙΟ 1. (ΕΠΩΑΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ) Με χρήση της πολυκάναλης μικροπιπέτας, μεταφέρετε 100 μl Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 1, Dsg-1 Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 2 και κάθε αραιωμένου δείγματος στις κατάλληλες μικροϋποδοχές της πλάκας εξέτασης αντιγόνου. (Μην αραιώσετε τους Βαθμονομητές.) *Η επώαση αρχίζει αμέσως μετά την διανομή στα επιστρωμένα με αντιγόνα βυθίσματα. Η διανομή πρέπει να ολοκληρωθεί το συντομότερο δυνατόν. Καλύψτε τα βυθίσματα σφραγίζοντάς τα, και επωάστε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) επί 60 λεπτά. ΣΤΑΔΙΟ 2. (ΠΛΥΣΗ) Αφαιρέστε ή απορρίψτε τα περιεχόμενα των βυθισμάτων. Γεμίστε το βύθισμα με Διάλυμα Πλυστικού και μετά απορρίψτε τα περιεχόμενα. Πλύνετε 4 φορές. Τινάξτε την πλάκα πάνω σε απορροφητικό χαρτί για να αφαιρέσετε κατάλοιπα του Πλυστικού. Όταν χρησιμοποιείται αυτόματη συσκευή πλύσης, πλύνετε 4 φορές. * Συνιστάται κάθε εργαστήριο να πιστοποιεί τους δικούς του χρόνους και διαδικασίες πλυσίματος. * Το Διάλυμα Πλυστικού πρέπει να χρησιμοποιείται σε C. ΣΤΑΔΙΟ 3. (ΕΠΩΑΣΗ ΣΥΖΕΥΓΜΑΤΟΣ) Τοποθετείτε το Διάλυμα Συζεύγματος μέσα σε περιέκτη αντιδραστηρίου Διανέμετε 100 l του Διαλύματος συζεύγματος σε κάθε βύθισμα, με πολυκάναλης μικροπιπέτας. Καλύπτετε τα βυθίσματα και επωάζετε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) επί 60 λεπτά. ΣΤΑΔΙΟ 4. (ΠΛΥΣΗ) Πλένετε την μικροπλάκα ακολουθώντας την διαδικασία που περιγράφεται στο ΣΤΑΔΙΟ 2 ΣΤΑΔΙΟ 5. (ΕΠΩΑΣΗ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ) Τοποθετείτε το υπόστρωμα μέσα σε δοχείο μιας χρήσης. Διανέμετε 100 l του υποστρώματος σε κάθε 48
51 Ελληνικά βύθισμα, με πολυκάναλης μικροπιπέτας. *Αυτό το δοχείο πρέπει να είναι διαφορετικό από αυτό του Διαλύματος συζεύγματος. Πρέπει να χρησιμοποιηθεί άλλο δοχείο γιατί το υπόστρωμα μπορεί εύκολα να οξειδωθεί από ιόν μετάλλου. Καλύπτετε τα βυθίσματα και επωάζετε σε θερμοκρασία δωματίου (20-25 C) επί 30λεπτά. ΣΤΑΔΙΟ 6. (ΔΙΑΚΟΠΗ ΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ) Τοποθετείτε το Διάλυμα Διακοπής της Αντίδρασης μέσα σε δοχείο μιας χρήσης. Διανέμετε 100 l του Διαλύματος Διακοπής σε κάθε βύθισμα, με πολυκάναλης μικροπιπέτας. ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Διαβάστε την απορρόφηση κάθε βυθίσματος στα 450 nm. Εάν υπάρχει διαθέσιμη συσκευή ανάγνωσης σε δύο μήκη κύματος, διαβάστε το αποτέλεσμα στα 450 nm με μήκος αναφοράς, τα 620 nm. *Η ανάγνωση πρέπει να γίνει όσο το δυνατόν ταχύτερα από την διακοπή της αντίδρασης. *Βεβαιωθείτε ότι ο πυθμένας της πλάκας είναι καθαρός και στεγνός, και ότι δεν υπάρχουν φυσαλίδες στην επιφάνεια του υγρού των βυθισμάτων, πριν την ανάγνωση. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ {( A 450 (Δείγματος) Α450 (Αντιδρ/ίου βαθμονόμησης 1)} Τιμή Ανάλυσης (Unit/ml) = Χ 100 {A 450 (Αντιδρ/ου βαθμονόμησης2) - A 450 (Αντιδρ/ίου βαθμονόμησης 1)} *A450 είναι η τιμή απορρόφησης στα 450 nm. *Επειδή δεν διατίθεται διεθνές υλικό αναφοράς, για αντισώματα κατά Dsg-1, η ανάλυση βαθμονομείται σε αυθαίρετες μονάδες. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Κάθε αποτέλεσμα ανάλυσης πρέπει να πληροί τα κάτωθι κριτήρια A 450 Αντιδρ. Βαθμ. 1: A 450 του Dsg1 Αντιδρ. Βαθμον.2: Αν οποιοδήποτε από τα προαναφερθέντα κριτήρια δεν πληρείται, τα αποτελέσματα είναι άκυρα και η εξέταση πρέπει να επαναληφθεί. Πριν επαναλάβετε την ανάλυση, ελέγξτε την κάτωθι διαδικασία. Θερμοκρασία Επώασης Χρόνος Επώασης Πλύση ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΗ ΤΙΜΗ Το παρόν προορίζεται μόνο ως οδηγός ερμηνείας. Συνιστάται κάθε εργαστήριο να προσδιορίζει τα δικά του κριτήρια ερμηνείας αποτελεσμάτων βάσει των πληθυσμιακών δειγμάτων που αντιμετωπίζει. τιμή κατά Dsg1 (U/ml) Ερμηνεία 20 Θετικό 20>- 14 Απροσδιόριστο 14> Αρνητικό Η παραπάνω τιμή προσδιορίστηκε μετά από ανάλυση 179 φυσιολογικών ορών, 60 ορών ασθενών με 49
52 Ελληνικά Φυλλώδη Πέμφυγγα (PF) και ορών ασθενών που δεν έχουν PF. Όταν ερμηνεύεται ως Απροσδιόριστο, συνιστάται να εξεταστεί προσεκτικότερα το μεταβατικό στάδιο μετάδοσης της νόσου. Αυτό το αντιδραστήριο δείχνει τίτλο αντισωμάτων ως τιμή ανάλυσης Μια αλλαγή του τίτλου των αντισωμάτων, θεωρείται ενδεικτική δραστηριότητας της νόσου του ασθενούς, αλλά υπάρχει περίπτωση να μην γίνει σαφώς αντιληπτή η αλλαγή τίτλου, όταν η τιμή των αντισωμάτων είναι υψηλότερη από 150 U/ml. Η αλλαγή του τίτλου αντισωμάτων μπορεί να γίνει αντιληπτή καθαρότερα με την μέτρηση του δείγματος σε διάλυμα μεγαλύτερης αραίωσης. (π.χ. αραίωση 1: 2,020). ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ Όπως και με άλλες διαγνωστικές μεθόδους, τα αποκτώμενα αποτελέσματα με το Διαγνωστικό σύνολο MESACUP ΤΕΣΤ ΔεσμογλεΐνηςDsg1 χρησιμεύουν μόνο ως υποβοήθημα διάγνωσης και δεν θα έπρεπε να χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικό εργαλείο αφ εαυτού τους. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Νόσος Θετικό δείγμα Θετικό ποσοστό Φυλλώδης Πέμφυγξ (PF) 31/ % Κοινή Πέμφυγξ (PV) 27/ % Πομφολυγώδες Πεμφυγοειδές (BP) 0/45 0.0% Φυσιολογικοί 0/ % ΑΚΡΙΒΕΙΑ Η επαναληψιμότητα παρουσιάστηκε εξετάζοντας 3 δείγματα έξι φορές το καθένα. Η αναπαραγωγιμότητα προσδιορίστηκε εξετάζοντας 3 δείγματα σε 5 διαφορετικές ημέρες (ημέρα με την ημέρα) και εξετάζοντας 3 δείγματα από 3 παρτίδες (από παρτίδα σε παρτίδα). Οι % τιμές του συντελεστή απόκλισης (CV) για αναπαραγωγιμότητα και επαναληψιμότητα ήταν κάτω από 15% για κάθε δείγμα. ΕΥΡΟΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ Τα εύρος ανάλυσης αυτού του διαγνωστικού συνόλου εκτείνεται από 5 U/ml σε 150 U/ml Όταν το αποτέλεσμα της ανάλυσης υπερβαίνει τα 150 U/ml, θα πρέπει να αναφερθεί «τιμή μεγαλύτερη από 150 U/ml». ΕΜΠΛΕΚΟΜΕΝΕΣ ΟΥΣΙΕΣ Αιμοσφαιρίνη (έως και 490 mg/dl), Μπιλιρουμπίνη F (έως και 18.2 mg/dl), Μπιλιρουμπίνη C (έως και 22 mg/dl), χυλός (έως και 2800 μονάδες ως Φορμαζίνη) και /ή Ρευματοειδής παράγων (έως και 480 IU/ml) δεν επηρεάζουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης,, αλλά αποφύγετε την χρήση πολύ αιμολυμένων και πολύ λιπαιμικών δειγμάτων. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Stanley JR: Cell adhesion molecules as targets of autoantibodies in pemphigus and pemphigoid, bullous diseases due to defective epidermal cell adhesion. Adv Immunol 53: , Amagai M: Pemphigus: autoimmunity to epidermal cell adhesion molecules. Adv Dermatol 11: , 50
53 Ελληνικά Amagai M, Hashimoto T, Green KJ, Shimizu N, Nishikawa T: Antigen-specific immunoadsorption of pathogenic autoantibodies in pemphigus foliaceus. J Invest Dermatol 104: , Ishii K, Amagai M, Hall RP, Hashimoto T, Takayanagi A, Gamou S, Shimizu N, Nishikawa T: Characterization of autoantibodies in pemphigus using antigen-specific ELISAs with baculovirus expressed recombinant desmogleins. J Immunol 159: ,
54 **The following symbols are used on the label. **Les symboles suivants ont été utilisés sur l étiquette. **Die folgenden Symbole finden Sie auf dem Etikett. **En las etiquetas se usan los siguientes símbolos **I seguenti simboli sono usati sulle etichette. **Os simbolos seguintes são usados no rótulo. **Τα κάτωθι σύμβολα χρησιμοποιούνται στην ετικέτα For in vitro diagnostic use Dispositif médical de diagnostic in vitro Für in-vitro Diagnostik Enkel voor in vitro diagnostisch gebruik Para uso diagnóstico in vitro Per uso diagnostico in vitro Para diagnóstico in vitro Για in vitro διαγνωστική χρήση Catalogue number Référence du catalogue Artikelnummer Cataloog nummer Número de catálogo Numero di catalogo Número de catálogo Αριθμός καταλόγου Lot Code du lot Charge Lot Lote Lotto Lote Παρτίδας 96 tests Contenu suffisant pour 96 tests 96 Bestimmungen 96 tests 96 test 96 tests 96 testes 96 εξετάσεις See instructions for use Consulter les instructions d utilisation Siehe Packungsbeilage Zie instructies voor gebruik Ver instrucciones de uso Vedi Istruzioni per l uso Ver instruções de utilização Δείτε τις οδηγίες χρήσης 52
55 Use by Utiliser jusque Haltbarkeit Gebruik bij Temperatura de uso Uso da Utilizar até Να χρησιμοποιηθεί έως Store at 2 8 C Limites de température : 2 à 8 C Lagerung bei 2 8ºC Bewaren bij 2 8 C Conservar a 2 8 C Conservare a 2 8 C Armazenar a 2 8ºC Φύλαξη στους 2-8 ºC Manufactured by Fabricant Hersteller Geproduceerd door Fabricado por Prodotto da Produzido por Παρασκευάστηκε από Authorized Representative Mandataire dans la Communauté européenne Bevollmächtigter Geauthoriseerde vertegenwoordiger Representane Autorizado Rappresentante Autorizzato Representante Autorizado Εξουσιοδοτημένος αντιπρόσωπος <ELISA Components> Microwell Strips Micro plaque Mikrotiterstreifen Microwell Strips Tiras de Micropocillos Strips di micropozzetti Microplacas Ταινίες Βυθισμάτων Calibrator 1 Calibrateur 1 Kalibrator 1 Calibrator 1 Calibrador 1 Calibratore 1 Calibrador 1 Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 1 53
56 Calibrator 2 Calibrateur 2 Kalibrator 2 Calibrator 2 Calibrador 2 Calibratore 2 Calibrador 2 Αντιδραστήριο Βαθμονόμησης 2 Positive Control Contrôle positif Positivkontrolle Positieve Controle Control Positivo Controllo Positivo Controlo Positivo Θετικό Πρότυπο Ελέγχου Negative Control Contrôle négatif Negativkontrolle Negatieve Controle Control Negativo Controllo Negativo Controlo Negativo Αρνητικό Πρότυπο Ελέγχου Standard Sera Sérum Calibrateur 1 Standardserum Standaard Sera Suero Estandard Sieri standard Soro Padrão Πρότυποι Οροί Καμπύλης Conjugate Reagent Conjugué (prêt à l emploi) Konjugatreagenz Conjugaat Reagens Reactivo Conjugado Coniugato Reagente conjugado Αντιδραστήριο Συζεύγματος Conjugate Reagent (101x) Conjugué (101x) Konjugatreagenz (101x) Conjugaat Reagens (101x) Reactivo Conjugado (101x) Coniugato (101x) Reagente Conjugado (101x) Αντιδραστήριο Συζεύγματος 101x 54
57 Conjugate Diluent Diluant conjugué Konjugatdiluent Conjugaat Diluent Diluyente de Conjugado Diluente del Coniugato Diluente do Conjugado Διαλύτης Αντιδραστηρίου Συζεύγματος Assay Diluent Diluant sérum Probendiluent Assay Diluent Diluyente de Ensayo Diluente del Test Diluente Διαλύτης Ανάλυσης Wash Concentrate (10x) Solution de lavage (10x) Waschkonzentrat (10x) Was Concentraat (10x) Solución de Lavado Concentrada (10x) Soluzione di Lavaggio concentrata (10x) Solução de Lavagem Concentrada (10x) Συμπυκνωμένο Πλυστικό 10 x Substrate Substrat Substrat Substraat Sustrato Substrato Substrato Υπόστρωμα Substrate A Substrat A Substrat A Substraat A Sustrato A Substrato A Substrato A Υπόστρωμα Α Substrate B Substrat B Substrat B Substraat B Sustrato B Substrato B Substrato B Υπόστρωμα Β 55
58 Stop Solution Solution d arrêt Stopplösung Stopplösung Solución de Parada Soluzione bloccante Solução de Paragem Διάλυμα Διακοπής Αντίδρασης 56
MESACUP BP230 TEST http://www.mbl.co.jp
MESACUP BP230 TEST Cat. No. 7613E: 48 wells Cat. No. 7613E: 48 puits Art.-Nr. 7613E: 48 Auftragsstellen Cat. No. 7613E: 48 pocillos Cat. n. 7613E: 48 pozzetti Cat. Nº 7613E: 48 poços Aρ. Κατ. 7613E: 48
BD OptEIA ELISA Sets ELISA
BD OptEIA ELISA Sets ELISA BD OptEIA ELISA Sets ELISA CaptureDetection Detection 9620 170,000 ELISAEnzymed-Linked ImmunoSorbent Assay CaptureDetection BD OptEIA ELISA Set 2 BD OptEIA ELISA Set BD OptEIA
MESACUP anti-synthetase TEST
MESACUP anti-synthetase TEST Cat. No. : 48 wells Cat. No. : 48 puits Art. Nr. : 48 Auftragsstellen Cat. No. : 48 pocillos Cat. N. : 48 pozzetti Cat. N : 48 poos Aρ. Κατ. : 48 βυθισμάτων MEDICAL & BIOLOGICAL
English PDFsharp is a.net library for creating and processing PDF documents 'on the fly'. The library is completely written in C# and based
English PDFsharp is a.net library for creating and processing PDF documents 'on the fly'. The library is completely written in C# and based exclusively on safe, managed code. PDFsharp offers two powerful
English PDFsharp is a.net library for creating and processing PDF documents 'on the fly'. The library is completely written in C# and based
English PDFsharp is a.net library for creating and processing PDF documents 'on the fly'. The library is completely written in C# and based exclusively on safe, managed code. PDFsharp offers two powerful
Mean bond enthalpy Standard enthalpy of formation Bond N H N N N N H O O O
Q1. (a) Explain the meaning of the terms mean bond enthalpy and standard enthalpy of formation. Mean bond enthalpy... Standard enthalpy of formation... (5) (b) Some mean bond enthalpies are given below.
Mouse Apolipoprotein A1 (Apo-A1) ELISA Kit. MyBioSource.com
Mouse Apolipoprotein A1 (Apo-A1) ELISA Kit Catalog Number. For the quantitative determination of mouse apolipoprotein A1 (Apo-A1) concentrations in serum, plasma, cell culture supernates, tissue homogenates,
3 Lösungen zu Kapitel 3
3 Lösungen zu Kapitel 3 31 Lösungen der Aufgaben zu Abschnitt 31 311 Lösung Die Abbildung D : { R 4 R 4 R 4 R 4 R, a 1, a 2, a 3, a 4 ) D( a 1, a 2, a 3, a 4 ) definiere eine Determinantenform (auf R 4
CHORUS. EPSTEIN-BARR EARLY ANTIGEN IgG REF 81058 REF 81058/12
/GK/ 1/17 CHORUS EPSTEIN-BARR EARLY ANTIG IgG REF 81058 REF 81058/12 Fabriqué par/κατασκευάζεται από/manufactured by: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy Modifications
FR/GK 1/13 ENZY-WELL. Epstein-Barr EBNA IgG. DIESSE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose, 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy REF 91057
/GK 1/13 ZYWELL EpsteinBarr EBNA IgG REF 91057 DISE Diagnostica Senese S.p.A. Via delle Rose, 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy IO09/022 IFU 91057 Ed. 10.07.2014 2/13 INSTRUCTIONS POUR L UTILISATION
Assalamu `alaikum wr. wb.
LUMP SUM Assalamu `alaikum wr. wb. LUMP SUM Wassalamu alaikum wr. wb. Assalamu `alaikum wr. wb. LUMP SUM Wassalamu alaikum wr. wb. LUMP SUM Lump sum lump sum lump sum. lump sum fixed price lump sum lump
CHAPTER 25 SOLVING EQUATIONS BY ITERATIVE METHODS
CHAPTER 5 SOLVING EQUATIONS BY ITERATIVE METHODS EXERCISE 104 Page 8 1. Find the positive root of the equation x + 3x 5 = 0, correct to 3 significant figures, using the method of bisection. Let f(x) =
CHORUS SYPHILIS SCREEN RECOMBINANT. REF 81100 (36 tests)
/GK/ 1/15 CHORUS SYPHILIS SCRE RECOMBINANT REF 81100 (36 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από/manufactured by: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy /GK/ 2/15
MSM Men who have Sex with Men HIV -
,**, The Japanese Society for AIDS Research The Journal of AIDS Research HIV,0 + + + + +,,, +, : HIV : +322,*** HIV,0,, :., n,0,,. + 2 2, CD. +3-ml n,, AIDS 3 ARC 3 +* 1. A, MSM Men who have Sex with Men
Tipologie installative - Installation types Type d installation - Installationstypen Tipos de instalación - Τυπολογίες εγκατάστασης
AMPADE MOOCROMATICHE VIMAR DIMMERABII A 0 V~ - VIMAR 0 V~ DIMMABE MOOCHROME AMP AMPE MOOCHROME VIMAR VARIATEUR 0 V~ - DIMMERFÄHIGE MOOCHROMATICHE AMPE VO VIMAR MIT 0 V~ ÁMPARA MOOCROMÁTICA VIMAR REGUABE
ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA
EN ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA [IVD] For in vitro diagnostic use PRODUCT INSERT [REF] 5152A B2GP1 IgA Antibody ELISA 96 Determinations [REF] 5152G B2GP1 IgG Antibody
La Déduction naturelle
La Déduction naturelle Pierre Lescanne 14 février 2007 13 : 54 Qu est-ce que la déduction naturelle? En déduction naturelle, on raisonne avec des hypothèses. Qu est-ce que la déduction naturelle? En déduction
Math 6 SL Probability Distributions Practice Test Mark Scheme
Math 6 SL Probability Distributions Practice Test Mark Scheme. (a) Note: Award A for vertical line to right of mean, A for shading to right of their vertical line. AA N (b) evidence of recognizing symmetry
Right Rear Door. Let's now finish the door hinge saga with the right rear door
Right Rear Door Let's now finish the door hinge saga with the right rear door You may have been already guessed my steps, so there is not much to describe in detail. Old upper one file:///c /Documents
Strain gauge and rosettes
Strain gauge and rosettes Introduction A strain gauge is a device which is used to measure strain (deformation) on an object subjected to forces. Strain can be measured using various types of devices classified
Advanced Subsidiary Unit 1: Understanding and Written Response
Write your name here Surname Other names Edexcel GE entre Number andidate Number Greek dvanced Subsidiary Unit 1: Understanding and Written Response Thursday 16 May 2013 Morning Time: 2 hours 45 minutes
Instruction Execution Times
1 C Execution Times InThisAppendix... Introduction DL330 Execution Times DL330P Execution Times DL340 Execution Times C-2 Execution Times Introduction Data Registers This appendix contains several tables
The Simply Typed Lambda Calculus
Type Inference Instead of writing type annotations, can we use an algorithm to infer what the type annotations should be? That depends on the type system. For simple type systems the answer is yes, and
MATERIALIEN ZUR VORBEREITUNG AUF DIE KLAUSUR INFORMATIK II FÜR VERKEHRSINGENIEURWESEN ANTEIL VON PROF. VOGLER IM WINTERSEMESTER 2011/12
Fakultät Informatik Institut für Angewandte Informatik, Professur Technische Informationssysteme MATERIALIEN ZUR VORBEREITUNG AUF DIE KLAUSUR INFORMATIK II FÜR VERKEHRSINGENIEURWESEN ANTEIL VON PROF. VOGLER
the total number of electrons passing through the lamp.
1. A 12 V 36 W lamp is lit to normal brightness using a 12 V car battery of negligible internal resistance. The lamp is switched on for one hour (3600 s). For the time of 1 hour, calculate (i) the energy
Approximation of distance between locations on earth given by latitude and longitude
Approximation of distance between locations on earth given by latitude and longitude Jan Behrens 2012-12-31 In this paper we shall provide a method to approximate distances between two points on earth
Capacitors - Capacitance, Charge and Potential Difference
Capacitors - Capacitance, Charge and Potential Difference Capacitors store electric charge. This ability to store electric charge is known as capacitance. A simple capacitor consists of 2 parallel metal
Το σύστημα των αξιών της ελληνικής κοινωνίας μέσα στα σχολικά εγχειρίδια της Λογοτεχνίας του Δημοτικού Σχολείου
ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΠΑΙΔΑΓΩΓΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΔΗΜΟΤΙΚΗΣ ΕΚΠ/ΣΗΣ ΔΙΔΑΣΚΑΛΕΙΟ «ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΚΑΣΤΑΝΟΣ» Το σύστημα των αξιών της ελληνικής κοινωνίας μέσα στα σχολικά εγχειρίδια της Λογοτεχνίας του Δημοτικού
1) Formulation of the Problem as a Linear Programming Model
1) Formulation of the Problem as a Linear Programming Model Let xi = the amount of money invested in each of the potential investments in, where (i=1,2, ) x1 = the amount of money invested in Savings Account
Εμπορική αλληλογραφία Ηλεκτρονική Αλληλογραφία
- Εισαγωγή Sehr geehrter Herr Präsident, Sehr geehrter Herr Präsident, Εξαιρετικά επίσημη επιστολή, ο παραλήπτης έχει ένα ειδικό τίτλο ο οποίος πρέπει να χρησιμοποιηθεί αντί του ονόματος του Sehr geehrter
IL-4-EASIA KAP1281. DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue de l'industrie, 8 - B-1400 Nivelles - Belgium
IL4EASIA KAP1281 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue de l'industrie, 8 B14 Nivelles Belgium : 955/1 en Read entire protocol before use. IL4EASIA I. INTENDED USE Immunoenzymetric assay for the in vitro quantitative
derivation of the Laplacian from rectangular to spherical coordinates
derivation of the Laplacian from rectangular to spherical coordinates swapnizzle 03-03- :5:43 We begin by recognizing the familiar conversion from rectangular to spherical coordinates (note that φ is used
ENZYWELL. VARICELLA IgG. REF 91078 (48 tests) REF 91088 (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL VARICELLA IgG REF 91078 (48 tests) REF 91088 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από : DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/15 SOMMAIRE
Συστήματα Διαχείρισης Βάσεων Δεδομένων
ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ Συστήματα Διαχείρισης Βάσεων Δεδομένων Φροντιστήριο 9: Transactions - part 1 Δημήτρης Πλεξουσάκης Τμήμα Επιστήμης Υπολογιστών Tutorial on Undo, Redo and Undo/Redo
HOMEWORK 4 = G. In order to plot the stress versus the stretch we define a normalized stretch:
HOMEWORK 4 Problem a For the fast loading case, we want to derive the relationship between P zz and λ z. We know that the nominal stress is expressed as: P zz = ψ λ z where λ z = λ λ z. Therefore, applying
Κεφάλαιο 2 H επικοινωνία στην οικονομία
Κεφάλαιο 2 H επικοινωνία στην οικονομία Σύνοψη Στο κεφάλαιο αυτό, θα περιγράψουμε τι σημαίνει ειδική επικοινωνία και θα φωτίσουμε τη σχέση της με την ειδική γλώσσα. Για την κατανόηση των μηχανισμών της
Cellular Physiology and Biochemistry
Original Paper 2016 The Author(s). 2016 Published The Author(s) by S. Karger AG, Basel Published online: November 25, 2016 www.karger.com/cpb Published by S. Karger AG, Basel 486 www.karger.com/cpb Accepted:
Second Order RLC Filters
ECEN 60 Circuits/Electronics Spring 007-0-07 P. Mathys Second Order RLC Filters RLC Lowpass Filter A passive RLC lowpass filter (LPF) circuit is shown in the following schematic. R L C v O (t) Using phasor
[1] P Q. Fig. 3.1
1 (a) Define resistance....... [1] (b) The smallest conductor within a computer processing chip can be represented as a rectangular block that is one atom high, four atoms wide and twenty atoms long. One
Main source: "Discrete-time systems and computer control" by Α. ΣΚΟΔΡΑΣ ΨΗΦΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΔΙΑΛΕΞΗ 4 ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 1
Main source: "Discrete-time systems and computer control" by Α. ΣΚΟΔΡΑΣ ΨΗΦΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΔΙΑΛΕΞΗ 4 ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 1 A Brief History of Sampling Research 1915 - Edmund Taylor Whittaker (1873-1956) devised a
ΙΑΤΡΟΦΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙ Α ΓΙΑ ΤΑΞΙ ΙΩΤΕΣ ΣΥΝΤΟΜΗΣ ΚΑΙ ΜΑΚΡΑΣ ΙΑΡΚΕΙΑΣ
ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΚΑΙ ΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ, ΤΕΙ ΚΡΗΤΗΣ ΙΑΤΡΟΦΙΚΗ ΦΡΟΝΤΙ Α ΓΙΑ ΤΑΞΙ ΙΩΤΕΣ ΣΥΝΤΟΜΗΣ ΚΑΙ ΜΑΚΡΑΣ ΙΑΡΚΕΙΑΣ ΕΠΙΜΕΛΕΙΑ: ΑΛΕΞΙΑ ΤΣΕΡΛΙΓΚΑ ΥΠΕΥΘΥΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Γ. Α. ΦΡΑΓΚΙΑ ΑΚΗΣ. 2012 σελ.
ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ
ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΛΕΝΑ ΦΛΟΚΑ Επίκουρος Καθηγήτρια Τµήµα Φυσικής, Τοµέας Φυσικής Περιβάλλοντος- Μετεωρολογίας ΓΕΝΙΚΟΙ ΟΡΙΣΜΟΙ Πληθυσµός Σύνολο ατόµων ή αντικειµένων στα οποία αναφέρονται
ENZYWELL. EPSTEIN BARR EA IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL EPSTEIN BARR EA IgG REF 91058 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από : DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/16 SOMMAIRE/ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.
ΚΥΠΡΙΑΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ CYPRUS COMPUTER SOCIETY ΠΑΓΚΥΠΡΙΟΣ ΜΑΘΗΤΙΚΟΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ 19/5/2007
Οδηγίες: Να απαντηθούν όλες οι ερωτήσεις. Αν κάπου κάνετε κάποιες υποθέσεις να αναφερθούν στη σχετική ερώτηση. Όλα τα αρχεία που αναφέρονται στα προβλήματα βρίσκονται στον ίδιο φάκελο με το εκτελέσιμο
PARTIAL NOTES for 6.1 Trigonometric Identities
PARTIAL NOTES for 6.1 Trigonometric Identities tanθ = sinθ cosθ cotθ = cosθ sinθ BASIC IDENTITIES cscθ = 1 sinθ secθ = 1 cosθ cotθ = 1 tanθ PYTHAGOREAN IDENTITIES sin θ + cos θ =1 tan θ +1= sec θ 1 + cot
25OH Vitamin D Total ELISA KAP1971
25OH Vitamin D Total ELISA KAP1971 DIAsource ImmunoAssays S.A. - Rue du Bosquet, 2 - B-1348 Louvain-la-Neuve - Belgium : 14512/2 en US: For in-vitro diagnostic use only. I. INTENDED USE Read entire protocol
ελτίο δεδοµένων ασφαλείας σύµφωνα µε το 1907/2006/EK, Άρθρο 31
Σελίδα: 1/6 ΤΜΗΜΑ 1: Στοιχεία ουσίας/παρασκευάσµατος και εταιρείας/επιχείρησης 1.1 Αναγνωριστικός κωδικός προϊόντος Αριθµός προϊόντος: A4569 Aριθµός CAS: 112926-00-8 Αριθµός ΕC: 231-545-4 1.2 Συναφείς
ENZYWELL. MUMPS IgG. REF (48 tests) REF (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL MUMPS IgG REF 91075 (48 tests) REF 91084 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy /GK 2/15 SOMMAIRE /
ENZYWELL. HELICOBACTER PYLORI IgA. REF 91062 (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL HELICOBACTER PYLORI IgA REF 91062 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy /GK 2/15 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
Wenn ihr nicht werdet wie die Kinder...
Wenn ihr nicht werdet wie die Kinder... . Der Memoriam-Garten Schön, dass ich mir keine Sorgen machen muss! Mit dem Memoriam-Garten bieten Ihnen Friedhofsgärtner, Steinmetze
Phys460.nb Solution for the t-dependent Schrodinger s equation How did we find the solution? (not required)
Phys460.nb 81 ψ n (t) is still the (same) eigenstate of H But for tdependent H. The answer is NO. 5.5.5. Solution for the tdependent Schrodinger s equation If we assume that at time t 0, the electron starts
Θεραπευτική. Θεραπευτικές προτάσεις στην Πέμφιγα. Treatment Approaches in Pemphigus. Ðå ñß ëç øç. Summa ry
Θεραπευτική Θεραπευτικές προτάσεις στην Πέμφιγα Κυριακού Στ. Γεροχρήστου Μ. Γεροδήμου Μ. Χασάπη Β. Ειδικευόμενη, Γ Δερματολογική Κλινική, Νοσ/μείο δερματικών & Αφροδισίων νόσων Α. Συγγρός Επιμελήτρια,
ENZYWELL. TREPONEMA IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL TREPONEMA IgG REF 91050 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από : DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. UTILISATION
(1) Describe the process by which mercury atoms become excited in a fluorescent tube (3)
Q1. (a) A fluorescent tube is filled with mercury vapour at low pressure. In order to emit electromagnetic radiation the mercury atoms must first be excited. (i) What is meant by an excited atom? (1) (ii)
ENZYWELL. MEASLES IgG. REF (48 tests) REF (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL MEASL IgG REF 91072 (48 tests) REF 91080 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy /GK 2/15 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
Hauptseminar Mathematische Logik Pcf Theorie (S2A2) Das Galvin-Hajnal Theorem
Hauptseminar Mathematische Logik Pcf Theorie (S2A2) Das Galvin-Hajnal Theorem Jonas Fiege 21 Juli 2009 1 Theorem 1 (Galvin-Hajnal [1975]) Sei ℵ α eine singuläre, starke Limes-Kardinalzahl mit überabzählbarer
Code Breaker. TEACHER s NOTES
TEACHER s NOTES Time: 50 minutes Learning Outcomes: To relate the genetic code to the assembly of proteins To summarize factors that lead to different types of mutations To distinguish among positive,
ΚΥΠΡΙΑΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ CYPRUS COMPUTER SOCIETY ΠΑΓΚΥΠΡΙΟΣ ΜΑΘΗΤΙΚΟΣ ΔΙΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗΣ 6/5/2006
Οδηγίες: Να απαντηθούν όλες οι ερωτήσεις. Ολοι οι αριθμοί που αναφέρονται σε όλα τα ερωτήματα είναι μικρότεροι το 1000 εκτός αν ορίζεται διαφορετικά στη διατύπωση του προβλήματος. Διάρκεια: 3,5 ώρες Καλή
Section 8.3 Trigonometric Equations
99 Section 8. Trigonometric Equations Objective 1: Solve Equations Involving One Trigonometric Function. In this section and the next, we will exple how to solving equations involving trigonometric functions.
Case 1: Original version of a bill available in only one language.
currentid originalid attributes currentid attribute is used to identify an element and must be unique inside the document. originalid is used to mark the identifier that the structure used to have in the
Figure 1 T / K Explain, in terms of molecules, why the first part of the graph in Figure 1 is a line that slopes up from the origin.
Q1.(a) Figure 1 shows how the entropy of a molecular substance X varies with temperature. Figure 1 T / K (i) Explain, in terms of molecules, why the entropy is zero when the temperature is zero Kelvin.
ENZYWELL. HERPES SIMPLEX 1+2 IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL HERP SIMPLEX 1+2 IgG REF 91020 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.
TNF-α- EASIA KAP1751
TFα EASIA KAP1751 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2 B134 Louvainlaeuve Belgium : 11221/3 en Read entire protocol before use. TFαEASIA I. ITEDED USE Immunoenzymetric assay for the in vitro quantitative
ENZYWELL. TOXOPLASMA IgA. REF (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL TOXOPLASMA IgA REF 91043 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) - Italy 0123 /GK 2/15 SOMMAIRE/ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.
Potential Dividers. 46 minutes. 46 marks. Page 1 of 11
Potential Dividers 46 minutes 46 marks Page 1 of 11 Q1. In the circuit shown in the figure below, the battery, of negligible internal resistance, has an emf of 30 V. The pd across the lamp is 6.0 V and
C.S. 430 Assignment 6, Sample Solutions
C.S. 430 Assignment 6, Sample Solutions Paul Liu November 15, 2007 Note that these are sample solutions only; in many cases there were many acceptable answers. 1 Reynolds Problem 10.1 1.1 Normal-order
ENZYWELL. TOXOPLASMA IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL TOXOPLASMA IgG REF 91040 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy Modifications apportées à la révision courante
EE512: Error Control Coding
EE512: Error Control Coding Solution for Assignment on Finite Fields February 16, 2007 1. (a) Addition and Multiplication tables for GF (5) and GF (7) are shown in Tables 1 and 2. + 0 1 2 3 4 0 0 1 2 3
ENZYWELL. RUBELLA IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL RUBELLA IgG REF 91030 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy 0123 /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. UTILISATION
ΕΞΕΤΑΣΤΕΑ ΥΛΗ ΣΤΑ ΓΑΛΛΙΚΑ
ΤΑΞΗ Α ΓΥΜΝΑΣΙΟΥ (Τµήµα Α1 και Α2) Méthode : Action.fr-gr1, σελ. 8-105 (Ενότητες 0, 1, 2, 3 µε το λεξιλόγιο και τη γραµµατική που περιλαµβάνουν) Οι διάλογοι και οι ερωτήσεις κατανόησης (pages 26-27, 46-47,
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΔΟΝΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΑΝΩΤΕΡΑΣ ΠΡΟΣΘΕΤΙΚΗΣ
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΟΔΟΝΤΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΟΔΟΝΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΑΝΩΤΕΡΑΣ ΠΡΟΣΘΕΤΙΚΗΣ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΣΥΓΚΡΑΤΗΤΙΚΗΣ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΟΡΙΣΜΕΝΩΝ ΠΡΟΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΜΕΝΩΝ ΣΥΝΔΕΣΜΩΝ ΑΚΡΙΒΕΙΑΣ
Econ 2110: Fall 2008 Suggested Solutions to Problem Set 8 questions or comments to Dan Fetter 1
Eon : Fall 8 Suggested Solutions to Problem Set 8 Email questions or omments to Dan Fetter Problem. Let X be a salar with density f(x, θ) (θx + θ) [ x ] with θ. (a) Find the most powerful level α test
ENZYWELL. CYTOMEGALOVIRUS IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL CYTOMEGALOVIRUS IgG REF 91010 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy 0123 /GK 2/16 SOMMAIRE / ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
Απόκριση σε Μοναδιαία Ωστική Δύναμη (Unit Impulse) Απόκριση σε Δυνάμεις Αυθαίρετα Μεταβαλλόμενες με το Χρόνο. Απόστολος Σ.
Απόκριση σε Δυνάμεις Αυθαίρετα Μεταβαλλόμενες με το Χρόνο The time integral of a force is referred to as impulse, is determined by and is obtained from: Newton s 2 nd Law of motion states that the action
Test Data Management in Practice
Problems, Concepts, and the Swisscom Test Data Organizer Do you have issues with your legal and compliance department because test environments contain sensitive data outsourcing partners must not see?
Matrices and Determinants
Matrices and Determinants SUBJECTIVE PROBLEMS: Q 1. For what value of k do the following system of equations possess a non-trivial (i.e., not all zero) solution over the set of rationals Q? x + ky + 3z
Technisches Handbuch. Pergola Top Star 120X70. metaform Bescha ungssysteme
02 Technisches Handbuch Pergola Top Star 120X70 Exklusiv von Metaform ΑVΕΕ entworfen, ist es die Innova on bei der professionellen Bescha ung, denn das wegweisende Hebesystem erlaubt es Ihnen, sie an jeder
Ειδικό πρόγραμμα ελέγχου για τον ιό του Δυτικού Νείλου και την ελονοσία, ενίσχυση της επιτήρησης στην ελληνική επικράτεια (MIS 365280)
«Ειδικό πρόγραμμα ελέγχου για τον ιό του Δυτικού Νείλου και την ελονοσία, ενίσχυση της επιτήρησης στην ελληνική επικράτεια» Παραδοτέο Π1.36 Έκδοση ενημερωτικών φυλλαδίων Υπεύθυνος φορέας: Κέντρο Ελέγχου
Daewoo Technopark A-403, Dodang-dong, Wonmi-gu, Bucheon-city, Gyeonggido, Korea LM-80 Test Report
LM-80 Test Report Approved Method: Measuring Lumen Maintenance of LED Light Sources Project Number: KILT1212-U00216 Date: September 17 th, 2013 Requested by: Dongbu LED Co., Ltd 90-1, Bongmyeong-Ri, Namsa-Myeon,
DEUTSCHE SCHULE ATHEN ΓΕΡΜΑΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΑΘΗΝΩΝ
Herzlich Willkommen zu unserem Elternabend Übergang aus dem Elternhaus in den Kindergarten Καλωσορίσατε στη συνάντηση γονέων με θέμα τη μετάβαση από το οικογενειακό περιβάλλον στο προνηπιακό τμήμα 1 Überblick
Homework 3 Solutions
Homework 3 Solutions Igor Yanovsky (Math 151A TA) Problem 1: Compute the absolute error and relative error in approximations of p by p. (Use calculator!) a) p π, p 22/7; b) p π, p 3.141. Solution: For
2 Composition. Invertible Mappings
Arkansas Tech University MATH 4033: Elementary Modern Algebra Dr. Marcel B. Finan Composition. Invertible Mappings In this section we discuss two procedures for creating new mappings from old ones, namely,
Surface Mount Multilayer Chip Capacitors for Commodity Solutions
Surface Mount Multilayer Chip Capacitors for Commodity Solutions Below tables are test procedures and requirements unless specified in detail datasheet. 1) Visual and mechanical 2) Capacitance 3) Q/DF
Inverse trigonometric functions & General Solution of Trigonometric Equations. ------------------ ----------------------------- -----------------
Inverse trigonometric functions & General Solution of Trigonometric Equations. 1. Sin ( ) = a) b) c) d) Ans b. Solution : Method 1. Ans a: 17 > 1 a) is rejected. w.k.t Sin ( sin ) = d is rejected. If sin
Other Test Constructions: Likelihood Ratio & Bayes Tests
Other Test Constructions: Likelihood Ratio & Bayes Tests Side-Note: So far we have seen a few approaches for creating tests such as Neyman-Pearson Lemma ( most powerful tests of H 0 : θ = θ 0 vs H 1 :
Zenit a-gbm semi quantitative kit (Goodpasture syndrome)
Instruction Zenit a-gbm semi quantitative kit (Goodpasture syndrome) Enzyme immunoassay for detection of autoantibodies against glomerular basement membrane Microtitration strips (12x8) 96 wells Store
ΜΑΡΙΟΛΑΚΟΣ Η., ΦΟΥΝΤΟΥΛΗΣ Ι., ΣΠΥΡΙΔΩΝΟΣ Ε., ΑΝΔΡΕΑΔΑΚΗΣ Ε., ΚΑΠΟΥΡΑΝΗ, Ε.
ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ Νο 95 ΜΑΡΙΟΛΑΚΟΣ Η., ΦΟΥΝΤΟΥΛΗΣ Ι., ΣΠΥΡΙΔΩΝΟΣ Ε., ΑΝΔΡΕΑΔΑΚΗΣ Ε., ΚΑΠΟΥΡΑΝΗ, Ε. (2003). Το πρόβλημα του νερού στη Θεσσαλία και προτάσεις για την αντιμετώπισή του στα πλαίσια της αειφόρου ανάπτυξης.
ENZYWELL. HERPES SIMPLEX 1 IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL HERP SIMPLEX 1 IgG REF 91027 (96 tests) Fabriqué par/κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. UTILISATION
4K HDMI Splitter 1x4. User s Guide / Bedienungsanleitung / Εγχειρίδιο Χρήστη
4K HDMI Splitter 1x4 User s Guide / Bedienungsanleitung / Εγχειρίδιο Χρήστη INTRODUCTION The EDISION 4K HDMI Splitter 1x4 uses a single HDMI input source, to distribute it to 4 HDMI outputs. The splitter
Griechisches Staatszertifikat - Deutsch
ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΕΘΝΙΚΗΣ ΠΑΙ ΕΙΑΣ ΚΑΙ ΘΡΗΣΚΕΥΜΑΤΩΝ ΚΡΑΤΙΚΟ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΓΛΩΣΣΟΜΑΘΕΙΑΣ Griechisches Ministerium für Bildung und Religion Griechisches Staatszertifikat - Deutsch Niveau A1 & A2 Entspricht dem Gemeinsamen
The challenges of non-stable predicates
The challenges of non-stable predicates Consider a non-stable predicate Φ encoding, say, a safety property. We want to determine whether Φ holds for our program. The challenges of non-stable predicates
ENZYWELL. EPSTEIN BARR VCA IgG. REF (96 tests)
/GK 1/16 ZYWELL EPSTEIN BARR VCA IgG REF 91055 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από : DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy /GK 2/16 SOMMAIRE/ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ
ΑΚΑ ΗΜΙΑ ΕΜΠΟΡΙΚΟΥ ΝΑΥΤΙΚΟΥ ΜΑΚΕ ΟΝΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΜΑ : ΧΗΜΙΚΑ ΠΡΟΣΘΕΤΑ ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΟ ΝΕΡΟ ΤΟΥ ΑΤΜΟΛΕΒΗΤΑ
ΑΚΑ ΗΜΙΑ ΕΜΠΟΡΙΚΟΥ ΝΑΥΤΙΚΟΥ ΜΑΚΕ ΟΝΙΑΣ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΘΕΜΑ : ΧΗΜΙΚΑ ΠΡΟΣΘΕΤΑ ΠΟΥ ΠΡΟΟΡΙΖΟΝΤΑΙ ΓΙΑ ΤΟ ΝΕΡΟ ΤΟΥ ΑΤΜΟΛΕΒΗΤΑ ΣΠΟΥ ΑΣΤΗΣ : ΑΓΟΡΑΣΤΟΣ ΧΡΥΣΟΒΑΛΑΝΤΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ :
ENZYWELL. TREPONEMA IgM. REF (96 tests)
/GK 1/15 ZYWELL TREPONEMA IgM REF 91051 (96 tests) Fabriqué par / Κατασκευάζεται από: DISE Diagnostica Senese Via delle Rose 10 53035 Monteriggioni (Siena) Italy Modifications apportées à la révision courante
Fragen, ob Gebühren anfallen, wenn man in einem bestimmten Land Geld abhebt
- Allgemeines Μπορώ να κάνω ανάληψη στην [χώρα] χωρίς να πληρώσω προμήθεια; Kann ich in [Land] gebührenfrei Geld abheben? Fragen, ob Gebühren anfallen, wenn man in einem bestimmten Land Geld abhebt Πόσα
Niveau A1 & A2 PHASE 3 ΚΡΑΤΙΚΟ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΓΛΩΣΣΟΜΑΘΕΙΑΣ ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΠΑΙ ΕΙΑΣ, ΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΚΑΙ ΘΡΗΣΚΕΥΜΑΤΩΝ
ΥΠΟΥΡΓΕΙΟ ΠΑΙ ΕΙΑΣ, ΙΑ ΒΙΟΥ ΜΑΘΗΣΗΣ ΚΑΙ ΘΡΗΣΚΕΥΜΑΤΩΝ ΚΡΑΤΙΚΟ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΓΛΩΣΣΟΜΑΘΕΙΑΣ Griechisches Ministerium für Bildung, Lebenslanges Lernen und Religionsangelegenheiten Griechisches Staatszertifikat
6.1. Dirac Equation. Hamiltonian. Dirac Eq.
6.1. Dirac Equation Ref: M.Kaku, Quantum Field Theory, Oxford Univ Press (1993) η μν = η μν = diag(1, -1, -1, -1) p 0 = p 0 p = p i = -p i p μ p μ = p 0 p 0 + p i p i = E c 2 - p 2 = (m c) 2 H = c p 2
Section 1: Listening and responding. Presenter: Niki Farfara MGTAV VCE Seminar 7 August 2016
Section 1: Listening and responding Presenter: Niki Farfara MGTAV VCE Seminar 7 August 2016 Section 1: Listening and responding Section 1: Listening and Responding/ Aκουστική εξέταση Στο πρώτο μέρος της
ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ
ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ & ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΚΑΙ ΠΟΤΩΝ Π.Μ.Σ. «ΕΠΙΣΤΗΜΗ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΤΡΟΦΙΜΩΝ & ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΟΥ ΑΝΘΡΩΠΟΥ» Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ
Practice Exam 2. Conceptual Questions. 1. State a Basic identity and then verify it. (a) Identity: Solution: One identity is csc(θ) = 1
Conceptual Questions. State a Basic identity and then verify it. a) Identity: Solution: One identity is cscθ) = sinθ) Practice Exam b) Verification: Solution: Given the point of intersection x, y) of the