ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΣΧΟΛΕΣ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑΤΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΚΑΙ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «Απομόνωση και χαρακτηρισμός συστατικών του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα του είδους Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (Boiss. & Heldr.) Baden» Αντώνιος Μπισκίνης Χημικός Επιβλέπουσα: Φωτεινή Λάμαρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Πάτρα, 2021

2 Πανεπιστήμιο Πατρών, Τμήμα Φαρμακευτικής Αντώνιος Μπισκίνης Με την επιφύλαξη παντός δικαιώματος

3 SCHOOLS OF NATURAL AND HEALTH SCIENCES DEPARTMENTS OF CHEMISTRY, MEDICINE AND PHARMACY POSTGRADUATE PROGRAM «MEDICINAL CHEMISTRY: DRUG DISCOVERY AND DESIGN» MASTER S THESIS «Isolation and characterization of compounds derived from the ethyl acetate extract of the species Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (Boiss. & Heldr.) Baden» Antonios Biskinis Chemist Supervisor: Fotini Lamari, Associate Professor, Department of Pharmacy, University of Patras Patras, 2021

4 University of Patras, Department of Pharmacy Antonios Biskinis All rights reserved

5 ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ Φωτεινή Λάμαρη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Φωτεινή Λάμαρη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Βασιλική Μαγκαφά Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Μανώλης Φουστέρης Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Πατρών SUPERVISOR Fotini Lamari Associate Professor, Department of Pharmacy, University of Patras EXAMINERS COMITTEE Fotini Lamari Associate Professor, Department of Pharmacy, University of Patras Vasiliki Magafa Assistant Professor, Department of Pharmacy, University of Patras Manolis Fousteris Associate Professor, Department of Pharmacy, University of Patras v

6 vi

7 vii Αφιερώνεται στην πολυαγαπημένη μου μητέρα, Δήμητρα.

8 viii

9 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η εκπόνηση της παρούσας διπλωματικής εργασίας έγινε στο Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, με επιβλέπουσα την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα Φωτεινή Λάμαρη. Ήταν ένα πόνημα πολύ σημαντικό για εμένα, καθώς μέσα από χαρές, αλλά κυρίως προκλήσεις και δυσκολίες, μου άνοιξε το δρόμο σε σπουδαία γνώση και εμπειρίες που με έκαναν καλύτερο χημικό και μεγαλύτερο άνθρωπο. Θα ήθελα να πω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στην καθηγήτριά μου, Φωτεινή Λάμαρη για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωματική μου μαζί της, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, τις συμβουλές της και τις γνώσεις που μου μετέδωσε, σε κάθε βήμα, καθώς και την ουσιαστική συμπαράσταση και βοήθειά της όσες φορές χρειάστηκε, πάντα με χαμόγελο, μεγάλη υπομονή, αισιοδοξία και όμορφη, ειλικρινή επικοινωνία. Θα ήθελα ακόμα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της τριμελούς επιτροπής, την Επίκουρη Καθηγήτρια κα Βασιλική Μαγκαφά και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κo Μανώλη Φουστέρη, που βρίσκονταν εκεί για να συνδράμουν σε ό,τι χρειάστηκε κατά τη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου έρευνας. Ένα πολύ μεγάλο, βαθύ ευχαριστώ θα ήθελα να πω στη Δρ. Βιργινία Δημάκη για την πολύ μεγάλη βοήθειά της, την υπομονή, το χαμόγελο και την αισιοδοξία της, αλλά και για την πρακτική βοήθειά της, συνεργασία και συμβουλές σε καθημερινή βάση σε όλο αυτό το ταξίδι, από τις πρώτες μέρες και την εκκίνηση των πειραμάτων, μέχρι και τη συγγραφή της διατριβής. Ακόμα, θα ήθελα να καταγράψω την εκτίμησή μου σε όλους τους συμφοιτητές που βρεθήκαμε μαζί στο εργαστήριο και πιο πολύ στην ομάδα Φαρμακογνωσίας, Ιωάννη Μπακρατσά, Σέργιο Βαρεμένο, Ιωάννα Αυγέρη, Μαρία Γκιώνη για την εξαιρετική επικοινωνία και συνεργασία και το πολύ όμορφο κλίμα που είχαμε ανελλιπώς. Ένα μεγάλο ευχαριστώ θα ήθελα να πω ακόμα στη συμφοιτήτρια Έφη Σταμοπούλου για την πολύ όμορφη παρέα, βοήθεια και συνεργασία. Ευχαριστώ ακόμα τη Δρ. Κωνσταντίνα Ζέλιου για τις γνώσεις που μου μετέδωσε και τη Δρ. Κατερίνα Ανδρεοπούλου από το Κέντρο Ενόργανης Ανάλυσης του Πανεπιστημίου Πατρών για την πολύ σημαντική συνεργασία της. ix

10 Ιδιαίτερα σημαντικοί ήταν και είναι οι φίλοι, χωρίς τους οποίους καμία χαρά δεν έχει νόημα και καμία θλίψη δε μετριάζεται. Ευχαριστώ πολύ για τη φιλία τους, την αγάπη τους και τη βαθιά συμπαράστασή τους, τους: Γιάννη, Αλέξανδρο, Άμνερις, Μαρία, Κατερίνα, Χριστίνα, Πωλ και Στέλιο. Τέλος, τη μεγαλύτερη ευγνωμοσύνη μου θέλω να εκφράσω στην οικογένειά μου, τη μητέρα μου Δήμητρα πάνω από όλους, τον πατέρα μου Μαρίνο και την αδερφή μου Αθηνά. Χωρίς την υλική στήριξη και τεράστια βοήθεια πολλών ετών, αλλά και ουσιαστική στήριξη ως άνθρωπο, στις επιλογές μου, από τους γονείς μου και τη βοήθεια και συμπαράσταση από την αδερφή μου, δε θα μπορούσα να υλοποιήσω αυτόν τον σημαντικό στόχο. Τους ευχαριστώ από τα βάθη της καρδιάς μου. Αντώνης Μπισκίνης, Ιούλιος 2021 x

11 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Αντικείμενο της παρούσας διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε το ενδημικό είδος της Πελοποννήσου Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, από το όρος Χελμός. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε το πιο άπολο κλάσμα του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα των εναέριων τμημάτων του φυτού και πιο συγκεκριμένα ένα υποκλάσμα αυτού, με στόχο τον χαρακτηρισμό και απομόνωση όσων ενώσεων ήταν δυνατό και την αξιολόγηση των τελικών ενώσεων ή κλασμάτων ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση, που εμπλέκεται φαρμακολογικά στη νευροδιαβίβαση. Προκειμένου να επιτευχθεί ο παραπάνω στόχος, πραγματοποιήθηκαν δύο κλασματώσεις με υγρή χρωματογραφία στήλης, ενώ προηγήθηκε εκτενής μελέτη με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Κατά τη διάρκεια της μελέτης με TLC, δοκιμάστηκε πληθώρα διαλυτών, μειγμάτων έκλουσης και αντιδραστηρίων εμφάνισης. Το αρχικό άπολο κλάσμα, που υποβλήθηκε στην πρώτη κλασμάτωση, έφερε πολύ μεγάλο αριθμό ενώσεων και βρισκόταν σε περιορισμένη ποσότητα. Το τελικό κλάσμα προς μελέτη, έφερε ακόμα μεγάλο αριθμό ενώσεων, γεγονός που αποτέλεσε ένδειξη της υψηλής χημειοποικιλότητας που έχει το είδος. Ταυτόχρονα, η ιδιαίτερα περιορισμένη διαθέσιμη ποσότητα φυτικού υλικού δεν επέτρεψε την απομόνωση καθαρής ένωσης. Προκειμένου να απλοποιηθεί περαιτέρω, ώστε να γίνει εφικτός ο χαρακτηρισμός των ενώσεών του, το τελικό κλάσμα υποβλήθηκε εκ νέου σε κλασμάτωση. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε για τα τελικά υποκλάσματα αυτού, μέθοδος UHPLC-DAD-ESI/MS ανάλυσης, ώστε να δοθεί η δυνατότητα άντλησης όσο το δυνατόν περισσότερων ποιοτικών-δομικών πληροφοριών για τις ενώσεις τους, με τη συνδρομή υπολογιστικά προβλεπόμενων, θεωρητικών φασμάτων μαζών. Τέλος, ελέγχθηκε η ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστεράσης από τα τελικά κλάσματα, με μια παραλλαγή της μεθόδου Ellman. Η χρωματογραφική ανάλυση έδειξε ότι τα τελικά κλάσματα περιείχαν συνολικά 30 διαφορετικές κορυφές, από τις οποίες μελετήθηκαν οι κυριότερες 23. Οι πιθανές ενώσεις που μπόρεσαν να αποδοθούν από τη σχετική βιβλιογραφία, ήταν στην πλειοψηφία τους διτερπενοειδή, δύο γλυκοζίτες φλαβονοειδών και μία κουμαρίνη. Τέλος, όλα τα τελικά κλάσματα επέδειξαν μέτρια προς χαμηλή ικανότητα αναστολής της ακετυλοχολινεστρεάσης, με εξαίρεση ένα από αυτά, το οποίο είχε μέτρια μεν, αλλά σημαντικά μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής. Το γεγονός αυτό θα μπορούσε να xi

12 οφείλεται στο αξιοσημείωτο εύρημα σε αυτό, μιας άγνωστης ένωσης που θα μπορούσε να αφορά ένα αλκαλοειδές διτερπένιο. Λέξεις κλειδιά: Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, τσάι του βουνού, υγρή χρωματογραφία στήλης, UHPLC-DAD-ESI/MS, φυσικά προϊόντα, διτερπένια, αντιχολινεστερασική δράση. xii

13 ABSTRACT The subject of this dissertation was the endemic species of Peloponnese, Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, from Mount Helmos. In particular, this study focused on the most non-polar fraction of the ethyl acetate extract of the aerial parts of the plant and more specifically on a subfraction of it, with the aim of characterizing and isolating as many compounds as possible and evaluating their ability to inhibit acetylcholinesterase, which is involved in neurotransmission. To achieve the above objective, two fractionations were performed by column chromatography, after an extensive study by thin layer chromatography. During the TLC study, a variety of solvents, eluents and TLC-stains were tested. The initial non-polar fraction was in a limited quantity but was subjected to the first fractionation, and the results showed that it comprised a very large number of compounds. Its final fraction still contained many compounds, which is an indication of the high chemovariability of the species. At the same time, the very limited amount of plant material available did not allow the isolation of any pure compound. In order to make the characterization of its compounds feasible, the final fraction was re-fractionated. Subsequently, a UHPLC- DAD-ESI / MS analysis method was developed for its final subfractions through which qualitative-structural information about their compounds was obtained. In support of this process, computationally predicted, theoretical mass spectra were used. Finally, the ability of the final fractions to inhibit acetylcholinesterase was tested with a modification of the Ellman method. The results from the chromatographic analysis showed that the final fractions contained a total of 30 different peaks, of which the major 23 were further studied. The possible compounds that could be attributed to the peaks, according to the relevant literature, were mostly diterpenoids, two flavonoid glycosides and one coumarin. Regarding their activity, all final fractions showed moderate to low acetylcholinesterase inhibitory capacity, except for one, which had a moderate but significantly higher inhibitory capacity. This could be due to the remarkable finding in it, of an unknown compound that could be related to an alkaloid diterpene. xiii

14 Key words: Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, mountain tea, column chromatography, UHPLC-DAD-ESI/MS, natural products, diterpenes, anticholinesterase activity. xiv

15 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΟΡΩΝ ssp. υποείδος subspecies GC-MS LC-MS MIC IC50 Αέρια Χρωματογραφία- Φασματομετρία Μάζας Υγρή Χρωματογραφία- Φασματομετρία Μάζας Ελάχιστη Συγκέντρωση Αναστολής Συγκέντρωση Αναστολής Κατά 50 % Gas Chromatography- Mass Spectrometry Liquid Chromatography- Mass Spectrometry Minimum Inhibitory Concentration Half-Maximal Inhibitory Concentration MDA Μηλονική Διαλδεΰδη Malondialdehyde GSH Ανηγμένη Γλουταθειόνη Glutathione Reduced ΑΡΡ MWM Πρόδρομος Πρωτεΐνη Αμυλοειδούς Υδάτινος Λαβύρινθος κατά Morris Amyloid-beta Precursor Protein Morris Water Maze AD Νόσος Αλτσχάιμερ Alzheimer s Disease CNS-ΚΝΣ Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Central Nervous System MCI Ήπια Γνωστική Εξασθένηση Mild Cognitive Impairment FDA Αμερικανικός Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων U.S. Food and Drug Administration EMA HPLC TLC Ευρωπαϊκός Οργανισμός Φαρμάκων Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης Χρωματογραφία Λεπτής Στοιβάδας European Medicines Agency High Performance Liquid Chromatography Thin Layer Chromatography xv

16 CC Υγρή Χρωματογραφία Στήλης Column Chromatography UHPLC UHPLC-MS Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης- Φασματομετρία Μάζας Ultra High Performance Liquid Chromatography Ultra High Performance Liquid Chromatography- Mass Spectrometry ESI Ιονισμός Ηλεκτροψεκασμού Electrospray Ionization RSLC Υγρή Χρωματογραφία Ταχέως Διαχωρισμού Rapid Separation Liquid Chromatography UV Υπεριώδες Ultraviolet Vis Ορατό Visible DAD Ανιχνευτής Συστοιχίας Διόδων Diode Array Detector xvi

17 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 1 ΤΟ ΓΕΝΟΣ SIDERITIS... 2 ΒΟΤΑΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ... 3 ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΕΞΑΠΛΩΣΗ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ... 4 ΤΟ ΕΙΔΟΣ SIDERITIS CLANDESTINA (BORY & CHAUB.) HAYEK... 6 ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS... 8 ΔΙΤΕΡΠΕΝΟΕΙΔΗ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) ΣΠΑΣΜΟΛΥΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) ΓΑΣΤΡΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗΣ ΔΡΑΣΗ (in vivo) ΝΕΥΡΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΑΠΟ ΤΟ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ (in vivo) ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗΣ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΝ (in vivo) ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΕΠΑΝΑΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΜΟΝΟΑΜΙΝΩΝ (in vitro) ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ AMPA-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΗΣ (ex vivo) ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗΣ (AChE) Η ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗ ΩΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΗΣ ΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΕΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ (ACh) ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΑChE ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ AChE AΠΟ ΤΟ ΓΕΝΟΣ SIDERITIS ΣΚΟΠΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΟΡΓΑΝΑ ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΙ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ - THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ COLUMN CHROMATOGRAPHY (CC) ΚΛΑΣΜΑ ΑΒ ΚΛΑΣΜΑ ΑΒ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ, ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ (UHPLC-MS) ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΜΑΖΩΝ ΠΙΘΑΝΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ELLMAN ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ ΑΠΟ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΟ ΧΕΛΙ (eeache), in vitro xvii

18 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΡΟΓΕΝΕΣΤΕΡΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ SIDERITIS CLANDESTINA SSP. PELOPONNESIACA ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΒ ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ ΑΒ ΔΟΚΙΜΕΣ ΠΡΙΝ ΤΗ ΣΤΗΛΗ ΣΤΟ ΑΒ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΣΤΗΛΗΣ ΣΤΟ ΑΒ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΒ15-17 ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΠΡΙΝ ΤΗ ΣΤΗΛΗ ΣΤΟ ΑΒ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΣΤΗΛΗΣ ΣΤΟ ΑΒ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ UHPLC-MS ΓΙΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΑΒ ΔΟΚΙΜΕΣ Uo ΚΑΙ Uo ΔΟΚΙΜΗ U ΔΟΚΙΜΗ U ΔΟΚΙΜΗ U ΔΟΚΙΜΗ U ΔΟΚΙΜΗ U5 ΤΕΛΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΚΟΡΥΦΩΝ ΠΙΘΑΝΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΑΝΑ ΚΛΑΣΜΑ ΚΑΙ ΣΕΙΡΑ ΕΚΛΟΥΣΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΙΘΑΝΟΤΕΡΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΚΟΡΥΦΗ ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΚΛΑΣΜΑ F ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΤΗΣ ACHE ΑΠΟ ΤΑ ΚΛΑΣΜΑΤΑ F3-F ΣΥΝΟΨΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ xviii

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟ ΓΕΝΟΣ SIDERITIS Ο Σιδηρίτης (τσάι του βουνού) είναι ένα γένος ανθοφόρων φυτών, γνωστών για την παραδοσιακή τους χρήση, ως αρωματικό τσάι βοτάνων, από την αρχαιότητα. Το όνομα του γένους εκτιμάται ότι προέρχεται από την ελληνική λέξη «Σίδερος» λόγω της φερόμενης αποτελεσματικότητάς του στη θεραπεία πληγών προερχόμενων από μέταλλο, με το Διοσκουρίδη να προτείνει το έγχυμά του σε τραυματισμένους στρατιώτες ως αναζωογονητική βοήθεια για την ταχύτερη και πληρέστερη ανάρρωσή τους, τον 1 ο αιώνα μ.χ., στο βιβλίο του De Materia Medica [González-Burgos et al., 2011]. Τo γένος Sideritis απαριθμεί πάνω από 150 είδη θάμνων ή ποών, πολυετών ή μονοετών [Mendoza-Heuer et al., 1977]. Διαιρείται σε δύο υπογένη, τα Sideritis και Leucophae. Το πρώτο αποτελείται από τέσσερις ομάδες: Hesiodia, Burgsdorffia, Empedoclea, Sideritis και 125 είδη που κατανέμονται στη Βόρεια Αφρική, στην Ιβηρική Χερσόνησο, στις Μεσογειακές χώρες και τη Μέση Ανατολή [Obón de Castro C. Rivera- Núñez, 1994], [Morales et al., 2010]. Το δεύτερο, με τρεις ομάδες, Cretica, Empedocleopsis και Marrubiastrum, περιλαμβάνει τα είδη της περιοχής της Μακαρονησίας (μόνο στις Κανάριες νήσους και στη Μαδέρα) (Εικόνα 1). [Huynh et al., 1972], [Perez de Paz, Negrin Sosa, 1992]. Εικόνα 1. Γεωγραφική κατανομή του γένους Sideritis. [Barber et al., 2002] 2

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΟΤΑΝΙΚΗ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ Τα φυτά του γένους Sideritis αναπτύσσονται ιδανικά υπό άφθονη ηλιοφάνεια και είναι καλά προσαρμοσμένα σε συνθήκες ξηρασίας. Απαντώνται σε βραχώδεις πλαγιές και βοσκοτόπους, σε υψόμετρο μέχρι και περισσότερο από 3000 μέτρα από το επίπεδο της θάλασσας, ενώ ευνοούνται από εδάφη με μέτρια ποσότητα θρεπτικών συστατικών και ελαφρώς αλκαλικό ph [Davis et al., 1982], [Davis et al., 1988]. Καλλιεργούνται μερικά μόνο από τα είδη του γένους στην Ελλάδα και τη Βουλγαρία, μεταξύ των οποίων τα Sideritis scardica Griseb., Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek, Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. και Sideritis syriaca L. [Bojovic et al., 2011]. ΒΟΤΑΝΙΚΗ ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Σύμφωνα με το Angiosperm Phylogeny Group IV system, 2016 (APG IV system), το γένος ταξινομείται συστηματικά ως εξής: Βασίλειο Άθροισμα Υποάθροισμα Υπερομάδα Ομάδα Τάξη Οικογένεια Υποοικογένεια Γένος Φυτά (Plantae) Αγγειόσπερμα (Angiospermae ή Magnoliophyta) Μεσαγγειόσπερμα ( Mesangiospermae) Αστερίδες (Asterides) Λαμιίδες (Lamiides) Λαμιώδη (Lamiales) Χειλανθή (Lamiaceae) Λαμιώδη (Lamioideae) Σιδηρίτης (Sideritis L.) 3

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΕΞΑΠΛΩΣΗ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Στην Ελλάδα απαντώνται 16 taxa, που ανήκουν σε 12 διαφορετικά είδη. Από αυτά, 5 είναι ενδημικά. Πιο αναλυτικά παρατίθενται παρακάτω: Sideritis albiflora Hub.-Mor., ανατολικής Μεσογείου. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στα νησιά του ανατολικού Αιγαίου πελάγους. Sideritis curvidens Stapf, ανατολικής Μεσογείου. Συνώνυμο: Sideritis romana subsp. curvidens (Stapf) Holmboe. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στα νησιά ολόκληρου του Αιγαίου πελάγους, του Ιονίου πελάγους και σε ολόκληρη την ηπειρωτική χώρα, εκτός της Ηπείρου. Sideritis lanata L., Βαλκανίων και Μ. Ασίας. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στα νησιά του Βόρειου και Ανατολικού Αιγαίου πελάγους, στις Κυκλάδες, καθώς επίσης και στη βορειοανατολική ηπειρωτική χώρα και την Πελοπόννησο. Sideritis montana L., με τα δύο υποείδη του: Sideritis montana L. subsp. montana, Μεσογείου και νοτιοδυτικής Ασίας. Στην Ελλάδα εντοπίζεται σε ολόκληρες τις: Στερεά Ελλάδα, Ήπειρο και Μακεδονία. Sideritis montana subsp. remota (d'urv.) P.W. Ball, Μεσογείου και νοτιοδυτικής Ασίας. Συνώνυμο: Sideritis remota d Urv. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στην Πελοπόννησο, τη Στερεά Ελλάδα, την Εύβοια, τα νησιά Βορείου, Ανατολικού και Δυτικού Αιγαίου πελάγους, στη Βόρεια Κεντρική Ελλάδα και στη Βορειοανατολική ηπειρωτική χώρα. Sideritis perfoliata L., με τα δύο υποείδη του: Sideritis perfoliata subsp. athoa (Papan. & Kokkini), Βαλκανίων και Μ. Ασίας. Συνώνυμο: Sideritis athoa Papan. & Kokkini. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στη βορειοανατολική ηπειρωτική χώρα και τα νησιά του βορειοανατολικού Αιγαίου. Sideritis perfoliata L. subsp. perfoliata, Ανατολικής Μεσογείου. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στην Ήπειρο, στην περιοχή της Νότιας Πίνδου. Sideritis purpurea Benth., Βαλκανίων. Συνώνυμο: Sideritis romana subsp. purpurea (Benth.) Heywood. Στην Ελλάδα εντοπίζεται σε ολόκληρη την ηπειρωτική χώρα, στα νησιά του Ιονίου πελάγους, του Δυτικού Αιγαίου πελάγους και την Εύβοια. 4

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Sideritis scardica Griseb., Βαλκανίων. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στην ανατολική κεντρική, βόρεια κεντρική και βορειοανατολική ηπειρωτική χώρα, καθώς στα νησιά του βορειοανατολικού Αιγαίου. Sideritis sipylea Boiss., ανατολικής Μεσογείου. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στα νησιά του ανατολικού Αιγαίου πελάγους. Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek, με τα δύο υποείδη του: Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek subsp. clandestina, ενδημικό. Συνώνυμα: Phlomis clandestina Bory & Chaub., Sideritis cretica Sm. [non Sideritis cretica L.], Sideritis syriaca Bory & Chaub. [non Sideritis syriaca L.], Sideritis theezans Boiss. & Heldr. Εντοπίζεται αποκλειστικά στην Πελοπόννησο. Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (Boiss. & Heldr.) Baden, ενδημικό. Συνώνυμα: Sideritis peloponnesiaca Boiss. & Heldr., Sideritis theezans subsp. peloponnesiaca (Boiss. & Heldr.) Bornm., Sideritis clandestina subsp. cyllenea (Boiss.) Papan. & Kokkini. Εντοπίζεται αποκλειστικά στην Πελοπόννησο. Sideritis euboea Heldr., ενδημικό. Εντοπίζεται στα νησιά του δυτικού Αιγαίου πελάγους και την Εύβοια. Sideritis raeseri Boiss. & Heldr., με τα δύο υποείδη του: Sideritis raeseri subsp. attica (Heldr.) Papan. & Kokkini, ενδημικό. Εντοπίζεται αποκλειστικά στη Στερεά Ελλάδα. Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. subsp. raeseri, Βαλκανίων. Στην Ελλάδα εντοπίζεται στη Στερεά Ελλάδα, σε όλη την έκταση της Πίνδου και στη βόρεια κεντρική ηπειρωτική χώρα. Sideritis syriaca L. subsp. syriaca, ενδημικό. Εντοπίζεται αποκλειστικά στην Κρήτη και την Κάρπαθο. [Dimopoulos et al., 2016] 5

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟ ΕΙΔΟΣ SIDERITIS CLANDESTINA (BORY & CHAUB.) HAYEK Το ενδημικό είδος των βουνών της Πελοποννήσου, Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek, εντοπίζεται στις αλπικές και υποαλπικές ζώνες και αυτοφύεται σε πετρώδη σημεία εντός λιβαδιών. Η περίοδος ανθοφορίας του είναι από την αρχή του Ιουλίου έως τα μέσα Αυγούστου. Είναι μια πολυετής, χνουδωτή πόα, με γκρι ή κιτρινωπό χρώμα. Εμφανίζει τα παρακάτω βοτανικά χαρακτηριστικά [Papanikolaou, Kokkini, 1982]: Βάση του στελέχους: Σχετικά ξυλώδης. Παράγει αρκετούς ανερχόμενους βλαστούς, μήκους cm, με ή χωρίς διακλάδωση. Φύλλα της βάσης: Μετρίως παχιά, πυκνά τριχώδεις, οδοντωτά ή ενιαία, επιμήκη-πεπλατυσμένα, αμβλεία, ιδιαίτερα απότομα προσαρτημένα σε μακρύ μίσχο, με μέγεθος x mm (συμπεριλαμβανομένου του μίσχου). Ανώτερα φύλλα: σχεδόν άμισχα, κυκλικά προς αμβλυμμένα στη βάση, λογχοειδή ή επιμήκη-λογχοειδή, υποξικά, μεγέθους x mm. Ταξιανθία: Συνήθως χωρίς διακλάδωση. Σπόνδυλοι ταξιανθίας: Συναθροισμένοι ή μη συναθροισμένοι. Βράκτια: Ωοειδείς-τριγωνικά, μήκους 5-15 mm, 2-3 φορές το μήκος των ανθών, τα οποία γίνονται κοντύτερα και στενότερα προς την κορυφή της ταξιανθίας. Κάλυκας: Πυκνά τριχοειδής σε ολόκληρη την επιφάνειά του, με τριχίδια μήκους 1-3 mm, στενά καμπανοειδής με μήκος 7-11 mm, με οδόντες μήκους 3-5 mm. Στεφάνη: Κίτρινη με δύο ρίγες στα δύο λοβία του πάνω χείλους, με μήκος mm. Το είδος Sideritis clandestina διαθέτει δύο υποείδη, το πιο διαδεδομένο ssp. peloponnesiaca (Eικόνες 2α, 2β) και το ssp. clandestina (Eικόνες 3α, 3β). Οι βασικές διαφορές τους έγκεινται στα εξής χαρακτηριστικά: To ssp. clandestina διαθέτει συναθροισμένους σπονδύλους ταξιανθίας, βράκτια ιδιαίτερα πυκνώς τριχοειδή, μεγέθους x mm, φύλλα του μίσχου ισομήκη ή μακρύτερα από τα μεσογονάτια διαστήματα, ενώ το ssp. peloponnesiaca διαθέτει μη συναθροισμένους σπονδύλους 6

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ταξιανθίας, τριχοειδή βράκτια μεγέθους x mm και φύλλα του μίσχου κοντύτερα από τα μεσογονάτια διαστήματα. Eικόνες 2α, 2β. Φωτογραφίες του Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca (Boiss. & Heldr.), από το όρος Κυλλήνη (Ζήρεια) του νομού Κορινθίας, στο οροπέδιο Λιβάδι, σε υψόμετρο 1550 m [Dimopoulos et al., 2013] Eικόνες 3α, 3β. Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek subsp. clandestina, από το όρος Ταΰγετος, σε υψόμετρο m [Dimopoulos et al., 2013]. 7

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΣΥΣΤΑΣΗ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS Όσον αφορά τη χημική σύσταση του γένους, έχουν απομονωθεί από τα μεσογειακά είδη οι εξής δευτερογενείς μεταβολίτες: Φλαβονοειδή Στερόλες Φαινυλοπροπανοειδή (και κουμαρίνες) Μεταλλικά στοιχεία Τερπένια (μονοτερπένια, σεσκιτερπένια, διτερπένια, τριτερπένια) Tα υδατικά εκχυλίσματα έξι διαφορετικών ειδών Sideritis που ευδοκιμούν στην Ελλάδα: Sideritis clandestina subsp. clandestina, Sideritis euboea, Sideritis perfoliata subsp. perfoliata, Sideritis raeseri subsp. raeseri, Sideritis scardica και Sideritis syriaca έχει βρεθεί ότι περιλαμβάνουν σχεδόν τους ίδιους δευτερογενείς μεταβολίτες με μικρές μόνο διαφορές ως προς τη σχετική ποσότητά τους [Papaefstathiou et al., 2014]. ΑΙΘΕΡΙΟ ΕΛΑΙΟ Όσον αφορά τη σύσταση του αιθέριου ελαίου, υπάρχουν διαφορές στις δημοσιευμένες μελέτες οι οποίες πηγάζουν κύρια από το διαφορετικό φυτικό υλικό και γενότυπο, την εποχή συλλογής, τον τρόπο απομόνωσης του αιθερίου ελαίου και τον τρόπο ανάλυσης. Ενδεικτικά, σύμφωνα με τη μελέτη [Fraga et al., 2012], τo αιθέριο έλαιο του Sideritis scardica (0,03%) περιέχει κυρίως β-πινένιο (17,9%), καρβακρόλη (14,8%) και α-πινένιο, ενώ σύμφωνα με τη μελέτη [Kostandinova et al., 2007], το αιθέριο έλαιο των ειδών S. scardica και S. raeseri από τη Βουλγαρία και τη Βόρεια Μακεδονία αποτελείται από διτερπένια. Το έλαιο του S. raeseri περιέχει σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σεσκιτερπένια, με κύριες ενώσεις τη germacrone (25%) και την elemol acetate (15,9%). Στο έλαιο του S. pisidica, κύρια συστατικά είναι τα: δ-cadinene (19,5%), τ-cadinol (16,7%) και β-cubenene (10,4%) [Deveci et al., 2017], στο έλαιο του S. albiflora κύρια ένωση είναι το β-caryophyllene (21,2%) και στο έλαιο του S. leptoclada κυριαρχεί το germacrene D (17,9%) [Deveci et al., 2019]. Στη διδακτορική διατριβή [Δημάκη, 2019], στο αιθέριο έλαιο ολόκληρης της δρόγης του S. clandestina ssp. peloponnesiaca, ταυτοποιήθηκαν 72 συστατικά, στην πλειονότητά τους τερπένια. Τα κυριότερα ήταν τα: β-καρυοφυλλένιο (12,30%), α-πινένιο (8,14%), γερμακρένιο 8

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (4,44%), δικυκλογερμακρένιο (4,10%), β-πινένιο (4,01%), οξείδιο του καρυοφυλλενίου (3,85%) και δ-καδινένιο (3,58%). ΦΛΑΒΟΝΟΕΙΔΗ Τα κύρια φλαβονοειδή που έχουν απομονωθεί από είδη του γένους Sideritis είναι οι 7-Ο-γλυκοζίτες δύο τύπων φλαβονών, ο πρώτος με 8-ΟΗ (hypolaetin, isoscutellarein και τα μεθοξυ-παράγωγά τους) και ο δεύτερος με 5,7-ΟΗ (apigenin και luteolin, με το μεθοξυ-παράγωγό της, chrysoeriol). Συνοπτικά, έξι ακετυλιωμένοι 7-Ο-διγλυκοζίτες των apigenin και isoscutellarein και τέσσερα ισομερή της apigenin 7-O-(coumaroyl) glucopyranoside, μαζί με την apigenin 7-O-acetylcoumaroyl allosyl (1 2) glucoside είναι τα κύρια φλαβονοειδή [Petreska et al., 2011a], [Bojovic et al.,2011], [Yaneva, Balabanski, 2013], Fraga, 2012], [Vassilopoulou et al., 2013], [Papaeftastathiou et al., 2014]. ΣΤΕΡΟΛΕΣ Ενδεικτικές ενώσεις της κατηγορίας των στερολών, που έχουν απομονωθεί από το γένος Sideritis είναι οι: campesterol, stigmasterol και β-sitosterol [Chinou, 2016]. ΦΑΙΝΥΛΟΠΡΟΠΑΝΟΕΙΔΗ Ενδεικτικά φλαβονοειδή που έχουν απομονωθεί από το γένος Sideritis είναι υδροξυκινναμικά οξέα και φαινυλαιθανοειδείς γλυκοζίτες [Chinou, 2016]. ΜΕΤΑΛΛΙΚΑ ΣΤΟΧΕΙΑ Σε υδατικά εκχυλίσματα αποξηραμένων υπέργειων τμημάτων του γένους Sideritis έχουν προσδιοριστεί είκοσι μεταλλικά στοιχεία. Τα πιο άφθονα είναι κατά σειρά τα: K>Ca>Mg>P>Fe>Al>Na [Bojovic et al., 2011], [Yaneva, Balabanski, 2013]. 9

28 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΕΡΠΕΝΙΑ Τα τερπένια συνιστούν τη μεγαλύτερη κατηγορία δευτερογενών μεταβολιτών. Η δομική μονάδα του ανθρακικού σκελετού τους είναι το ισοπρένιο (C5H8). Ο όρος «τερπένια» αναφέρεται στους απλούς υδρογονάνθρακες με πολλαπλές μονάδες ισοπρενίου, ενώ ο όρος «τερπενοειδή» αφορά τροποποιημένα τερπένια, που φέρουν ποικίλες λειτουργικές ομάδες, καθώς και οξειδωμένη μεθυλο-ομάδα, η οποία έχει μετακινηθεί ή αφαιρεθεί από διάφορες θέσεις του σκελετού τους. Ανάλογα με τον αριθμό των μονάδων ισοπρενίου που φέρουν, τα τερπένια-τερπενοειδή κατατάσσονται στις εξής κατηγορίες (Εικόνα 4) [Perveen, 2018]: Μονοτερπένια, 2 μονάδες ισοπρενίου, C10H16 Σεσκιτερπένια, 3 μονάδες ισοπρενίου, C15H24 Διτερπένια, 4 μονάδες ισοπρενίου, C20H32 Τριτερπένια, 6 μονάδες ισοπρενίου, C30H48 Τετρατερπένια, 8 μονάδες ισοπρενίου, C40H64 10

29 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 4. Κατηγορίες τερπενοειδών ανάλογα με τις μονάδες ισοπρενίου από τις οποίες αποτελούνται. 11

30 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι μέθοδοι εκχύλισης και ανάλυσης των τερπενοειδών εξαρτώνται κυρίως από τις πολικότητές τους. Πτητικά ή άπολα τερπενοειδή εκχυλίζονται με υδρόφοβους διαλύτες και αναλύονται-ποσοτικοποιούνται με χρήση της τεχνικής GC-MS. Αντίθετα, τα πολικά τερπενοειδή αναλύονται κυρίως με την τεχνική LC-MS [Louie et al., 2020]. ΔΙΤΕΡΠΕΝΟΕΙΔΗ Το γένος Sideritis είναι ιδιαίτερα πλούσιο σε διτερπενοειδή. Απαντώνται σε σχεδόν όλα τα είδη του, έχουν απομονωθεί περισσότερα από 160 και εμφανίζουν ποικιλία στους ανθρακικούς σκελετούς τους, με τα περισσότερα να έχουν την ent διαμόρφωση (εναντιομερή του μητρικού τερπενίου) [Piozzi et al., 2006]. Οι κατηγορίες διτερπενοειδών που έχουν βρεθεί στα είδη του Sideritis είναι οι: λαβδάνια και οξείδια λαβδανίων, ent-καουράνια, ent-μπεγεράνια, ent-τραχιλομπάνια, ent-πιμαράνια, entροζάνια και ent-ατισάνια. ΛΑΒΔΑΝΙΑ ΟΞΕΙΔΙΑ ΛΑΒΔΑΝΙΩΝ Στην Εικόνα 5 παρουσιάζεται ο βασικός ανθρακικός σκελετός της κατηγορίας των λαβδανίων-οξειδίων λαβδανίων. Πλήθος αυτών έχει απομονωθεί από ισπανικά taxa του γένους Sideritis. Εικόνα 5. Δομή του διτερπενίου λαβδάνιο, που φέρει το μητρικό σκελετό των διτερπενοειδών λαβδανίων-οξειδίων λαβδανίων. Χαρακτηριστικές ενώσεις αυτής της κατηγορίας είναι οι: villenol, villenolone, andalusol, isoandalusol-6-monoacetate, 6-deoxyandalusal, 6-deoxyandalusoic acid, borjatriol, varol, varodiol, ribenol, ent-13-epi-manoyl oxide 18-acid, barbatol, 3α- 12

31 ΕΙΣΑΓΩΓΗ hydroxy-ent-manoyl oxide, jabugodiol, 13-epi-jabugodiol, 13-epi-jabugotriol [Fraga, 2012]. ΚΑΟΥΡΑΝΙΑ Στη συνέχεια, παρουσιάζονται διτερπενοειδή με ανθρακικό σκελετό της κατηγορίας των καουρανίων (Εικόνα 6), που έχουν απομονωθεί από διάφορα είδη του γένους Sideritis. Εικόνα 6. Δομή του διτερπενίου ent-καουράνιο, που φέρει το μητρικό σκελετό των διτερπενοειδών ent-καουρανίων. Ενδεικτικά διτερπενοειδή με ανθρακικό σκελετό της κατηγορίας των ent-καουρ- 16-ενίων, που έχουν απομονωθεί από ισπανικά taxa του γένους Sideritis είναι τα: foliol, sidol, linearol, leucanthol, leucanthol-7,18-diacetate, leucanthol-3-monoacetate, leucanthol-18-monoacetate, 11α,18-dihydroxy-ent-kaur-16-ene, eubotriol, eubol, candol B, epicandicandiol, epicandicandiol-7-monoacetate, candidiol. Mία άλλη σημαντική κατηγορία είναι αυτή των ent-καουρ-15-ενίων (ισοκαουρενίων), με χαρακτηριστικούς εκπροσώπους τα: isofoliol, isosidol, isolinearol, isoleucanthol, funkiol, sidofunkiol, sideridiol, siderol, sideroxol, από τα ισπανικά είδη και sidol, linearol, isofoliol, isolinearol, leucanthol-18-monoacetate, sideridiol, siderol, sideripol, sideroxol, sideritriol, ucriol, sideron, eubotriol, eubol από ελληνικά και ιταλικά είδη [Fraga, 2012]. 13

32 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΠΕΓΕΡΑΝΙΑ ΑΤΙΣΑΝΙΑ Δύο ακόμα κατηγορίες διτερπενοειδών που έχουν απομονωθεί από διάφορα ισπανικά είδη του γένους Sideritis είναι τα μπεγεράνια και ατισάνια (Εικόνα 7) και παρουσιάζονται παρακάτω. Εικόνα 7. Δομές του διτερπενίου ent-μπεγεράνιο (αριστερά) και ent-ατισάνιο (δεξιά), που φέρουν τους μητρικούς σκελετούς των διτερπενοειδών ent-μπεγερανίων και ent-ατισανίων. Όσον αφορά τα μπεγεράνια, χαρακτηριστικά διτερπενοειδή απομονωμένα από ισπανικά taxa, με ανθρακικό σκελετό της κατηγορίας των 17-υδροξυ-ent-μπεγερ-15- ενίων, είναι τα: tobarol, benuol, conchitriol, jativatriol, jativatriol-1-monoacetate, jativatriol-12-monoacetate, jativatriol-1,12-diacetate και jativatriol-1,17-diacetate και της κατηγορίας των 14α-υδροξυ-ent-μπεγερ-15-ενίων είναι τα: tartessol, pusillatriol, pusillatriol-7-monoacetate, pusillatriol-14-monoacetate, isopusillatriol, isopusillatriol- 14-monoacetate, isopusillatriol-3-monoacetate, pusillatetrol, pusillatetrol-7- monoacetate, pusillatetrol-14-monoacetate και διακετυλιωμένες μορφές των isopusillatriol και pusillatetrol. Όσον αφορά τα ατισάνια, κύριοι εκπρόσωποι από ισπανικά taxa, με ανθρακικό σκελετό της κατηγορίας των ent-ατισ-13-ενίων, είναι τα: serradiol, sideritol, sideritol-1- monoacetate, sideritol-1,17-diacetate, isosideritol και atisideritol [Fraga, 2012]. 14

33 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΡΑΧΙΛΟΜΠΑΝΙΑ Ακολούθως, παρουσιάζεται μία ακόμα κατηγορία διτερπενοειδών που έχει απομονωθεί από διάφορα είδη του γένους Sideritis, τα τραχιλομπάνια (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Δομή του διτερπενίου ent-τραχιλομπάνιο, που φέρει το μητρικό σκελετό των διτερπενοειδών ent-τραχιλομπανίων. Συγκεκριμένα, έχουν απομονωθεί από το είδος S. canariensis Ait. τα: trachinol, trachinodiol και 7β-acetyl-trachinodiol, από το είδος S. canariensis var. pannosa τα: trachinodiol 18-palmitate, trachinodiol 18-formate-7β-acetate και trachinol acetate, από το είδος S. soluta Clos. το trachilobane και από το είδος S. ferrensis P. Pérez et. L. Negrín, το trachinol diacetate [Δημάκη, 2019]. ΡΟΖΑΝΙΑ Κάποια χαρακτηριστικά ροζάνια διτερπενοειδή, που έχουν απομονωθεί από το γένος Sideritis και προέρχονται από το σκελετό του ent-ροζανίου (Εικόνα 9), είναι τα: lagascatriol και lagascol. Το lagascatriol έχει απομονωθεί από τα είδη S. angustifolia Lag., S. tragoriganum και S. serrata Lag. To lagascol έχει απομονωθεί από το S. serrata και S. reverchonii Willk [Fraga, 2012]. 15

34 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 9. Δομή του διτερπενίου ent-ροζάνιο, που φέρει το μητρικό σκελετό των διτερπενοειδών ent-ροζανίων. ΠΙΜΑΡΑΝΙΑ Τέλος, στην κατηγορία των πιμαρανίων, έχει βρεθεί περιορισμένος αριθμός διτερπενοειδών στο γένος Sideritis, όπως και στην κατηγορία των ροζανίων. Προέρχονται από το σκελετό του ent-πιμαρανίου (Εικόνα 10). Χαρακτηριστικές ενώσεις αυτής της κατηγορίας είναι τα: 2β-hydroxy-ent-pimara-8(14),15-diene (απομονώθηκε από το είδος S. trojana Bornm.) και το 3α-hydroxy-ent-pimara-8(14),15-diene (από το είδος S. canariensis L. var. pannosa) [Fraga, 2012]. Εικόνα 10. Δομή του διτερπενίου ent-πιμαράνιο, που φέρει το μητρικό σκελετό των διτερπενοειδών ent-πιμαρανίων. 16

35 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΕΣ ΧΡΗΣΕΙΣ Τα μέρη του φυτού Sideritis που χρησιμοποιούνται παραδοσιακά είναι οι κορυφές των μίσχων μαζί με τα φύλλα και τα άνθη. Οι ανθισμένοι μίσχοι συλλέγονται κατά τους μήνες ανθοφορίας, δηλαδή Ιούνιο, Ιούλιο, Αύγουστο και Σεπτέμβριο και αποξηραίνονται στη σκιά [Yaneva, Balabanski, 2013]. Παρακάτω, περιγράφονται οι παραδοσιακές φαρμακευτικές χρήσεις που έχουν καταγραφεί για το είδος Sideritis scardica Griseb. Το είδος Sideritis scardica Griseb., ιδιαίτερα διαδεδομένο στα Βαλκάνια, χρησιμοποιείται παραδοσιακά είτε για την παρασκευή τσαγιού, είτε για τις αρωματικές του ιδιότητες στις ντόπιες κουζίνες. Το τσάι παρασκευάζεται συχνότερα ως αφέψημα με βράσιμο των μίσχων, φύλλων και ανθών και συχνά σερβίρεται με μέλι ή / και λεμόνι. Χρησιμοποιείται ως βοηθητικό χώνευσης, ως τονωτικό του ανοσοποιητικού συστήματος και καταπραϋντικό του κοινού κρυολογήματος, της γρίπης και άλλων ιώσεων, εναντίον αλλεργιών, της δυσκολίας στην αναπνοή, της ρινικής συμφόρησης, και ακόμα εναντίον του πόνου και του ήπιου άγχους [Yaneva, Balabanski, 2013]. Στην παραδοσιακή ευρωπαϊκή ιατρική, το «τσάι του βουνού» έχει χρησιμοποιηθεί κυρίως για τη θεραπεία παθήσεων των πνευμόνων, όπως βήχας διαφόρων αιτιών, άσθμα, πνευμονικό εμφύσημα και βρογχίτιδα. Επιπροσθέτως, το S. scardica θεωρείται παραδοσιακά χρήσιμο στη θεραπεία φλεγμονών, γαστρεντερικών διαταραχών και του κοινού κρυολογήματος και ως συμπλήρωμα διατροφής για την πρόληψη της αναιμίας, λόγω του σιδήρου που περιέχει [Dordevic et al., 1993]. Ακόμα, το ίδιο είδος, σύμφωνα με τη μελέτη [Alikowski et al., 2008] χρησιμοποιείται για τη θεραπεία ουρολογικών προβλημάτων του προστάτη, ως διουρητικό, για την εξάλειψη της πέτρας των νεφρών, καθώς επίσης εναντίον της στηθάγχης και του πονόλαιμου. Συμπληρωματικά, εκτός από τη μορφή του τσαγιού, χρησιμοποιούνταν παραδοσιακά, με τοπική εφαρμογή, αιθανολικά εκχυλίσματα του S. scardica ως αντισηπτικό και παυσίπονο μέσο έπειτα από εξαγωγή δοντιών, αλλά και μίγμα συντεθλιμμένων φύλων του φυτού με ελαιόλαδο ως κατάπλασμα. Το σύνολο των βιολογικών δράσεων που έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία αποδίδονται κυρίως στο φαινολικό και τερπενικό περιεχόμενο του φυτού [Petreska et al., 2011a, 2011b], [Bojovic et al., 2011]. Όσον αφορά την Ελλάδα, κυρίως τα είδη Sideritis syriaca, Sideritis scardica, Sideritis raeseri και Sideritis clandestina, μαζί με άλλα αποκλειστικά άγρια είδη, 17

36 ΕΙΣΑΓΩΓΗ χρησιμοποιούνται από την αρχαιότητα ως τσάι, παρασκευαζόμενο ως αφέψημα (15-25 g αποξηραμένων μίσχων, φύλλων και ανθών σε περίπου 1 L νερού [Floca et al., 1981]. Ακολουθεί συνοπτικός πίνακας (Πίνακας 1) με τον παραδοσιακό, φαρμακευτικό τρόπο χρήσης διάφορων ειδών του γένους Sideritis που έχουν καταγραφεί στη βιβλιογραφία [Chinou, 2016]. Πίνακας 1. Σύνοψη καταγεγραμμένων, παραδοσιακών, φαρμακευτικών χρήσεων διάφορων ειδών του γένους Sideritis, από διαφορετικές βιβλιογραφικές πηγές. ΕΙΔΟΣ S. scardica S. montana, S. taurica, S. scardica, S. raeseri, S. syriaca S. syriaca, S. scardica, S. raeseri, S. clandestina S. scardica ΠΑΡΑΔΟΣΙΑΚΗ ΚΑΤΑΓΕΓΡΑΜΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ αποχρεμπτικό, ανακουφιστικό φλεγμονών βλεννογόνων αναπνευστικής οδού, αντιβηχικό, αντιιδρωτικό ανακουφιστικό από βήχα σχετιζόμενο με κρυολόγημα ενάντια σε: κρυολογήματα, αναπνευστικά προβλήματα, βήχα και γαστρεντερικές διαταραχές και ως βοηθητικό πέψης ανακουφιστικό από: συμπτώματα βήχα, βρογχίτιδας, κοινού κρυολογήματος, βήχα προέλευσης βρογχίτιδας και εμφυσήματος, αποχρεμπτικό ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΜΟΡΦΗ / ΔΟΣΟΛΟΓΙΑ έγχυμα: 3-4 g εμποτισμένα σε 200 g ζεστό νερό, ως τσάι, 2-3 φορές την ημέρα προσθήκη ml βραστού νερού σε 3-4 βλαστούς τεμαχισμένους και εκχύλιση για 10 min, ως τσάι, μία κ.σ. κάθε 2h, σε ζεστές ξεχωριστές γουλιές έγχυμα: g αποξηραμένων φύλλων και ανθών σε ~1L βραστού νερού ή 2,3-4 g σε 150 ml ζεστού νερού έγχυμα: 2-5 g αποξηραμένων φύλλων και ανθών σε 200 ml ζεστού νερού, εκχύλιση για 5-10 min, 3-4 φορές την ημέρα 18

37 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πρόσφατα, εγκρίθηκε μονογραφία από τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Φαρμάκων (EMA) για τα είδη Sideritis scardica Griseb., Sideritis clandestina (Bory & Chaub.) Hayek, Sideritis raeseri Boiss. & Heldr. και Sideritis syriaca L., η οποία εγκρίνει και διασαφηνίζει τη φαρμακευτική χρήση των παραπάνω φυτικών ειδών, βασιζόμενη στην παραδοσιακή, αποδεδειγμένη φαρμακευτική χρήση τους στη βιβλιογραφία, για τουλάχιστον 30 χρόνια (με 15 χρόνια στην Ευρωπαϊκή Ένωση), με σαφώς καθορισμένες δοσολογίες και τρόπο παρασκευής της φαρμακευτικής μορφής. Σύμφωνα με τη μονογραφία, τα τέσσερα αυτά είδη του γένους Sideritis ενδείκνυνται για φαρμακευτική χρήση, με δια στόματος πρόσληψη και στόχο: 1. Την ανακούφιση από βήχα σχετιζόμενο με κρυολόγημα. 2. Την ανακούφιση από ήπια γαστρεντερική δυσφορία. Ως δοσολογία για ενήλικες και ηλικιωμένους, για αμφότερες τις ενδείξεις, ορίζεται 2-4 g τεμαχισμένου φυτικού υλικού σε ml νερό, ως φυτικό έγχυμα, 2-3 φορές την ημέρα, καθημερινά, με ημερήσια δόση έως 12 g. Ως χρονικό διάστημα φαρμακευτικής χρήσης, ορίζεται 1 εβδομάδα για την ένδειξη 1 και 2 εβδομάδες για την ένδειξη 2 [EMA, 2016]. ΔΕΔΟΜΕΝΑ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ Τα είδη του γένους Sideritis έχουν υποβληθεί σε πληθώρα πειραματικών μελετών με σκοπό τη διερεύνηση των φαρμακολογικών τους ιδιοτήτων. Έχουν μελετηθεί κυρίως ως προς τις αντιμικροβιακές, σπασμολυτικές, αντιοξειδωτικές, κυτταροτοξικές, γαστροπροστατευτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητές τους, καθώς και πιο πρόσφατα, για τη δραστικότητά τους έναντι νευρολογικών διαταραχών του εγκεφάλου. Βασικές μελέτες που αφορούν αυτές τις ιδιότητες, παρατίθενται παρακάτω. ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) Έχει αποδειχτεί η αντιμικροβιακή δράση του αιθανολικού εκχυλίσματος του S. scardica και των κλασμάτων του: Et2O, EtOAc, n-buoh σε διαφόρους βαθμούς εναντίον των βακτηρίων Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, 19

38 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa και εναντίον του μύκητα Candida albicans, με χρήση μεθόδων agar diffusion και broth microdilution. Η μεγαλύτερη δραστικότητα έχει παρατηρηθεί εναντίον των S. epidermidis, M. luteus, E. coli και P.aeruginosa, ενώ μέτρια δραστικότητα εναντίον του K. pneumoniae. Το κλάσμα της n-buoh ήταν το πιο δραστικό, με τη συγκέντρωση 50 mg/ml σε αιθανόλη να εμφανίζει δράση στο 206,7% της αμπικιλλίνης εναντίον του S. epidermidis [Tadić et al., 2007]. Σε συνέχεια της προηγούμενης μελέτης, εκχυλίσματα EtOH, Et2O, EtOAc, n- BuOH, καθώς και εκχυλίσματα αιθέριου ελαίου με υπερκρίσιμο CO2 του S. scardica έχουν δείξει επίσης δράση, με τη μέθοδο broth microdilution, εναντίον των Gramθετικών βακτηρίων: Streptococcus pyogenes, Streptococcus canis, Moraxella catarrhalis Staphylococcus aureus, ανθεκτικού στη μεθικιλλίνη Staphylococcus aureus, Corynebacterium pseudotuberculosis, Enterococcus faecalis, των Gram-αρνητικών: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Pasteurella multocida και Haemophilus spp., και του μύκητα Candida albicans με Ελάχιστη Συγκέντρωση Αναστολής (MIC) της τάξης των 40 με 2,56 μg/ml. Εικάζεται ότι στη αντιμικροβιακή δράση του είδους συνεισφέρουν τα διάφορα είδη τερπενοειδών που περιέχει [Tadić et al., 2012]. Επιπροσθέτως, εκχυλίσματα οργανικών διαλυτών των ειδών Sideritis syriaca και Sideritis montana έχουν δείξει δράση εναντίον του Staphylococcus aureus, με το βουτανολικό εκχύλισμα του Sideritis syriaca να εμφανίζει επιπλέον αντιμυκητιασική δράση εναντίον του μύκητα Candida albicans [Yaneva, Blabanski, 2013]. ΣΠΑΣΜΟΛΥΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) Έχει μελετηθεί η επίδραση του αιθανολικού εκχυλίσματος του S. raeseri στην εντερική δραστηριότητα [Brankovic et al., 2011]. Ξηρά, κονιορτοποιημένα, υπέργεια τμήματα του φυτού, εκχυλισμένα με 96% EtOH, σε συγκεντρώσεις 0,03-0,3 mg/ml, προκάλεσαν χαλάρωση στις αυθόρμητες συσπάσεις απομονωμένου ειλεού αρουραίων - επωασμένου σε διάλυμα Tyrode, με παροχή αερίου O2:CO2 (95:5) στους 37 C - παρόμοια με τη χαλάρωση που προκαλεί η ένωση αναφοράς, η παπαβερίνη. Το φυτικό εκχύλισμα έδειξε αξιοσημείωτη αναστολή στη συσταλτική απόκριση στην ακετυλοχολίνη (p < 0,01) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε τιμές συγκεντρώσεων 0,015-0,15 mg/ml. Επιπλέον, προκλήθηκε χαλάρωση σε προ-συσταλμένο ειλεό από ισταμίνη και 20

39 ΕΙΣΑΓΩΓΗ χλωρίδιο του βαρίου, με το εκχύλισμα του ίδιου είδους (0,03-0,3 mg/ml) να μετακινεί αξιοσημείωτα την καμπύλη συγκέντρωσης-απόκρισης στην ισταμίνη (p < 0,01), καθώς και να αναστέλλει αξιοσημείωτα τις συσπάσεις που είχαν προκληθεί από το χλωρίδιο του βαρίου (p < 0,01). Συμπερασματικά, το αιθανολικό εκχύλισμα του S. raeseri μπορεί να προκαλέσει αναστολή αυθόρμητων συσπάσεων σε ειλεό αρουραίων, καθώς και συσπάσεων επαγόμενων από διάφορα σπασμογόνα, γεγονός που αποτελεί ένδειξη ότι το συγκεκριμένο είδος δρα ως σπασμολυτικό στο εντερικό λείο μυ, σε συμφωνία με την παραδοσιακή χρήση του εναντίον γαστρεντερικών διαταραχών [Brankovic et al., 2011]. ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) Εκχυλίσματα των ειδών Sideritis scardica, Sideritis syriaca και Sideritis montana, από τη Βουλγαρία, με διαλύτες MeOH, t-bumeo, Me2CO και επιμέρους κλάσματά τους, μελετήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική τους δράση με τις μεθόδους: β-carotene bleaching test (BCBT) και 2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging method και συγκρίθηκαν με δύο ενώσεις αναφοράς διαφορετικής πολικότητας, το λιπόφιλο διβουτυλυδροξυτολουόλιο BHT και το υδρόφιλο ροσμαρινικό οξύ. Την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση στην BCBT εμφάνισαν τα πιο άπολα εκχυλίσματα προερχόμενα από το εκχύλισμα t-bumeo, με τιμές κοντά στου BHT. Από τα τρία είδη προς μελέτη, κλάσματα από τα εκχυλίσματα n-buoh και EtOAc, καθώς και τα εκχυλίσματα της MeOH στο σύνολό τους εμφάνισαν ισχυρή ικανότητα σάρωσης ελευθέρων ριζών έναντι της 2,2 -diphenyl-1-picrylhydrazyl, παρεμφερή με αυτή του ροσμαρινικού οξέος. Τα ολικά εκχυλίσματα του S. montana ήταν ελαφρώς λιγότερο ισχυροί αναστολείς δημιουργίας ελευθέρων ριζών στη μέθοδο BCBT, συγκρινόμενα με τα εκχυλίσματα των άλλων δύο ειδών [Koleva et al., 2003]. Σε άλλη μελέτη, [Danesi et al., 2013], συγκρίθηκε η αντιοξειδωτική δράση εκχυλίσματος με MeOH:H2O (70:30) του Sideritis scardica με αυτή ενός ξηρού εκχυλίσματος πράσινου τσαγιού (Camellia sinensis), διαθέσιμου στην αγορά, και αυτή του αντιοξειδωτικού α-τοκοφερόλη σε βιολογικό σύστημα (κύτταρα HepG2) έναντι του οξειδωτικού στρες. Χρησιμοποιήθηκε επαγόμενη οξειδωτική προσβολή με tert-butyl hydroperoxide (t-booh), και εκτιμήθηκε η αναπαραγωγική ικανότητα των κυττάρων με τη χρωματομετρική μέθοδο 3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Παρόλο που το S. scardica διέθετε πολύ μικρότερο φαινολικό 21

40 ΕΙΣΑΓΩΓΗ περιεχόμενο, η ενδοκυτταρική αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν παρόμοια και για τα δύο φυτά [Danesi et al., 2013]. Έρευνα των Petreska et al. (2011a) εξέτασε την αντιοξειδωτική δράση σε σχέση με τη φυτοχημική σύσταση, καθώς και την περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά (σε διαφορετικά μέρη του φυτού-άνθη, φύλλα, μίσχοι) των εκχυλισμάτων MeOH και H2O, (το δεύτερο ώστε να προσομοιωθεί η οικιακή παρασκευή του εγχύματος) των ειδών S. scardica και S. raeseri. Μετά από χρήση σακούλας παρασκευής εγχύματος 2 g, το ολικό φαινολικό περιεχόμενο ήταν περίπου 190 mg στη περίπτωση του μεθανολικού εκχυλίσματος και περίπου 72 mg στο υδατικό εκχύλισμα. Συμπερασματικά, το μεθανολικό εκχύλισμα του άγριου S. raeseri επέδειξε την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση με βάση τις μεθόδους DPPH, ABTS και FRAP, με την αντιοξειδωτική του δράση να συσχετίζεται γραμμικά με την ποσότητα των φαινολικών συστατικών. Όσον αφορά τα μέρη του φυτού, το φύλλο αποδείχτηκε το πλουσιότερο σε φαινολικά συστατικά, ακολουθούμενο από το άνθος και τέλος το μίσχο [Petreska et al, 2011c]. Ακόμα, άλλη μία μελέτη της ικανότητας σάρωσης ελευθέρων ριζών με τη μέθοδο DPPH, των ελληνικών ειδών Sideritis clandestina subsp. clandestina, Sideritis euboea, Sideritis perfoliata subsp. perfoliata, Sideritis raeseri subsp. raeseri, Sideritis scardica και Sideritis syriaca κατέληξε ότι όλα τα εκχυλίσματα κατείχαν αξιοσημείωτη αντιοξειδωτική δράση με ικανότητα δέσμευσης ελευθέρων ριζών σε ποσοστό μεγαλύτερο του 74% σε συγκέντρωση 300 μg/ml. Ως διαλύτες εκχύλισης χρησιμοποιήθηκαν μίγματα Η2Ο/EtOH διαφορετικών αναλογιών [Papaefstathiou et al., 2014]. Τέλος, στις μελέτες που παρατίθενται παρακάτω παρατηρήθηκε μέτρια αντιοξειδωτική δραστικότητα από τα είδη S. javalambrensis, S. raeseri, S. euboea, S. perfoliata subsps. perfoliata και S. libanotica ssp. linearis, η οποία αποδόθηκε κυρίως σε φλαβονοειδή. Πιο συγκεκριμένα, στη μελέτη των Rios et al. (1992), το υπό εξέταση είδος ήταν το Sideritis jaualambrensis. Το φυτό εκχυλίστηκε με Hexane και έπειτα MeOH. Το υδατοδιαλυτό κλάσμα της MeOH κλασματώθηκε με Et2O, EtOAc και BuOH. Τελικά, περεταίρω κλασμάτωση του τελευταίου οδήγησε στην απομόνωση 5 φλαβονοειδών γλυκοζιτών που δοκιμάστηκαν για τις αντιοξειδωτικές τους ικανότητες ως αναστολείς της μη-ενζυμικής λιπιδικής υπεροξείδωσης και ως υπεροξειδικοί σαρωτές. Τα αποτελέσματα έδειξαν αξιόλογη δράση με 2 ενώσεις να ξεχωρίζουν, τις: hypolaetin-8- glucoside και 3 -hydroxy-4 -Ο-methylisoscutellarein-7-Ο-[6 -acetyllallopyranosyl- 22

41 ΕΙΣΑΓΩΓΗ (1 2)glucopyranoside]. Οι τιμές IC50 για την λιπιδική υπεροξείδωση ήταν 1,3 και 19,7 μμ, αντίστοιχα, με την πρότυπη συνθετική αντιοξειδωτική propyl gallate να εμφανίζει τιμή 4,4 μμ. Οι τιμές IC50 για την υπεροξειδική σάρωση ήταν 6,4 και 18,6 μμ, αντίστοιχα, με την πρότυπη να έχει τιμή 7,7 μμ. Επιπλέον, στη μελέτη των Demirtas et al., 2011, εκτιμήθηκε η αντιοξειδωτική δραστικότητα φλαβονών του εκχυλίσματος με MeOH του είδους Sideritis libanotica ssp. linearis, σε σχέση με άλλες κατηγορίες ενώσεων του φυτού, με χρήση των μεθόδων: θειοκυανικού αμμωνίου (ολική αντιοξειδωτική δράση), DPPH (δραστικότητα σάρωσης ελευθέρων ριζών) και αναγωγική ισχύς. Τα αποτελέσματα, μετά από σύγκριση με τους θετικούς μάρτυρες, τοκοφερόλη και BHT, έδειξαν ότι οι φλαβόνες επιδεικνύουν υψηλότερη αντιοξειδωτική δραστικότητα σε σύγκριση με τις υπόλοιπες κατηγορίες ενώσεων και μάλιστα τόσο υψηλή όσο η α-τοκοφερόλη. Τη χαμηλότερη δραστικότητα παρουσίασαν τα λιπαρά οξέα και οι υδατάνθρακες. Στη μελέτη των Gabrieli et al., 2005, αξιολογήθηκε η αντιοξειδωτική δραστικότητα του n-buoh κλάσματος του εκχυλίσματος με MeOH του είδους Sideritis raeseri subsp. raeseri με τις μεθόδους Co(II) EDTA-induced luminol chemiluminescence και DPPH. Το είδος εμφάνισε μέτρια δραστικότητα, η οποία μπορεί να συσχετιστεί με την παρουσία 5- και 8-O-διϋποκατεστημένων φλαβονών. Δεδομένα από τη μελέτη των Tsaknis et al., 2005, καταλήγουν ότι το εκχύλισμα της n-buoh (έπειτα από μια σειρά εκχυλίσεων με n-hexane, MeOH, Et2O και EtOAc) του είδους Sideritis euboea έδειξε την υψηλότερη αντιοξειδωτική δραστικότητα. Μετά από περαιτέρω κλασμάτωση, απομονώθηκε η πιο δραστική ένωση με βάση τις μεθόδους DPPH, Rancimat και Schaal oven test, η οποία ήταν η φλαβόνη kaempherol που σε συγκέντρωση 400 ppm επέδειξε την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση, συγκρινόμενη με αυτή των πρότυπων αντιοξειδωτικών ενώσεων BHT και α-tocopherol. Στη μελέτη των Charami et al., 2008, διερευνήθηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα του είδους Sideritis perfoliata subsp. perfoliata ως προς την ικανότητα σάρωσης ελευθέρων ριζών (μέθοδος DPPH) και αναστολής της λιποξυγενάσης σόγιας. Η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε διαδοχικά με petroleum ether, CHCl3 και MeOH. Το υδατοδιαλυτό κλάσμα του εκχυλίσματος της MeOH κλασματώθηκε περεταίρω με διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας (Et2O, EtOAc και n-buoh). Διερευνήθηκαν τα ολικά εκχυλίσματα, καθώς και 10 απομονωμένες ενώσεις (φαινυλοπροπανοϊκοί γλυκοζίτες και φλαβονοειδή) από τα πολικά υπο-κλάσματα της n-buoh. Τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι όλα τα εκχυλίσματα αλληλεπίδρασαν πολύ ισχυρά με τη σταθερή ελεύθερη ρίζα 23

42 ΕΙΣΑΓΩΓΗ DPPH (92,8 96,1% σε συγκέντρωση 25 mg/ml και όγκους 20 μl και 200 μl), με τρόπο ανεξάρτητο του χρόνου και με μια μικρή μείωση στην εκατοστιαία αλληλεπίδραση, μετά από αύξηση της συγκέντρωσης, στις περιπτώσεις των MeOH, Et2O και Η2Ο. Οι 9 από τις 10 απομονωμένες ενώσεις έδειξαν υψηλή ικανότητα σάρωσης από 73,8 έως 89,0% σε συγκέντρωση 0,1 mm. Αντίστοιχα, τα εκχυλίσματα έδειξαν υψηλή αναστολή της λιποξυγενάσης σόγιας (29-77% σε συγκέντρωση 100 μl/ml), με το εκχύλισμα της n- BuOH να είναι το δραστικότερο. Οι 8 από τις 10 απομονωμένες ενώσεις έδωσαν σημαντική αναστολή με τιμές IC50 από 6 έως 312,13 nm, σε σχέση με την πρότυπη ένωση quercetin (215,75 nm). ΚΥΤΤΑΡΟΤΟΞΙΚΗ ΔΡΑΣΗ (in vitro) Σε συνέχεια της έρευνας των Todorova, Trendafilova (2014), έγινε αποτίμηση της δράσης των εκχυλισμάτων με διαλύτες EtOH, Et2O, EtOAc και n-buoh του είδους Sideritis scardica σε κύτταρα με γλοίωμα (πρωτοπαθής όγκος του εγκεφάλου που αναπτύσσεται από τα νευρογλοιακά κύτταρα) αρουραίων C6. Τα εκχυλίσματα (με συγκέντρωση 50 μg/ml) προκάλεσαν μείωση της βιωσιμότητας του γλοιώματος κατά 59,4% σε σύγκριση με τα κακοήθη κύτταρα στα οποία δεν εισήχθησαν τα εκχυλίσματα. Η βιωσιμότητα των πρωτογενών αστροκυττάρων (κατηγορία νευρογλοιακών κυττάρων του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος) των αρουραίων δεν επηρεάστηκε αρνητικά από τις ίδιες συγκεντρώσεις των εκχυλισμάτων, ωστόσο, προκλήθηκε ζημιά στην κυτταρική μορφολογία και την κατανομή της ακτίνης. Επιπλέον, τα τέσσερα εκχυλίσματα οδήγησαν σε αυξημένη παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου στα γλοιωματικά και στα πρωτογενή αστροκύτταρα των αρουραίων, ενώ προήγαγαν την ενεργοποίηση της κασπάσης και, ως αποτέλεσμα, τον κυτταρικό θάνατο. Τα εκχυλίσματα των Et2O και EtOAc εμφάνισαν κυτταροτοξική δράση στα γλοιωματικά κύτταρα των C6 αρουραίων με IC50 81,6 μg/ml και 109,4 μg/ml, αντίστοιχα. Ως υπεύθυνες ενώσεις για αυτή την κυτταροτοξική δραστικότητα θεωρήθηκαν τα κύρια άγλυκα φλαβονοειδή, όπως η απιγενίνη και η λουτεολίνη. Τα εκχυλίσματα δεν εμφάνισαν κυτταροτοξικότητα σε αστροκύτταρα C6 αρουραίων πρωτογενούς καλλιέργειας. Στη μελέτη των Tadić et al., 2012, εξετάστηκαν και πάλι τα εκχυλίσματα των διαλυτών EtOH, Et2O, EtOAc και n-buoh του είδους Sideritis scardica ως προς την κυτταροτοξική τους δράση. Για την αξιολόγηση της κυτταροτοξικότητας των εκχυλισμάτων, χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα PBMC, B16 μελανώματος και HL-60 24

43 ΕΙΣΑΓΩΓΗ λευχαιμικά και έγινε σύγκριση της δράσης τους με την επιμέρους κυτταροτοξική δραστικότητα των κύριων φαινολικών συστατικών τους. Μόνο το εκχύλισμα του Et2O προκάλεσε αξιοσημείωτη δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα B16 και HL-60, μειώνοντας την ανάπτυξή τους κατά 51,3 και 77,5%, αντίστοιχα, σε σχέση με το μάρτυρα, σε συγκέντρωση 100 μg/ml. Οι περισσότερο κυτταροτοξικές ενώσεις ήταν οι luteolin, apigenin-7-0-ß-glycoside, apigenin, και luteolin-7-0-ß-glycoside. ΓΑΣΤΡΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΦΛΕΓΜΟΝΩΔΗΣ ΔΡΑΣΗ (in vivo) Σε συνέχεια της μελέτης των [Tadić et al., 2012], τα εκχυλίσματα EtOH, Et2O, EtOAc και n-buoh του είδους Sideritis scardica ελέγχθηκαν για ενδεχόμενη γαστροπροστατευτική και αντιφλεγμονώδη δράση. Όσον αφορά τη γαστροπροστασία, προκλήθηκε σε αρουραίους οξύ έλκος από στρες, επαγόμενο από αιθανόλη και δοκιμάστηκε επί αυτού η προστατευτική δράση των εκχυλισμάτων. Τα εκχυλίσματα διαλύθηκαν σε DMSO και χορηγήθηκαν δια στόματος (p.o.) σε δόσεις mg/ml, 60 λεπτά πριν τη χορήγηση της αιθανόλης. Η ρανιτιδίνη σε δόσεις 5-20 mg/ml p.o. χρησιμοποιήθηκε ως φάρμακο αναφοράς. Όλα τα εκχυλίσματα έδειξαν δοσοεξαρτώμενη γαστροπροστατευτική δράση με αποτελεσματικότητα συγκρίσιμη με της ρανιτιδίνης. Όσον αφορά την αντιφλεγμονώδη δράση, έπειτα από δια στόματος χορήγηση, όλα των εκχυλίσματα εμφανίστηκαν δραστικά σε μοντέλο αρουραίων με φλεγμονή στο πόδι, επαγόμενη από καραγενάνη. Σε σύγκριση με τη δράση του θετικού μάρτυρα, το αντιφλεγμονώδες φάρμακο ινδομεθακίνη (σε δόση 4 mg/ml), το οποίο προκάλεσε μείωση κατά 50% στη φλεγμονή, τα εκχυλίσματα EtOH, Et2O, EtOAc και n-buoh εμφάνισαν περίπου την ίδια δράση, σε δόσεις των 100 και 200 mg/ml (53,6, 48,7, 48,4 και 49,9% αντιστοίχως). ΝΕΥΡΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑ Τα τελευταία χρόνια, έχει εκδηλωθεί έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον στη μελέτη του γένους Sideritis ως προς την πιθανή προστατευτική του δράση έναντι της νευροεκφύλισης, η οποία σχετίζεται με διαταραχές της διάθεσης και του συναισθήματος, ψυχιατρικές διαταραχές, γνωστικές δυσλειτουργίες, και τις νόσους Alzheimer s και 25

44 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Parkinson s. Οι βασικές νευροπροστατευτικές οδοί, για τις οποίες έχει εξεταστεί, είναι η προστασία από το οξειδωτικό στρες, η μείωση της παραγωγής και εναπόθεσης αμυλοειδών πλακών και η επιδιόρθωση βλαβών κατά τη νευροδιαβίβαση. ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΑΠΟ ΤΟ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ (in vivo) Τα νευροτοξικά αποτελέσματα του οξειδωτικού στρες και η συνεπακόλουθη νευροεκφύλιση σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου έχουν προταθεί ως αιτιώδεις παράγοντες για τη νόσο Alzheimer s, για τον Παρκινσονισμό και τη διαδικασία της γήρανσης [Halliwell, 1992]. Ο εγκέφαλος είναι το πιο ευάλωτο όργανο στην οξειδωτική βλάβη εξαιτίας της υψηλής απαίτησής του σε οξυγόνο, του υψηλού λιπιδικού περιεχομένου (κυρίως πολυακόρεστα λιπαρά οξέα), της αφθονίας οξειδοαναγωγικώς ενεργών ιόντων μεταβατικών μετάλλων, της χαμηλής δραστηριότητας του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος και της μειωμένης του ικανότητας για κυτταρική αναγέννηση. Πολυφαινολικές ενώσεις που περιέχονται σε διάφορες τροφές, όπως φρούτα, λαχανικά, κρασί και τσάι έχουν επιδείξει μεγάλη ποικιλία επωφελών βιολογικών δράσεων [Yao et al., 2004], πολλές από τις οποίες έχουν αποδοθεί στις ισχυρές αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες [Urquiaga et al., 2000]. Το άγχος είναι μία ψυχολογική και φυσιολογική κατάσταση που περιλαμβάνει σωματικά, συναισθηματικά, γνωσιακά και συμπεριφορικά στοιχεία. Μελέτες έχουν αποδείξει μία σύνδεση μεταξύ του οξειδωτικού στρες και της αγχώδους συμπεριφοράς [Rammal et al., 2008]. Κάποιες από αυτές προτείνουν ότι το οξειδωτικό στρες προκαλεί αγχώδεις συμπεριφορές σε ανθρώπους με διαταραχές πανικού και, ειδικότερα, ότι ο οξειδωτικός μεταβολισμός μπορεί να επηρεάσει τη ρύθμιση του άγχους [Kuloglu et al., 2002], ενώ άλλες υποστηρίζουν μία συσχέτιση αιτιατού - αποτελέσματος σε ανθρώπους και ζώα, χωρίς όμως να αποσαφηνίζουν τους υποκείμενους μηχανισμούς [Bouaved et al., 2009]. Με βάση τα παραπάνω, στη μελέτη των Celik et al., 2011 δείχτηκε ότι αρουραίοι που κατανάλωσαν τσάι από το είδος Sideritis caesarea για 50 ημέρες προστατεύτηκαν ενάντια στη χημικώς επαγόμενη οξειδωτική βλάβη. Επιπλέον, η μελέτη των Linardaki et al., 2011 έδειξε ότι η κατανάλωση τσαγιού από το είδος Sideritis clandestina subsp. peloponnesiaca ενίσχυσε την αντιοξειδωτική άμυνα του εγκεφάλου ενηλίκων τρωκτικών με τοποειδικό τρόπο. 26

45 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Επιπροσθέτως, πιο λεπτομερώς, το τσάι από το είδος Sideritis clandestina subsp. clandestina έχει μελετηθεί [Vassilopoulou et al., 2013] ως προς την επίδρασή του σε ενήλικα ποντίκια σε συμπεριφορικές και οξειδωτικές/αντιοξειδωτικές παραμέτρους μετά την κατανάλωση για διάστημα 6 εβδομάδων. Ως δείγμα χρησιμοποιήθηκαν όλα τα μέρη του φυτού (άνθη, φύλλα και μίσχοι), σε ίσες ποσότητες, αποξηραμένα. Εκχυλίστηκαν, ως εγχύματα, ποσότητες 2 και 4 g φυτικού υλικού με 100 ml βραστού νερού για 5 min, με σκοπό να προσομοιωθούν οι πραγματικές συνθήκες παρασκευής του εγχύματος για κατανάλωση από ενήλικες ανθρώπους. Όσον αφορά τη φυτοχημική σύσταση του υδατικού εκχυλίσματος, η οποία δείχθηκε για πρώτη φορά, ανάλυση με LC/DAD/ESI- MS n οδήγησε στην ταυτοποίηση 17 ενώσεων που ανήκουν στις κατηγορίες των παραγώγων κινικού οξέος, μελιτοσιδών, φαινυλοπροπανοειδών και φλαβονοειδών. Ως προς τα αντικείμενα της μελέτης, αυτά περιλάμβαναν τρεις άξονες: α) Μελέτη της επίδρασης δύο δόσεων (2 και 4% w/v, ημερησίως) του εγχύματος σε αγχώδους τύπου κατάσταση, μέσω της εκτίμησης της θιγμοτακτικής συμπεριφοράς των ποντικιών. β) Αξιολόγηση της οξειδωτικής/αντιοξειδωτικής κατάστασης του εγκεφάλου (- Cerebellum ή -Ce), του ήπατος και της καρδιάς, αρσενικών ενήλικων Balb-c ποντικιών, έπειτα από την κατανάλωση του τσαγιού, μέσω της μέτρησης των επιπέδων της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA) και της ανηγμένης γλουταθειόνης (GSH), με χρήση φθορισμομετρικών μεθόδων. γ) Μελέτη της αντιοξειδωτικής επίδρασης του τσαγιού σε συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου (εγκεφαλικό φλοιό, παρεγκεφαλίτιδα και μεσεγκέφαλο). Σημειώνεται εδώ ότι όταν ποντίκια εισάγονται σε ανοιχτό πεδίο περιβαλλόμενο από τοίχωμα (όπως στο λαβύρινθο του Morris), παρουσιάζουν την τάση να εξερευνούν κυρίως την περιφερική ζώνη του ανοιχτού πεδίου. Αυτή η τάση να παραμένουν κοντά στο τοίχωμα, που αποκαλείται θιγμοταξία, ελαττώνεται σταδιακά κατά τα πρώτα λεπτά της εξερεύνησης. Ο βαθμός της θιγμοταξίας κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου ελάττωσης αποτελεί δείκτη του μεγέθους του άγχους στα ποντίκια και έχει επαληθευτεί τόσο από αγχογόνα φάρμακα (dexamphetamine, pentylenetetrazole, yohimbine, idazoxan) - τα οποία οδήγησαν σε αυξημένη θιγμοταξία - όσο και αγχολυτικά φάρμακα (buspirone, phenobarbital), τα οποία τη μείωσαν [Simon et al., 1994]. Οι ελεύθερες ρίζες προκαλούν τις αντιδράσεις υπεροξείδωσης των λιπιδίων σε έναν οργανισμό. Η μηλονική διαλδεΰδη (MDA) είναι ένα από τα τελικά προϊόντα της 27

46 ΕΙΣΑΓΩΓΗ υπεροξείδωσης των λιπαρών οξέων στα κύτταρα. Αύξηση στην ποσότητα ελευθέρων ριζών προκαλεί υπερπαραγωγή της MDA. Η τιμής της ποσότητας της MDA χρησιμοποιείται συχνά ως δείκτης του οξειδωτικού στρες και της αντιοξειδωτικής κατάστασης στους ασθενείς με καρκίνο [Gawel et al., 2004]. Η ανηγμένη γλουταθειόνη (GSH) είναι η αφθονότερη θειόλη μικρού μοριακού βάρους που συντίθεται στα κύτταρα. Διαδραματίζει κομβικό ρόλο, ως ισχυρό αναγωγικό, στην προστασία των κυττάρων από την οξειδωτική βλάβη και την τοξικότητα ξενοβιοτικών ηλεκτρόφιλων οντοτήτων, συντηρώντας την οξειδοαναγωγική ομοιόσταση των κυττάρων [Forman et al., 2009]. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο το τσάι περιεκτικότητας 4% παρουσίασε αγχολυτικού-τύπου ιδιότητες, καθώς οδήγησε σε στατιστικώς σημαντική (p < 0,05) μείωση του θιγμοτακτικού χρόνου και αύξηση του αριθμού των εισόδων στην κεντρική ζώνη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (control group). Αμφότερες οι δοσολογίες (2 και 4% w/v) είχαν ως αποτέλεσμα την αύξηση της GSH (12 και 28% αντίστοιχα, p < 0,05) και τη μείωση της MDA (16 και 29%, p < 0,05) στον εγκέφαλο (-Ce), ενώ το ήπαρ και η καρδιά έμειναν ανεπηρέαστα. Επίσης αμφότερες οι δοσολογίες προκάλεσαν αξιοσημείωτη αύξηση της GSH στην παρεγκεφαλίδα (13 και 36% αντίστοιχα, p < 0,05) και στο μεσεγκέφαλο (17 και 36%, p < 0,05). Κατά αντιστοιχία με την αύξηση της GSH, τα επίπεδα της MDA μειώθηκαν στην παρεγκεφαλίδα (45 και 79% αντίστοιχα, p < 0,05) και στο μεσεγκέφαλο (50 και 63%), p < 0,05), με τον εγκεφαλικό φλοιό να μένει ανεπηρέαστος. Συμπερασματικά, σύμφωνα με τους ερευνητές, το υδατικό εκχύλισμα (έγχυμα) του Sideritis clandestina προλαμβάνει αγχώδεις συμπεριφορές και αποδίδει αντιοξειδωτική προστασία στους ιστούς τρωκτικών με τόπο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σημειώνεται ότι όσον αφορά την περιεκτικότητα φαινολικών ενώσεων στο παραδοσιακό έγχυμα με βραστό νερό, οι κυρίαρχες μορφές τους ήταν εστεροποιημένες μορφές φλαβονών και υδροξυκινναμικά οξέα. Η σύσταση των μερών του φυτού για την παρασκευή του εγχύματος του τσαγιού με τη μέγιστη περιεκτικότητα σε φαινολικά θα πρέπει να περιλαμβάνει 60% φύλλα και 40% άνθη, με όσο το δυνατόν μικρότερη προσθήκη μίσχων [Petreska et al., 2011a]. 28

47 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΕΙΩΣΗ ΤΗΣ ΣΥΣΣΩΡΕΥΣΗΣ ΑΜΥΛΟΕΙΔΩΝ (in vivo) Η αμυλοειδής υπόθεση θεωρεί το β-αμυλοειδές (Αβ) ως την κύρια αιτία πρόκλησης της νόσου Alzheimer s. Προτείνει ότι η λανθασμένη αναδίπλωση της εξωκυτταρικής πρωτεΐνης Αβ, που συσσωρεύεται σε «πλάκες» στον εξωκυττάριο χώρο και η ενδοκυτταρική εναπόθεση της αναδιπλωμένης πρωτεΐνης tau σε νευροϊνιδιακά συμπλέγματα προκαλεί απώλεια μνήμης και σύγχυση, οδηγώντας σε εξασθένιση της προσωπικότητας και των γνωστικών λειτουργιών με το χρόνο [Chen et al., 2017]. Το παθολογικά συσσωρευμένο πεπτίδιο Αβ είναι το κύριο συστατικό των γεροντικών «πλακών» και προέρχεται από την πρωτεολυτική διάσπαση μιας μεγαλύτερης γλυκοπρωτεΐνης, η οποία ονομάζεται πρόδρομος πρωτεΐνη αμυλοειδούς (ΑΡΡ). Η ΑΡΡ είναι μια γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης τύπου 1 που παίζει σημαντικό ρόλο σε μια σειρά βιολογικών δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένης της νευρωνικής ανάπτυξης, της σηματοδότησης, της ενδοκυτταρικής μεταφοράς και άλλων πτυχών της νευρωνικής ομοιόστασης. Αρκετά προϊόντα διάσπασης της APP μπορεί να συμβάλλουν σημαντικά στην παθογένεια της νόσου Alzheimer s, προκαλώντας νευρωνική δυσλειτουργία. Οι εναποθέσεις πεπτιδίων Αβ παρατηρούνται κυρίως στην περιοχή του ιππόκαμπου και του νεοφλοιού, καθώς και στο αγγειακό σύστημα του εγκεφάλου [Chen et al., 2017]. Η μελέτη των Feistel et al., 2013 παρουσίασε την in vivo επίδραση του Sideritis scardica στη γνωστική λειτουργία διαγονιδιακών ποντικών C57BL/6, ως πειραματικό μοντέλο της νόσου Alzheimer s (AD). Για την εκτίμηση της γνωστικής λειτουργίας και ιδιαίτερα της χωρικής μνήμης χρησιμοποιήθηκε ο υδάτινος λαβύρινθος του Morris (Morris Water Maze, MWM). Τα ζώα χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: διαγονιαδιακά C57BL/6 με AD, χωρίς να τους έχει χορηγηθεί εκχύλισμα S. scardica ως control 1, υγιή, μη διαγονιδιακά C57BL/6, χωρίς να τους έχει χορηγηθεί εκχύλισμα S. scardica ως control 2 και διαγονιδιακά C57BL/6 με AD, στα οποία χορηγήθηκε εκχύλισμα S. scardica. Τα αποτελέσματα έδειξαν τα εξής: Η ομάδα υγιών ποντικών παρουσίασε ελαττωμένη καθυστέρηση διαφυγής (-20%) σε σχέση με την πάσχουσα διαγονιδιακή ομάδα control 1, γεγονός που δηλώνει την καλύτερη ενθύμηση της τοποθεσίας της πλατφόρμας από τα υγιή. Οι πάσχοντες διαγονιδιακοί ποντικοί που κατανάλωσαν το εκχύλισμα του S. scardica παρουσίασαν αξιοσημείωτα χαμηλότερες καθυστερήσεις (- 60% σε σχέση με τους πάσχοντες που δεν τους χορηγήθηκε το εκχύλισμα και -40% σε σχέση με την υγιή ομάδα). Αυτά τα αποτελέσματα της παραπάνω συμπεριφορικής 29

48 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μελέτης συσχετίζονται με την παρατηρηθείσα μείωση της συνολικής ποσότητας β- αμυλοειδούς κατά 55% στα ποντίκια που κατανάλωσαν το εκχύλισμα του S. scardica, σε σύγκριση με την πάσχουσα ομάδα με AD, control 1, στην οποία δεν χορηγήθηκε το εκχύλισμα. Η μελέτη των Hofrichter et al., 2016 παρουσίασε δεδομένα για την in vivo αποτελεσματικότητα εκχυλισμάτων των ειδών S. euboea και S. scardica στη θεραπεία της εξασθένισης των γνωστικών λειτουργιών σε ένα μοντέλο τρωκτικών για τη νόσο Alzheimer s (APP-διαγονιδιακά) και σε ηλικιωμένους, μη διαγονιδιακούς C57Bl/6 ποντικούς. Ως φυτικό υλικό χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα H2O/EtOH (80:20) και τα δύο είδη δοκιμάστηκαν τόσο ξεχωριστά, όσο και σε συνδυασμό 1:1. Χορηγήθηκαν στους διαγονιδιακούς ποντικούς σε δύο δόσεις, 1,2 g/kg σωματικού βάρους (πριν την έναρξη της AD) και 12 g/kg μετά την εμφάνιση της νόσου. Στους μη διαγονιδιακούς, γηραιούς ποντικούς χορηγήθηκε δόση 6 g/kg. Στόχος ήταν η αξιολόγηση των φυτικών εκχυλισμάτων ως προς την επίδρασή τους στις γνωστικές λειτουργίες των ποντικών και η μελέτη ιστομορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών που σχετίζονταν με εναπόθεση β- αμυλοειδούς, καθώς και την ικανότητα θεραπείας αυτών από τα εκχυλίσματα. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η από του στόματος θεραπεία με τα εκχυλίσματα των S. euboea και S. scardica ενίσχυσαν πολύ σημαντικά τη γνωστική λειτουργία στους ηλικιωμένους, μη διαγονιδιακούς, καθώς και στους ΑΡΡ-διαγονιδιακούς ποντικούς, ένα αποτέλεσμα που ήταν ακόμη πιο έντονο όταν εφαρμόστηκαν σε συνδυασμό εκχυλίσματα και των δύο ειδών. Η θεραπεία ελάττωσε ισχυρά το φορτίο Αβ1-42 στους APPδιαγονιδιακούς ποντικούς, οδήγησε σε αυξημένη φαγοκυτταρική δραστικότητα των μικρογλοίων και αυξημένη έκφραση της α-σεκρετάσης ADAM10 (πρωτεΐνη που διασπά την APP με μηχανιστικό μονοπάτι μη αμυλοειδογονικό και συνεπώς αναστέλλει την παραγωγή από αυτή των β-αμυλοειδούς). Επιπρόσθετα, η θεραπεία ήταν ικανή να εμποδίσει πλήρως τη νευρωνική απώλεια των ΑΡΡ-διαγονιδιακών ποντικών, διατηρώντας της στα επίπεδα των μη διαγονιδιακών μαρτύρων. Ακόμα, η θεραπεία είχε θετική επίδραση στους υγιείς ηλικιωμένους ποντικούς, ως προς τη γνωστική τους επίδοση (σε λαβύρινθο του Morris). Αμφότερα τα είδη του Sideritis ήταν δραστικά σε χαμηλές δόσεις πριν την έναρξη και σε υψηλές δόσεις μετά την έναρξη της νόσου. Οι ερευνητές συμπέραναν ότι τα δύο προς μελέτη είδη θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια αποτελεσματική, καλά ανεκτή επιλογή για τη θεραπεία συμπτωμάτων γνωστικής δυσλειτουργίας στους ηλικιωμένους ανθρώπους και της νόσου Alzheimer s, 30

49 ΕΙΣΑΓΩΓΗ καθώς επηρεάζουν τα παθολογικά ορόσημά της: την Αβ παθολογία και την εξασθένιση των γνωστικών λειτουργιών. Κλινικές μελέτες απέδειξαν ότι τα εκχυλίσματα του S. scardica μπόρεσαν να βελτιώσουν τη νοητική επίδοση υγιών ατόμων, υπό συνθήκες στρες, καθώς και ατόμων που πάσχουν από ήπια γνωστική διαταραχή (MCI), η οποία είναι πρόδρομος της AD [Behrendt et al., 2016], [Dimpfel et al., 2016b]. Διπλά-τυφλή, τυχαιοποιημένη και ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο κλινική μελέτη έδειξε αξιοσημείωτη επίδραση ενός συνδυασμού εκχυλισμάτων των ειδών S. scardica και Bacopa monnieri στη νοητική επίδοση ατόμων που πάσχουν από MCI [Dimpfel et al., 2016c]. Η μελέτη [Heiner et al., 2018], διερεύνησε διάφορα υδροαλκοολικά εκχυλίσματα του είδους S. scardica ως προς την ικανότητά τους να εξουδετερώσουν την τοξικότητα και τη συσσώρευση του β- αμυλοειδούς σε διαγονιδιακούς νηματοειδείς σκώληκες που εκφράζουν μεγάλες ποσότητες Αβ, η οποία παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση της νόσου Alzheimer s. Δημιουργήθηκαν εκχυλίσματα με διαλύτες Η2Ο:EtOH (80:20, 60:40, 50:50, 30:70) και αναλύθηκαν με HPLC, ώστε να εκτιμηθεί η συγκέντρωση των διάφορων πολυφαινολικών ενώσεων που περιείχαν. Ακόμα, δημιουργήθηκαν πολικά και άπολα κλάσματα από το μητρικό Η2Ο:EtOH (60:40) και αναλύθηκε το φυτοχημικό περιεχόμενό τους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυξανόμενης της λιποφιλίας του διαλύτη εκχύλισης, αυξήθηκε και η περιεκτικότητα σε φυτοχημικά συστατικά. Η χορήγηση αυτών σε διαγονιδιακά στελέχη C. elegans, ικανά να εκφράζουν β-αμυλοειδές, είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των συσσωματωμάτων πεπτιδίων στην περιοχή της κεφαλής των σκουληκιών και ελάττωση της τοξικότητας του β-αμυλοειδούς, η οποία εκτιμήθηκε μέσω του βαθμού προκύπτουσας παράλυσης στα ζώα. Τα εκχυλίσματα ενδιάμεσης πολικότητας (40 και 50% αιθανόλη) αποδείχθηκαν τα πιο δραστικά, καθώς μείωσαν τον αριθμό των αμυλοειδικών πλακών κατά 21% και καθυστέρησαν την επαγόμενη από β- αμυλοειδές παράλυση έως και 3,5 ώρες. Τα περισσότερο λιπόφιλα κλάσματα των εκχυλισμάτων παρουσίασαν υψηλότερη δραστικότητα από τα υδρόφιλα. Συμπερασματικά, οι ερευνητές κατέληξαν ότι τα εκχυλίσματα από το είδος Sideritis scardica επέδειξαν φαρμακολογική δραστικότητα και στο C. elegans ενάντια στα παθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer s, δεδομένα που υποστηρίζουν τις τρέχουσες προσπάθειες για την εκτίμηση της δυνατότητας του είδους S. scardica ως προς τη θεραπεία της εξασθένισης των γνωστικών λειτουργιών. Ο μηχανισμός δράσης διερευνάται περαιτέρω. 31

50 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΤΗΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΕΠΑΝΑΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΜΟΝΟΑΜΙΝΩΝ (in vitro) Οι μεταφορείς μονοαμινών εμπλέκονται σε αρκετές νευρολογικές φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, λόγω του ρόλου τους που είναι η επαναπρόσληψη των μονοαμινικών νευροδιαβιβαστών ντοπαμίνη, νοραδρεναλίνη και σεροτονίνη. Συνιστούν σημαντικούς στόχους για φάρμακα που χρησιμοποιούνται στη θεραπεία διαταραχών της διάθεσης όπως η κατάθλιψη, η διαταραχή ελλειμματικής προσοχής-υπερκινητικότητα, στην αντιμετώπιση της σχιζοφρένειας, της νόσου Πάρκινσον ή σε περιπτώσεις κατάχρησης ναρκωτικών [Knörle, 2012]. Σύμφωνα με τη μελέτη Knörle, 2012, τα εκχυλίσματα του είδους Sideritis scardica με διαλύτες Η2Ο, MeOH και EtOH:H2O (70:30) επέδειξαν αναστολή της επαναπρόσληψης των μονοαμινών σεροτονίνη, νοραδρεναλίνη και ντοπαμίνη σε συναπτοσώματα εγκεφάλου αρουραίων, καθώς και αναστολή της επαναπρόσληψης σεροτονίνης σε ανθρώπινα κύτταρα JAR (χοριοκαρκινώματος του πλακούντα). Η αναστολή της επαναπρόσληψης και των τριών μονοαμινών προκλήθηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο, όσον αφορά τη συγκέντρωση των χορηγούμενων εκχυλισμάτων, με τα αλκοολικά εκχυλίσματα να είναι πιο αποτελεσματικά από το υδατικό, με τιμές EC50 περίπου μg/ml. Στην περίπτωση του ανθρώπινου μεταφορέα σεροτονίνης, το μεθανολικό εκχύλισμα ήταν το πιο δραστικό (EC50 14 μg/ml). Σύμφωνα με τον ερευνητή, οι υπεύθυνες ενώσεις για τη δραστικότητα στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα θα μπορούσαν να είναι τερπένια, φλαβονοειδή και φαινόλες, μεταξύ άλλων. ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ AMPA-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΗΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΗΣ (ex vivo) Ο υποδοχέας AMPA, είναι ένας ιοντοτροπικός διαμεμβρανικός υποδοχέας του νευροδιαβιβαστή γλουταμινικού οξέος, που συμμετέχει στην ταχεία συναπτική διαβίβαση στο ΚΝΣ. Η μελέτη των [Dimpfel et al., 2016a] ήταν η πρώτη που χαρακτήρισε φαρμακολογικά σε in vivo δοκιμές εκχύλισμα του Sideritis scardica, ως προς τη δράση του στον εγκέφαλο, διερευνώντας τον πιθανό μηχανισμό δράσης του. Εξετάστηκε το εκχύλισμα H2O/EtOH (20:80), το οποίο ήταν γνωστό ότι είχε θετική επίδραση στις γνωστικές λειτουργίες, με δύο ερευνητικούς στόχους: 32

51 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1) Αν το εκχύλισμα θα μπορούσε να τροποποιήσει τη διεγερσιμότητα του ιππόκαμπου του εγκεφάλου αρουραίων, έπειτα από καθημερινή δια στόματος χορήγησή του, σε δόση 100 mg/kg, για διάρκεια μιας εβδομάδας, πριν την αφαίρεση του ιππόκαμπου την επόμενη της έβδομης ημέρας (ex vivo). 2) Αν υπήρχε η δυνατότητα να αναστραφεί ή να εμποδιστεί η τροποποίηση που προκάλεσε το εκχύλισμα, από έξι διαφορετικούς ανταγωνιστές υποδοχέων, που αλληλεπιδρούν με τη γλουταμινεργική συναπτική διαβίβαση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η συγκεκριμένη δοσολογία του εκχυλίσματος οδήγησε πράγματι σε ιδιαίτερα σημαντική διέγερση του ιππόκαμπου, σε σύγκριση με την placebo δοκιμή. Στη συνέχεια, αποδείχτηκε ότι από τους έξι ανταγωνιστές που δοκιμάστηκαν, μόνο αυτός που αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα AMPA ήταν ικανός να τροποποιήσει την διέγερση που είχε προκληθεί από το εκχύλισμα του S. scardica. Συγκεκριμένα, ο ιδιαίτερα εκλεκτικός ανταγωνιστής του υποδοχέα AMPA, NBQX (2,3- dioxo-6-nitro-1,2,3,4-tetrahydrobenzo[f]quinoxaline-7-sulfonamide disodium salt), σε συγκέντρωση 0,05 μμ, μείωσε ξεκάθαρα τη διέγερση που είχε προκληθεί αποκλειστικά από το εκχύλισμα του S. scardica, με στατιστικώς σημαντικό τρόπο. Ο υποδοχέας AMPA έχει αποδειχτεί ότι εμπλέκεται στη γνωστική λειτουργία. Το αποτέλεσμα αυτής της έρευνας έδειξε ότι κατά τη θετική επίδραση του εκχυλίσματος του S. scardica στη λειτουργία του εγκεφάλου, προκαλείται τροποποίηση του υποδοχέα AMPA. Με βάση όλη τη γνώση για το συγκεκριμένο υποδοχέα, οι ερευνητές κατέληξαν ότι το εκχύλισμα που μελετήθηκε έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τη γνωστική λειτουργία και τις νοητικές διεργασίες, καθώς και να αποτρέψει την εξασθένιση της νοητικής ικανότητας που προκαλεί η γήρανση. ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗΣ (AChE) Η ακετυλοχολινεστεράση (AChE) εμπλέκεται στον τερματισμό της μετάδοσης παλμών, μέσω ταχείας υδρόλυσης του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh), σε πολλές χολινεργικές οδούς στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα. Παρακάτω, παρουσιάζεται ο νευροδιαβιβαστής ακετυλοχολίνη και τα ένζυμα χολινεστεράσες, με έμφαση στην AChE. Περιγράφεται ο τρόπος λειτουργίας της ακετυλοχολίνης, καθώς και η δομή αλλά και ο μηχανισμός ενζυμικής δραστικότητας της AChE. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται οι σημαντικότεροι αναστολείς της AChE που χρησιμοποιούνται στην 33

52 ΕΙΣΑΓΩΓΗ θεραπευτική, καθώς και κάποιες αξιοσημείωτες περιπτώσεις ισχυρών αναστολέων που έχουν απομονωθεί από φυτικά είδη. Τέλος, παρουσιάζονται ενδεικτικά στοιχεία από πρόσφατες μελέτες πάνω σε είδη του γένους Sideritis, για τα οποία έχει δειχτεί ότι διαθέτουν σημαντική δραστικότητα ως προς την ικανότητα αναστολής της AChE. Η ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗ ΩΣ ΝΕΥΡΟΔΙΑΒΙΒΑΣΤΗΣ Η ακετυλοχολίνη (ACh) είναι νευροδιαβιβαστής που εντοπίζεται σε όλα τα γάγγλια του αυτόνομου νευρικού συστήματος, στη νευρομυϊκή σύναψη, και σε πολλαπλές οδούς στο ΚΝΣ. Στο αυτόνομο νευρικό σύστημα, η ACh είναι ο κύριος νευροδιαβιβαστής στους προγαγγλιακούς συμπαθητικούς και παρασυμπαθητικούς νευρώνες, στο μυελό των επινεφριδίων, καθώς και σε όλα τα όργανα του παρασυμπαθητικού νευρικού συστήματος. Στο περιφερικό νευρικό σύστημα, η ACh είναι ο νευροδιαβιβαστής στη νευρομυϊκή σύνδεση μεταξύ του κινητικού νεύρου και του σκελετικού μυ. Στο κεντρικό νευρικό σύστημα, η ACh βρίσκεται κυρίως στους διάμεσους νευρώνες και σε σημαντικές χολινεργικές οδούς. ΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΕΣ Οι χολινεστεράσες είναι μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την υδρόλυση του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh) σε χολίνη και οξικό οξύ, μια αντίδραση που επιτρέπει σε ένα χολινεργικό νευρώνα να επιστρέψει στην κατάσταση ηρεμίας μετά την ενεργοποίησή του. Περιλαμβάνει τους παρακάτω δύο ενζυμικούς τύπους: 1. Ακετυλοχολινεστεράση (AChE, ή ακετυλυδρολάση της ακετυλοχολίνης). Εντοπίζεται σε πολλούς τύπους αγώγιμων ιστών: νευρώνες και μύες, κεντρικούς και περιφερικούς ιστούς, κινητικές και αισθητικές ίνες, χολινεργικές και μη χολινεργικές ίνες. Η δραστικότητα της AChE είναι υψηλότερη στους κινητικούς νευρώνες παρά στους αισθητικούς νευρώνες. 2. Βουτυρυλοχολινεστεράση (BuChE ή χολινεστεράση πλάσματος ή ψευδοχολινεστεράση ή ακυλυδρολάση της ακυλοχολίνης). Εντοπίζεται κυρίως στο ήπαρ. Σε αντίθεση με την AChE, η BuChE υδρολύει τη βουτυρυλοχολίνη πιο γρήγορα από την ΑCh [Čolović et al., 2013]. 34

53 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στον υγιή εγκέφαλο, η AChE είναι η κύρια χολινεστεράση, ενώ η BuChE θεωρείται ότι διαδραματίζει ένα μικρό ρόλο στη ρύθμιση των επιπέδων της ακετυλοχολίνης. Οι νευρώνες στους οποίους εντοπίζεται η BuChE, βρίσκονται στον μετωπιαίο φλοιό και εικάζεται ότι εμπλέκονται στην προσοχή, την εκτελεστική λειτουργία, τη συναισθηματική μνήμη και τη συμπεριφορά. Όσον αφορά τη νόσο Alzheimer s, η δραστικότητα της BuChE αυξάνεται όσο πιο σοβαρή γίνεται η νόσος, σε αντίθεση με την AChE, η δραστικότητα της οποίας μένει αμετάβλητη ή ελαττώνεται. Συνεπώς, η αναστολή της BuChE μπορεί να αποτελέσει μία ακόμα στόχευση για τη νόσο Alzheimer s, ξεχωριστά ή και συνδυαστικά μαζί με την αναστολή της AChE, καθώς επίσης, πρόσφατες ενδείξεις συνηγορούν στο ότι και οι δύο χολινεστεράσες εμπλέκονται στην αιτιολογία και εξέλιξη της νόσου, με επιπλέον μηχανισμούς, διαφορετικούς της ρύθμισης των συναπτικών επιπέδων της ACh [Greig et al., 2002], [Lane et al., 2005]. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΗΣ (ACh) Η ακετυλοχολίνη (ACh) συντίθεται με μία αντίδραση ενός σταδίου, η οποία καταλύεται από το βιοσυνθετικό ένζυμο ακετυλοτρανσφεράση της χολίνης. Η παρουσία του συγκεκριμένου ενζύμου σε ένα νευρώνα σηματοδοτεί ότι αυτός είναι χολινεργικός. Το μεγαλύτερο ποσοστό της ACh στις νευρικές απολήξεις περιέχεται σε διαυγή κυστίδια μεγέθους 100 nm, ενώ μια μικρή ποσότητα ACh εντοπίζεται ελεύθερη στο κυτοσόλιο. Η επαναπρόσληψη της ACh σε αποθηκευτικά κυστίδια λαμβάνει χώρα μέσω μιας ενεργειακά εξαρτώμενης αντλίας, η οποία οξινίζει το κυστίδιο. Κατά τη νευροδιαβίβαση, η ACh απελευθερώνεται από το νευρώνα προς τη συναπτική σχισμή και συνδέεται στους υποδοχείς της (νικοτινικούς και μουσκαρινικούς), που βρίσκονται στη μετασυναπτική μεμβράνη, μεταδίδοντας το σήμα από το νεύρο. Η AChE, που βρίσκεται επίσης στη μετασυναπτική μεμβράνη, τερματίζει τη μετάδοση του σήματος υδρολύοντας την ACh. Έπειτα, η απελευθερωμένη χολίνη από την αποσύνθεση της ACh λαμβάνεται ξανά από τον προσυναπτικό νευρώνα και ο νευροδιαβιβαστής συντίθεται ξανά, αντιδρώντας με το ακέτυλο-coa, με τη βοήθεια της ακετυλοτρανσφεράσης της χολίνης [Čolović et al., 2013]. 35

54 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ AChE H AChE είναι μια υδρολάση σερίνης που εντοπίζεται κυρίως στις νευρομυϊκές συνδέσεις και τις χολινεργικές συνάψεις του εγκεφάλου. Ο κύριος βιολογικός της ρόλος είναι ο τερματισμός της διαβίβασης σημάτων στις χολινεργικές συνάψεις, υδρολύοντας ταχέως το νευροδιαβιβαστή ΑCh σε οξικό οξύ και χολίνη, ενώ εμφανίζει εξαιρετικά εξειδικευμένη καταλυτική δραστικότητα. Το μόριο της AChE έχει ελλειψοειδές σχήμα με διαστάσεις 45 x 60 x 65 Å και συνιστά μια α/β πρωτεΐνη, αποτελούμενη από 12 μεμονωμένα, εσωτερικά αναδιπλωμένα β πτυχωτά φύλλα, που περιβάλλονται από 12 α έλικες. Το αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό της δομής της είναι μία βαθιά και στενή κοιλότητα, μήκους περίπου 20 Å, η οποία διεισδύει μέχρι τα μισά του ενζύμου και διευρύνεται κοντά στη βάση του. Το ενεργό κέντρο της AChE βρίσκεται μέσα σε αυτή την κοιλότητα, 4 Å από τον πυθμένα και αποτελείται από δύο υποπεριοχές. Η πρώτη χαρακτηρίζεται ως «εστερασική» και περιλαμβάνει τις οντότητες που διενεργούν την κατάλυση ενώ η δεύτερη χαρακτηρίζεται ως «ανιονική» και συνιστά το σημείο πρόσδεσης της χολίνης (Εικόνα 11). Η ανιονική υποπεριοχή, όντας φορτισμένη και λιπόφιλη, έχει συγγένεια και προσδένει τις θετικά φορτισμένες οντότητες και συγκεκριμένα τη θετικά φορτισμένη τεταρτοταγή αμινομάδα της χολίνης, που είναι προσδεμένη στην εστερασική υποπεριοχή. Τα υπόλοιπα κατιονικά υποστρώματα δεν προσδένονται από αρνητικά φορτισμένο αμινοξύ της ανιονικής υποπεριοχής, αλλά προσδένονται μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων με 14 αρωματικά κατάλοιπα που περιβάλλουν την κοιλότητα που οδηγεί στο ενεργό κέντρο. Το σύνολο των 14 αμινοξέων στην αρωματική κοιλότητα είναι ιδιαίτερα συντηρημένα ανάμεσα στα διάφορα είδη οργανισμών. Από αυτά τα αμινοξέα, κρίσιμης σημασίας είναι η παρουσία της τρυπτοφάνης 84, καθώς η αντικατάστασή της από αλανίνη προκαλεί μείωση κατά 3000 φορές στην ενζυμική ενεργότητα. Η εστερασική υποπεριοχή, όπου υδρολύεται η ΑCh σε οξικό οξύ και χολίνη, περιέχει, παρόμοια με τις καταλυτικές υποπεριοχές των ενεργών κέντρων άλλων υδρολασών σερίνης, την καταλυτική τριάδα των αμινοξέων: γλουταμινικό οξύ, ιστιδίνη και σερίνη [Čolović et al., 2013]. 36

55 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 11. Απλοποιημένη σχηματική απεικόνιση της πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης στην AChE, και η αντίδραση της υδρόλυσής της. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΥΔΡΟΛΥΣΗΣ ΤΗΣ ACh H αντίδραση υδρόλυσης του καρβοξυλικού εστέρα ακετυλοχολίνη έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός ακυλ-ενζύμου και ελεύθερης χολίνης. Στη συνέχεια, το ακυλ-ενζυμο δέχεται πυρηνόφιλη προσβολή από ένα μόριο νερού, υποβοηθούμενη από την ιστιδίνη-440 προς απελευθέρωση οξικού οξέος και αναγέννηση του ελεύθερου ενζύμου (Εικόνα 12). 37

56 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 12. Μηχανισμός της υδρόλυσης της ακετυλοχολίνης (ACh), καταλυόμενη από το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση (AChE), με τη συμμετοχή των τριών αμινοξέων Glu-327, His-440 και Ser-200 [Čolović et al., 2013]. ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ ΑChE Εκτός από τις δύο υποπεριοχές του ενεργού κέντρου, η AChE διαθέτει μία ακόμα ανιονική περιφερική περιοχή, απομακρυσμένη από το σημείο πρόσδεσης της ακετυλοχολίνης του ενεργού κέντρου. Ο ρόλος της είναι να προσδένει επίσης την ακετυλοχολίνη, καθώς και άλλους τεταρτοταγείς προσδέτες, οι οποίοι δρουν έτσι ως μηανταγωνιστικοί αναστολείς, καθώς προσδένονται σε μια περιοχή εντελώς διαφορετική από αυτή που καταλαμβάνεται από τους ανταγωνιστικούς τεταρτοταγείς αναστολείς. Η περιοχή αυτή εμπλέκεται στην αναστολή της AChE και αποτελεί επιπλέον στόχευση για τους αναστολείς του ενζύμου, εκτός από τις περιοχές του ενεργού κέντρου. Oι αναστολείς της AChE παρεμποδίζουν το ένζυμο από το να διασπάσει την ΑCh, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο το χρόνο και το ποσοστό πραγματοποίησης της νευροδιαβίβασης. Ανάλογα με τον τρόπο δράσης τους, οι αναστολείς της AChE μπορούν να διαιρεθούν σε δύο κατηγορίες, τους αντιστρεπτούς και τους μη αντιστρεπτούς. 38

57 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Θεραπευτική δράση εμφανίζουν κυρίως οι αντιστρεπτοί, ανταγωνιστικοί ή μη, ενώ τοξική επίδραση σχετίζεται με τους μη αντιστρεπτούς αναστολείς. Οι αντιστρεπτοί αναστολείς διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη φαρμακολογική ρύθμιση της ενζυμικής ενεργότητας της AChE. Έχουν χρησιμοποιηθεί στη διαγνωστική ή / και θεραπεία διαφόρων ασθενειών, όπως: μυασθένεια Gravis, νόσος Alzheimer s, μετεγχειρητικός ειλεός, διαταραχές της ουροδόχου κύστης, γλαύκωμα, καθώς και ως αντίδοτο στην υπερδοσολογία από αντιχολινεργικούς παράγοντες. Όσον αφορά τη νόσο Alzheimer s, ο κύριος θεραπευτικός στόχος των φαρμάκων που χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη είναι η αναστολή της AChE του εγκεφάλου. Οι αναστολείς αυτοί αντιμετωπίζουν συμπτώματα που σχετίζονται με τη μνήμη, τη σκέψη, τη γλώσσα, την κρίση και άλλες διεργασίες του νου. Διάφορες φυσιολογικές διαδικασίες που σχετίζονται με τη νόσο Alzheimer s, στην πραγματικότητα καταστρέφουν κύτταρα που παράγουν και αξιοποιούν την ACh, ελαττώνοντας έτσι την ποσότητά της που μένει διαθέσιμη για τη μεταφορά σημάτων μέσω της νευροδιαβίβασης. Οι αναστολείς της AChE διατηρούν υψηλά τα επίπεδα της ACh στη σύναψη, με το να μειώνουν το ρυθμό καταστροφής της και εν τέλει, ενισχύουν τη χολινεργική νευροδιαβίβαση. Οι ενώσεις που έχουν εγκριθεί, ως φαρμακευτικές αγωγές από τους FDA και EMA για τη θεραπεία των γνωστικών εκδηλώσεων της νόσου Alzheimer s και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών (Εικόνα 13), είναι οι: donepezil, rivastigmine και galanthamine ως αναστρέψιμοι αναστολείς της AChE. Η ένωση tacrine ήταν ο πρώτος αναστολέας της AChE που εγκρίθηκε για την αντιμετώπιση της νόσου Alzheimer s το 1993, ωστόσο, η χρήση της απαγορεύτηκε λόγω της μεγάλης πιθανότητας παρενεργειών που εμφάνιζε, συμπεριλαμβανομένης ηπατοτοξικότητας. [Čolović et al., 2013]. 39

58 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 13. Δομές των τεσσάρων ενώσεων που χρησιμοποιούνται στη αντιμετώπιση της νόσου Alzheimer s. Η ένωση donepezil είναι ένας εκλεκτικός, αναστρέψιμος αναστολέας της AChE που προσδένεται στην περιφερική ανιονική περιοχή και αντιμετωπίζει τη νόσο Alzheimer s συμπτωματικά. Η ένωση rivastigmine είναι ένας ισχυρός, αργά-αναστρέψιμος αναστολέας καρβαμικού οξέος, ο οποίος παρεμποδίζει την ενεργότητα της AChE μέσω πρόσδεσης στην εστερασική υποπεριοχή του ενεργού της κέντρου. Η ένωση galanthamine, φυσικό προϊόν, αποτελεί ένα αλκαλοειδές που απομονώθηκε από το φυτό Galanthus woronowii της οικογένειας Amaryllidaceae και χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση της ήπιας ή μέτριου βαθμού νόσου Alzheimer s. Είναι ένας εκλεκτικός, ανταγωνιστικός, ταχέως-αναστρέψιμος αναστολέας της AChE που αλληλεπιδρά με την ανιονική υποπεριοχή του ενεργού κέντρου, αλλά και τα αρωματικά αμινοξικά κατάλοιπα που περιβάλλουν την κοιλότητα του ενζύμου. Επιπρόσθετα, η galanthamine είναι ένας αλλοστερικός προσδέτης των νικοτινικών χολινεργικών υποδοχέων και εμπλέκεται στη ρύθμισή τους. Αλληλεπιδρά με τους νικοτινικούς υποδοχείς σε σημεία πρόσδεσης απομακρυσμένα από αυτά της ACh και των νικοτινικών αγωνιστών και δρα με υψηλή ειδίκευση, με τέτοιο τρόπο ώστε να προκαλεί ενίσχυση της ενεργότητας (ευαισθητοποίηση) των νικοτινικών υποδοχέων παρουσία της 40

59 ΕΙΣΑΓΩΓΗ AChE. Με αυτόν τον τρόπο αντισταθμίζει σε ένα βαθμό την απώλεια νικοτινικών υποδοχέων που προκαλεί η νόσος Alzheimer s [Čolović et al., 2013]. ΦΥΣΙΚΑ ΠΡΟΙΟΝΤΑ ΩΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΙΣ ΤΗΣ AChE Μεταξύ των δύο υποπεριοχών του ενεργού κέντρου της AChE, η εστερασική αποτελείται από ένα κατάλοιπο ιστιδίνης (His-447), ενώ η ανιονική από ένα κατάλοιπο τρυπτοφάνης (Trp-84), ικανό να προσδένει τεταρτοταγείς προσδέτες, οι οποίοι μπορούν να δρουν ως ανταγωνιστικοί αναστολείς [Dos Santos et al., 2018]. Η ανασκόπηση [Dos Santos et al., 2018] των φυσικών προϊόντων που έχουν καταγραφεί στη βάση δεδομένων Pubmed μεταξύ των ετών 2007 και 2018, ως ικανά να αναστέλλουν την AChE (αξιολογημένα με τη μέθοδο του Ellman), κατέδειξε τα εξής: Οι περισσότεροι αναστολείς-φυσικά προϊόντα ανήκουν στα αλκαλοειδή. Δεκαέξι ενώσεις, απομονωμένες από φυτά, εμφάνισαν υψηλότερη ικανότητα αναστολής της AChE σε σχέση με τη galanthamine. Από αυτές, 13 ήταν αλκαλοειδή, 2 ήταν κουμαρίνες και 1 ήταν τερπένιο. Η δραστικότητα των αλκαλοειδών αποδίδεται στην πολυπλοκότητα των αζωτούχων δομών τους, οι οποίες, φορτισμένες θετικά προσδένονται στην ανιονική υποπεριοχή του ενεργού κέντρου. Αντιθέτως, τα μη αλκαλοειδή φυσικά προϊόντααναστολείς (τερπένια, φλαβονοειδή και άλλες φαινολικές ενώσεις) φαίνεται να δρουν ως μη ανταγωνιστικοί αναστολείς, καθώς προσδένονται στην περιφερική ανιονική περιοχή (PAS). Οι τρεις ισχυρότεροι φυσικοί αναστολείς της AChE, μεταξύ των 16 που επέδειξαν τιμές IC50 μικρότερες της galanthamine, είναι οι ενώσεις decursinol, berberine και palmatine (Εικόνα 14). H decursinol είναι μία διυδροπυρανοκουμαρίνη που απομονώθηκε από το είδος Angelica gigas Nakai, της οικογένειας Apiaceae, από τους Anand et al., 2012 και αποτελεί το πιο δραστικό φυσικό προϊόν με IC50 = 0,28 μm. Η ιδιαίτερα υψηλή δραστικότητα της decursinol έχει αποδοθεί σε χαρακτηριστικά της κυκλοποίησης της ισοπρενυλικής μονάδας στον C-6 και τις λειτουργικές ομάδες που φέρει ο κουμαρινικός πυρήνας της, οι οποίες διαφέρουν από άλλες κουμαρίνες. Οι ενώσεις berberine και palmatine ανήκουν στα αλκαλοειδή. Απομονώθηκαν από τους Jung et al., 2009 από το ρίζωμα του φυτού Coptis chinensis Franch και επέδειξαν τιμές IC50 = 0,44 μm, η berberine και IC50 = 0,51 μm, η palmatine. 41

60 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 14. Δομές των φυσικών προϊόντων - ισχυρών αναστολέων της AChE: decursinol, berberine και palmatine. ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΗΣ AChE AΠΟ ΤΟ ΓΕΝΟΣ SIDERITIS Σε μελέτες των τελευταίων ετών, που αφορούν αρκετά διαφορετικά είδη του γένους Sideritis, έγινε εκτίμηση της ικανότητας αναστολής της AChE (και συχνά της BuChE) από εκχυλίσματα ή / και απομονωμένες ενώσεις, στο πλαίσιο της διερεύνησης της νευροπροστατευτικής δράσης που φαίνεται να έχει το φυτό. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα των μελετών αυτών παρουσιάζονται παρακάτω. Σε όλες τις μελέτες, χρησιμοποιήθηκε με μικροπαραλλαγές, ως μέθοδος εκτίμησης της in vitro ικανότητας αναστολής της AChE, η μέθοδος του Ellman [Ellman, 1961]. Στο πλαίσιο της έρευνας των Ertas et al., 2009, με αντικείμενο μελέτης τα εναέρια τμήματα του είδους Sideritis arguta, απομονώθηκαν 5 διτερπενοειδή από το εκχύλισμα πετρελαϊκoύ αιθέρα: epoxysiderol, siderol, sideroxol, 15-epi-eubol, eubol και 4 ακόμα ent-καουράνια από υποκλάσμα ακετόνης του ίδιου εκχυλίσματος: diacetyldistanol, epoxysiderol, 7-epicandicandiol, eubotriol. Η δραστικότητα που επέδειξαν κάποιες από αυτές τις ενώσεις ως προς την αναστολή των ενζύμων AChE και BuChE, σε σύγκριση με την πρότυπη ένωση galanthamine παρουσιάζεται στον Πίνακα 2. 42

61 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 2. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα (ΙC 50) έναντι των AChE και BuChE, από διτερπενοειδή του είδους Sideritis arguta, συγκρινόμενη με τον πρότυπο αναστολέα galanthamine [Ertas et al., 2009]. Ένωση AChE (IC 50, μm) BuChE (IC 50, μm) diacetyldistanol - 175,8 ± 2,0 eubol - 23,2 ± 3,2 eubotriol - 98,1 ± 2,6 sideroxol 14,5 ± 0,8 25,0 ± 3,0 7-epicandicandiol 22,8 ± 0,7 21,1 ± 5,1 galanthamine 73,9 ± 0,8 50,9 ± 0,9 Η έρευνα των Topçu et al., 2011 αφορούσε στο είδος Sideritis congesta, και ως δρόγη χρησιμοποιήθηκε κονιορτοποιημένο, ολόκληρο το φυτό. Η δρόγη εκχυλίστηκε διαδοχικά με πετρελαϊκό αιθέρα και ακετόνη. Από το εκχύλισμα του πετρελαϊκού αιθέρα, το οποίο κλασματώθηκε με μείγματα διαλυτών: πετρελαϊκό αιθέρα, DCM, Me2CO, MeOH, απομονώθηκαν τα διτερπενοειδή: 7-acetyldistanol, sideroxol, sideridiol, siderol και 7-epicandicandiol. Από το εκχύλισμα της ακετόνης, το οποίο κλασματώθηκε με μείγματα διαλυτών DCM, Me2CO, MeOH, απομονώθηκαν τα διτερπενοειδή: epoxyisolinearol, siderol, 7-epicandicandiol, foliol, linearol και sidol. Οι παραπάνω ενώσεις, εκτός της foliol, εξετάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν τα ένζυμα ΑChE και BuChE σε σύγκριση με την πρότυπη ένωση galanthamine, και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. Πίνακας 3. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα (ΙC 50) έναντι των AChE και BuChE, από διτερπενοειδή του είδους Sideritis congesta, συγκρινόμενη με τον πρότυπο αναστολέα galanthamine [Topçu et al., 2011]. Ένωση AChE (IC 50, mm) BuChE (IC 50, mm) 7-acetyldistanol 1,89 ± 0,08 1,19 ± 1,67 epoxyisolinearol 0,87 ± 0,01 0,43 ± 0,02 sideroxol 1,27 ± 0,80 0,024 ± 0,00 sideridiol 8,04 ± 0,87 3,67 ± 0,99 siderol 0,69 ± 0,81 0,65 ± 0,09 7-epicandicandiol 0,23 ± 0,09 0,022 ± 0,01 linearol 2,66 ± 1,27 0,15 ± 0,01 sidol 0,92 ± 0,01 0,05 ± 0,00 galanthamine 0,0037 ± 0,00 0,041 ± 0,01 43

62 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Παρόλο που όλα τα διτερπενοειδή που ελέγχθηκαν επέδειξαν μια μικρή δραστικότητα αναστολής του ενζύμου AChE, αξιοσημείωτο ήταν το εύρημα ότι τα entκαουράνια sideroxol και 7-epicandicandiol επέδειξαν ακόμα καλύτερη αναστολή της BuChE από τον πρότυπο αναστολέα galanthamine. Στην έρευνα των Zengin et al., 2014, μελετήθηκε το είδος Sideritis galactica. Ως δρόγη χρησιμοποιήθηκαν τα αποξηραμένα εναέρια τμήματα του φυτού, τα οποία εκχυλίστηκαν με τρεις διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας: πετρελαϊκό αιθέρα, οξικό αιθυλεστέρα, μεθανόλη και σε ξεχωριστή, νέα εκχύλιση, με νερό, ώστε να προκύψουν τέσσερα εκχυλίσματα. Εξετάστηκε η δραστικότητα των εκχυλισμάτων αυτών ως προς την ικανότητα αναστολής των ενζύμων AChE και BuChE και τα αποτελέσματα, με τη μορφή mg ισοδύναμων της galanthamine ανά g εκχυλίσματος, παρουσιάζονται στον Πίνακα 4. Πίνακας 4. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα σε mg ισοδύναμου της galanthamine / g εκχυλίσματος, έναντι των AChE και BuChE, εκχυλισμάτων του είδους Sideritis congesta [Zengin et al., 2014]. Εκχυλίσματα Ένζυμο Πετρελαϊκού Οξικού Μεθανόλης Υδατικό AChE 5,47 ± 0,03 5,59 ± 0,04 3,87 ± 0,13 0,06 ± 0,01 BuChE 24,59 ± 0,51 27,28 ± 0,38 18,33 ± 1,26 - Τη μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής σε αμφότερα τα ένζυμα, επέδειξε το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα, ακολουθούμενο από αυτά του πετρελαϊκού αιθέρα και της μεθανόλης, τα οποία ήταν σημαντικώς διαφορετικά (p < 0,05). To εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα ήταν πλούσιο στα φλαβονοειδή kaempferol και apigenin, τα οποία ωστόσο, έχουν αναφερθεί στη βιβλιογραφία ως ανενεργά ως προς την αναστολή των AChE και BuChE [Orhan et al., 2007]. Επομένως, οι ερευνητές κατέληξαν ότι οι δραστικότητα που διαπίστωσαν οφείλεται πιθανώς σε μη φαινολικές ενώσεις, όπως για παράδειγμα σαπωνίνες και αλκαλοειδή. Στη συγκεκριμένη μελέτη, όπως και σε άλλες σχετικές, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της ικανότητας αναστολής των χολινεστερασών και του φαινολικού περιεχόμενου. Στο πλαίσιο της μελέτης των Korkmaz et al., 2017, αξιολογήθηκε η ικανότητα αναστολής του ενζύμου AChE από το είδος Sideritis libanotica ssp. linearis. Συγκεκριμένα, το αποξηραμένο, κονιορτοποιημένο φυτικό υλικό υποβλήθηκε σε δύο 44

63 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ξεχωριστές εκχυλίσεις, μία με διαλύτη εξάνιο και με μία με μεθανόλη. Με κάθε διαλύτη εκχυλίστηκε ξεχωριστά φυτικό υλικό που προερχόταν α) από τις ρίζες και β) από τα εναέρια τμήματα. Ως πηγές του ενζύμου, χρησιμοποιήθηκαν ανθρώπινο πλάσμα του αίματος και ερυθροκύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάποιες μορφές εκχυλισμάτων, από το σώμα του φυτού και τις ρίζες, έχουν την ικανότητα να αναστέλλουν την AChE του πλάσματος ή / και των ερυθροκυττάρων του ανθρώπου. Οι τιμές IC50 για την επίδραση των εκχυλισμάτων από το σώμα του φυτού στην AChE του πλάσματος ήταν 1,066 x 10-3 mg/ml για το μεθανολικό εκχύλισμα και 5,888 x 10-3 για το εκχύλισμα του εξανίου. Όσον αφορά τα εκχυλίσματα των ριζών, το μεθανολικό εμφάνισε IC50 = 0,174 x 10-3 mg/ml, ενώ το εκχύλισμα του εξανίου δεν εμφάνισε ικανότητα αναστολής. Όσον αφορά την αναστολή της AChE των ερυθροκυττάρων, οι τιμές IC50 για το μεθανολικό εκχύλισμα από το σώμα του φυτού ήταν 0,1679 x 10-3 και για το μεθανολικό εκχύλισμα των ριζών ήταν 0,2136 x Κανένα εκχύλισμα εξανίου δεν επέδειξε αναστολή στην AChE των ερυθροκυττάρων. Μέρος της μελέτης των Deveci et al., 2017, εστίασε στην αξιολόγηση της ικανότητας αναστολής των χολινεστερασών AChE (από ηλεκτροφόρο χέλι) και BuChE (από ορό αίματος αλόγου), από εκχυλίσματα των εναέριων τμημάτων του είδους Sideritis pisidica, τα οποία προέκυψαν από ξεχωριστές εκχυλίσεις με διαλύτες εξάνιο, ακετόνη και μεθανόλη. Οι τιμές της επί τοις εκατό αναστολής των εκχυλισμάτων και της πρότυπης ένωσης galanthamine, παρουσιάζονται στον Πίνακα 5. Σημαντική ήταν η αναστολή που επέδειξε το εκχύλισμα του εξανίου στην AChE. Πίνακας 5. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα (% αναστολή) έναντι των AChE και BuChE, από εκχυλίσματα του είδους Sideritis arguta, συγκέντρωσης 200 μg/ml, συγκρινόμενη με τον πρότυπο αναστολέα galanthamine [Deveci et al., 2017]. Εκχύλισμα % αναστολή AChE % αναστολή BuChE Αιθέριο έλαιο 11,60 ± 1,20 58,373 ± 1,03 Εξανίου 62,54 ± 0,88 47,47 ± 0,98 Ακετόνης - 43,43 ± 1,10 Μεθανόλης - 16,35 ± 0,91 galanthamine 80,41 ± 0,98 82,23 ± 0,67 Στο πλαίσιο της μελέτης των Ozturk et al., 2019a, αξιολογήθηκε η ικανότητα αναστολής των AChE (από ηλεκτροφόρο χέλι) και BuChE (από ορό αλόγου), από το αιθέριο έλαιο των ειδών Sideritis albiflora και Sideritis leptoclada. Τα αιθέρια έλαια 45

64 ΕΙΣΑΓΩΓΗ εκχυλίστηκαν μέσω υδροαπόσταξης σε συσκευή τύπου-clevenger. Τα αποτελέσματα της μελέτης, στη μορφή επί τοις εκατό αναστολής για την AChE και IC50 για τη BuChE, παρουσιάζονται στον Πίνακα 6. Ιδιαίτερα μεγάλη ήταν η ικανότητα αναστολής που επέδειξαν τα αιθέρια έλαια και των δύο ειδών στη BuChE. Πίνακας 6. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα (% αναστολή ΑChE και IC 50 ΒuChE) έναντι των AChE και BuChE, των αιθέριων ελαίων συγκέντρωσης 200 μg/ml από τα είδη Sideritis albiflora και Sideritis leptoclada, συγκρινόμενη με τον πρότυπο αναστολέα galanthamine [Deveci et al., 2019a]. Είδος AChE (% αναστολή) BuChE (IC 50, μg/ml) Sideritis albiflora 22,1 ± 0,4 157,2 ± 0,9 Sideritis leptoclada 4,3 ± 0,3 199,0 ± 1,0 galanthamine 80,4 ± 0,4 50,8 ± 0,9 Στη συνέχεια [Deveci et al., 2019b], αξιολογήθηκε η δραστικότητα εκχυλισμάτων των ίδιων ειδών ως προς την αναστολή των AChE (από ηλεκτροφόρο χέλι) και BuChE (από ορό αλόγου). Τα εναέρια τμήματα των φυτών εκχυλίστηκαν διαδοχικά με τους διαλύτες: εξάνιο, ακετόνη και μεθανόλη, ώστε να προκύψουν τρία αντίστοιχα εκχυλίσματα και να εκτιμηθούν ως αναστολείς των χολινεστερασών. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 7. Πίνακας 7. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα (IC 50) έναντι των ΑChE και ΒuChE, τριών εκχυλισμάτων από τα είδη Sideritis albiflora και Sideritis leptoclada, συγκρινόμενη με τον πρότυπο αναστολέα galanthamine [Deveci et al., 2019b]. Είδος Εκχύλισμα AChE (IC 50, μg/ml) BuChE (IC 50, μg/ml) S. albiflora S. leptoclada Εξανίου 162,78 ± 0,63 152,91 ± 0,65 Ακετόνης > ,18 ± 1,05 Μεθανόλης > 200 >200 Εξανίου 104,44 ± 1,09 119,02 ± 0,70 Ακετόνης > ,25 ± 0,99 Μεθανόλης > 200 > 200 Πρότυπη ένωση galanthamine 5,00 ± 0,13 50,80 ± 0,93 Συμπερασματικά, ως προς την αναστολή της AChE, τα εκχυλίσματα εξανίου επέδειξαν κάποια μέτρια ικανότητα αναστολής, ενώ ήταν πιο δραστικά έναντι της BuChE. Τα μη πολικά εκχυλίσματα εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα αναστολής των χολινεστερασών από τα πολικά. 46

65 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στο πλαίσιο της μελέτης των Zengin et al., 2019, διερευνήθηκε η αντιχολινεστερασική δραστικότητα έναντι των ενζύμων AChE και BuChE από το είδος Sideritis ozturkii. Συγκεκριμένα, ελέγχθηκαν εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα, μεθανόλης και νερού από τα εναέρια τμήματα του φυτού και τα αποτελέσματα, με τη μορφή mg ισοδύναμων της galanthamine / g εκχυλίσματος, παρουσιάζονται στον Πίνακα 8. Πίνακας 8. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα σε mg ισοδύναμου της galanthamine / g εκχυλίσματος, έναντι των AChE και BuChE, εκχυλισμάτων του είδους Sideritis ozturkii [Zengin et al., 2019]. Εκχυλίσματα Ένζυμο Οξικού αιθυλεστέρα Μεθανόλης Υδατικό AChE 3,38 ± 0,13 3,06 ± 0,19 - BuChE 2,36 ± 0, Το ισχυρότερο κλάσμα ως προς την αναστολή της AChE ήταν το κλάσμα του οξικού αιθυλεστέρα, με αξιοσημείωτη δράση, αλλά ωστόσο μικρότερη από αυτή που επέδειξε το αντίστοιχο κλάσμα από το είδος S. galactica, όπως παρουσιάστηκε παραπάνω. Ένα αξιοσημείωτο εύρημα στη συγκεκριμένη μελέτη ήταν η ανίχνευση μέσω HPLC-MS/MS του αλκαλοειδούς indole-4-carbaldehyde (Εικόνα 15), τόσο στο εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα, όσο και στο μεθανολικό. Εικόνα 15. Δομή του αλκαλοειδούς indole-4-carbaldehyde που ταυτοποιήθηκε με ανάλυση HPLC-MS/MS στο είδος S. ozturkii. Όσον αφορά το είδος Sideritis hololeuca, αξιολογήθηκε η ικανότητα αναστολής των AChE και BuChE από τα εκχυλίσματα εξανίου, διχλωρομεθανίου, ακετόνης, καθώς και απομονωμένων διτερπενοειδών, σε σύγκριση με τον πρότυπο αναστολέα 47

66 ΕΙΣΑΓΩΓΗ galanthamine [Carikci et al., 2020]. Κανένα από τα εκχυλίσματα δεν επέδειξε δράση έναντι της AChE. Ένα μόνο κλάσμα από το μεθανολικό εκχύλισμα εμφάνισε μέτρια δράση (45,78 ± 0,72%) έναντι της BuChE, με τη galanthamine να εμφανίζει αναστολή 80,02 ± 0,38%. Τα υπόλοιπα μεθανολικά κλάσματα εμφάνισαν κάποια μικρή μόνο αναστολή στη BuChE. Αναφορικά με τα διτερπενοειδή, η ένωση 7-epicandicandiol επέδειξε σημαντική και μάλιστα καλύτερη ικανότητα αναστολής της BuChE, συγκριτικά με τη galanthamine. Η αξιολόγηση των εκχυλισμάτων οξικού αιθυλεστέρα, μεθανόλης και νερού από τα εναέρια τμήματα του είδους Sideritis perfoliata [Sarikurkcu et al., 2020], ως προς την ικανότητα αναστολής των AChE και BuChE, παρουσιάζονται στον Πίνακα 9, στη μορφή mg ισοδύναμων της galanthamine / g εκχυλίσματος. Οι ερευνητές, με δεδομένα τα ευρήματα της βιβλιογραφίας, κατέληξαν ότι το γένος Sideritis εν γένει, συνιστά αξιοσημείωτη πηγή φυσικών ενζυμικών αναστολέων. Πίνακας 9. Αντιχολινεστερασική δραστικότητα σε mg ισοδύναμου της galanthamine / g εκχυλίσματος, έναντι των AChE και BuChE, εκχυλισμάτων του είδους Sideritis perfoliata [Sarikurkcu et al., 2020]. Εκχύλισμα αναστολή AChE αναστολή BuChE Οξικού αιθυλεστέρα 0,23 ± 0,03 0,53 ± 0,01 Μεθανόλης 0,26 ± 0,03 0,35 ± 0,03 Υδατικό 0,14 ± 0,03 0,09 ± 0 01 Τέλος, στο πλαίσιο διδακτορικής διατριβής [Δημάκη, 2019], στην οποία μελετήθηκε το ίδιο είδος με την παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική εργασία, Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, αξιολογήθηκε η ικανότητα αναστολής της AChE (από ηλεκτροφόρο χέλι) από έγχυμα (υδατικό διάλυμα), καθώς και τρία απομονωμένα διτερπενοειδή από σχετικά άπολο κλάσμα του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα. Το έγχυμα εμφάνισε μια μέτρια αναστολή του ενζύμου AChE της τάξης του 39%, η οποία ισοδυναμεί με 0,115 mg galanthamine ανά g εγχύματος. Τα διτερπενοειδή που απομονώθηκαν ήταν η siderol και δύο νέα ent-καουρένια. Από αυτά, υψηλότερη αναστολή (45%) επέδειξε η siderol, ενώ συνολικά οι αναστολές και των τριών ενώσεων χαρακτηρίστηκαν μέτριες έως χαμηλές. 48

67 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΚΟΠΟΣ Ο Sideritis (τσάι του βουνού) είναι ένα γένος της οικογένειας Lamiaceae (Χειλανθή) που αριθμεί πάνω από 150 είδη και εντοπίζεται κυρίως γύρω από τη Μεσόγειο. Το έγχυμά του χρησιμοποιείται θεραπευτικά από την αρχαιότητα και πλήθος μελετών έχει αποδώσει στο φυτό ποικίλες επωφελείς βιολογικές δράσεις: αντιμικροβιακή (in vitro), σπασμολυτική (in vitro), αντιοξειδωτική (in vitro), κυτταροτοξική (in vitro), γαστροπροστατευτική και αντιφλεγμονώδη (in vivo). Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονο επιστημονικό ενδιαφέρον και ενδείξεις για την ικανότητα του φυτού να προστατεύει από την νευροεκφύλιση και διερευνάται η ενδεχόμενη δυνατότητά του να προσφέρει νέα θεραπευτικά μέσα για την αντιμετώπιση νόσων όπως Alzheimer s και Parkinson s. Οι μελέτες σχετικά με τη νευροπροστατευτική ικανότητα του Sideritis έχουν εστιάσει σε τρεις κύριους άξονες: i) προστασία από το οξειδωτικό στρες, ii) μείωση της συσσώρευσης αμυλοειδών και iii) προστασία της νευροδιαβίβασης. Όσον αφορά τον άξονα i, έχουν προκύψει αξιοσημείωτα θετικά αποτελέσματα, in vivo, για υδατικά εκχυλίσματα από τα είδη S. caesarea και S. clandestina ssp. peloponnesiaca. Αναφορικά με τον άξoνα ii, σημαντικά θετική δράση έχει δειχτεί in vivo, για εκχυλίσματα αιθανόλης/νερού από τα είδη S. scardica και S. euboea. Ως προς τον άξονα iii, με στόχευση στην επαναπρόσληψη μονοαμινών, αξιοσημείωτη δράση έχει δειχτεί από υδροαλκοολικά εκχυλίσματα του είδους S. scardica, ενώ με στόχευση στη ρύθμιση της AMPA-εξαρτώμενης νευροδιαβίβασης, το εκχύλισμα αιθανόλης/νερού του S. scardica εμφάνισε σημαντικά θετική επίδραση. Οι δραστικές ενώσεις που χρησιμοποιούνται στην ιατρική πράξη για την αντιμετώπιση του Alzheimer s, στοχεύουν στη νευροδιαβίβαση, με αναστολή του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE). Σχετικά με αυτή, έχει δειχτεί σημαντική ικανότητα αναστολής από ποικίλα είδη του γένους Sideritis. Ενώσεις που έχουν ξεχωρίσει είναι οι sideroxol και 7-epicandicandiol, ενώ από συγκριτικές μελέτες εκχυλισμάτων διαφορετικής πολικότητας, φαίνεται να υπάρχει μεγαλύτερη ικανότητα αναστολής από τα περισσότερο άπολα. Λαμβάνοντας υπόψιν τα παραπάνω βιβλιογραφικά δεδομένα και ιδιαίτερα την ένδειξη ότι τα λιγότερο πολικά κλάσματα διαφορετικών ειδών του γένους Sideritis, φαίνεται να ξεχωρίζουν ως προς την αντιχολινεστερασική τους δράση, διαμορφώθηκε ο σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας: Η συμβολή στη φυτοχημική ανάλυση και 49

68 ΕΙΣΑΓΩΓΗ η εκτίμηση της ικανότητας αναστολής της AChE ενός άπολου κλάσματος του εκχυλίσματος οξικού αιθυλεστέρα των εναέριων τμημάτων του ενδημικού είδους της Πελοποννήσου, Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca, μέσω απομόνωσης ή χαρακτηρισμού όσων ενώσεων ήταν δυνατόν. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, το λιγότερο πολικό κλάσμα (ΑΒ) του εκχυλίσματος EtOAc, των υπέργειων τμημάτων του φυτού, υποβλήθηκε σε κλασμάτωση με στήλη υγρής χρωματογραφίας, παρακολουθούμενη από εκτενή μελέτη με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC). Από τα κλάσματα που προέκυψαν, μελετήθηκε το πιο πολικό ΑΒ Η μεγάλη πολυπλοκότητα της χημικής του σύστασης, σε συνδυασμό με την ιδιαίτερα περιορισμένη διαθέσιμη ποσότητά του, δεν κατέστησε δυνατή την απομόνωση καθαρής ένωσης. Επομένως, υποβλήθηκε και αυτό σε υγρή χρωματογραφία στήλης, ώστε να μπορέσει να γίνει εφικτός ο χαρακτηρισμός των ενώσεών του. Μετά την εκτενή μελέτη με TLC, προέκυψαν τα τελικά κλάσματα F3-F9 και αναπτύχθηκε για αυτά μέθοδος UHPLC-DAD-ESI/MS ανάλυσης. Από αυτή, προέκυψαν ποιοτικά-δομικά δεδομένα σχετικά με τις πιθανές ενώσεις που περιείχαν. Tέλος, τα κλάσματα ελέγχθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναστέλλουν την AChE in vitro, με μια παραλλαγή της μεθόδου Ellman. Χρησιμοποιήθηκε ακετυλοχολινεστεράση από ηλεκτροφόρο χέλι, η οποία μοιάζει με την ανθρώπινη και συνιστά βασικό μοντέλο εργασίας για σχετικές μελέτες. 50

69 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

70 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΑ ΔΙΑΛΥΤΕΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Πίνακας 10. Διαλύτες και αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν. Όνομα Σύντμηση Εναλλακτικό όνομα Εταιρία Καθαρότητα Αιθανόλη EtOH Sigma Aldrich HPLC grade Ακετόνη Me 2CO Sigma Aldrich & Panreac HPLC grade Ακετονιτρίλιο AcCN Fischer Scientific HPLC grade Ακετυλοχολινεστεράση από ηλεκτροφόρο χέλι Αλβουμίνη ορού βοός eeache Sigma Aldrich Type V-S 1000 units/mg protein BSA PAN TM Biotech GmbH > 99% Γαλανθαμίνη Galanthamine hydrobromide Alfa Aesar 98% 5,5 -Διθειο-δις-(2- νιτροβενζοϊκό οξύ) DTNB Sigma Aldrich 99% Διμεθυλσουλφοξείδιο DMSO Sigma Aldrich 99,9 % Διμεθυλφορμαμίδιο DMF Sigma Aldrich 99% Διχλωρομεθάνιο DCM Sigma Aldrich & Panreac HPLC grade Εξάνιο Hex, Hexane Sigma Aldrich & Panreac HPLC grade Θειικό Δημήτριο (IV) Ce(SO 4) 2 ChemLab NV 98% Θειικό οξύ H 2SO 4 Penta 96% Ιωδίδιο ακετυλοθειοχολίνης ATCI Fluka > 99% Ιώδιο Ι 2 Merck 99,8% Μεθανόλη MeOH, Methanol Fischer Scientific HPLC grade Νερό Η 2Ο Fischer Scientific HPLC grade 52

71 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όνομα Σύντμηση Εναλλακτικό όνομα Εταιρία Καθαρότητα Οξικός αιθυλεστέρας EtOAc Carlo Erba HPLC grade Οξικό οξύ ΑcOH Fischer Scientific HPLC grade π-ανισαλδεΰδη PAA Sigma Aldrich 98% Πετρελαϊκός αιθέρας Petroleum ether, P.ether Fischer Scientific HPLC grade Τολουόλιο Toluene, PhMe Sigma Aldrich 99,7% Υδροχλωρικό τρις(υδροξυμεθυλ)αμινομεθάνιο Tris-HCl Sigma Aldrich > 99% Φορμικό οξύ HCOOH Merck HPLC grade Φωσφομολυβδαινικό οξύ H 3PMo 12O 40 PanReac 98% Χλωριούχο Αντιμόνιο (ΙΙΙ) SbCl 3 Alfa Aesar 99% Χλωριούχο Αργίλιο AlCl 3 Acros Organics 99% Χλωροφόρμιο CHCl 3 Fischer Scientific Analytical grade ΟΡΓΑΝΑ Αναδευτήρας Vortex (IKA Works, Inc.). Αναλυτικός Ζυγός υψηλής ακρίβειας 0,0001g (Kern & Sohn GmbH). Ηλεκτρονικός Ζυγός ακρίβειας 0,001g (Kern & Sohn GmbH) Λουτρό Υπερήχων (ISOLAB). Μαγνητικός Θερμαινόμενος Αναδευτήρας (IKA Works, Inc.). Περιστροφικός Εξατμιστήρας (Rotavapor, Büchi). Υγρή Χρωματογραφία Υπερυψηλής Απόδοσης συζευγμένη με Φασματόμετρο Μαζών UHPLC-MS (ESI) (Dionex Ultimate 3000 της εταιρίας ThermoScientific, με λογισμικό Chromeleon Xpress και φασματόμετρο MS Amazon SL, της εταιρίας Bruker, με λογισμικό Bruker Compass DataAnalysis 4.2), Κέντρο Ενόργανης Ανάλυσης, Πανεπιστήμιο Πατρών. Φασματοφωτόμετρο TECAN Sunrise TM. 53

72 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΦΥΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ Η δρόγη που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διπλωματική εργασία ήταν τα αποξηραμένα, τεμαχισμένα, υπέργεια τμήματα του είδους Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca. Η συλλογή έγινε στο όρος Χελμός της Βόρειας Πελοποννήσου, τον Ιούνιο του 2017, κατά την ανθοφορία του φυτού. Μια ποσότητα του φυτικού υλικού αξιοποιήθηκε από τον Ομότιμο Καθηγητή Γρηγόριο Ιατρού, του τμήματος Βιολογίας, του Πανεπιστημίου Πατρών, προκειμένου να αναγνωριστεί το taxon του και κατατέθηκε στο Βοτανικό Μουσείο του Πανεπιστημίου Πατρών. Στη συνέχεια, στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής της Δρ. Βιργινίας Δημάκη [Δημάκη, 2019], η δρόγη εκχυλίστηκε διαδοχικά με τρεις οργανικούς διαλύτες αυξανομένης πολικότητας: πετρελαϊκό αιθέρα, οξικό αιθυλεστέρα και μεθανόλη. Η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των εκχυλισμάτων ήταν η διαβροχή της δρόγης, σε θερμοκρασία δωματίου. Η διαβροχή με κάθε διαλύτη διήρκησε τρεις ημέρες, ενώ o κάθε διαλύτης ανανεώθηκε πέντε φορές, ώστε να προκύψει εξαντλητική εκχύλιση και παραλαβή του συνόλου των ενώσεων του φυτικού υλικού. Τα συστατικά του συμπυκνωμένου και ξηραμένου εκχυλίσματος του EtOAc (13,01 g) διαμοιράστηκαν μέσω κλασμάτωσης με υγρή χρωματογραφία στήλης σε νέα κλάσματα ΑΒ (0,71 g), ΓΔ (5,56 g), ΕΖΗ (2,14 g), ΘΙΚΛ (3,23 g) και ΜΝΞ (0,38 g). Αντικείμενο της παρούσας μελέτης αποτέλεσε το πιο άπολο κλάσμα του εκχυλίσματος EtOAc, το ΑΒ. ΜΕΘΟΔΟΙ Παρακάτω, περιγράφονται οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν για τις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν κατά την πορεία των πειραμάτων της παρούσας εργασίας. Περιγράφονται επίσης κάποιες βασικές αρχές που διέπουν την κύρια αναλυτική τεχνική (UHPLC-MS), η οποία αξιοποιήθηκε για την εξαγωγή αποτελεσμάτων. 54

73 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΛΕΠΤΗΣ ΣΤΟΙΒΑΔΑΣ - THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) Χρησιμοποιήθηκαν αναλυτικές πλάκες TLC κανονικής φάσης, της εταιρίας Sigma- Aldrich, επιστρωμένες σε αλουμίνιο, με άμορφο διοξείδιο του πυριτίου, silica gel (SiO2), μεγέθους πόρων 60 Å, που έφερε δείκτη φθορισμού F1054, με διαστάσεις 20x20 cm και πάχος επίστρωσης 250 mm. Τα τμήματα της πλάκας που χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμές πριν τις στήλες CC, στα κλάσματα AB και AB15-17, καθώς και για την απεικόνιση της κλασμάτωσης μετά τις στήλες, είχαν συνολικό ύψος 8,3 cm. Από αυτά, 0,8 cm ήταν το ύψος της γραμμής βάσης και 7,0 cm το καθαρό μήκος ανάπτυξης των κηλίδων. Όσον αφορά τους τρόπους ανίχνευσης των ενώσεων, μετά την ανάπτυξη της πλάκας, χρησιμοποιήθηκε η φυσική ανίχνευση, είτε στο ορατό, είτε κάτω από λυχνία υπεριώδους φωτός στα 254 και 365 nm και κυρίως η χημική ανίχνευση με τα εξής αντιδραστήρια εμφάνισης: 1. Ατμοί Ιωδίου, Ι2. Γενικό. Ετοιμάστηκε με προσθήκη 5 σφαιριδίων I2 σε υάλινο κλειστό δοχείο και παραμονή 30 min, έως ότου δημιουργηθεί κορεσμός των ατμών Ι2. Για την εμφάνιση κηλίδων στο ορατό, κυρίως κίτρινου και πράσινου χρώματος, η πλάκα TLC εισήχθη στο δοχείο και παρέμεινε για 5 min. 2. π-ανισαλδεΰδη, διάλυμα (PAA). Ειδικό για αλλυλικές αλκοόλες, φαινόλες, αμίνες, αλδεύδες, κετόνες, υδρογονάνθρακες και εστέρες. Δεν εμφανίζει αρωματικές ενώσεις. Παρασκευάστηκε με ανάμιξη, σε μαγνητικό αναδευτήρα, 3,7 ml π- ανισαλδεΰδης σε 135 ml EtOH και οξίνιση του διαλύματος με 5 ml πυκνό Η2SO4 και 1,5 ml AcOH. Για την εμφάνιση έγχρωμων κηλίδων στο ορατό, εφαρμόστηκε εμβάπτιση της πλάκας TLC, εξάτμιση της περίσσειας του διαλύματος PAA με θερμό ρεύμα αέρα και έπειτα τοποθέτηση σε θερμαντική πλάκα, για 3 min, στους 70 ⁰C. 3. Χλωριούχο Αντιμόνιο (SbCl3), υπέρκορο διάλυμα. Ειδικό για τερπένια, στεροειδή, σαπωνίνες, βιταμίνες Α & D και καροτενοειδή. Παρασκευάστηκε με διάλυση, σε μαγνητικό αναδευτήρα, 25 g SbCl3 σε 75 ml CHCl3. Για την εμφάνιση έγχρωμων κηλίδων, στο ορατό και ακόμα πιο πλούσιων και έντονων χρωματισμών κάτω από λυχνία 365 nm, εφαρμόστηκε εμβάπτιση της πλάκας TLC και τοποθέτηση σε θερμαντική πλάκα, για 6 min στους 100 ⁰C. 4. Χλωριούχο Αργίλιο (AlCl3), διάλυμα. Ειδικό για φλαβονοειδή. Παρασκευάστηκε με διάλυση, σε μαγνητικό αναδευτήρα, 1 g AlCl3 σε 100 ml EtOH. Για την 55

74 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ εμφάνιση των χαρακτηριστικών κίτρινων κηλίδων, κάτω από λυχνία 365 nm, απαιτείται εμβάπτιση της πλάκας TLC και τοποθέτηση σε θερμαντική πλάκα, για 5 min, στους 100 ⁰C. 5. Seebach, διάλυμα. Γενικό. Παρασκευάστηκε με διάλυση, σε μαγνητικό αναδευτήρα, 2,5 g φωσφομολυβδαινικού οξέος και 1,0 g Ce(SO4)2 σε 94 ml H2Ο και οξίνιση με 6 ml πυκνό Η2SO4. Για την εμφάνιση μπλε κηλίδων στο ορατό, εφαρμόστηκε εμβάπτιση της πλάκας TLC και τοποθέτηση σε θερμαντική πλάκα, για 5 min στους 70 ⁰C. Η τοποθέτηση του δείγματος με τη μορφή κηλίδας, στη γραμμή βάσης της πλάκας TLC, έγινε με χρήση τριχοειδούς υάλινου σωλήνα. Ως θάλαμοι ανάπτυξης χρησιμοποιήθηκαν ποτήρια ζέσεως 250 ml, καλυμμένα με φύλλα αλουμινίου και το ύψος του συστήματος διαλυτών ανάπτυξης ήταν 3 mm. ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ COLUMN CHROMATOGRAPHY (CC) 56 ΚΛΑΣΜΑ ΑΒ Το κλάσμα ΑΒ υποβλήθηκε σε στήλη υγρής χρωματογραφίας κανονικής φάσης με στόχο την κλασμάτωσή του. 710 mg του κλάσματος, αφού ξηράθηκαν πλήρως, φορτώθηκαν στη στήλη με τη μέθοδο της ξηρής φόρτωσης, στη μορφή ομογενοποιημένης σκόνης ξηρού φυτικού υλικού και silica. Ως υλικό πλήρωσης της στήλης, χρησιμοποιήθηκε silica gel (SiO2), με μέγεθος πόρων 60 Å και μέγεθος σωματιδίων μm της εταιρίας Merck. Το εναιώρημα της silica gel δημιουργήθηκε με διαλύτη πετρελαϊκό αιθέρα και τα συστήματα διαλυτών έκλουσης ήταν τα εξής: Πετρελαϊκός αιθέρας : Τολουόλιο (100:0), (98:2), (70:30), Πετρελαϊκός αιθέρας : Τολουόλιο : Ακετόνη (70:30:1) και τέλος Ακετόνη 100% για πλήρη έκλουση των ενώσεων. Η συλλογή των κλασμάτων έγινε σε υάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml. Μετά από μελέτη με TLC και συστήματα ανίχνευσης ατμούς Ι2 και Seebach, έγινε η τελική συνένωση στα εξής κλάσματα: ΑΒ1 (105,1 mg), ΑΒ2-6 (15,3 mg), AB7 (20,0 mg), AB8-10 (271,7 mg), AB11-12 (70,0 mg), AB13-14 (139,9 mg), AB15-17 (48,6 mg), ΑΒ18 (3,8 mg). Ήταν όλα διαλυτά σε DCM και τα συστήματα ανάπτυξης TLC, στα οποία καταδεικνυόταν επαρκώς η εικόνα των κηλίδων τους, ήταν τα: Πετρελαϊκός αιθέρας : Τολουόλιο (100:0), (9:1), (8:2), (1:1), (0:100) και Τολουόλιο : Ακετόνη (3:1). Η

75 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ανίχνευση των κηλίδων τους έγινε με βάση το χρώμα τους στο ορατό φως και τη χρήση του αντιδραστηρίου Seebach. Συμπυκνώθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα και αποθηκεύτηκαν σε κατάψυξη, υπό ατμόσφαιρα αζώτου. ΚΛΑΣΜΑ ΑΒ15-17 Το κλάσμα ΑΒ15-17 υποβλήθηκε επίσης σε στήλη υγρής χρωματογραφίας κανονικής φάσης με στόχο την κλασμάτωσή του. 43,5 mg του κλάσματος διαλύθηκαν σε μείγμα Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (1:1), με τη βοήθεια του λουτρού υπερήχων και φορτώθηκαν στη στήλη με τη μέθοδο της υγρής φόρτωσης. Το υλικό πλήρωσης της στήλης ήταν όμοιο με της στήλης στο ΑΒ. Το εναιώρημα της silica gel δημιουργήθηκε με διαλύτη εξάνιο και τα συστήματα διαλυτών έκλουσης ήταν τα εξής: Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (100:0), (1:1), (0:100), Διχλωρομεθάνιο : Οξικός αιθυλεστέρας (9:1), (8:2), (1:1), (0:100) και τέλος Ακετόνη 100% για πλήρη έκλουση των ενώσεων. Η συλλογή των κλασμάτων έγινε σε υάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες των 5 ml. Μετά από μελέτη με TLC και συστήματα ανίχνευσης PAA και Seebach, έγινε συνένωση στα εξής τελικά κλάσματα: F1 (2,9 mg), F2 (3,3 mg), F3 (3,9 mg), F4 (3,6 mg), F5 (4,7 mg), F6 (4,5 mg), F7 (0,7 mg), F8 (3,0 mg), F9 (3,8 mg), F10 (2,0 mg), F11 (3,1 mg). Ήταν όλα διαλυτά σε DCM και το σύστημα ανάπτυξης TLC, στο οποίο καταδεικνυόταν επαρκώς η εικόνα των κηλίδων τους, ήταν το: Εξάνιο : Οξικός Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2), ενώ το βέλτιστο σύστημα για την απεικόνιση ων κηλίδων του ολικού κλάσματος AB15-17 ήταν το Εξάνιο : Οξικός Αιθυλεστέρας : Ακετόνη (5:3:2). Η ανίχνευση των κηλίδων τους έγινε με χρήση των αντιδραστηρίων PAA και Seebach. Συμπυκνώθηκαν σε περιστροφικό εξατμιστήρα και αποθηκεύτηκαν σε κατάψυξη, υπό ατμόσφαιρα αζώτου. 57

76 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΓΡΗ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΥΠΕΡΥΨΗΛΗΣ ΑΠΟΔΟΣΗΣ, ΣΥΖΕΥΓΜΕΝΗ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΩΝ (UHPLC-MS) Η τεχνική UHPLC-MS είναι μια συζευγμένη τεχνική που αποτελεί το συνδυασμό της Υγρής Χρωματογραφίας Υπερυψηλής Απόδοσης και της Φασματομετρίας Μαζών. Όσον αφορά το κομμάτι της Υγρής Χρωματογραφίας, βασίζεται στις ίδιες αρχές με την τεχνική HPLC, με τη βασική διαφορά ότι οι χρωματογραφικές στήλες απαρτίζονται από σημαντικά μικρότερα σωματίδια (συνήθως 2 μm, ενώ στην HPLC συνήθως 3-5 μm) και συνεπώς απαιτούνται πολύ υψηλότερες πιέσεις, που φτάνουν μέχρι τα 1500 bar (ενώ στην HPLC bar). Συνιστά, επομένως, μια βελτίωση της HPLC στους παρακάτω αναλυτικούς παράγοντες: Υπάρχει η ικανότητα επίτευξης ίδιου αριθμού θεωρητικών πλακών σε πολύ μικρότερους χρόνους [Guillarme, Veuthey, 2017]. Δίνεται η δυνατότητα, με αύξηση του ήδη κατά πολύ ελαττωμένου χρόνου, για καλύτερους διαχωρισμούς σε πολύ σύνθετα μείγματα όπως μεταβολομικές αναλύσεις, πρωτεωμικές αναλύσεις και αναλύσεις φυτικών εκχυλισμάτων [Guillarme, Veuthey, 2017]. Απαιτούνται σημαντικά μικρότερες ροές κινητών φάσεων και επομένως προκύπτει οικονομία στη χρήση διαλυτών και συνεπώς λιγότερη περιβαλλοντική επιβάρυνση [Cielecka-Piontek J. et al., 2013]. Απαιτείται σημαντικά μικρότερη ποσότητα δείγματος [Cielecka-Piontek J. et al., 2013]. Στην Εικόνα 16, που ακολουθεί, παρουσιάζεται ένα παράδειγμα μεταφοράς μιας αναλυτικής μεθόδου από HPLC σε UHPLC, για την ανίχνευση ενός ετεροκυκλικού φαρμάκου σε εκχυλίσματα οργανικών διαλυτών. Σε αυτό τον πίνακα, φαίνονται ενδεικτικά οι διαφορές στις χρωματογραφικές παραμέτρους μεταξύ των δύο τεχνικών, ώστε να επιτευχθεί αντίστοιχη ανάλυση με βασικό χαρακτηριστικό τη μείωση του χρόνου από 10 min σε 1,5 min [Cielecka-Piontek et al., 2013]. 58

77 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 16. Σύγκριση παραμέτρων αναλυτικής μεθόδου μεταξύ HPLC και UHPLC για την ανίχνευση ενός ετεροκυκλικού φαρμάκου σε εκχυλίσματα οργανικών διαλυτών [Cielecka- Piontek et al., 2013]. Όσον αφορά το κομμάτι της Φασματομετρίας Μαζών, υπάρχει η δυνατότητα σύζευξης του οργάνου UHPLC με ένα όργανο MS, με ποικίλες δυνατότητες ως προς τον τρόπο ιονισμού. Έτσι, δίνεται η δυνατότητα διαχωρισμού του δείγματος, μέσω προσρόφησης στη στήλη του UHPLC, και ταυτόχρονα, απόκτηση σημάτων m/z (MS χρωματογραφήματος), κατά την έξοδο των ήδη διαχωρισμένων κορυφών από το UHPLC και την είσοδό τους στην πηγή ιονισμού του φασματόμετρου μαζών. Υπάρχει, ακόμα, η δυνατότητα για MS/MS αναλύσεις. Η σύζευξη της UHPLC με την MS προεκτείνει τη συνολική ευαισθησία της ανάλυσης σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις, οι οποίες θα ήταν αδύνατον να ανιχνευτούν μέσω των UV ανιχνευτών αλλά δίνει και δομικές πληροφορίες για κάθε εκλουόμενη ένωση. Η συνηθέστερη τεχνική ιονισμού, η οποία χρησιμοποιήθηκε και στην παρούσα εργασία, είναι η ESI (Electrospray Ionization). Σε αυτή την τεχνική, αφού εισαχθούν στην πηγή ιονισμού, ο διαλύτης και το δείγμα εκνεφώνονται, τα σταγονίδια που σχηματίζονται ξηραίνονται και απελευθερώνονται από αυτά ιόντα, κάτω από την επίδραση ενός ηλεκτροστατικού πεδίου υψηλού δυναμικού. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ενώσεις τόσο μεγάλου όσο και μικρού μοριακού βάρους, χωρίς προαπαίτηση να είναι πτητικές. Ενώσεις που φέρουν ετεροάτομα όπως N, S και O, συνήθως αναλύονται επιτυχημένα. Ως τεχνική, η ESI είναι γενικά πιο ευαίσθητη σε ενώσεις που ιονίζονται σε διάλυμα και 59

78 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ μπορεί να δημιουργήσει πολλαπλά φορτισμένα ιόντα. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό ότι το σήμα των ιόντων είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση του αναλύτη και ανεξάρτητο της ροής της κινητής φάσης ή του όγκου της ένεσης του δείγματος. Η θραυσμάτωση των πρωτονιωμένων ή αποπρωτονιωμένων μοριακών ιόντων είναι κατά κανόνα περιορισμένη και τα φάσματα μαζών που προκύπτουν είναι σχετικά απλά [Ho et al., 2003], [Powel, 2013], [BDAL Training Document, Bruker Daltonics]. Πιο αναλυτικά, στην παρακάτω Εικόνα 17, φαίνεται σχηματικά ο σχηματισμός των σταγονιδίων, η εκνέφωση και η ξήρανση του δείγματος, εντός του θαλάμου ψεκασμού του οργάνου. Εικόνα 17. Σχηματική απεικόνιση του σχηματισμού σταγονιδίων, της εκνέφωσης και της ξήρανσης του δείγματος, εντός του θαλάμου ψεκασμού ενός οργάνου Φασματομετρίας Μαζών, κατά τον ESI ιονισμό [BDAL Training Document, Bruker Daltonics]. Καθώς ο διαλύτης εξατμίζεται από το σταγονίδιο, αυτό φορτίζεται έντονα. Τη στιγμή που η δύναμη της άπωσης Coulomb υπερβαίνει την επιφανειακή τάση, το σταγονίδιο εκρήγνυται και παράγει φορτισμένα θυγατρικά σταγονίδια, τα οποία υπόκεινται στη συνέχεια σε περαιτέρω εξάτμιση (Εικόνα 18 ). 60

79 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 18. Σχηματική απεικόνιση της δημιουργίας ολοένα και μικρότερων σταγονιδίων μετά από εκτεταμένη ξήρανση των αρχικών σταγονιδίων δείγματος, εντός του θαλάμου ψεκασμού ενός οργάνου Φασματομετρίας Μαζών, κατά τον ESI ιονισμό [BDAL Training Document, Bruker Daltonics]. Στη συνέχεια, όταν πια η ισχύς του ηλεκτρικού πεδίου στην επιφάνεια των σταγονιδίων υπερβεί την επιφανειακή τάση, ιόντα εκπέμπονται κατευθείαν στην αέρια φάση (Εικόνα 19). Στη λειτουργία θετικού ιονισμού, προκύπτουν συνήθως πρωτονιωμένα είδη, καθώς επίσης και ιόντα προσθήκης με Na, K κ.ά. Στη λειτουργία αρνητικού ιονισμού, κυριαρχεί η αποπρωτονίωση. Εικόνα 19. Σχηματική απεικόνιση της δημιουργίας πολλαπλά φορτισμένων ιόντων, κατευθείαν στη αέρια φάση, με τη βοήθεια του ηλεκτρικού πεδίου, εντός του θαλάμου ψεκασμού ενός οργάνου Φασματομετρίας Μαζών, κατά τον ESI ιονισμό [BDAL Training Document, Bruker Daltonics]. Τα ιόντα που έχουν δημιουργηθεί ταξιδεύουν, έπειτα, μέσα από τον αναλυτή μαζών (στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε αναλυτής παγίδας ιόντων-ion trap και συγκεκριμένα ο amazon SL της εταιρείας Bruker ) και φτάνουν σε διαφορετικά σημεία του ανιχνευτή, ανάλογα το λόγο μάζα/φορτίο (m/z) τους. Αφού έρθουν σε επαφή με τον 61

80 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ανιχνευτή, δημιουργούνται αξιοποιήσιμα σήματα που καταγράφονται από ένα σύστημα υπολογιστή. Ο υπολογιστής απεικονίζει γραφικά τα σήματα με τη μορφή φάσματος μαζών, το οποίο δείχνει τη σχετική αφθονία των σημάτων ανάλογα με το λόγο m/z τους [Ho et al., 2003]. Όσον αφορά τον πιθανό ιονισμό ανάλογα με το είδος μορίων του δείγματος, αναλύτες με βασικό χαρακτήρα συνήθως ιονίζονται στη λειτουργία θετικού ιονισμού, καθώς το μόριο του δείγματος προσλαμβάνει ένα πρωτόνιο από την πιο όξινη κινητή φάση. Από την άλλη μεριά, πιο όξινοι αναλύτες είναι πιθανότερο να ιονιστούν στη λειτουργία αρνητικού ιονισμού, όπου το μόριο χάνει ένα πρωτόνιο, το οποίο προσλαμβάνεται από μια βάση στην κινητή φάση και επομένως φορτίζεται αρνητικά. Πολικά ουδέτερα χημικά είδη, τα οποία δεν πρωτονιώνοται ή αποπρωτονιώνονται εύκολα, μπορούν να ιονιστούν μέσω του σχηματισμού ιόντων προσθήκης, εάν η πολικότητά τους είναι επαρκής. Τα πιο σημαντικά ιόντα προσθήκης, για το θετικό ιονισμό είναι τα Na +, K + και NH4 +, ενώ για τον αρνητικό τα ΗCOO -, CH3COO - και Cl -. Τέλος, υπάρχει η δυνατότητα εμφάνισης συμπλόκων μεταξύ των ιόντων και των μορίων των διαλυτών της κινητής φάσης, με χαρακτηριστικά παραδείγματα τα [M+Na+CH3CN] + και [M+H+MeOH] +. Όσον αφορά τους καταλληλότερους διαλύτες και ρυθμιστικά διαλύματα για τον ESI ιονισμό, το συγκεκριμένο είδος ιονισμού απαιτεί πολικούς διαλύτες, ως κινητές φάσεις. Συνηθέστερα, χρησιμοποιούνται το νερό, η μεθανόλη, το ακετονιτρίλιο και η ισοπροπανόλη. Ιδιαίτερη σημασία έχει και το ph, σε περιπτώσεις αναλυτών που βρίσκονται σε ιοντισμένη μορφή στο διάλυμά τους. Το όξινο ph (< 7 έως 5) προτιμάται για το θετικό ιονισμό, ενώ βασικό (> 7 έως 9) προτιμάται για τον αρνητικό. Η επίδραση στο ph της κινητής φάσης μπορεί να ενισχύσει την αναλυτική ικανότητα σε μόρια προς ανάλυση, τα οποία είναι αδύναμες βάσεις ή οξέα, με την προϋπόθεση ότι το χημικό μέσο που προστίθεται για αυτό το σκοπό είναι πτητικό. Στο θετικό ιονισμό χρησιμοποιούνται κυρίως: φορμικό οξύ (0,1-1,0 %), οξικό οξύ (0,1-1,0 %) και τριφθοροοξικό οξύ (TFA) ( 0,05%). Το TFA δεν αποτελεί την ιδανικότερη επιλογή, παρόλο που είναι ιδιαίτερα πτητικό, καθώς το ανιόν του δεσμεύει τα κατιόντα των μορίων προς ανάλυση και συνεπώς οδηγεί σε μείωση του σήματος. Στον αρνητικό ιονισμό χρησιμοποιείται συνήθως υδροξείδιο του αμμωνίου με ph Το ph της κινητής φάσης θα πρέπει ιδανικά να απέχει 1 με 2 μονάδες από την pka των μορίων προς ανάλυση [Powel, 2013], [BDAL Training Document, Bruker Daltonics]. 62

81 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στην παρούσα διπλωματική εργασία, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική UHPLC-MS και τα όργανα: DIONEX, UltiMate 3000 της εταιρίας ThermoSCIENTIFIC (UHPLC), συζευγμένο με το amazon SL της εταιρίας Bruker (MS). Για το UHPLC, χρησιμοποιήθηκαν στήλες ανάστροφης φάσης RSLC C-18 (2,2 μm, 120 Å, 2,1 mm x 150 mm, Acclaim TM Dionex) και RSLC C-8 (2,2 μm, 120 Å, 2,1 mm x 150 mm, Acclaim TM Dionex). Η τελική μέθοδος (U5) που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των κλασμάτων F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9 και F10, είχε τις εξής παραμέτρους: Η συγκέντρωση των δειγμάτων ήταν 0,1 mg/ml σε AcCN, ο όγκος της ένεσης του δείγματος ήταν 10 μl, η ροή της κινητής φάσης ήταν 0,5 ml/min, η θερμοκρασία της στήλης 35 C, τα μήκη κύματος UV ανίχνευσης ήταν 195 / 215 / 250 / 270 nm. Η βαθμίδωση των διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο, που ακολουθήθηκε, παρουσιάζεται στον Πίνακα 11. Για κάθε MS χρωματογράφημα, λαμβανόταν τόσο το φάσμα μαζών, όσο και το φάσμα UV-Vis (μέσω του DAD ανιχνευτή), κάθε κορυφής. Πίνακας 11. Πρόγραμμα βαθμίδωσης κινητής φάσης της τελικής μεθόδου UHPLC-MS (U5). Χρόνος (min) % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) (A) % H 2O:MeOH (20:80) (0,1% v/v φορμικό οξύ) (B)

82 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Όσον αφορά το MS, χρησιμοποιήθηκαν οι εξής παράμετροι, τόσο για τη λειτουργία θετικού όσο και αρνητικού ιονισμού: Για την πηγή ιονισμού: Capillary (4500V), End Plate Offset (500V), Nebulizer (7,3 psi), Dry Gas (4,0 L/min), Dry Temp. (180 C). Για την ένεση στον MS αναλυτή: Syringe (Hamilton 500 μl), Flow Rate 4,00 μl/min. Για την παγίδα ιόντων: UltraScan, ICC (on), Target (100000), Max. Accu Time (50,00 ms), Scan (70 to 2200 m/z). Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με το λογισμικό Bruker Compass DataAnalysis 4.2. Για κάθε κλάσμα, έγινε εμφάνιση του χρωματογραφήματος μαζών του, στη μορφή BPC (Base Peak Chromatogram) και έπειτα ολοκλήρωση των κορυφών, ώστε να προκύψει το σχετικό επί τοις εκατό εμβαδό τους (Relative Area %). Για κάθε ολοκληρωμένη MS κορυφή, έγινε, έπειτα, εμφάνιση του φάσματος μαζών της, από όπου προέκυψε η σχετική επί τοις εκατό ένταση (Relative Intensity %) των m/z σημάτων της. ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΗ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΜΑΖΩΝ ΠΙΘΑΝΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ Μία χρήσιμη προσέγγιση, η οποία μπορεί να βοηθήσει στη διαδικασία ταυτοποίησης ενώσεων, με βάση το φάσμα μαζών τους, είναι η υπολογιστική πρόβλεψη των πιθανότερων m/z σημάτων που θα εμφάνιζε μία πιθανή ένωση, θεωρητικά, και η σύγκρισή τους με τα πραγματικά σήματα που αποδίδει η MS ανάλυση. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα CFM-ID 3.0 Competitive Fragmentation Modeling for Metabolite Identification [Djoumbou-Feunang Y, 2019], ειδικά σχεδιασμένο ώστε να εξάγει, για κάθε χημική ένωση που εισάγεται, τα πιθανότερα θραύσματα που θα εμφάνιζε στην ESI-MS/MS ανάλυση, σε τρεις περιπτώσεις ενέργειας σύγκρουσης (10, 20, 40 ev). Δεδομένου ότι η τεχνική που χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των ενώσεων των κλασμάτων του AB15-17, ήταν η ESI-MS, που οδηγεί σε πολύ ήπια θραυσμάτωση, αξιοποιήθηκαν τα προβλεπόμενα φάσματα του προγράμματος που προέκυπταν από τη χαμηλή θεωρητική ενέργεια σύγκρουσης και άρα ήπια θραυσμάτωση, 10 ev. 64

83 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΧΡΩΜΑΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ ELLMAN Η μέθοδος Ellman [Ellman et al., 1961] είναι μία φωτομετρική μέθοδος, η οποία δίνει τη δυνατότητα αξιολόγησης της ενεργότητας του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση (AChE) σε εκχυλίσματα, εναιωρήματα κυττάρων κλπ. Η ενζυμική ενεργότητα μετριέται με βάση την αύξηση του κίτρινου χρώματος, το οποίο παράγεται από τη θειοχολίνη όταν αυτή αντιδρά με το 5,5 -διθειο-δις-(2-νιτροβενζοϊκό οξύ). Βασίζεται στη σύζευξη των αντιδράσεων που παρουσιάζονται στην Εικόνα 20. Εικόνα 20. Σχηματική απεικόνιση των αντιδράσεων της χρωματομετρικής μεθόδου Ellman. Πιο συγκεκριμένα, η ακετυλοθειοχολίνη (υπόστρωμα) υδρολύεται από το ένζυμο AChE, παράγοντας θειοχολίνη και οξικό οξύ (αντίδραση 1). Στη συνέχεια, λαμβάνει χώρα η ταχεία αντίδραση 2, όπου η θειοχολίνη αντιδρά αμέσως με το άχρωμο αντιδραστήριο DTNB (Ellman s reagent) προς σχηματισμό του κίτρινου προϊόντος TNB. Η απορρόφηση της χρώσης του TNB μετριέται με φωτόμετρο και βάση αυτής εκτιμάται η ενεργότητα του ενζύμου. Μείωση της απορρόφησης σημαίνει αναστολή της ενεργότητας του ενζύμου. 65

84 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗΣ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΑΚΕΤΥΛΟΧΟΛΙΝΕΣΤΕΡΑΣΗ ΑΠΟ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΟ ΧΕΛΙ (eeache), in vitro Οι in vitro δοκιμές, στις οποίες υποβλήθηκαν τα κλάσματα F3, F4, F5, F6, F7, F8 και F9, προκειμένου να εκτιμηθεί η ικανότητά τους για αναστολή της ενεργότητας του ενζύμου eeache, βασίστηκαν στη μέθοδο Ellman, που περιγράφηκε παραπάνω. Ειδικότερα, εφαρμόστηκε παραλλαγή της μεθόδου της πειραματικής διαδικασίας που χρησιμοποιήθηκε στη διδακτορική διατριβή της Δρ. Βιργινίας Δημάκη [Δημάκη, 2019]. Συγκεκριμένα, στην παρούσα εργασία, οι δοκιμές έγιναν σε πλάκες 96 κελίων, ο συνολικός όγκος αντίδρασης σε κάθε κελίο ήταν 200 μl και οι συγκεντρώσεις των δειγμάτων ήταν 25 / 50 / 75 / 100 μg/ml. Τα βήματα της διαδικασίας ήταν τα εξής: 1. Προσθήκη 35 μl Tris-HCl (50 mm, ph=8), 36 μl MeOH, 4 μl δείγματος (διαλυμένο σε DMF), 25 μl ATCI (12,5 mm), 75 μl DTNB (2,5 mm) για τα κλάσματα F3-F9 και 50 μl Tris-HCl (50 mm, ph=8), 25 μl πρότυπης ουσίας (galanthamine, διαλυμένη σε Η2Ο), 25 μl ATCI (12,5 mm), 75 μl DTNB (2,5 mm) για την πρότυπη ουσία. 2. Μέτρηση απορρόφησης στο φωτόμετρο, στα 405 nm, έπειτα από 5 min επώασης σε σκοτεινό περιβάλλον και θερμοκρασία δωματίου. Οι απορροφήσεις που προκύπτουν σε αυτό το σημείο, πριν την προσθήκη του ενζύμου, αφαιρούνται από τις τελικές που προκύπτουν μετά την προσθήκη του ενζύμου. 3. Προσθήκη 25 μl ενζύμου eeache, σε συγκέντρωση 0,22 U/mL, διαλυμένο σε 100 mm Tris-HCl, ph=7,5, που περιείχε 0,1 % BSA. 4. Επώαση σε υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 C, σε σκοτεινό περιβάλλον και μέτρηση απορρόφησης στα χρονικά διαστήματα: 5, 10, 15, 20, 25, 30 min, στα 405 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται στη μορφή ποσοστιαίας επί τοις εκατό αναστολής της ενζυμικής ενεργότητας. Το ποσοστό αναστολής προκύπτει έπειτα από σύγκριση του ρυθμού υδρόλυσης του υποστρώματος ATCI από το ένζυμο eeache παρουσία των δειγμάτων, με το ρυθμό υδρόλυσης απουσία των δειγμάτων σε τυφλές δοκιμές 66

85 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ (αντικατάσταση του δείγματος με το διαλύτη DMF). Συγκεκριμένα, υπολογίζεται από τον τύπο: % Αναστολή= (Β-Α)/B x 100, όπου Α=Ατελ-Ααρχ και Β=Βτελ-Βαρχ Ατελ= η απορρόφηση του δείγματος (πρότυπο ή εκχύλισμα ή ουσία) μετά την προσθήκη του ενζύμου Ααρχ= η απορρόφηση του δείγματος (πρότυπο ή εκχύλισμα ή ουσία) πριν την προσθήκη του ενζύμου Βτελ= η απορρόφηση του τυφλού δείγματος μετά την προσθήκη του ενζύμου Βαρχ= η απορρόφηση του τυφλού δείγματος πριν την προσθήκη του ενζύμου Σε κάθε πείραμα, ως μάρτυρας και μέτρο σύγκρισης της ικανότητας αναστολής της AChE των δειγμάτων, χρησιμοποιήθηκε η galanthamine συγκέντρωσης 200 μm. 67

86 68

87 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ

88 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΡΟΓΕΝΕΣΤΕΡΗ ΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΙΔΟΥΣ Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca Στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής της Δρ. Βιργινίας Δημάκη [Δημάκη, 2019], πραγματοποιήθηκε αρχικά η εκχύλιση των εναέριων τμημάτων του φυτού, με τρεις διαδοχικούς οργανικούς διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας (πετρελαϊκός αιθέρας, EtOAc και MeOH) και προέκυψαν έτσι τρία εκχυλίσματα. Στη συνέχεια, το εκχύλισμα του EtOAc κλασματώθηκε μέσω υγρής χρωματογραφίας στήλης κανονικής φάσης και προέκυψαν τα νέα κλάσματα ΑΒ, ΓΔ, ΕΖΗ, ΘΙΚΛ, ΜΝΞ (Εικόνα 21). Ως διαλύτες έκλουσης, αυξανόμενης πολικότητας, χρησιμοποιήθηκαν: εξάνιο, EtOAc, ακετόνη, MeOH και MeOH:H2O (70:30). Στο πλαίσιο της ενδελεχούς μελέτης του εκχυλίσματος EtOAc του είδους S. clandestina ssp. peloponnesiaca, το κλάσμα ΑΒ αποτέλεσε το αντικείμενο μελέτης της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας. Το κλάσμα ΑΒ εκλούστηκε με εξάνιο, σε ποσότητα 0,71g, αποτελώντας το 5,9 % της ποσότητας των κλασμάτων που προέκυψαν από το εκχύλισμα EtOAc. Εικόνα 21. Σχηματική απεικόνιση της κλασμάτωσης του εκχυλίσματος του οξικού αιθυλεστέρα του Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca. ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΒ Το ΑΒ αποτελούσε το λιγότερο πολικό κλάσμα του εκχυλίσματος EtOAc, όπως φαίνεται στην Εικόνα 22, όπου συγκρίνεται με τα επόμενα δύο κλάσματα του εκχυλίσματος, και έτσι θα αναμενόταν να συνίσταται από αρκετά άπολες ενώσεις, με καλή συγγένεια-έκλουση με τους λιγότερο πολικούς οργανικούς διαλύτες. Στόχος ήταν η κλασμάτωσή του με υγρή χρωματογραφία στήλης, σε όσο το δυνατό πιο απλά 70

89 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ κλάσματα ως προς τον αριθμό των ενώσεών τους, ώστε να προκύψουν ευκρινή χρωματογραφήματα-φάσματα UHPLC-MS και να δοθεί η δυνατότητα χαρακτηρισμού ή απομόνωσης όσων ενώσεων ήταν δυνατό. Την παρούσα εργασία απασχολούσαν κυρίως τερπένια και φλαβονοειδή και όχι φυτικές χρωστικές ή έντονα χρωμοφόρες ενώσεις όπως καροτένια. i) ii) Εικόνα 22. Συγκριτικά TLC των κλασμάτων ΑΒ (αριστερή θέση), Γ (μεσαία θέση) και Δ (δεξιά θέση). Εμφανίστηκαν με ατμούς Ι 2 και αναπτύχθηκαν σε i) εξάνιο και ii) εξάνιο : EtOAc : ακετόνη (8:2:2). ΠΕΡΑΙΤΕΡΩ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ ΑΒ ΔΟΚΙΜΕΣ ΠΡΙΝ ΤΗ ΣΤΗΛΗ ΣΤΟ ΑΒ Αρχικά, έγιναν δοκιμές διαφόρων συστημάτων έκλουσης σε TLC, ώστε να επιλεγεί το καταλληλότερο για χρήση σε στήλη υγρής χρωματογραφίας κανονικής φάσης, με εναιώρημα άμορφου διοξειδίου του πυριτίου (silica gel.) Στόχος των δοκιμών ήταν να βρεθεί ο κατάλληλος συνδυασμός διαλυτών και επιπλέον, οι καταλληλότερες αναλογίες αυτών, έτσι ώστε να προκύψει ικανοποιητικός διαχωρισμός των κηλίδων-ενώσεων στα κλάσματα που θα προέκυπταν, αλλά και πλήρη έκλουση όλων των ενώσεων από τη στήλη. Για την εμφάνιση των πλακών TLC χρησιμοποιήθηκαν τα γενικά αντιδραστήρια εμφάνισης: Ι2 και Seebach. Δοκιμάστηκαν οι εξής διαλύτες: εξάνιο, πετρελαϊκός αιθέρας, τολουόλιο, μείγματα διαφορετικών αναλογιών πετρελαϊκού αιθέρα /τολουολίου και ένα τριπλό σύστημα διαλυτών εξάνιο : EtOAc : ακετόνη (9:0,5:0,5). Το συμπέρασμα που προέκυψε ήταν ότι το εξάνιο, είτε μόνο του, είτε σε σύστημα με άλλο διαλύτη, ήταν ιδιαίτερα ισχυρό και οδηγούσε σε μεγάλη αλληλεπικάλυψη των κηλίδων χωρίς καθόλου 71

90 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ δημιουργία ευδιάκριτων κηλίδων. Αντίθετα, ιδανικά φάνηκαν να είναι τα συστήματα με πετρελαϊκό αιθέρα : τολουόλιο, ως κύριοι διαλύτες έκλουσης και η προσθήκη ακετόνης σε αυτούς, για παραλαβή και των πιο πολικών ενώσεων στο τέλος. Παρακάτω, στην Εικόνα 23, ακολουθούν ενδεικτικά TLC από τις παραπάνω δοκιμές Εικόνα 23. TLC του κλάσματος ΑΒ στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 1) Εξάνιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Ι 2 2) Εξάνιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 3) Πετρελαϊκός αιθέρας 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Ι 2 4) Πετρελαϊκός αιθέρας 100% 6 αναπτύξεις Εμφάνιση με Ι 2 5) Τολουόλιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Ι 2 6) Τολουόλιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 7) Π.αιθέρας : Τολουόλιο (99,5:0,5) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Ι 2 8) Π.αιθέρας : Τολουόλιο (99,5:0,5) 5 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 9) Π.αιθέρας : Τολουόλιο (98:2) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Ι 2 10) Π.αιθέρας : Τολουόλιο (9:1) 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Ι 2 11) Εξάνιο : Οξικός Αιθυλεστέρας : Ακετόνη (9,0:0,5:0,5) 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΣΤΗΛΗΣ ΣΤΟ ΑΒ Τα 710 mg του ΑΒ υποβλήθηκαν σε υγρή χρωματογραφία στήλης με τους εξής διαλύτες έκλουσης: πετρελαϊκός αιθέρας : τολουόλιο (100:0), (98:2), (70:30), πετρελαϊκός αιθέρας: τολουόλιο : ακετόνη (70:30:1) και τέλος ακετόνη 100% για πλήρη έκλουση των ενώσεων. Από τη στήλη προέκυψαν 18 κλάσματα, τα οποία ελέγχθηκαν με TLC και αντιδραστήρια εμφάνισης Seebach, Ι2, και συγχωνεύτηκαν, σε ορισμένες περιπτώσεις, βάσει της χρωματογραφικής ομοιότητάς τους. Τα κλάσματα που προέκυψαν τελικά ήταν τα ΑΒ1, ΑΒ2-6, ΑΒ7, ΑΒ8-10, ΑΒ11-12, ΑΒ13-14, ΑΒ15-17 και ΑΒ18 (Πίνακας 12). 72

91 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 12. Κλάσματα που προέκυψαν από τη στήλη υγρής χρωματογραφίας στο κλάσμα ΑΒ του εκχυλίσματος EtOAc. Κλάσμα Ποσότητα (mg) ΑΒ1 105,1 ΑΒ2-6 15,3 ΑΒ7 20,0 ΑΒ ,7 ΑΒ ,0 ΑΒ ,9 ΑΒ ,6 ΑΒ18 3,8 Πιο αναλυτικά, παρακάτω παρουσιάζεται η εικόνα των 18 κλασμάτων μετά τη στήλη (Εικόνα 24α), (Εικόνα 24β), (Εικόνα 24γ) Εικόνα 24α. TLC των κλασμάτων ΑΒ1-ΑΒ8 μετά τη στήλη στο ΑΒ. Αναπτύχθηκαν μία φορά στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 1) ΑΒ1-ΑΒ3 Πετρελαϊκός αιθέρας 100% Εμφάνιση στο ορατό 2) ΑΒ1-ΑΒ3 Πετρελαϊκός αιθέρας 100% Εμφάνιση με Seebach 3) ΑΒ2-ΑΒ6 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (9:1) Εμφάνιση στο ορατό 4) ΑΒ2-ΑΒ6 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (9:1) Εμφάνιση με Seebach 5) ΑΒ2-ΑΒ8 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (8:2) Εμφάνιση στο ορατό 6) ΑΒ2-ΑΒ8 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (8:2) Εμφάνιση με Seebach 73

92 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 24β. TLC των κλασμάτων ΑΒ9, ΑΒ11, ΑΒ13-ΑΒ16 μετά τη στήλη στο ΑΒ. Αναπτύχθηκαν μία φορά στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 7) AB9, AB11, AB13-AB16 Τολουόλιο Εμφάνιση στο ορατό 8) AB9, AB11, AB13-AB16 Τολουόλιο Εμφάνιση με Seebach 9) AB9-AB13 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (1:1) Εμφάνιση στο ορατό 10) AB9-AB13 Π.αιθέρας : Τολουόλιο (1:1) Εμφάνιση με Seebach Εικόνα 24γ. TLC των κλασμάτων ΑΒ14-18 μετά τη στήλη στο ΑΒ. Αναπτύχθηκαν μία φορά στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 11) ΑΒ14-16 Τολουόλιο : Ακετόνη (3:1) Εμφάνιση στο ορατό 12) ΑΒ14-16 Τολουόλιο : Ακετόνη (3:1) Εμφάνιση με Seebach 13) ΑΒ16-18 Τολουόλιο : Ακετόνη (3:1) Εμφάνιση στο ορατό 14) ΑΒ16-18 Τολουόλιο : Ακετόνη (3:1) Εμφάνιση με Seebach 74

93 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το κλάσμα 1 είχε ιδιαίτερα πολύπλοκη εικόνα και δεν κρίθηκε σκόπιμη η περαιτέρω μελέτη του. Τα κλάσματα 2-6 εμφάνισαν μια έντονα κίτρινη στο ορατό κηλίδα, αρκετά πιο άπολη από τις κηλίδες των επόμενων κλασμάτων. Ακολούθησαν δοκιμές, ώστε να βρεθεί η κατηγορία των πιθανών ενώσεων της κίτρινης κηλίδας. Επιλέχτηκε ενδεικτικά το κλάσμα ΑΒ3, λόγω της καθαρότερης εικόνας που είχε σε αυτό. Αρχικά υποβλήθηκε σε TLC και χρωματίστηκε με διάλυμα AlCl3 1% v/v σε ΕtOH, ειδικό για ανίχνευση φλαβονοειδών, ωστόσο δεν εμφανίστηκε, κάτω από UV ακτινοβολία 365 nm, το χαρακτηριστικό κίτρινο χρώμα των φλαβονοειδών. Έτσι, έπειτα, έγινε λήψη του UV-Vis φάσματος απορρόφησής του, από το οποίο προέκυψε η χαρακτηριστική για τα καροτενοειδή διπλή κορυφή, με μέγιστο στα 452nm. Συνεπώς, τα κλάσματα αυτά αποτελούνταν κυρίως από καροτενοειδή, γεγονός που δικαιολογούσε και το έντονο πορτοκαλί-κίτρινο χρώμα κατά την εξέλιξη της στήλης. Τα υπόλοιπα κλάσματα δεν εμφάνισαν ιδιαίτερα έντονο χρώμα στο ορατό, ωστόσο φάνηκε να είναι ιδιαίτερα πλούσια σε ενώσεις, έπειτα από χρώση των TLC με το αντιδραστήριο Seebach. Ακολούθησε συνένωση των παρεμφερών κλασμάτων (Πίνακας 12). Επιλέχθηκε για τη συνέχεια της μελέτης το κλάσμα AB15-17, καθώς αποτελούσε το περισσότερο πολικό κλάσμα (με μια επαρκή ποσότητα σε σχέση με το ΑΒ18) του ΑΒ και συνεπώς, θα αναμενόταν να έχει καλύτερη συμπεριφορά στην υγρή χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, παρεμφερή με το αμέσως επόμενο κλάσμα ΓΔ που είχε ήδη υποβληθεί σε αναλύσεις HPLC, στο πλαίσιο μελετών του εργαστηρίου. Μετά από σύγκριση, με TLC (Εικόνα 25), του ΑΒ15-17 με το επόμενο κλάσμα ΓΔ, διαπιστώθηκε ότι διέφεραν τόσο ώστε να έχει νόημα να δουλευτούν ξεχωριστά Εικόνα 25. Συγκριτικά TLC των κλασμάτων ΓΔ (αριστερή θέση) και ΑΒ15-17 (δεξιά θέση). Αναπτύχθηκαν μία φορά σε σύστημα εξάνιο : οξικός αιθυλεστέρας : διχλωρομεθάνιο (5:3:2). 1) στο ορατό, 2) σε λυχνία UV στα 365 nm, 3) σε Seebach, 4) σε PAA. 75

94 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το ΑΒ15-17 έφερε ιδιαίτερα πολλές ενώσεις, ενώ ταυτόχρονα βρισκόταν σε μικρή ποσότητα. Για να μπορέσει να γίνει χαρακτηρισμός των ενώσεών του θα έπρεπε να υποβληθεί σε περαιτέρω κλασμάτωση, με στήλη υγρής χρωματογραφίας κανονικής φάσης, ώστε να ληφθούν στη συνέχεια καθαρά χρωματογραφήματα UHPLC-MS. ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΤΟΥ ΑΒ15-17 ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ ΔΟΚΙΜΕΣ ΠΡΙΝ ΤΗ ΣΤΗΛΗ ΣΤΟ ΑΒ15-17 Στο πλαίσιο της προετοιμασίας για τη στήλη στο ΑΒ15-17, έγιναν δοκιμές αναφορικά με το ποιο θα ήταν το καλύτερο αντιδραστήριο εμφάνισης των πλακών TLC για την παρακολούθηση της πορείας της στήλης, αλλά και της εικόνας των κλασμάτων που θα προέκυπταν. Ακόμα, μελετήθηκαν διαφορετικά συστήματα διαλυτών έκλουσης, ώστε να βρεθούν τα κατάλληλα για έναν επιτυχημένο διαμοιρασμό των ενώσεων σε νέα κλάσματα. Αρχικά, δοκιμάστηκε το αντιδραστήριο Antimony (III) Chloride (SbCl3), το οποίο εμφανίζει βιταμίνες Α&D, καροτενοειδή, στεροειδή, σαπωνίνες, γλυκοζίτες στεροειδών και τερπένια. Το αποτέλεσμα δεν ήταν το επιθυμητό, καθώς, ενώ εμφανίστηκαν κηλίδες, υπήρχε έντονη διάχυση του χρωματισμού χωρίς σαφείς κηλίδες και διαφορετικά χρώματα σε αυτές. Στη συνέχεια, δοκιμάστηκε το αντιδραστήριο π-ανισαλδεΰδη (PAA), ειδικό για την εμφάνιση φαινολών, σακχάρων, στεροειδών και τερπενίων, το οποίο δούλεψε πολύ καλύτερα, καθώς εμφάνισε μεγαλύτερο αριθμό έγχρωμων κηλίδων, με αρκετά διαφορετικά χρώματα μεταξύ τους και ευδιάκριτο σχήμα. Συνοδευτικά, χρησιμοποιήθηκε και εδώ το αντιδραστήριο Seebach, καθώς εμφάνιζε μεγάλο αριθμό κηλίδων, με πολύ ευδιάκριτο και έντονο τρόπο, και αρκετές επιπλέον από αυτές που εμφάνιζε η PAA, λόγω της υψηλής ευαισθησίας του. Όσον αφορά τους κατάλληλους διαλύτες έκλουσης για τη στήλη, δοκιμάστηκαν οι διαλύτες εξάνιο, τολουόλιο, EtOAc, DCM, καθώς και μείγματα διαλυτών διαφορετικών αναλογιών: εξάνιο /EtOAc/ακετόνη, εξάνιο/dcm, εξάνιο/etoac/dcm, DCM/EtOAc. Ενδεικτικά η εικόνα του ΑΒ15-17 στις παραπάνω δοκιμές φαίνεται παρακάτω (Εικόνα 26α), (Εικόνα 26β). 76

95 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 26α. TLC του κλάσματος ΑΒ15-17 στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 1) Εξάνιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 2) Εξάνιο 100% 3 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 3) Εξάνιο 100% 3 αναπτύξεις Εμφάνιση στο ορατό 4) Οξικός αιθυλεστέρας 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 5) Οξικός αιθυλεστέρας 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με PAA 6) Διχλωρομεθάνιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 7) Διχλωρομεθάνιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με PAA 8) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (99:1) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 9) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (99:1) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA 10) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (97:3) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 11) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (97:3) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA 12) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (90:10) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 13) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (90:10) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA Εικόνα 26β. TLC του κλάσματος ΑΒ15-17 στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 14) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (80:20) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 15) Διχλωρομεθάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας (80:20) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA 16) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Ακετόνη (5:3:2) 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με PAA 17) Τολουόλιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 18) Τολουόλιο 100% 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με PAA 19) Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (1:1) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 20) Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (1:1) 2 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA 21) Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (1:1) 3 αναπτύξεις Εμφάνιση με Seebach 22) Εξάνιο : Διχλωρομεθάνιο (1:1) 3 αναπτύξεις Εμφάνιση με PAA 23) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας :Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με Seebach 24) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας :Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) 1 ανάπτυξη Εμφάνιση με PAA 77

96 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Από τις παραπάνω δοκιμές προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: Το εξάνιο 100% ήταν πολύ αδύναμο ως προς την ικανότητα έκλουσης. Ο EtOAc 100% αντίθετα, πολύ ισχυρός, καθώς ανέβαζε όλες τις κηλίδες ψηλά, χωρίς να διαχωρίζονται μεταξύ τους. Το DCM 100% δούλεψε καλά, καθώς δημιουργούσε καλές και ευδιάκριτες κηλίδες, ανέβαζε τα σχετικά άπολα, προς μεσαίας πολικότητας συστατικά του κλάσματος με καλό διαχωρισμό, ενώ μετά από πολλαπλές αναπτύξεις του ίδιου TLC, οι κηλίδες αυτές διαχωρίζονταν ολοένα και καλύτερα, χωρίς να επικαλύπτονται. Ωστόσο, για το ανέβασμα των πολικότερων κηλίδων θα χρειαζόταν ενίσχυση, ενδεχομένως με EtOAc. Πράγματι, η προσθήκη EtOAc σε σύστημα με DCM απέφερε πιο ισχυρή τάση στο ανέβασμα των κηλίδων, με ήπιο τρόπο σε συστήματα DCM : EtOAc (99:1) και (97:3) και πιο έντονο στα συστήματα (90:10) και (80:20). To εξάνιο, από μόνο του, δημιουργούσε ογκώδεις κηλίδες, ενώ όταν αναμιγνυόταν με DCM φαίνονταν να μίκραιναν και να μορφοποιούνταν καλύτερα. Το σύστημα εξάνιο : EtOAc : ακετόνη (5:3:2) δε δούλεψε καλά, καθώς ήταν υπερβολικά ισχυρό, ώστε να προλάβουν οι ενώσεις να διαχωριστούν. Το τολουόλιο ήταν κι αυτό πολύ αδύναμο, οριακά πιο ισχυρό από το εξάνιο και λίγο πιο αδύναμο από το DCM. Δεν έδειξε να προσφέρει κάτι καλύτερο ως προς τον διαχωρισμό των ενώσεων και αποφασίστηκε να μη χρησιμοποιηθεί, κυρίως λόγω του ότι έχει από μόνο του ισχυρή UV απορρόφηση και επιπλέον απομακρύνεται δύσκολα, λόγω υψηλού σημείου ζέσεως. Το εξάνιο : DCM (1:1), ήταν αρκετά αδύναμο. Έμοιαζε με το DCM, αλλά ήταν λιγότερο ισχυρό, λόγω της επίδρασης του εξανίου. Τέλος, το εξάνιο : DCM : EtOAc (6:2:2) ήταν ένα πολύ καλό σύστημα για την απεικόνιση όλων σχεδόν των κηλίδων του κλάσματος, με καλοσχηματισμένη και σχετικά διακριτή μορφή. Συνεπώς, οι καλύτεροι διαλύτες όσον αφορά την πολικότητα-ισχύ έκλουσης, αλλά και τον ελεγχόμενο βαθμιδωτό διαχωρισμό ευδιάκριτων κηλίδων, ήταν οι: εξάνιο, DCM, EtOAc σε διάφορες αναλογίες. Πριν πραγματοποιηθεί η στήλη, έγιναν δύο δοκιμές με πολλαπλές αναπτύξεις TLC πλακών, με το ΑΒ15-17, στα βασικά συστήματα διαλυτών που θα χρησιμοποιούνταν στη στήλη (Εικόνα 27). Στόχος ήταν να διερευνηθεί πώς θα διαχωρίζονταν οι κηλίδες και τι εικόνα θα εμφάνιζαν, σε μια πιο ρεαλιστική προσέγγιση - προσομοίωση, όπου από το AB15-17, πάνω στη silica, θα περνούσαν μεγάλοι όγκοι διαλυτών σταδιακά αυξανομένης πολικότητας. 78

97 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ i ii i ii Εικόνα 27. TLC του κλάσματος ΑΒ15-17 με πολλαπλές αναπτύξεις στα εξής συστήματα ανάπτυξης: Αριστερά: 2x εξάνιο 100%, 2x διχλωρομεθάνιο 100%, 2x εξάνιο : διχλωρομεθάνιο (99:1) / (εμφάνιση με PAA -i- και Seebach -ii-). Δεξιά: 2x εξάνιο 100%, 2x διχλωρομεθάνιο 100%, 2x εξάνιο : διχλωρομεθάνιο (99:1), 2x εξάνιο : διχλωρομεθάνιο (97:3), 2x εξάνιο : διχλωρομεθάνιο (90:10), 2x εξάνιο : διχλωρομεθάνιο (80:20) / (εμφάνιση με Seebach -i- και PAA -ii-). Τα συμπεράσματα μετά τις προσομοιώσεις πάνω στην πλάκα TLC, ήταν πως οι κηλίδες έδειχναν να διαχωρίζονται αρκετά καλά, χωρίς να αλληλεπικαλύπτονται ή να αλλοιώνεται το σχήμα τους, σημαντικές ενδείξεις ότι η επικείμενη στήλη θα δούλευε καλά. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΣΤΗΛΗΣ ΣΤΟ ΑΒ ,5 mg του ΑΒ15-17 υποβλήθηκαν σε υγρή χρωματογραφία στήλης με τους εξής διαλύτες έκλουσης: εξάνιο 100%, εξάνιο : DCM (1:1), DCM 100%, DCM : EtOAc (9:1), (8:2), (1:1), EtOAc 100% και τέλος ακετόνη 100% για πλήρη έκλουση των ενώσεων. Από τη στήλη προέκυψαν 25 κλάσματα, τα οποία ελέγχθηκαν με TLC και αντιδραστήρια εμφάνισης Seebach, PAA και συγχωνεύτηκαν βάσει της χρωματογραφικής ομοιότητάς τους. Τα τελικά κλάσματα που προέκυψαν ήταν, κατά σειρά έκλουσης τα: F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10, F11. Τα τελικά κλάσματα παρουσιάζονται στον παρακάτω Πίνακα 13, μαζί με τα αρχικά κλάσματα, από τη συνένωση των οποίων προέκυψαν. Τα κλάσματα 6, 7, 8, 25, 26, δε χρησιμοποιήθηκαν στη μετέπειτα ανάλυση, λόγω πολύ μικρής ποσότητας και πολύπλοκης εικόνας στο TLC. 79

98 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 13. Κλάσματα που προέκυψαν από τη στήλη υγρής χρωματογραφίας στο κλάσμα ΑΒ Κλάσμα Ποσότητα Κλάσματα (mg) Προέλευσης F1 2,9 1, 2, 3 F2 3,3 4, 5-0,9 6-1,3 7, 8 F3 3,9 9, 10,11 F4 3,6 12, 13, 14 F5 4,7 15, 16 F6 4,5 17, 18 F7 0,7 19 F8 3,0 20, 21 F9 3,8 22, 23 F10 2,0 24-1,5 25, 26 F11 3,1 27, 28 Η αναλυτική εικόνα των αρχικών κλασμάτων, μετά τη στήλη και πριν την τελική συνένωση στα τελικά κλάσματα φαίνεται στις παρακάτω εικόνες TLC (Εικόνα 28α), (Εικόνα 28β) Εικόνα 28α. TLC του ολικού ΑΒ15-17 και των κλασμάτων 1, 3-8, 9, 11-14, μετά τη στήλη στο ΑΒ Αναπτύχθηκαν μία φορά στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 1) Ολικό ΑΒ15-17 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Ακετόνη (5:3:2) Εμφάνιση με PAA 2) Ολικό ΑΒ15-17 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 3) Ολικό ΑΒ15-17 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA 4) 1, 3-8 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 5) 1, 3-8 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA 6) 9, 11, 12, 14 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA 7) 9, 11, 12, 14 Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 8) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 9) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA 80

99 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 28β. TLC των κλασμάτων 12, 14-22, μετά τη στήλη στο ΑΒ Αναπτύχθηκαν μία φορά στα εξής συστήματα ανάπτυξης: 10) 12, Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 11) 12, Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA 12) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με Seebach 13) Εξάνιο : Οξ. Αιθυλεστέρας : Διχλωρομεθάνιο (6:2:2) Εμφάνιση με PAA Η κλασμάτωση του ΑΒ, μετά τις δύο στήλες, συνοψίζεται στο παρακάτω σχήμα (Εικόνα 29). Εικόνα 29. Σχηματική απεικόνιση της κλασμάτωσης του κλάσματος ΑΒ, από το εκχύλισμα EtO Ac του Sideritis clandestina ssp. peloponnesiaca. 81

100 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η κλασμάτωση κρίθηκε επιτυχημένη, καθώς διαμοιράστηκαν ικανοποιητικά τα ιδιαίτερα πολυάριθμα φυτοχημικά συστατικά του κλάσματος ΑΒ, όπως φαίνεται στις παραπάνω εικόνες των TLC. Το γεγονός αυτό έδωσε τη δυνατότητα στα κλάσματα του ΑΒ15-17 να υποβληθούν σε περαιτέρω ανάλυση με στόχο την ταυτοποίηση των ενώσεών τους. Λόγω της μικρής ποσότητάς τους, δεν κατέστη δυνατή η απομόνωση κάποιας ένωσης. Ακολούθησαν μελέτες για την ανάπτυξη κατάλληλης μεθόδου UHPLC-MS ανάλυσης των κλασμάτων F1 - F9. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΟΥ UHPLC-MS ΓΙΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΟΥ ΑΒ15-17 Σε όλες τις δοκιμές UHPLC-DAD-ESI/MS που ακολούθησαν, έγινε ανίχνευση των κορυφών του LC χρωματογραφήματος με σάρωση σε μήκη κύματος από nm και ανίχνευση των σημάτων m/z στο MS χρωματογράφημα, τόσο από θετικό, όσο και από αρνητικό ιονισμό. Τα δείγματα ήταν διαλυμένα σε 100% AcCN. ΔΟΚΙΜΕΣ Uo ΚΑΙ Uo Αρχικά, υποβλήθηκαν σε UHPLC-DAD-ESI/MS ανάλυση τα κλάσματα F1, F2 και F10, ενδεικτικά, ώστε να ληφθούν κάποια πρώτα δεδομένα για την εικόνα των κλασμάτων. Οι παράμετροι της μεθόδου Uo, στην οποία δοκιμάστηκαν τα F1 και F2 (σε στήλη C-18 / 2,2 μm / 120 Å / 2,1x150 cm) ήταν οι εξής: Συγκέντρωση δείγματος: 0,8 mg/ml Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: Χρόνος (min) % AcCN % H 2O Θερμοκρασία: 20 C 82

101 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι παράμετροι της μεθόδου Uo, στην οποία δοκιμάστηκε το F10, ήταν οι εξής: Συγκέντρωση δείγματος: 0,8 mg/ml Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: Χρόνος (min) % AcCN % H 2O Θερμοκρασία: 20 C Οι παρατηρήσεις από τις δοκιμές Uo και Uo ήταν ότι οι περισσότερες ενώσεις εκλούονταν σε 100% AcCN, ενώ μεγάλος αριθμός ενώσεων παρέμεναν προσκολλημένες στη στήλη, μετά το τέλος της ένεσης, όπως κατέδειξαν τυφλές ενέσεις που ακολούθησαν. Ακόμα, παρατηρήθηκε μικρή απορρόφηση στο υπεριώδες-ορατό (UV-Vis), πολλές κορυφές στο +MS και πολύ λιγότερες στο -MS. Συνεπώς, τα παραπάνω κλάσματα, και πιθανότατα και τα υπόλοιπα, αφορούσαν ιδιαίτερα άπολες ενώσεις, με χαμηλή απορρόφηση, αλλά αρκετά έντονο θετικό ιονισμό. ΔΟΚΙΜΗ U1 Με στόχο τη μείωση της κατακράτησης στη στήλη και την έκλουση όλων των ενώσεων, στην επόμενη δοκιμή U1, αντικαταστάθηκε η C-18 στήλη με μία αντίστοιχη C-8 (2,2 μm / 120 Å / 2,1x150 cm). Στη δοκιμή αυτή, έτρεξαν ενδεικτικά τα κλάσματα F3, F6 και F9. Οι παράμετροι της μεθόδου U1, στην οποία δοκιμάστηκαν τα F3, F6 και F9, ήταν οι εξής: 83

102 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Συγκέντρωση δείγματος: 0,8 mg/ml Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: Χρόνος (min) % AcCN % H 2O Θερμοκρασία: 20 C Τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν παρουσιάζονται παρακάτω (Εικόνα 30), (Εικόνα 31). Εικόνα 30. Συγκριτικά LC χρωματογραφήματα των κλασμάτων F3 (πάνω), F6 (μέση), F9 (κάτω), στα 195 nm, με τη μέθοδο U1. Εικόνα 31. Συγκριτικά MS χρωματογραφήματα των κλασμάτων F3 (πάνω), F6 (μέση), F9 (κάτω), με τη μέθοδο U1. Για κάθε κλάσμα, απεικονίζεται το +MS και -MS (μαύρο-f3, πράσινο- F6, κόκκινο-f9 για το -MS) χρωματογράφημα. 84

103 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η δοκιμή U1, έδειξε ότι οι ενώσεις των παραπάνω κλασμάτων απορροφούσαν με μικρή ένταση σε πολύ μικρά μήκη κύματος, γύρω στα 200 nm. Ο αρνητικός ιονισμός ήταν πολύ περιορισμένος, σε σχέση με το θετικό, που έδινε πληθώρα κορυφών με μεγάλη ένταση, και οι περισσότερες ενώσεις εκλούονταν και εδώ σε υψηλές περιεκτικότητες AcCN. Η C-8 στήλη φάνηκε ότι θα μπορούσε να διαχωρίσει επαρκώς τις κορυφές των κλασμάτων, με μια κατάλληλη μέθοδο, και επιλέχθηκε ως καταλληλότερη για τη συνέχεια. Ωστόσο και πάλι έμεινε μεγάλη ποσότητα δείγματος προσροφημένο και σε αυτή τη στήλη. ΔΟΚΙΜΗ U2 Μετά τη δοκιμή U1, αποφασίστηκε να δοθεί έμφαση σε ένα καλό διαχωρισμό των κορυφών. Έτσι, με στόχο την ενίσχυση των +MS κορυφών ως προς την ένταση αλλά και την ευκρίνειά τους, δοκιμάστηκε στη δοκιμή U2 η προσθήκη 0,1% φορμικού οξέος τόσο στο AcCN, όσο και στο H2O, μαζί με διόρθωση της βαθμίδωσης των διαλυτών της κινητής φάσης. Η δοκιμή θα έδειχνε επίσης αν η αύξηση της αρχικής περιεκτικότητας του AcCN, αλλά και η παρουσία οξέος στην κινητή φάση, θα επέτρεπε στις ενώσεις να εκλουστούν πλήρως κατά τη διάρκεια της ένεσης. Για λόγους ευκολίας, χρησιμοποιήθηκε στις επόμενες δοκιμές το κλάσμα F3, ως ενδεικτικό, καθώς εμφάνιζε κορυφές με σημαντικό εμβαδό, τόσο σε μικρούς, όσο και σε μεγάλους χρόνους κατακράτησης. Οι παράμετροι της μεθόδου U2, στην οποία δοκιμάστηκε το F3, ήταν οι εξής: Συγκέντρωση δείγματος: 0,8 mg/ml Χρόνος (min) Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) % H 2O (0,1% v/v φορμικό οξύ) Θερμοκρασία: 20 C 85

104 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν παρουσιάζονται παρακάτω (Εικόνα 32). Εικόνα 32. Επικαλυμμένα χρωματογραφήματα LC (215 nm, μπλε) και +MS (κόκκινο) του κλάσματος F3, με τη μέθοδο U2. Η προσθήκη του φορμικού οξέος και η εκκίνηση της βαθμίδωσης των διαλυτών έκλουσης από το 55% AcCN βελτιστοποίησαν σημαντικά το διαχωρισμό των κορυφών και την ευκρίνεια των +MS κορυφών. Ωστόσο, τυφλές ενέσεις που ακολούθησαν κατέδειξαν ότι το πρόβλημα της σημαντικής κατακράτησης ενώσεων, πάνω στη στήλη και μετά το τέλος της ένεσης, παρέμενε. ΔΟΚΙΜΗ U3 Στη συνέχεια, στη δοκιμή U3, δοκιμάστηκε μείωση της συγκέντρωσης του δείγματος με στόχο την ελάττωση της κατακράτησής του στη στήλη και την αύξηση της ευκρίνειας των +MS κορυφών. Η μείωση της συγκέντρωσης θα κατεύναζε σημαντικά την ήδη μικρή ένταση των κορυφών του LC. Με βάση το γεγονός ότι η συντριπτική πλειοψηφία των κορυφών του LC χρωματογραφήματος εμφάνιζαν κορυφή και στο +MS, στο οποίο μάλιστα εμφανίζονταν και αρκετές ακόμα κορυφές που δεν είχαν δώσει κάποια UV απορρόφηση, αποφασίστηκε ότι το χρωματογράφημα μαζών θετικού ιονισμού θα αποτελούσε τη βάση για το χαρακτηρισμό των ενώσεων των κλασμάτων. Παράλληλα, επιχειρήθηκε και μια διόρθωση στην αρχική περιεκτικότητα του AcCN, με ελάττωσή της στο 45% για μείωση της συνέκλουσης στα πρώτα λεπτά. 86

105 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι παράμετροι της μεθόδου U3, στην οποία δοκιμάστηκε το F3, ήταν οι εξής: Συγκέντρωση δείγματος: 0,5 mg/ml Χρόνος (min) Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) % H 2O (0,1% v/v φορμικό οξύ) Θερμοκρασία: 20 C Τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν παρουσιάζονται παρακάτω (Εικόνα 33). Εικόνα 33. Επικαλυμμένα χρωματογραφήματα LC (210nm, μπλε) και +MS (κόκκινο) του κλάσματος F3, με τη μέθοδο U3. Η καθαρότητα των κορυφών αυξήθηκε, ωστόσο και πάλι έμενε ποσότητα δείγματος προσροφημένη στη στήλη. ΔΟΚΙΜΗ U4 Στην επόμενη δοκιμή U4, ελαττώθηκε περαιτέρω η συγκέντρωση του δείγματος και επιχειρήθηκε διόρθωση της βαθμίδωσης των διαλυτών έκλουσης, ώστε να διαχωριστούν καλύτερα οι κορυφές. 87

106 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι παράμετροι της μεθόδου U4, στην οποία δοκιμάστηκε το F3, ήταν οι εξής: Συγκέντρωση δείγματος: 0,25 mg/ml Χρόνος (min) Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,1 ml/min Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) % H 2O (0,1% v/v φορμικό οξύ) Θερμοκρασία: 20 C Τα χρωματογραφήματα που προέκυψαν παρουσιάζονται παρακάτω (Εικόνα 34). Εικόνα 34. Επικαλυμμένα χρωματογραφήματα LC (200 nm, μπλε) και +MS (κόκκινο) του κλάσματος F3, με τη μέθοδο U4. Προέκυψε ένα καλό +MS χρωματογράφημα, με καλά διαχωρισμένες κορυφές, με αρκετό χρόνο ώστε να διαχωριστούν κορυφές που ενδεχομένως να υπάρχουν στα υπόλοιπα κλάσματα, στα πρώτα ή τα τελευταία λεπτά. Ωστόσο, η μέθοδος U4 είχε τα προβλήματα ότι ήταν πολύ μεγάλη σε διάρκεια για τα δεδομένα της UHPLC-MS ανάλυσης και ότι δεν κατάφερνε να καθαρίσει η στήλη μετά το τέλος της ένεσης. Απαιτούνταν μία τυφλή ένεση ακόμα, ώστε να καθαρίσει η στήλη επαρκώς. Σημειώνεται ότι απόπειρες να αυξηθεί η ροή της κινητής φάσης, ώστε να επιταχυνθεί η έκλουση των 88

107 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ κορυφών ή/και να βελτιωθεί ο διαχωρισμός τους οδηγούσαν σε απαγορευτική πίεση για τη δεδομένη στήλη. ΔΟΚΙΜΗ U5 ΤΕΛΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Με στόχο να αποφευχθούν τα παραπάνω προβλήματα, σχεδιάστηκε η δοκιμή U5, ως μια παραλλαγή της μεθόδου των Zhou et al., 2009, η οποία στόχευε στην ανάλυση των βασικών διτερπενοειδών από εκχυλίσματα με μεθανόλη, διαφόρων ειδών του γένους Salvia. Η μέθοδος των Zhou et al. είχε τις παρακάτω παραμέτρους: Στήλη C-8 Όγκος ένεσης: 2 μl Ροή: 0,5 ml/min Θερμοκρασία: 35 C Χρόνος (min) Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) (A) % H 2O:MeOH (80:20) (0,1% v/v φορμικό οξύ) (B) Η βασική τροποποίηση της παραπάνω μεθόδου, ήταν η αντιστροφή του κύριου συστατικού του διαλύτη έκλουσης B, από H2O:MeOH (80:20) σε H2O:MeOH (20:80). Η επιλογή αυτή βασίστηκε στον πολύ υδρόφοβο χαρακτήρα των ενώσεων της παρούσας μελέτης, όπως καταδείχτηκε από τις πιο πάνω δοκιμές και είχε ως στόχο την πλήρη έκλουσή τους. Ταυτόχρονα, θα έδινε τη δυνατότητα να αυξηθεί η ροή της κινητής φάσης κατά 5 φορές, σε 0,5 ml/min, χωρίς να δημιουργηθεί πρόβλημα υπερβολικής πίεσης στη στήλη. Ακόμα, η βαθμίδωση των διαλυτών θα έφτανε στο 100% A και αυξήθηκε σημαντικά ο χρόνος σε κάθε βήμα της βαθμίδωσης. 89

108 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Οι παράμετροι της δοκιμής U5 ήταν οι εξής: Στήλη C-8 C δείγματος: 0,1 mg/ml Όγκος ένεσης: 10 μl Ροή: 0,5 ml/min Θερμοκρασία: 35 C Χρόνος (min) Αναλογία διαλυτών έκλουσης ανά χρόνο: % AcCN (0,1% v/v φορμικό οξύ) (A) % H 2O:MeOH (20:80) (0,1% v/v φορμικό οξύ) (B) Το χρωματογράφημα μαζών θετικού ιονισμού που προέκυψε παρουσιάζεται παρακάτω (Εικόνα 35), συγκρινόμενο με το αντίστοιχο χρωματογράφημα τυφλής ένεσης στην ίδια μέθοδο. Εικόνα 35. Επικαλυμμένα χρωματογραφήματα +MS του F3 (κόκκινο) και τυφλής ένεσης (πράσινο) στη μέθοδο U5. 90

109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ H μέθοδος δούλεψε πολύ καλά. Εμφανίστηκαν οι κύριες +ΜS κορυφές του κλάσματος F3, οξείες και χωρίς αλληλεπικαλύψεις μεταξύ τους. Τα φάσματα μαζών που εμφάνιζαν ήταν καθαρά και αξιοποιήσιμα. Οι κορυφές του F3 εκλούστηκαν μέχρι το χρόνο 16,5 min. Μετά τα 25 λεπτά, το υπόλοιπο πρόγραμμα είχε ως στόχο τον καθαρισμό της στήλης. Η στήλη καθάριζε πλήρως μετά το πέρας των 34 λεπτών. Συνεπώς, η μέθοδος U5 έδινε πολύ καλό χρωματογράφημα, οδηγούσε σε καθαρή στήλη και σε πολύ μειωμένο συνολικό χρόνο, σε σχέση με όλες τις προηγούμενες δοκιμές. Στη συνέχεια, η μέθοδος U5 δοκιμάστηκε επιπλέον στα κλάσματα F6 και F9. Εμφάνισε εξίσου καλά αποτελέσματα και επιλέχθηκε ως κατάλληλη, ώστε να αναλυθούν με αυτή όλα τα υπόλοιπα κλάσματα, σε συγκέντρωση δείγματος 0,1 mg/ml. Παρακάτω, (Εικόνα 36), (Εικόνα 37) και (Εικόνα 38) παρουσιάζονται ενδεικτικά τα τελικά +MS χρωματογραφήματα των F3, F6 και F9, με τη μέθοδο U5. Εικόνα 36. Χρωματογράφημα μαζών θετικού ιονισμού από ανάλυση UHPLC-MS του κλάσματος F3 με τη μέθοδο U5. Εικόνα 37. Χρωματογράφημα μαζών θετικού ιονισμού από ανάλυση UHPLC-MS του κλάσματος F6 με τη μέθοδο U5. 91

110 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 38. Χρωματογράφημα μαζών θετικού ιονισμού από ανάλυση UHPLC-MS του κλάσματος F9 με τη μέθοδο U5. Όσον αφορά τα κλάσματα F1, F2 και F10, παρόλο που τα +MS χρωματογραφήματά τους εμφάνισαν ευδιάκριτες και καθαρές κορυφές, αυτές δεν συνοδεύτηκαν με αξιοποιήσιμα φάσματα μαζών. Τα φάσματα μαζών τους ήταν ιδιαίτερα σύνθετα, χωρίς παρουσία ευδιάκριτων ιόντων προσθήκης. Επομένως, τα τρία αυτά κλάσματα δεν μπόρεσαν να προχωρήσουν σε χαρακτηρισμό των ενώσεών τους. Μετά τη χρωματογραφική ανάλυση των κλασμάτων F3-F9, προέκυψαν 30 διαφορετικές, σημαντικές κορυφές οι οποίες αριθμούνται λατινικά από Ι έως ΧΧΧ. Παρακάτω (Εικόνα 39), παρουσιάζονται ενδεικτικά, αλληλεπικαλυπτόμενα, τα χρωματογραφήματα μαζών θετικού ιονισμού των κλασμάτων F3, F6, F9. Εικόνα 39. Χρωματογραφήματα μαζών θετικού ιονισμού από ανάλυση UHPLC-MS των κλασμάτων F3 (κάτω), F6 (μέση) και F9 (επάνω). 92

111 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σημειώνεται ότι η κορυφή στα 6,9 min στο F3, καθώς και οι κορυφές στα 5,7 min και 9,4 min του F6 αντιστοιχούν σε γνωστές προσμίξεις-επιμολύνσεις στην +ESI φασματομετρία μαζών (Πίνακας 14) και επομένως αποκλείστηκαν από περαιτέρω μελέτη. Πίνακας 14. Προσμίξεις- επιμολύνσεις που εκλούστηκαν στα κλάσματα F3 και F6. t R Πρόσμιξη-επιμόλυνση Ιόντα προσθήκης Βιβλιογραφία 5,7 min Stearamide (παράγοντας ολίσθησης σε μεμβράνες πολυαιθυλενίου) 284 [Μ+Η] [M+Na] + Keller et al., ,9 min diisooctylphthalate (πλαστικοποιητής) 413 [Μ+Νa] [2M+Na] + Keller et al., 2008 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΚΟΡΥΦΩΝ Ακολουθεί συγκεντρωτικός πίνακας (Πίνακας 15), όπου παρουσιάζονται οι 30 κορυφές (Ι-ΧΧΧ) που εκλούστηκαν στα κλάσματα του ΑΒ15-17 (F3-F9), με βάση το χρόνο κατακράτησης (tr). Δίνεται η μοριακή μάζα στην οποία αντιστοιχίστηκε κάθε κορυφή (M.W.) και το επί τοις εκατό σχετικό εμβαδό κάθε κορυφής για κάθε κλάσμα (Rel. Area %). Οι κύριες ή σημαντικές κορυφές, οι οποίες αναλύονται στη συνέχεια, σημειώνονται με έντονη γραμματοσειρά στη στήλη Α/Α. 93

112 Πίνακας 15. Το σύνολο των κορυφών των κλασμάτων F3-F9. A/A t R (min) F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 M.W. (g/mol) Rel. Area (%) t R (min) M.W. (g/mol) Rel. Area (%) t R (min) M.W. (g/mol) Rel. Area (%) Ι 1,1 232,2 16 t R (min) II 1,2 248,2 35 1,3 complex 7 1,3 complex 5 1,3 complex 8 1,3 complex III 1,5 378,2 32 IV 1,8 278,2 25 V 1,9 362,2 9 1,9 362, ,0 complex 8 94 M.W. (g/mol) VI 2,1 346,3 35 VII 2,2 286,3 8 2,2 complex 9 Rel. Area (%) t R (min) M.W. (g/mol) VIII 2,4 404,2 21 ΙΧ 2,8 313,3 28 X 2,9 304, ,9 304,2 92 XI 322,2 3,0 16 XII 286,2 XIII 3,1 306,2 10 XIV 3,3 346,2 51 3,3 346,2 100 XV 3,6 346,3 77 3,6 346,3 91 XVI 3,7 376,3 4 XVII 330,1 4,1 66 XVIII 374,2 XIX 4,5 388,2 12 4,5 388,3 12 XX 5,1 326,3 10 XXI 6,8 358,2 26 6,8 358,3 12 Rel. Area (%) t R (min) M.W. (g/mol) Rel. Area (%) t R (min) M.W. (g/mol) Rel. Area (%) 4,1 330,1 20 4,1 330,3 34 4,1 330,3 13 XXII 7,7 462,5 19 XXIII 7,9 324,2 7 XXIV 8,3 370, ,3 370,3 23 8,3 370,2 7 8,3 370,3 48 8,3 370,2 23 8,3 370,2 16 8,3 370,3 20 XXV 9,0 478,3 5 XXVI 9,4 478,3 16 XXVII 12,6 446,4 23 XXVIII 12,7 462,3 8 12,7 462,4 40 XXIX 15,1 446, ,1 446,2 100 XXX 16,5 434, ,5 434, ,5 434,4 27

113 95

114 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΠΙΘΑΝΕΣ ΕΝΩΣΕΙΣ ΑΝΑ ΚΛΑΣΜΑ ΚΑΙ ΣΕΙΡΑ ΕΚΛΟΥΣΗΣ Στη συνέχεια, παρουσιάζεται η ανάλυση των φασμάτων μαζών θετικού ιονισμού των κύριων κορυφών των κλασμάτων F3-F9, κατά σειρά έκλουσης. Σε όσες κορυφές ήταν δυνατόν, αποδόθηκε ένα σύνολο πιθανών ενώσεων - δομών από τη βιβλιογραφία του γένους Sideritis, με βάση το χρωματογραφικό τους προφίλ, τη μάζα τους και τα θραύσματα μαζών που εμφάνισαν σε ορισμένες περιπτώσεις. Οι τελικές ενώσεις που κρίθηκαν ως οι πιθανότερες για κάθε κορυφή παρουσιάζονται στον Πίνακα 16, που ακολουθεί. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΤΙΚΟΣ ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΙΘΑΝΟΤΕΡΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΚΟΡΥΦΗ 96

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 16. Τελικές ενώσεις της βιβλιογραφίας που επιλέχθηκαν ως πιθανότερες για τις κυριότερες κορυφές των κλασμάτων του ΑΒ15-17, κατά αύξοντα χρόνο κατακράτησης (t r). Δίνονται για κάθε ένωση ο αριθμός της κορυφής στην οποία βρέθηκε, ο Μοριακός Τύπος, η θεωρητική και πειραματικά ευρισκόμενη μοριακή μάζα (Θεωρητικό M.W.), (Πειραματικό M.W.), το σχετικό επί τοις εκατό εμβαδό κάθε κορυφής εντός κάθε κλάσματος (Relative Area %) σε σχέση με την κύρια ένωση αυτού η οποία θεωρήθηκε ότι έχει 100%, η σχετική ένταση θετικού ιονισμού των m/z από ιόντα προσθήκης που εμφανίστηκαν σε κάθε κορυφή (Rel. Int %) και το/τα κλάσματα στα οποία εμφανίστηκε η κορυφή της ένωσης. Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 1 1,1 I άγνωστη , ,3 [M+H] + (7) F8 255,2 [M+Na] + (100) 274,3 [M+AcCN+H] + (14) 487,3 [2M+Na] + (36) 2 1,2 II 7-demethyl siderin acetate C 13H 12O 5 248,1 248, ,2 [M+Na] + (100) F6 266,2 [M+NH 4] + (10) 287,1 [M+K] + (7) 519,2 [2M+Na] + (21) 3 1,5 III 3-acetyl-leucanthol or C 22H 34O 5 378,2 378, ,2 [M+Na] + (100) F4 18-acetyl-leucanthol or 779,3 [2M+Na] + (2) epoxy-isolinearol or epoxy-isosidol or funkiol or sidofunkiol or 7-acetyl-pusillatetrol or 14-acetyl-pusillatetrol 4 1,8 IV άγνωστη , ,2 [M+H] + (5) F3 301,2 [M+Na] + (100) 579,1 [2M+Na] + (6) 97

116 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 5 1,9 V 1-acetyl-jativatriol or C 22H 34O 4 362,2 362, ,3 [M+NH 4] + (10) F7 12-acetyl-jativatriol or 385,2 [M+Na] + (100) 3-acetyl-isopusillatriol or 401,3 [M+K] + (28) 14-acety l-isopusillatriol or 747,4 [2M+Na] + (13) 7-acetyl-pusillatriol or 763,4 [2M+K] + (8) 14-acetyl-pusillatriol or 362, ,3 [M+NH 4] + (9) F9 isolinearol or 385,3 [M+Na] + (100) isosidol 747,5 [2M+Na] + (31) 6 2,1 VI siderol or C 22H 34O 3 346,3 346, ,23 [M+Na] + (100) F6 sideripol or 364,29 [M+NH 4] + (36) tartessol or 385,22 [M+K] + (8) epoxyisocandol A acetate or 7-acetyl-epicandicandiol or 7-epicandicandiol 18-monoacetate or trachinodiol 7β-monoacetate or 7 2,4 VIII 7,17-diacetyl-sideritriol or C 24H 36O 5 404,3 404, ,3 [M+NH 4] + (5) F7 1,12-diacetyl-jatrivatriol or 427,2 [M+Na] + (100) 1,17-diacetyl-jatrivatriol or 831,4 [2M+Na] + (10) 3,14-diacetyl-isopusillatriol or 14,18-diacetyl-isopusillatriol 8 2,8 IX άγνωστη , ,3 [M+H] + (29) F6 336,3 [M+Na] + (100) 649,4 [2M+Na] + (14) 98

117 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 9 2,9 X sideridiol or C 20H 32O 2 304,2 304, ,1 [M+H] + (5) F7 7-epicandicandiol or 322,2 [M+NH 4] + (13) trachinodiol 327,2[M+Na] + (81) 631,4 [2M+Na] + (100) 304, ,3 [M+H] + (6) F8 322,3 [M+NH 4] + (8) 327,2 [M+Na]+ (93) 346,3 [M+AcCN+H] + (19) 631,4 [2M+Na] + (58) 10 3,3 XIV siderol or C 22H 34O 3 346,3 346, ,3 [M+NH 4] + (6) F7 sideripol or 369,2 [M+Na] + (100) 7-acetyl-epicandicandiol or 385,1 [M+K] + (3) 7-epicandicandiol-18monoacetate or 715,3 [2M+Na] + (29) trachinodiol 7β-monoacetate 346, ,3 [M+Na] + (100) F8 715,1 [2M+Na] + (16) 11 3,6 XV 7-acetyl-epicandicandiol or C 22H 34O 3 346,3 346, ,3 [M+NH 4] + (8) F5 7-epicandicandiol 18-monoacetate or 369,3 [M+Na] + (100) trachinodiol 7β-monoacetate 715,5 [2M+Na] + (22) 346, ,3[M+NH 4] + (5) F6 369,3 [M+Na] + (100) 715,5 [2M+Na] + (35) 99

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 12 4,1 XVIII 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol C 23H 36O 4 374,2 374,2 66 (διπλή κορυφή) 13 4,1 XVII trachinol acetate C 22H 36O 2 330,1 330,1 66 (διπλή κορυφή) 397,2 [M+Na] + (100) F4 771,4 [2M+Na] + (11) 353,3 [M+Na] + (66) F4 682,9 [2M+Na] + (11) XVII candol A acetate or C 22H 36O 2 330,3 330, ,3 [M+Na] + (100) F7 candol B acetate or 682,9 [2M+Na] + (15) isocandol A acetate 330, ,3 [Μ+Νa] + (100) F8 683,4 [2M+Na] + (10) 330, ,3 [M+Na] + (30) F9 683,6 [2M+Na] + (5) 14 4,5 ΧΙΧ 7,18-diacetyl-epicandicandiol or C 24H 36O 4 388,3 388, ,3 [M+Na] + (100) F5 trachinodiol diacetate or 799,1 [2M+Na] + (7) ent-19-hydroxykaur-15-en , ,3 [M+Na] + (100) F6 carboxylic isobutyl ester (FLVD1) 799,6 [2M+Na] + (6) 15 6,8 XXI άγνωστη , ,3 [M+Na] + (100) F4 739,1 [2M+Na] + (17) 358, ,3 [M+Na] + (100) F7 739,4 [2M+Na] + (13) 100

119 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 16 7,7 XXII άγνωστη , ,5 [M+H] + (51) F8 485,5 [M+Na] + (100) 17 8,3 ΧΧIV άγνωστη , ,4 [M+H] + (11) F3 393,4 [M+Na] + (100) 762,8 [2M+Na] + (24) 370, ,3 [M+H] + (12) F4 393,3 [M+Na] + (100) 370, ,4 [M+H] + (16) F5 393,4 [M+Na] + (100) 763,0 [2M+Na] + (7) 370, ,3 [M+H] + (11) F6 393,4 [M+Na] + (100) 763,4 [2M+Na] + (15) 370, ,3 [M+H] + (10) F7 393,3 [M+Na] + (100) 763,0 [2M+Na] + (10) 370, ,4 [M+Na] + (100) F8 763,1[2M+Na] + (9) 370, ,4 [M+H] + (12) F9 393,4 [M+Na] + (100) 763,1 [2M+Na] + (8) 101

120 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 18 9,0 XXV hypolaetin 8-O-glucuronide C 22H 22O ,1 478, ,4 [M+H] + (100) F7 (ή ισομερές της) 501,4 [M+Na] + (21) 957,3 [2M+H] + (4) 979,8 [2M+Na] + (12) 19 9,4 XXVI hypolaetin 8-O-glucuronide C 22H 22O ,3 478, ,4 [M+H] + (100) F7 (ή ισομερές της) 501,4 [M+Na] + (23) 957,3 [2M+H] + (15) 979,5 [2M+Na] + (12) 20 12,6 XXVII 3,7,18-triacetyl-foliol C 26H 38O 6 446,3 446, ,5 [M+H] + (100) F6 469,4 [M+Na] + (51) 485,5 [Μ+Κ] + (60) 894,1 [2M+H] + (5) 915,5 [2M+Na] + (6) 931,4 [2Μ+Κ] + (19) 21 12,7 XXVIII άγνωστη , ,5 [M+H] + (7) F5 485,4 [M+Na] + (100) 925,4 [2M+H] + (19) 947,3 [2M+Na] + (40) 462, ,5 [M+H] + (22) F6 485,4 [M+Na] + (100) 501,5 [M+K] + (3) 947,4 [2M+Na] + (22) 102

121 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Α/Α t R (min) Κορυφή Ένωση Μοριακός Τύπος Θεωρητικό M.W. Πειραματικό M.W. Relative Area % Θετικός Ιονισμός m/z (Rel. Int. %) Κλάσμα 22 15,1 XXIX άγνωστη , ,4 [M+H] + (2) F5 469,5 [M+Na] + (51) 893,3 [2M+H] + (34) 915,4 [2M+Na] + (36) 446, ,4 [M+H] + (4) F6 469,5 [M+Na] + (45) 893,2 [2M+H] + (40) 915,4 [2M+Na] + (39) 23 16,5 XXX άγνωστη , ,4 [M+H] + (15) F3 457,4 [M+Na] + (100) 891,7 [2M+Na] + (23) 434, ,4 [M+H] + (15) F4 457,4 [M+Na] + (100) 869,6 [2M+H] + (5) 891,6 [2M+Na] + (31) 434, ,4 [M+H] + (15) F5 457,4 [M+Na] + (100) 891,7 [2M+Na] + (32) 103

122 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Για κάθε κορυφή που εμφάνισε θραύσματα μαζών, κάθε μία πιθανή ένωση-δομή εισήχθη στο υπολογιστικό πρόγραμμα CFM-ID Competitive Fragmentation Modeling for Metabolite Identification [Djoumbou-Feunang et al., 2019], ώστε μέσω αυτού, να προκύψουν θεωρητικώς, τα πιθανότερα θραύσματα που θα εμφάνιζε κάθε ένωση στη ESI φασματοσκοπία μάζας θετικού ιονισμού. Τα υπολογιστικά προβλεπόμενα αυτά θραύσματα, συγκρίθηκαν με τα θραύσματα που έδωσε πραγματικά η κορυφή και η ύπαρξη κοινών θραυσμάτων (θεωρητικών-πειραματικών) αξιοποιήθηκε στη συζήτηση για τις πιθανότερες ενώσεις που θα μπορούσαν να αποδοθούν σε κάθε κορυφή. Σημειώνεται ότι κορυφές με m/z: 301, 338, 353, 360, 388, 413, εμφανίζονταν ως μόνιμο background τόσο στις τυφλές ενέσεις όσο και στις ενέσεις των φυτικών κλασμάτων και έτσι αποκλείστηκαν από περαιτέρω μελέτη. Ακολουθεί, λεπτομερώς, η ανάλυση των κύριων κορυφών των κλασμάτων F3-F9. ΚΛΑΣΜΑ F3 Οι κύριες κορυφές του κλάσματος F3 ήταν τρεις, η IV (25% σε σχέση με την κυριότερη), η ΧΧIV (100%) και η ΧΧΧ (18%), χωρίς ωστόσο να είναι δυνατή η ταυτοποίησή τους. Πιο συγκεκριμένα: ΚΟΡΥΦΗ IV Η κορυφή (IV) είναι η πρώτη κορυφή που εκλούστηκε στο κλάσμα F3, στα 1,8 min. Το φάσμα μαζών της παρουσιάζεται παρακάτω (Εικόνα 40). Αντιστοιχίστηκε σε Μ.Β. 278 g/mol και δεν εκλούστηκε σε κάποιο άλλο κλάσμα. Επίσης, δεν εμφάνισε UV- Vis απορρόφηση, ούτε αξιοσημείωτα θραύσματα. Το Μ.Β. 278 g/mol δεν μπόρεσε να αποδοθεί σε κάποια ένωση που έχει βρεθεί ξανά στο γένος Sideritis. Θα μπορούσε να πρόκειται για ένα απλό, μικρό διτερπένιο, χωρίς πολλές χαρακτηριστικές ομάδες, αρωματικό σύστημα ή συζυγία διπλών δεσμών. 104

123 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 40. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής IV στο κλάσμα F3. ΚΟΡΥΦΗ XXIV Η κορυφή XXIV αποτελεί την κύρια κορυφή του κλάσματος F3. Εκλούστηκε σε χρόνο 8,3 min και αντιστοιχίστηκε σε Μ.Β. 370 g/mol. Είναι η μοναδική κορυφή που βρέθηκε σε όλα τα κλάσματα στα αμέσως επόμενα F4, F5, με πτωτική τάση ως προς το σχετικό εμβαδό της, στο κλάσμα F6 με ξανά σημαντική συνεισφορά και στα κλάσματα F7, F8, F9 με μειωμένο σχετικό εμβαδό, όπως φαίνεται στον Πίνακα 15. Τόσο στο F3, όσο και στα υπόλοιπα κλάσματα, εμφανίστηκε με καθαρά φάσματα μαζών, χωρίς κάποιο σημαντικό θραύσμα και δεν εμφάνισε UV-Vis απορρόφηση. Ωστόσο, δεν έχει βρεθεί μια σχετική ένωση στη βιβλιογραφία και έτσι δεν ήταν δυνατό να προχωρήσουμε στην ταυτοποίησή της. Ενδεχομένως πρόκειται για κάποιο διτερπένιο χωρίς αρωματικό σύστημα ή κάποια συζυγία διπλών δεσμών. Παρακάτω (Εικόνα 41), (Εικόνα 42), παρουσιάζεται το φάσμα μαζών της κορυφής, όπως προέκυψε στα κλάσματα F3 και F6. 105

124 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 41. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXIV στο κλάσμα F3. Εικόνα 42. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXIV στο κλάσμα F6. ΚΟΡΥΦΗ XXX H κορυφή ΧΧΧ αποτελεί την τρίτη κυριότερη κορυφή του κλάσματος F3. Εκλούστηκε σε χρόνο 16,5 min και αντιστοιχίστηκε σε Μ.Β. 434 g/mol. Εμφανίστηκε και σε άλλα δύο κλάσματα, στο επόμενο F4 και στο μεθεπόμενο F5. Εμφανίστηκε με σχετικά καθαρά φάσματα μαζών (με δεδομένο το γνωστό θόρυβο ως background), χωρίς να δώσει θραύσματα ή UV-Vis απορρόφηση. Ωστόσο, δεν μπόρεσε να αντιστοιχιστεί σε κάποια ένωση που έχει απομονωθεί από το γένος Sideritis και έτσι δεν ήταν δυνατή η ταυτοποίησή της. Θα μπορούσε να αφορά κάποιο διτερπένιο χωρίς αρωματικό σύστημα ή κάποια συζυγία διπλών δεσμών. Παρακάτω, (Εικόνα 43), (Εικόνα 44), παρουσιάζεται το φάσμα μαζών της κορυφής, όπως εμφανίστηκε στα κλάσματα F3 και F4. 106

125 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 43. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXΧ στο κλάσμα F3. Εικόνα 44. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXΧ στο κλάσμα F4. ΚΛΑΣΜΑ F4 Οι κύριες κορυφές του κλάσματος F4 ήταν οι: ΙΙΙ (32% σε σχέση με την κυριότερη), XVII συνεκλουόμενη με τη XVIII (66% αθροιστικά), ΧΧΙ (26%), XXIV (23%) και XXX (81%). Εκλούστηκαν σε χρόνους από 1,5 min έως 16,5 min. Οι κορυφές XXIV και XXX αναλύθηκαν στο πλαίσιο του κλάσματος F3, όπου και πρωτοεκλούστηκαν. Αναλυτικότερα: ΚΟΡΥΦΗ ΙΙΙ Η κορυφή ΙΙΙ αποτελεί την τρίτη κυριότερη κορυφή του κλάσματος F4. Εκλούστηκε σε χρόνο 1,5 min, αποκλειστικά στο F4 και αντιστοιχίστηκε σε Μ.Β

126 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ g/mol. Με βάση τη βιβλιογραφία, της αποδόθηκε ο μοριακός τύπος C22H34O5, ως μοναδικός πιθανός Μ.Τ., και οι παρακάτω ενώσεις (Eικόνα 45) ως πιθανές ταυτοποιήσεις. Δεν εμφάνισε UV-Vis απορρόφηση, και το φάσμα μαζών της παρουσιάζεται στην Εικόνα 46. Εικόνα 45. Πιθανές δομές για την κορυφή ΙΙΙ. 108

127 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ακολουθεί το φάσμα μαζών της κορυφής ΙΙΙ (Εικόνα 46). Εικόνα 46. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής III στο κλάσμα F4. Οι πιθανές ενώσεις για αυτή την κορυφή παρουσιάζονται παρακάτω, στον Πίνακα 17. Ανήκουν όλες στα διτερπένια και συγκεκριμένα στις κατηγορίες των entκαουρανίων, ent-εποξυκαουρανίων και ent-μπεγερενίων. Πίνακας 17. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή ΙΙΙ. Ένωση Κατηγορία ένωσης Είδος Διαλύτης εκχύλισης 3-acetyl-leucanthol ent-καουρένιο Sideritis varoi Εξάνιο 18-acetyl-leucanthol ent-καουρένιο Sideritis varoi Εξάνιο epoxy-isolinearol ent-εποξυκαουρένιο Sideritis sipylea Εξάνιο epoxy-isosidol ent-εποξυκαουρένιο Sideritis biflora Π.αιθέρας funkiol sidofunkiol ent-καουρένιο ent-καουρένιο Sideritis funkiana Sideritis funkiana DCM/ Me 2CO DCM/ Me 2CO 7-acetyl-pusillatetrol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο 14-acetyl-pusillatetrol ent-μπεγερένιο S. pusilla ssp. flavovirens Εξάνιο Βιβλιογραφική αναφορά Algarra et al., 1983 Algarra et al., 1983 Topcu et al., 2002a Garcia- Alvarez et al., 1976 Garcia-Granados et al., 1980 Garcia-Granados et al., 1980 de Quesada et al., 1974 Garcia-Granados et al., 1984 ΚΟΡΥΦΕΣ XVII ΚΑΙ XVIII - ΣΥΝΕΚΛΟΥΣΗ Στο χρόνο 4,1 min εκλούστηκε μία διπλή κορυφή με σημαντικό σχετικό εμβαδό (66%). Αποτελεί ουσιαστικά δύο διαφορετικές κορυφές, με διαφορετικά Μ.Β, που αφορούν συνεπώς διαφορετικές ενώσεις. Κάθε κορυφή έδωσε θραύσματα, τα οποία 109

128 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ αξιοποιήθηκαν στην προσπάθεια ταυτοποίησης των ενώσεών τους. Οι κορυφές αυτές είναι η XVII και ΧVIII και ακολουθεί η ανάλυσή τους: Η κορυφή XVII εκλούστηκε στο χρόνο 4,1 min και εκτός από το F4, βρέθηκε και στα κλάσματα F7, F8, F9. Στο F4, ωστόσο, εμφάνισε περισσότερα θραύσματα (269, 313, 315) σε σχέση με τα υπόλοιπα. Αντιστοιχίστηκε σε Μ.Β. 330 g/mol και, σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, θα μπορούσαν να της αποδοθούν ως πιθανές ενώσεις τα φλαβονοειδή cirsiliol ή 5,7,3'-trihydroxy-6,4'-dimethoxyflavone, με Μ.Τ. C17H14O7 και τα διτερπένια candol A acetate, candol B acetate, isocandol A acetate, trachinol acetate με Μ.Τ. C22H34O2. Ωστόσο, η κορυφή δεν εμφάνισε το αναμενόμενο μοτίβο UV-Vis απορρόφησης των φλαβονοειδών, το οποίο συνίσταται από δύο κορυφές με λmax στα nm η μία και nm η άλλη [Tosovic et al., 2015], καθώς είχε μηδενική UV απορρόφηση. Συνεπώς, τα δύο φλαβονοειδή αποκλείονται και η κορυφή πρόκειται πιθανόν για κάποιο από τα παρακάτω διτερπένια candol A acetate, candol B acetate, isocandol A acetate, trachinol acetate, (Eικόνα 47). Εικόνα 47. Πιθανές δομές για την κορυφή ΧVII. 110

129 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Την εκτίμηση ότι η κορυφή θα μπορούσε να αφορά ένα από αυτά τα διτερπένια, ενισχύει το γεγονός ότι τα θραύσματα που έδωσε, προέκυψαν και θεωρητικά από το πρόγραμμα και για τις τέσσερις αυτές πιθανές δομές. Ο τρόπος θραυσμάτωσης των ενώσεων candol A acetate (η candol B acetate έχει παρεμφερή δομή), isocandol A acetate και trachinol acetate, που προτείνεται από το πρόγραμμα, παρουσιάζεται παρακάτω (Eικόνα 48), (Εικόνα 49), (Εικόνα 50). Εικόνα 48. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης candol A acetate, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 315, 313, 269 της κορυφής XVII. Το θραύσμα 315 μπορεί να προκύψει από απώλεια του άνθρακα του διπλού δεσμού του Γ δακτυλίου (ως CH3), το θραύσμα 313 από απώλεια του οξυγόνου του καρβονυλίου της ακετοξυ-ομάδας (ως ΟΗ) και το θραύσμα 269 από το 313, έπειτα από απώλεια και του εναπομείναντος τμήματος της αρχικής ακετοξυ-ομάδας (ως C2H5O), μαζί με προσθήκη ενός Η

130 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 49. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης isocandol A acetate, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 315, 313, 269 της κορυφής XVII. Το θραύσμα 315 μπορεί να προκύψει από απώλεια μίας από τις πλευρικές μεθυλομάδες, το θραύσμα 313 από απώλεια του οξυγόνου του καρβονυλίου της ακετοξυ-ομάδας (ως ΟΗ) και το θραύσμα 269 από το 313, έπειτα από απώλεια και του εναπομείναντος τμήματος της αρχικής ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O + ), μαζί με απώλεια ενός Η

131 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 50. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης trachinol acetate, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 315, 313, 269 της κορυφής XVII. Το θραύσμα 315 μπορεί να προκύψει από απώλεια μίας από τις πλευρικές μεθυλομάδες, το θραύσμα 313 από απώλεια του οξυγόνου του καρβονυλίου της ακετοξυ-ομάδας (ως ΟΗ) και το θραύσμα 269 από το 313, έπειτα από απώλεια και του εναπομείναντος τμήματος της αρχικής ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O + ), μαζί με απώλεια ενός Η +. Από τα παραπάνω τέσσερα διτερπένια, τα candol A acetate, candol B acetate και isocandol A acetate ανήκουν στα ent-καουρένια και το trachinol acetate στα entτραχιλομπάνια. Η πιθανότερη όμως ένωση για την κορυφή XVII, στο κλάσμα F4, είναι η trachinol acetate, αν ληφθούν υπόψη τα δεδομένα από την κορυφή XVIII. H κορυφή XVIII, συνεκλούστηκε στον ίδιο χρόνο, όπως φαίνεται στο παρακάτω φάσμα μαζών (Eικόνα 51). Δεν βρέθηκε σε κάποιο άλλο κλάσμα και αντιστοιχίστηκε σε 113

132 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μ.Β. 374 g/mol, το οποίο θα μπορούσε να προκύψει από το 330 g/mol της ένωσης trachinol acetate, αν στη δομή της προστεθεί μια φορμυλο-ομάδα. Εικόνα 51. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού των συνεκλουόμενων κορυφών XVII και XVIIΙ στο κλάσμα F4. Στη βιβλιογραφία, βρέθηκε ως μοναδική πιθανή ένωση για το Μ.Β. 374 g/mol, η 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol, με Μ.Β. C23H36O4, που αποτελεί τη φορμυλιωμένη εκδοχή της trachinol acetate στον C18. Εμφάνισε τα ίδια θραύσματα με την XVII (269, 313, 315) και ένα επιπλέον θραύσμα στα 347, τα οποία απαντώνται επίσης και στο φάσμα μαζών της 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol, όπως αυτό προέκυψε από το πρόγραμμα, και παρουσιάζονται παρακάτω (Eικόνα 53). Η κορυφή XVIII, συνεπώς, ταυτοποιείται κατά μεγάλη πιθανότητα ως η ένωση 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol (Eικόνα 52). Εικόνα 52. Δομή της 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol, πιθανής ένωσης για την κορυφή XVIII. 114

133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ακολουθεί ο τρόπος θραυσμάτωσης της ένωσης 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol, σύμφωνα με το πρόγραμμα: Εικόνα 53. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης 7-acetyl-18-formyltrachinodiol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 347, 315, 313, 269 της κορυφής XVIIΙ. Το θραύσμα 347 μπορεί να προκύψει έπειτα από απώλεια του καρβονυλίου της φορμυλο-ομάδας (ως CΟ) και προσθήκη ενός Η +, τα θραύσματα 315, 313 από απώλειες μίας ακετοξυ-ομάδας (με διαφορετικούς μετασχηματισμούς) και το θραύσμα 269 από το 313, έπειτα από απώλεια της φορμυλo-ομάδας (ως CHO2) και προσθήκη ενός Η +. Το 347 είναι το σημαντικότερο θραύσμα, καθώς το γεγονός ότι εμφανίστηκε στην κορυφή, 115

134 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ αυξάνει την πιθανότητα να αφορά τη φορμυλιωμένη ένωση, που καθώς θραυσματώνεται, μένει πιθανώς με -ΟΗ στον C18. Τέλος, το ιόν προσθήκης με m/z 353, το οποίο αντιστοιχεί στο [M+Na] + της trachinol acetate και εμφανίστηκε στο φάσμα της κορυφής XVII, ενισχύει την πιθανότητα ύπαρξης της trachinol acetate μέσα στη διπλή κορυφή, καθώς αποκλείει το σενάριο η κορυφή να συνίσταται μόνο από την 7-acetyl-18-formyl-trachinodiol και τα θραύσματα αυτής. Συμπερασματικά, λοιπόν, υπάρχει σημαντική πιθανότητα, στο χρόνο 4,1 min, στο κλάσμα F4, να συνεκλούστηκαν οι ενώσεις trachinol acetate και 7-acetyl-18-formyltrachinodiol. Αμφότερες οι ενώσεις ανήκουν στα ent-τραχιλομπάνια διτερπενοειδή και απομονώθηκαν από τους Fraga et al., 1991a., από το είδος Sideritis canariensis var. pannosa των Κανάριων Νήσων, έπειτα από εκχύλιση με διαλύτη EtOH σε συσκευή Soxhlet. ΚΟΡΥΦΗ ΧΧΙ Η κορυφή ΧΧΙ εκλούστηκε στο χρόνο 6,8 min στο κλάσμα F4, ενώ βρέθηκε και στο κλάσμα F7 σε μικρό σχετικό εμβαδό. Το φάσμα μαζών της φαίνεται παρακάτω (Εικόνα 54) και με βάση αυτό, της αποδόθηκε το Μ.Β. των 358 g/mol, το οποίο, από τη βιβλιογραφία του Sideritis, αντιστοιχίστηκε μόνο σε μία ένωση, το φλαβονοειδές 5- demethylsinensetin, με Μ.Τ. C19H18O7. Ωστόσο, η κορυφή δεν εμφάνισε τη χαρακτηριστική για τα φλαβονοειδή UV απορρόφηση και επομένως δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί ως η 5-demethylsinensetin. Η κορυφή XXI αφορά ενδεχομένως κάποιο μη αρωματικό διτερπένιο, χωρίς χαρακτηριστική ομάδα που απορροφά στο UV-Vis, που φέρει όμως υδροξυλομάδα, καθώς εμφάνισε θραύσμα με m/z = 341 (απώλεια υδροξυλομάδας, ως ΟΗ), τόσο στο F4 όσο και στο F7. 116

135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 54. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXI στο κλάσμα F4. ΚΛΑΣΜΑ F5 Το κλάσμα F5 εμφάνισε συνολικά έξι καθαρές κορυφές, από τις οποίες κύριες ήταν οι: XV (77% σε σχέση με την κυριότερη), XXIX (100%) και ΧΧΧ (27%). Από τις υπόλοιπες, η XIX (12%) εμφάνισε ενδιαφέρον αναφορικά με μια πιθανή συσχέτισή της με την XV, όπως αναλύεται παρακάτω, ενώ οι XXIV (7%) και ΧΧΧ (27%) βρέθηκαν επίσης στα προηγούμενα δύο κλάσματα, παρουσιάστηκαν στο πλαίσιο του κλάσματος F3 και εδώ εμφανίστηκαν αρκετά μειωμένες σε σχέση με το F4. Οι κορυφές εκλούστηκαν σε χρόνους από 3,6 min έως 16,5 min. Αναλυτικότερα: ΚΟΡΥΦΕΣ XV ΚΑΙ ΧΙΧ Η κορυφή XV εκλούστηκε στο χρόνο 3,6 min, στο κλάσμα F5, καθώς και στο κλάσμα F6 και αποτελεί την δεύτερη κυριότερη κορυφή σε αμφότερα τα κλάσματα. Φαίνεται να πρωτοεμφανίστηκε στο F5 και να κορυφώθηκε στο F6. Η κορυφή ΧΙΧ εκλούστηκε ακριβώς μετά τη XV, σε χρόνο 4,5 min, τόσο στο F5, όσο και στο F6. Στην κορυφή XV αποδόθηκε το Μ.Β. 346 g/mol και οι πιθανές ενώσεις για αυτή, όλες με Μ.Τ. C22H34O3, φαίνονται παρακάτω (Εικόνα 55). 117

136 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 55. Πιθανές δομές για την κορυφή ΧV. 118

137 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Όλες οι πιθανές ενώσεις ανήκουν στα διτερπένια και πιο συγκεκριμένα σε τρεις κατηγορίες διτερπενίων: ent-καουρένια, ent-μπεγερένια, εποξυκαουράνια και entτραχιλομπάνια. Παρουσιάζονται στον Πίνακα 18. Πίνακας 18. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή XV. Ένωση siderol Κατηγορία ένωσης ent-καουρένιο Είδος Διαλύτης εκχύλισης Me 2CO sideripol ent-καουρένιο Sideritis sicula Π.αιθέρας tartessol ent-μπεγερένιο Sideritis grandiflora Εξάνιο epoxyisocandol A acetate Sideritis hubermorathii 7-acetylepicandicandiol Βιβλιογραφική αναφορά Baser et al.,1996 Venturella et al., 1978 Rabanal et al., 1974 εποξυκαουράνιο Sideritis trojana MeOH Topcu et al., 2002 ent-καουρένιο S. bolleana, S. canariensis, S. dasygnaphala, S. dendrochahorra, S. candicans EtOH Gonzalez et al., epicandicandiol 18-monoacetate ent-καουρένιο Sideritis argyrea MeOH Topcu et al., 2001 trachinodiol 7βmonoacetate entτραχιλομπάνιο S. bolleana, S. canariensis, S. candicans, S. dendrochahorra EtOH Gonzalez et al., 1979 Στην κορυφή XΙΧ αποδόθηκε το Μ.Β. 388 g/mol και οι δύο πιθανές ενώσεις για αυτή, με βάση την πρότερη βιβλιογραφία του Sideritis, με Μ.Τ. C22H36O4, φαίνονται παρακάτω (Εικόνα 56) και παρουσιάζονται στον Πίνακα 19. Εικόνα 56. Πιθανές δομές για την κορυφή XIX. 119

138 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 19. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή XΙΧ. Ένωση Κατηγορία ένωσης Είδος 7,18-diacetylepicandicandiol trachinodiol diacetate ent-καουρένιο ent-τραχιλομπάνιο Sideritis cystosiphon Sideritis ferrensis Διαλύτης εκχύλισης Βιβλιογραφική αναφορά EtOH Fraga et al., 1987 EtOH Fraga et al., 1991c Οι δύο αυτές πιθανές ενώσεις ανήκουν στα διτερπένια και συγκεκριμένα στα entκαουρένια και ent-τραχιλομπάνια. Τα Μ.Β. των κορυφών XV (346), XIX (388) έχουν διαφορά 42 g/mol. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να προκύψει αν η ΧΙΧ ήταν η ακετυλιωμένη εκδοχή της XV. Έτσι, εξετάστηκε αυτή η εικασία, με βάση τη χρωματογραφική εικόνα τους, αλλά και με βάση τα φάσματα μαζών και τα θραύσματα που αυτά έδωσαν. Αμφότερες οι κορυφές δεν εμφάνισαν UV-Vis απορρόφηση, ενώ έδωσαν καθαρά φάσματα μαζών (Εικόνα 57), (Εικόνα 58), με κάποια όμοια θραύσματα. Εικόνα 57. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XV στο κλάσμα F5. Εικόνα 58. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XIX στο κλάσμα F5. 120

139 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στους παρακάτω πίνακες, (Πίνακας 20), (Πίνακας 21), παρουσιάζονται τα θραύσματα που εμφανίστηκαν πειραματικά στο φάσμα μαζών κάθε κορυφής (στη δεξιά μεριά) και αυτά που προβλέφθηκαν από το πρόγραμμα για κάθε μία πιθανή ένωση (στα αριστερά). Πίνακας 20. Θραύσματα της κορυφής ΧV που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση siderol 269, 287, 329, Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από τα κλάσματα F5, F6 sideripol 213, 269, 287, 329 tartessol 269, 287, 329 epoxyisocandol A acetate 269, 287, acetyl-epicandicandiol 269, 287, epicandicandiol 18- monoacetate 213, 269, 287, 329 trachinodiol 7β-monoacetate 269, 287, 329 Θραύσματα στο F5 Θραύσματα στο F6 213, 269, , 287, 256, 329 Πίνακας 21. Θραύσματα της κορυφής ΧΙΧ που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση 7,18-diacetyl-epicandicandiol 269, 329 trachinodiol diacetate 269, 329 Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από τα κλάσματα F5, F6 Θραύσματα στο F5 227, 241, 269, 329, 353, 381 Θραύσματα στο F6 227, 241, 255, 261, 269, 329, 353, 381 Το γεγονός ότι εμφανίστηκαν πειραματικά, και για τις δύο κορυφές, κάποια θραύσματα που προβλέφθηκαν και από το πρόγραμμα, αυξάνει την πιθανότητα οι κορυφές αυτές να αφορούν πράγματι τα παραπάνω διτερπένια. Ακολουθεί ενδεικτικά ο τρόπος θραυσμάτωσης για το μόριο της sideripol, πιθανής ένωσης για την κορυφή XV, (Εικόνα 59) και της 7,18-diacetyl-epicandicandiol, πιθανής ένωσης για την κορυφή XΙΧ (Εικόνα 60), σύμφωνα με το πρόγραμμα: 121

140 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 59. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης sideripol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 329, 287, 269, 213 της κορυφής XV. Το θραύσμα 329 μπορεί να προκύψει από απώλεια του υδροξυλίου (ως ΟΗ), το θραύσμα 287 από απώλεια της ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O2), το θραύσμα 269 από απώλειες ακετοξυ-ομάδας και υδροξυλίου, ενώ το θραύσμα 213 μπορεί να προκύψει από το 269, έπειτα από θραύση του δακτυλίου Α (απώλεια C4H8). 122

141 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 60. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης 7,18-diacetylepicandicandiol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 329, 269 της κορυφής ΧΙΧ. Το θραύσμα 329 μπορεί να προκύψει από απώλεια της μίας ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O2) και το θραύσμα 269 από το 329 με απώλεια και της δεύτερης ακετοξυ-ομάδας (ως C2H4O2). Συμπερασματικά, λοιπόν, η εικασία ότι η κορυφή XV αφορά πιθανόν την μόνοακετυλιωμένη και η κορυφή XIX τη διπλά ακετυλιωμένη εκδοχή του ίδιου κατά τα άλλα ανθρακικού σκελετού, θα μπορούσε να ενισχυθεί και από τα παρακάτω δεδομένα: Και οι δύο κορυφές εμφάνισαν θραύσματα στα m/z 329 (παραμονή μίας ακετοξυομάδας, χωρίς -ΟΗ στο μόριο) και 269 (χωρίς καμία ακετοξυ-ομάδα και -ΟΗ). Με βάση τη μελέτη των Shiao et al., 1989, η προσθήκη ακετοξυ-ομάδας στη θέση μιας υδροξυλομάδας, σε αυτό το είδος ενώσεων, οδηγεί σε μείωση της πολικότητας του μορίου. Συνεπώς, θα αναμενόταν αυξημένος χρόνος κατακράτησης στη UHPLC χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, γεγονός που θα μπορούσε να ισχύει και με τη ΧΙΧ, που εκλούεται μεταγενέστερα της XV. 123

142 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αν πράγματι ισχύει αυτή η εικασία, τότε οι πιθανές ενώσεις για τις δύο αυτές κορυφές, των κλασμάτων F5 και F6, μπορούν να μειωθούν σε όσες έχουν όμοιο ανθρακικό σκελετό, που φέρει υδροξυλομάδα όπου οι πιθανές ενώσεις της XIX φέρουν ακετοξυ-ομάδα. Συνεπώς, τα πιθανότερα ζευγάρια ενώσεων θα μπορούσαν να είναι: 7- acetyl-epicandicandiol ή 7-epicandicandiol-18monoacetate (κορυφή XV) με 7,18- diacetyl-epicandicandiol (κορυφή XIX) και trachinodiol 7β-monoacetate (XV) με trachinodiol diacetate (XIX). Μια εναλλακτική εκτίμηση για την κορυφή XIX, αφορά μία διαφορετική, αρκετά πιθανή ένωση, η οποία απομονώθηκε πρόσφατα, για πρώτη φορά από το γένος Sideritis, στο πλαίσιο της διδακτορικής διατριβής [Δημάκη, 2019] από το κλάσμα ΓΔ της ίδιας δρόγης. Η ένωση αυτή είναι το διτερπενοειδές με σκελετό ent-καουρενίου, ent-19- hydroxykaur-15-en-17-carboxylic isobutyl ester (FLVD1) με Μ.Β. 388 g/mol (Εικόνα 61). Εικόνα 61. Δομή της πιθανής ένωσης για την κορυφή ΧΙΧ, ent-19-hydroxykaur-15- en-17-carboxylic isobutyl ester (FLVD1) ΚΟΡΥΦΗ XXVIII H κορυφή XXVIII εκλούστηκε στο χρόνο 12,7 min, στα κλάσματα F5 και F6, με μικρό σχετικό εμβαδό στο πρώτο και σημαντικά μεγαλύτερο στο δεύτερο. Σε αμφότερα τα κλάσματα, η κορυφή έδωσε όμοιο χρωματογραφικό προφίλ, χωρίς UV-Vis απορρόφηση. Η μοναδική ένωση που θα μπορούσε πιθανόν να αποδοθεί, με βάση τη βιβλιογραφία στην κορυφή, είναι ένας γλυκοζίτης φλαβονοειδούς, η chrysoeriol-7-oglucoside με Μ.Β. 462 g/mol και Μ.Τ. C22H22O11. Ωστόσο, λόγω του ότι η κορυφή δεν εμφάνισε καθόλου UV-Vis, δεν κρίνεται πιθανό να αφορά κάποιο φλαβονοειδές και συνεπώς δεν μπόρεσε να ταυτοποιηθεί. 124

143 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Σημειώνεται ότι και στα δύο κλάσματα η κορυφή έδωσε στο φάσμα μαζών της (Εικόνα 62) θραύσματα στα 445 (απώλεια -ΟΗ) και 447 (απώλεια -ΟΗ και προσθήκη Η + ), γεγονός που θα μπορούσε να σημαίνει ύπαρξη τουλάχιστον μιας -ΟΗ στη δομή της ένωσης. Εικόνα 62. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXVIII στο κλάσμα F6. ΚΟΡΥΦΗ XXIX Η κορυφή XΧΙΧ εκλούστηκε, ως κύρια κορυφή, στο χρόνο 15,1 min, στα κλάσματα F5 και F6 και της αποδόθηκε το Μ.Β. 446 g/mol. Σε αμφότερα τα κλάσματα, η κορυφή εμφανίστηκε με όμοιο χρωματογραφικό προφίλ, έδωσε καθαρά φάσματα μαζών (Εικόνα 63) και αξιοσημείωτη UV απορρόφηση με λmax 270 nm. Παρακάτω, παρατίθεται το συνδυαστικό φάσμα μαζών και UV-Vis απορρόφησης της κορυφής (Εικόνα 64) και ακολουθεί το συνδυαστικό φάσμα μαζών και UV-Vis απορρόφησης του διαλύτη (Εικόνα 65), λίγο μετά την έκλουση της κορυφής, ως μέτρο σύγκρισης. 125

144 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 63. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XXIX στο κλάσμα F5. Εικόνα 64. Συνδυαστικό φάσμα μαζών και UV-Vis απορρόφησης της κορυφής XXIX στο κλάσμα F6. Εικόνα 65. Συνδυαστικό φάσμα μαζών και UV-Vis απορρόφησης του διαλύτη, μετά την έκλουση της κορυφής XXIX στο κλάσμα F6. 126

145 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η μοναδική ένωση, με βάση τη βιβλιογραφία, που θα μπορούσε πιθανόν να αποδοθεί στην κορυφή, είναι η 3,7,18-triacetyl-foliol με Μ.Τ. C26H38O6. Είναι διτερπένιο της κατηγορίας των ent-καουρανίων, χωρίς αρωματικό δακτύλιο ή κάποιο συζυγιακό σύστημα διπλών δεσμών, κι επομένως δεν μπορεί να δικαιολογήσει τη UV απορρόφηση, οπότε απορρίπτεται. Η κορυφή αυτή δεν μπόρεσε να ταυτοποιηθεί. Σημειώνεται, όμως, ότι εμφάνισε θραύσμα με ιδιαίτερα αξιοσημείωτη ένταση στα 429, το οποίο θα μπορούσε να πρόκειται για απώλεια -ΟH. ΚΛΑΣΜΑ F6 Το κλάσμα F6 ήταν το πιο πλούσιο κλάσμα του ΑΒ15-17, καθώς εμφάνισε δέκα καθαρές κορυφές, που εκλούστηκαν σε χρόνους από 1,2 min έως 15,1 min. Κυριότερη κορυφή του κλάσματος ήταν η XXIX, όπως και στο F5. Ιδιαίτερα σημαντική ήταν και η κορυφή XV (91% σε σχέση με την κυριότερη), η οποία περιγράφηκε στο πλαίσιο του κλάσματος F5, μαζί με την XIX, που εμφανίστηκε και εδώ. Σημαντικές ήταν ακόμα οι κορυφές XXIV (48%), XXVIII (40%), II (35%), VI (35%), IX (28%) και ΧΧVII (23%). Από αυτές, οι XXVIII και ΧΧΙΧ έχουν παρουσιαστεί στο πλαίσιο του F4, ενώ η XXIV στο F3, όπου και πρωτοεμφανίστηκαν. Οι υπόλοιπες παρουσιάζονται στη συνέχεια: ΚΟΡΥΦΗ ΙΙ Η κορυφή ΙΙ εκλούστηκε αποκλειστικά στο κλάσμα F6, στο χρόνο 1,2 min, με σημαντικό σχετικό εμβαδό, χωρίς UV-Vis απορρόφηση. Η μοναδική ένωση, με βάση τη βιβλιογραφία, που θα μπορούσε πιθανόν να αποδοθεί στην κορυφή, είναι η 7-demethyl siderin acetate (Εικόνα 66) με Μ.Τ. C13H12O5 και Μ.Β. 248 g/mol. Εικόνα 66. Δομή της πιθανής ένωσης για την κορυφή ΙΙ, 7-demethyl siderin acetate. 127

146 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η 7-demethyl siderin acetate ανήκει στην κατηγορία των κουμαρινών (βενζοπυρόνες) και απομονώθηκε αρχικά από τους Fraga et al., 1995, από το είδος Sideritis massoniara var. crassifolia της περιοχής της Μαδέρας, από εκχύλισμα EtOH. Όσον αφορά τις κουμαρίνες, σύμφωνα με το άρθρο των Donovalova et al., 2012, κατάλληλη υποκατάσταση σε συγκεκριμένες θέσεις του σκελετού τους μπορεί να ενεργοποιήσει το συζυγιακό σύστημα διπλών δεσμών τους και να οδηγήσει σε αυξημένη UV-Vis απορρόφηση, παρόλο που η μητρική ένωση 2-oxo-2H-chromene, παρουσιάζει μηδενική ή πολύ αδύναμη απορρόφηση. Συγκεκριμένα, η έντονη απορρόφηση των κουμαρινών ενεργοποιείται με παρουσία ηλεκτρονιοδοτικής ομάδας, με δυνατότητα +Μ μεσομεριακού φαινομένου, στη θέση 7 και ηλεκτρονιοελκτικής ομάδας στη θέση 3. Στην περίπτωση της 7-demethyl siderin acetate, ικανοποιείται η πρώτη προϋπόθεση. Η κορυφή ΙΙ θα μπορούσε πιθανόν να πρόκειται για την ένωση αυτή. ΚΟΡΥΦΗ VI Η κορυφή VI εκλούστηκε στο χρόνο 2,1 min, με σημαντικό σχετικό εμβαδό, χωρίς να εμφανίσει UV-Vis απορρόφηση και της αποδόθηκε το Μ.Β. 346 g/mol. Οι πιθανές ενώσεις που αντιστοιχούν στην κορυφή VI (346 g/mol) έχουν παρουσιαστεί στον Πίνακα 18, στο πλαίσιο του κλάσματος F5. Η συγκεκριμένη κορυφή, ωστόσο, αφορά κάποια διαφορετική ένωση από αυτή της κορυφής XV (F5, F6) - 3,6 min, καθώς υπάρχει μεγάλη διαφορά στο χρόνο έκλουσής τους. Ακόμα, θα αναμενόταν η ένωση της κορυφής VI να έχει μεγαλύτερη πολικότητα από της XV λόγω μικρότερου χρόνου κατακράτησης στη χρωματογραφία UHPLC ανάστροφης φάσης. ΚΟΡΥΦΗ IX Η κορυφή ΙΧ εκλούστηκε αποκλειστικά στο κλάσμα F6, στο χρόνο 2,8 min. Εμφανίστηκε με καθαρό φάσμα μαζών (Εικόνα 67α), (Εικόνα 67β), δεν εμφάνισε UV- Vis απορρόφηση και της αποδόθηκε το Μ.Β. 313 g/mol. Δεν αντιστοιχίστηκε σε κάποια ένωση της βιβλιογραφίας και επομένως δεν ήταν δυνατή η ταυτοποίησή της. Το γεγονός ότι η συγκεκριμένη κορυφή αντιστοιχεί σε Μ.Β. περιττού αριθμού θα μπορούσε ενδεχομένως να σημαίνει πως πρόκειται για κάποιο αλκαλοειδές διτερπένιο, μη αρωματικό και χωρίς συζυγιακό σύστημα διπλών δεσμών. Στο γένος Sideritis δεν έχει απομονωθεί ως τώρα κάποιο αλκαλοειδές διτερπένιο. Αναφορικά με αζωτούχες ενώσεις, 128

147 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία [Zengin et al., 2019] μόνο μία ταυτοποίηση ενός αλκαλοειδούς ινδολίου, της ένωσης indole-4-carbaldehyde (Εικόνα 15), η οποία έχει βασιστεί όμως μόνο σε HPLC-MS/MS ανάλυση, χωρίς απομόνωση της ένωσης. Εικόνα 67α. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής IX στο κλάσμα F6. Εικόνα 67β. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής που αντιστοιχεί σε Μ.Β. 313 g/mol από ανάλυση πυκνού δείγματος (0,8 mg/ml) του κλάσματος F6, αναλυμένο με τη δοκιμαστική μέθοδο U1. ΚΟΡΥΦΗ ΧΧVII Η κορυφή XXVII εκλούστηκε στο χρόνο 12,6 min και της αποδόθηκε το Μ.Β. 446 g/mol, όμοια με την κορυφή ΧΧΙΧ (F5, F6-15,1 min). Σε αντίθεση με την ΧΧΙΧ, η κορυφή XXVII εκλούστηκε σε διαφορετικό χρόνο, δεν έδωσε θραύσματα και δεν 129

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ εμφάνισε UV-Vis απορρόφηση. Συνεπώς, πρόκειται πιθανόν για διαφορετική ένωση από αυτή της κορυφής ΧΧΙΧ. Η μοναδική ένωση που αντιστοιχεί, με βάση τη βιβλιογραφία, στο Μ.Β. 446 g/mol, είναι η 3,7,18-triacetyl-foliol με Μ.Τ. C26H38O6, η οποία απομονώθηκε από το είδος Sideritis huber-morathii από εκχύλισμα Me2CO, από τους Baser et al., 1996 και παρουσιάστηκε στο κλάσμα F5, στο πλαίσιο της κορυφής XXIX. H κορυφή XXVII είναι πιθανό να ταυτοποιείται ως η 3,7,18-triacetyl-foliol και η δομή της παρουσιάζεται παρακάτω (Εικόνα 68). Εικόνα 68. Πιθανή δομή για την κορυφή XXVΙΙ. ΚΛΑΣΜΑ F7 Το κλάσμα F7 ήταν το δεύτερο πλουσιότερο κλάσμα, με 9 καθαρές κορυφές, που εκλούστηκαν σε χρόνους από 1,9 min έως 9,4 min και μαζί με το F6 ουσιαστικά αποτέλεσαν τα δύο κύρια κλάσματα του AB15-17, όσον αφορά τον αριθμό ενώσεων που περιείχαν. Στο F7, εμφανίστηκαν δύο ιδιαίτερα σημαντικές κορυφές ως προς το σχετικό εμβαδό τους, οι Χ (100%) και XIV (51% σε σχέση με τη την κυριότερη), οι οποίες εμφανίζουν ενδιαφέρον αναφορικά με κάποια πιθανή συσχέτιση μεταξύ τους. Πιθανή συσχέτιση συζητείται παρακάτω και μεταξύ των κορυφών V (9%) και VIII (21%), αλλά και για την XVII (20%) με τις προηγούμενες. Παρουσιάζονται, ακόμα, οι κορυφές ΧΧV (5%) και XXVI (16%), ενώ, τέλος, εμφανίστηκαν οι κορυφές XXI (12%) και XXIV (23%). Η κορυφή ΧΧΙ είχε εκλουστεί ξανά στο κλάσμα F4, όπου και παρουσιάστηκε, ενώ η XXIV παρουσιάστηκε στο F3. Πιο αναλυτικά: 130

149 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΟΡΥΦΕΣ V ΚΑΙ VIII Η κορυφή V εκλούστηκε στο χρόνο 1,9 min, στο κλάσμα F7, καθώς και στο κλάσμα F9, ενώ η κορυφή VIII εκλούστηκε στα 2,4 min, αποκλειστικά στο κλάσμα F7, αμέσως μετά την V, χωρίς να μεσολαβήσει άλλη κορυφή. Στην κορυφή V αποδόθηκε το Μ.Β. 362 g/mol και οι πιθανές ενώσεις για αυτή, με Μ.Τ. C22H34O4 και C23H38O, φαίνονται παρακάτω (Εικόνα 69). Δεδομένου ότι η κορυφή εμφανίστηκε ακριβώς στον ίδιο χρόνο στα F7 και F9, με ίδιο χρωματογραφικό προφίλ, εικάζεται ότι αφορά πιθανότατα την ίδια ένωση και στα δύο κλάσματα. Εικόνα 69. Πιθανές δομές για την κορυφή V. 131

150 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Όλες οι πιθανές ενώσεις ανήκουν στα διτερπένια και πιο συγκεκριμένα σε τέσσερις κατηγορίες διτερπενίων: ent-καουρένια, ent-μπεγερένια, εποξυκαουράνια και ent- μανοϋλοξείδια. Παρουσιάζονται στον Πίνακα 22. Πίνακας 22. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή V. Ένωση sidol eubol linearol 1-acetyl-jativatriol Κατηγορία ένωσης ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-μπεγερένιο Είδος Sideritis brevidens, Sideritis rubiflora Sideritis niveotomentosa S.akmanii, S.niveotomentosa, S.brevidens, S.rubiflora, S.gulendamii Sideritis pusilla, Sideritis tragoriganum Διαλύτης εκχύλισης Βιβλιογραφική αναφορά Me 2CO Bondi et al., 2000 Me 2CO Carikci et al., 2012 Me 2CO Bondi et al., 2000 n.f. Piozzi et al., acetyl-jativatriol ent-μπεγερένιο Sideritis serrata Π.αιθέρας Escamilla et al., acetyl-isopusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο Garcia-Granados et al., acetyl-isopusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla n.f. Rodriguez et al., acetyl-pusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο Garcia-Granados et al., acetyl-pusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο Garcia-Granados et al., 1984 isolinearol ent-καουρένιο Sideritis akmanii Me 2CO Bondi et al., 2000 isosidol ent-καουρένιο Sideritis leucantha Π.αιθέρας de Quesada et al., 1972 epoxysiderol εποξυκαουράνιο Sideritis caesarea Me 2CO Halfon et al., acetyl sideroxol εποξυκαουράνιο Sideritis stricta Me 2CO Kilic, acetyl sideroxol εποξυκαουράνιο Sideritis trojana Me 2CO Aslan et al., 2006 ent-1β-hydroxy-7αacetyl-15β,16βepoxykaurane ent-13-epi-12aacetoxymanoyl oxide εποξυκαουράνιο Sideritis stricta Me 2CO Kilic, 2006 ent-μανοϋλοξείδιο Sideritis javalambrensis Εξάνιο de las Heras et al., 1994 Στην κορυφή VIII αποδόθηκε το Μ.Β. 404 g/mol και οι πιθανές ενώσεις για αυτή, όλες με Μ.Τ. C24H36O5, παρουσιάζονται παρακάτω (Εικόνα 70). 132

151 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 70. Πιθανές δομές για την κορυφή VIII. Όλες οι πιθανές ενώσεις ανήκουν στα διτερπένια και πιο συγκεκριμένα στην κατηγορία των ent-μπεγερένιων. Παρουσιάζονται στον Πίνακα 23. Πίνακας 23. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή VIII. Ένωση Κατηγορία ένωσης Είδος Διαλύτης εκχύλισης 1,12-diacetyl-jativatriol ent-μπεγερένιο Sideritis serrata Π.αιθέρας 1,17-diacetyl-jativatriol ent-μπεγερένιο Sideritis serrata Π.αιθέρας 7,17-diacetyl-sideritriol ent-μπεγερένιο Sideritis cystosiphon EtOH 3,14-diacetyl-isopusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο 14,18-diacetyl-isopusillatriol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο Βιβλιογραφική αναφορά Escamilla et al., 1980 Escamilla et al., 1980 Fraga et al., 1990 Garcia - Granados et al., 1984 Garcia - Granados et al.,

152 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα Μ.Β. των κορυφών V (362), VIII (404) έχουν διαφορά 42 g/mol. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να προκύψει αν η VIII ήταν η ακετυλιωμένη εκδοχή της V. Έτσι, εξετάστηκε αυτή η εικασία, με βάση τη χρωματογραφική εικόνα τους, αλλά και με βάση τα φάσματα μαζών και τα θραύσματα που αυτά έδωσαν. Αμφότερες οι κορυφές δεν εμφάνισαν UV-Vis απορρόφηση, ενώ έδωσαν καθαρά φάσματα μαζών (Εικόνα 71), (Εικόνα 72), (Εικόνα 73), με κάποια όμοια θραύσματα. Εικόνα 71. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής V στο κλάσμα F7. Εικόνα 72. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής V στο κλάσμα F9. 134

153 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 73. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής VIII στο κλάσμα F7. Παρακάτω, (Πίνακας 24), (Πίνακας 25) παρουσιάζονται τα θραύσματα που εμφανίστηκαν πειραματικά στο φάσμα μαζών κάθε κορυφής και ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα από το πρόγραμμα, για κάθε μία πιθανή ένωση. Πίνακας 24. Θραύσματα της κορυφής V που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από τα κλάσματα F7, F9 sidol 285, 301, 303 eubol 285, 301, 303, 313 linearol 285, 301, acetyl-jativatriol 285, 301, 303, acetyl-jativatriol 285, 301, acetyl-isopusillatriol 285, 301, acetyl-isopusillatriol 285, 301, 303, acetyl-pusillatriol 285, 289, 301, 303, acetyl-pusillatriol 285, 289, 301, 303, 313 isolinearol 285, 301, 303 isosidol 285, 301, 303 epoxysiderol 285, 289, 301, acetyl-sideroxol 285, 289, 301, acetyl-sideroxol 285, 289, 301, 303 ent-1β-hydroxy-7α-acetyl- 15β,16β-epoxykaurane ent-13-epi-12aacetoxymanoyl oxide 285, 301, , 301, 303 Θραύσματα στο F7 267, 285, 289, 301, 303, 323, 341, 343 Θραύσματα στο F9 255, 267, 285, 303, 313,

154 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 25. Θραύσματα της κορυφής VIII που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από το κλάσμα F7 1,12-diacetyl-jativatriol 285, 305, 327, 345 1,17-diacetyl-jativatriol 285, 305, 327, 345 7,17-diacetyl-sideritriol 285, 327, 345 3,14-diacetyl-isopusillatriol 285, 327, ,18-diacetyl-isopusillatriol 285, 327, 345 Θραύσματα στο F7 267, 285, 305, 327, 345, 367, 381 Το γεγονός ότι εμφανίστηκαν πειραματικά, και για τις δύο κορυφές, κάποια θραύσματα που προβλέφθηκαν και από το πρόγραμμα, αυξάνει την πιθανότητα οι κορυφές αυτές να αφορούν πράγματι τα παραπάνω διτερπένια. Ακολουθεί ενδεικτικά ο τρόπος θραυσμάτωσης για το μόριο της 14-acetylpusillatriol, πιθανής ένωσης για την κορυφή V, (Εικόνα 74) και της 1,17-diacetyljativatriol, πιθανής ένωσης για την κορυφή VIII (Εικόνα 75), σύμφωνα με το πρόγραμμα: Εικόνα 74. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης 14-acetyl-pusillatriol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 303, 313, 301, 289,

155 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το θραύσμα 303 μπορεί να προκύψει είτε από απώλεια της ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O2), είτε από απώλειες ακετυλ-ομάδας (ως C2H3O) και ενός εκ των υδροξυλίων (ως ΟΗ), μαζί με προσθήκη ενός Η +. Το θραύσμα 313 μπορεί να προκύψει από απώλεια της -CH2OH (ως CH3O + ) και του υδροξυλίου (ως OΗ). Το θραύσμα 289 μπορεί να προκύψει από το 313, έπειτα από θραύση του δακτυλίου Α. Το θραύσμα 301 μπορεί να προκύψει από απώλεια της ακετοξυ-ομάδας (ως C2H5O2 + ) και το 285 από το 301, έπειτα από απώλεια της μίας υδροξυλομάδας (ως ΟΗ) και προσθήκη ενός Η +. Εικόνα 75. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης 1,17-diacetyl-jativatriol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 345, 327,

156 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Το θραύσμα 345 μπορεί να προκύψει είτε από απώλεια της μίας ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O2), δίνοντας τα 345a και 345b, είτε από απώλεια της ακετυλ-ομάδας από την ακετοξυ-ομάδα (ως C2H3O) του δακτυλίου Α, μαζί με απώλεια του υδροξυλίου (ως ΟΗ) και προσθήκη ενός Η +, δίνοντας το 345c. Το θραύσμα 327a μπορεί να προκύψει από το 345a, έπειτα από απώλεια της υδροξυλομάδας (ως Η2Ο). Ομοίως, το θραύσμα 327b μπορεί να προκύψει από το 345c, έπειτα από απώλεια της υδροξυλομάδας (ως Η2Ο). Το θραύσμα 285a μπορεί να προκύψει από το 345b, έπειτα από απώλεια και της δεύτερης ακετοξυ-ομάδας (ως C2H4O2). Το θραύσμα 285b μπορεί να προκύψει από το 327b, έπειτα από απώλεια δύο μεθυλομάδων και θραύση του δακτυλίου A (απώλεια C3H6). Τέλος, το 305 μπορεί να προκύψει από το 345b, έπειτα από θραύση του δακτυλίου A (απώλεια C3H4). Όσον αφορά την κορυφή V, η ένωση ent-13-epi-12a-acetoxymanoyl oxide, η μόνη από τις πιθανές με M.T. C23H38O, ήταν και η μοναδική που στο θεωρητικό της φάσμα δεν εμφανίστηκε το θραύσμα με m/z=285, το οποίο ήταν όμως το κύριο της κορυφής V και συνεπώς η πιθανότητα η ένωση αυτή να αντιστοιχεί στην κορυφή V είναι μικρότερη. Συμπερασματικά, λοιπόν, η εικασία ότι η κορυφή V αφορά πιθανόν την μόνοακετυλιωμένη και η κορυφή VIII τη διπλά ακετυλιωμένη εκδοχή του ίδιου κατά τα άλλα ανθρακικού σκελετού, θα μπορούσε να ενισχυθεί και από τα παρακάτω δεδομένα: Και οι δύο κορυφές εμφάνισαν θραύσμα με ιδιαίτερα μεγάλη ένταση στα m/z 285 (παραμονή μίας υδροξυλομάδας, χωρίς καμία ακετοξυ-ομάδα στο μόριο). Με βάση τη μελέτη των Shiao et al., 1989, η προσθήκη ακετοξυ-ομάδας στη θέση μιας υδροξυλομάδας, σε αυτό το είδος ενώσεων, οδηγεί σε μείωση της πολικότητας του μορίου. Συνεπώς, θα αναμενόταν αυξημένος χρόνος κατακράτησης στη UHPLC χρωματογραφία ανάστροφης φάσης, γεγονός που θα μπορούσε να ισχύει και με τη VIII, που εκλούεται μεταγενέστερα της V. Αν πράγματι ισχύει αυτή η εικασία, τότε οι πιθανές ενώσεις για την κορυφή V, μπορούν να μειωθούν σε όσες έχουν όμοιο ανθρακικό σκελετό, που φέρει υδροξυλομάδα όπου οι πέντε πιθανές ενώσεις της VIII (Πίνακας 23) φέρουν ακετοξυ-ομάδα. Συνεπώς οι πιθανότερες ενώσεις της V, θα μπορούσαν να θεωρηθούν οι εξής: 1-acetyl-jativatriol, 12-acetyl-jativatriol, 3-acetyl-isopusillatriol, 14-acetylisopusillatriol, 7-acetyl-pusillatriol, 14-acetyl-pusillatriol, isolinearol και isosidol. Σημειώνεται ότι οι 7-acetyl-pusillatriol και 14-acetyl-pusillatriol εμφάνισαν στο υπολογιστικά προβλεπόμενο φάσμα μαζών τους τα περισσότερα κοινά θραύσματα (285, 138

157 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ 289, 301, 303, 313) με αυτά που έδωσε πειραματικά η κορυφή V, όπως έχουν παρουσιαστεί παραπάνω. ΚΟΡΥΦΕΣ Χ ΚΑΙ XIV Η κορυφή X εκλούστηκε στο χρόνο 2,9 min, στο κλάσμα F7, καθώς και στο κλάσμα F8. Αποτελεί την κύρια κορυφή του F7 και τη δεύτερη κυριότερη του F8. Η κορυφή ΧΙV εκλούστηκε ακριβώς μετά τη X, σε χρόνο 3,3 min, τόσο στο F7, όσο και στο F8 και αποτελεί την κύρια κορυφή του F8, καθώς φαίνεται να πρωτοεμφανίστηκε στο F7 και να κορυφώθηκε στο F8. Στην κορυφή X αποδόθηκε το Μ.Β. 304 g/mol και οι πιθανές ενώσεις για αυτή, όλες με Μ.Τ. C22H34O3, φαίνονται παρακάτω (Εικόνα 76α), (Εικόνα 76β). Εικόνα 76α. Πιθανές δομές για την κορυφή Χ 139

158 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 76β. Πιθανές δομές για την κορυφή Χ. Όλες οι πιθανές ενώσεις ανήκουν στα διτερπένια και πιο συγκεκριμένα σε τέσσερις κατηγορίες διτερπενίων: ent-καουρένια, ent-μπεγερένια, ent-λαβδένια και entτραχιλομπάνια. Παρουσιάζονται στον Πίνακα

159 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 26. Πιθανές ενώσεις για την κορυφή X. Ένωση sideridiol ferrediol Κατηγορία ένωσης ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο Είδος Sideritis niveotomentosa Sideritis ferrensis Sideritis chamaedryfolia Διαλύτης εκχύλισης Me 2CO EtOH benuol ent-μπεγερένιο Sideritis serrata Π.αιθέρας tobarrol ent-μπεγερένιο Sideritis serrata Π.αιθέρας flavovirol ent-μπεγερένιο Sideritis pusilla Εξάνιο candicandiol 7-epicandicandiol candidiol canadiol sidendrodiol sicanadiol ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο Sideritis candicans var. eriocephala S.niveotomentos a, S.brevidens, S.rubriflora, S.gulendamii Sideritis candicans var. eriocephala Sideritis canariensis var. pannosa Sideritis arborescens n.f. EtOH Me 2CO n.f. EtOH n.f. ent-καουρένιο Sideritis athoa Me 2CO ent-καουρένιο Sideritis athoa Εξάνιο ent-καουρένιο ent-καουρένιο ent-λαβδένιο ent-λαβδένιο Sideritis dendrochahorra Sideritis canariensis var. pannosa Sideritis canariensis var. pannosa Sideritis canariensis var. pannosa EtOH EtOH EtOH EtOH 6-deoxyandalusal ent-λαβδένιο Sideritis varoi Εξάνιο trachinodiol ent-3β,7αdihydroxykaur-16-ene ent-3a,18-dihydroxykaur-16-ene ent-2-oxo-13-epimanoyloxide ent-2-oxo-13-epimanoyloxide entτραχιλομπάνιο Sideritis canariensis n.f. Βιβλιογραφική αναφορά ent-11β,18-dihydroxykaur-15-ene Carikci et al., 2012 Fraga et al., 1991b Garcia-Alvarez M. et al., 1979 de Quesada et al., 1975 de Quesada et al., 1975 Garcia- Granados et al., 1984 Breton et al., 1969 Bondi et al., 2000 Rodriguez et al., 1970 Fraga et al., 1991a ent-11β,18-dihydroxykaur-16-ene Garcia- Granados et al., 1981 Halfon et al., 2011 Topcu et al., 1999 Fraga et al., 1987 Fraga et al., 1991a Fraga et al., 1991a Fraga et al., 1991a Algarra et al., 1983 Gonzalez et al.,

160 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην κορυφή ΧΙV αποδόθηκε το Μ.Β. 346 g/mol. Αφορά όμως πιθανότατα διαφορετική ένωση από αυτές που εκλούστηκαν στα κλάσματα F5 και F6, με το ίδιο Μ.Β. (κορυφές VI και XV), λόγω διαφορετικού χρόνου έκλουσης. Οι πιθανές ενώσεις για αυτό το Μ.Β. έχουν απεικονιστεί και παρουσιαστεί στο πλαίσιο της κορυφής XV του κλάσματος F5 (Εικόνα 55), (Πίνακας 18). Τα Μ.Β. των κορυφών Χ (304), ΧΙΧ (346) έχουν διαφορά 42 g/mol. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να προκύψει αν η ΧΙΧ ήταν η ακετυλιωμένη εκδοχή της Χ. Έτσι, εξετάστηκε αυτή η εικασία, με βάση τη χρωματογραφική εικόνα τους, αλλά και με βάση τα φάσματα μαζών και τα θραύσματα που αυτά έδωσαν. Αμφότερες οι κορυφές δεν εμφάνισαν UV-Vis απορρόφηση, ενώ έδωσαν καθαρά φάσματα μαζών (Εικόνα 77), (Εικόνα 78), (Εικόνα 79), (Εικόνα 80) με κάποια όμοια θραύσματα. Εικόνα 77. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής X στο κλάσμα F7. Εικόνα 78. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής X στο κλάσμα F8. 142

161 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 79. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XIV στο κλάσμα F7. Εικόνα 80. Φάσμα μαζών θετικού ιονισμού της κορυφής XIV στο κλάσμα F8. Στους παρακάτω πίνακες, (Πίνακας 27), (Πίνακας 28) παρουσιάζονται τα θραύσματα που εμφανίστηκαν πειραματικά στο φάσμα μαζών κάθε κορυφής (στη δεξιά μεριά) και αυτά που προβλέφθηκαν από το πρόγραμμα για κάθε μία πιθανή ένωση (στα αριστερά). 143

162 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 27. Θραύσματα της κορυφής Χ που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από τα κλάσματα F7, F8 sideridiol 269, 287, 231, 123, 199 tobarrol 269, 287, 123, 229 flavovirol 269, 287, 123, 213, 231 candicandiol 269, 287, 123, 199, 213, epicandicandiol 269, 287, 123, 199, 213, 231 candidiol 269, 287, 213, 229, 231 ferrediol 269, 287, 187, 199, 213, 229, 231 ent-11β,18-dihydroxy-kaur- 15-ene 269, 287, 213, 231 benuol 269, 287, 123, 229 canadiol 269, 287, 187, 229, 231 ent-11β,18-dihydroxy-kaur- 16-ene 269, 287, 213, 231 ent-3β,7α-dihydroxykaur- 16-ene 269, 287, 123, 213, 231 ent-3α,18-dihydroxy-kaur- 16-ene 269, 287, 229 sidendrodiol 269, 287, 199, 213, 229, 231 sicanadiol 269, 287, 123, 229, 231 ent-2-oxo-13-epimanoyloxide 287, 231 ent-3-oxo-13-epimanoyloxide 287, deoxyandalusal 269, 287, 231 trachinodiol 269, 287, 123, 199, 213, 231 Θραύσματα στο F7 187, 199, 213, 229, 231, 269, 287, 327 Θραύσματα στο F8 123, 199, 213, 229, 269, 287 Στην κορυφή X, τόσο στο κλάσμα F7, όσο και στο F8 εμφανίστηκαν κατά κύριο λόγο όμοια θραύσματα. Συγκεκριμένα, και στα δύο κλάσματα εμφανίστηκαν τα 199, 213, 229, 269, 287. Τα κύρια ήταν τα 269,

163 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Πίνακας 28. Θραύσματα της κορυφής ΧIV που ταυτίστηκαν με υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα κάθε πιθανής ένωσης. Ένωση siderol 269, 287 Θραύσματα κοινά με το θεωρητικά προβλεπόμενο φάσμα κάθε ένωσης από τα κλάσματα F7, F8 sideripol 269, 287, 301 tartessol 269, 287 epoxyisocandol A acetate 269, acetyl-epicandicandiol 269, epicandicandiol 18-monoacetate 269, 287, 301 trachinodiol 7β-monoacetate 269, 287 Θραύσματα στο F7 187, 269, 287, 327, 301 Θραύσματα στο F8 259, 269, 287, 301, 338 Στην κορυφή XΙV, τόσο στο κλάσμα F7, όσο και στο F8 εμφανίστηκαν όμοια κύρια θραύσματα και συγκεκριμένα τα 269 και 287. Το γεγονός ότι εμφανίστηκαν πειραματικά, και για τις δύο κορυφές, κάποια θραύσματα που προβλέφθηκαν και από το πρόγραμμα, αυξάνει την πιθανότητα οι κορυφές αυτές να αφορούν πράγματι τα παραπάνω διτερπένια. Ακολουθεί ενδεικτικά ο τρόπος θραυσμάτωσης για το μόριο της sideridiol, πιθανής ένωσης για την κορυφή Χ (Εικόνα 81) και της sideripol, πιθανής ένωσης για την κορυφή XIV (Εικόνα 82), σύμφωνα με το πρόγραμμα: 145

164 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 81. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης sideridiol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 287, 269, 231, 199, 123 της κορυφής Χ. Το θραύσμα 287 μπορεί να προκύψει από απώλεια μίας εκ των δύο υδροξυλομάδων (ως ΟΗ). Το θραύσμα 269 από απώλεια και των δύο υδροξυλομάδων (ως ΟΗ και Η2Ο), ενώ τα υπόλοιπα με περεταίρω διασπάσεις του ανθρακικού σκελετού του

165 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Εικόνα 82. Υπολογιστικά προβλεπόμενα θραύσματα της ένωσης sideripol, που πιθανόν αντιστοιχούν στα πειραματικά ευρισκόμενα m/z 301, 287, 269 της κορυφής XIV. Το θραύσμα 301 μπορεί να προκύψει έπειτα από απώλεια της υδροξυλομάδας και θραύση του δακτυλίου Β της sideripol (συνολική απώλεια C2ΟH5). Το θραύσμα 287 μπορεί να προκύψει από απώλεια της ακετοξυ-ομάδας (ως C2H3O2), ενώ το θραύσμα 269 μπορεί να προκύψει από το 287, έπειτα από απώλεια της υδροξυλομάδας (ως Η2Ο). Όσον αφορά στην κορυφή Χ, οι ενώσεις ent-2-oxo-epi-manoyloxide και ent-3-oxoepi-manoyloxide ήταν οι μοναδικές από τις πιθανές ενώσεις, που στο υπολογιστικά προβλεπόμενο φάσμα τους δεν εμφανίστηκε το θραύσμα με m/z=269, το οποίο ήταν όμως ένα από τα δύο κύρια θραύσματα της κορυφής και συνεπώς, η πιθανότητα οι ενώσεις αυτές να αντιστοιχούν στην κορυφή Χ είναι μικρότερη. Συμπερασματικά, λοιπόν, η εικασία ότι η κορυφή Χ αφορά πιθανόν την υδροξυκαι η κορυφή ΧΙV την ακετυλιωμένη εκδοχή του ίδιου κατά τα άλλα ανθρακικού σκελετού, θα μπορούσε να ενισχυθεί και από τα παρακάτω δεδομένα: 147