ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ-ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ- ΦΥΤΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΟΞΙΚΟΥ ΑΙΘΥΛΕΣΤΕΡΑ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ Sideritis syriaca ( Μαλοτήρας ). ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΡΜΑΤΑ ΜΑΡΙΑΣ Επιβλέπων καθηγητής: Ευγένιος Κοκκάλου Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακογνωσίας ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 26

2 ΑΡΜΑΤΑ ΜΑΡΙΑ ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΤΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΟΞΙΚΟΥ ΑΙΘΥΛΕΣΤΕΡΑ ΤΟΥ ΦΥΤΟΥ Sideritis syriaca ( Μαλοτήρας ). ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Στο Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας-Φαρμακολογίας. Εξεταστική επιτροπή: Κοκκάλου Ευγένιος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Επιβλέπων Νιώπας Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Εξεταστής Ρούσης Βασίλειος, Καθηγητής, Εξεταστής

3 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Ευχαριστώ θερμά τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Κοκκάλου Ευγένιο για την υπόδειξη του θέματος της διατριβής μου, για την επιμέλεια και καθοδήγηση κατά τη διάρκεια της πραγματοποίησης της καθώς και για το άριστο κλίμα συνεργασίας που μου παρείχε. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Νιώπα Ιωάννη, Αναπληρωτή Καθηγητή καθώς και τον κ. Ρούση Βασίλειο, Καθηγητή, οι οποίοι συμμετέχουν στην εξεταστική επιτροπή και βοήθησαν με τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την Δρ. Χρυσή Γαβριέλη για την πολύτιμη βοήθειά της, τη συνεχή παρακολούθηση του πειράματός μου και την επιμέλεια του κειμένου. Ευχαριστώ την υποψήφια διδάκτορα Αικατερίνη Τερμετζή για το άριστο κλίμα συνεργασίας και τη σημαντική βοήθεια που μου παρείχε. Επιπλέον, εκφράζω τις ευχαριστίες μου στον Δρ. Παναγιώτη Κεφάλα, Ερευνητή του Μ.Α.Ι.Χ. και την Δρ. Μαρία Ζερβού, Ερευνήτρια του Ε.Ι.Ε., για τα φάσματα LC-DAD-MS (ESI+) και πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού.

4 Στον σύζυγο μου, Σωτήρη

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ.. 1 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1 ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 3 2 ΒΟΤΑΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS 4 3 ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ Γεωγραφική εξάπλωση του γένους Sideritis Αυτοφυή είδη του γένους Sideritis στην Ελλάδα 7 4 ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS Αιθέρια έλαια Τερπένια Διτερπένια Τριτερπένια Φαινόλες Φαινολικά οξέα Βιοσύνθεση φαινολικών οξέων Κουμαρίνες και Λιγνάνες Φλαβονοειδή Βιοσύνθεση φλαβονοειδών 22

6 5 ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS Αντιφλεγμονώδης δράση Αναλγητική δράση Αντιμικροβιακή δράση Αντιοξειδωτική δράση Άλλες δράσεις 27 6 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΡΤΙΒΗΣ.. 28 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) Χρωματογραφία στήλης ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Φασματομετρία υπερώδους ορατού Φασματομετρία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού Τεχνική [LC-DAD-MS (ESI+)] Μέτρηση αντιοξειδωτικής ικανότητας 33 ΚΥΡΙΩΣ ΕΡΕΥΝΑ 1 ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΗΣ ΔΡΟΓΗΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΚΑΤΑΝΟΜΕΣ... 34

7 3.1 Συμπεράσματα ΦΥΤΟΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΤΕΡΕΟΥ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΟΣ ΤΟΥ ΟΞΙΚΟΥ ΑΙΘΥΛΕΣΤΕΡΑ. 4 5 ΈΛΕΓΧΟΣ ΑΝΤΙΟΞΕΙΔΩΤΙΚΗΣ ΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΣΤΕΡΕΩΝ ΥΠΟΛΕΙΜΜΑΤΩΝ Έλεγχος με τη μέθοδο DPPH Έλεγχος με τη μέθοδο της χημειοφωταύγειας Σύγκριση των μεθόδων DPPH χημειοφωταύγειας ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΥΣΙΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΙΖΗΜΑ ΤΟΥ ΟΞΙΚΟΥ ΑΙΘΥΛΕΣΤΕΡΑ Απομόνωση της ουσίας Απομόνωση της ουσίας Απομόνωση της ουσίας Απομόνωση των ουσιών 4 και Απομόνωση της ουσίας Στήλη πολυαμιδίου Β Απομόνωση των ουσιών 6γ και ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1 ΟΥΣΙΑ ΟΥΣΙΑ ΟΥΣΙΑ3.. 84

8 4 ΟΥΣΙΑ ΟΥΣΙΑ ΟΥΣΙΑ Ουσίες 6α, 6β, 6γ 13 7 ΟΥΣΙΕΣ 6Γ ΚΑΙ Ουσία 6γ Ουσια ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 115

9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΙΣΤΟΡΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ. Το φυτό του Σιδερίτη στην Ελλάδα είναι γνωστό από την αρχαιότητα και αναφέρεται από το Θεόφραστο ( π.χ.). Η πρώτη περιγραφή του δόθηκε από τον Διοσκουρίδη (1 µ.χ. αιώνα) ο οποίος το χρησιμοποιούσε ως θεραπευτικό των πληγών. Στο έργο του De Materia Medica αναφέρονται τρία είδη: «Περί Σιδηρίτιδος, Περί ετέρας Σιδηρίτιδος (Andere Sideritis) και Περί ετέρας Σιδηρίτιδος (Weitere Sideritis)» [1]. Αργότερα σε μια μετάφραση του έργου του Διοσκουρίδη, τα είδη αυτά αντιστοιχήθηκαν στο Stachys recte order heracleae (Lamiaceae), στο Poterium polyganum (Rosaceae) και στο Scrophularia lucida order chrysanthemifolia (Scrophulariacea) [2]. Η πρώτη ολοκληρωμένη περιγραφή των ειδών του Σιδερίτη έγινε από το Λιναίο ο οποίος θεωρείται ο πατέρας της ταξινόμησης. Ο Λιναίος έδωσε ακριβή χαρακτηριστικά των ειδών και τα διαχώρισε σε δύο κατηγορίες: τα αβράκτια και τα βράκτια [3]. Από βιβλιογραφικές πηγές φαίνεται ότι διατηρείται η κατά Λιναίου κατάταξη [4], μέχρι οι Webb & Berthelot αναιρέσουν τα προηγούμενα υποστηρίζοντας ότι τα είδη του Σιδερίτη ανήκαν στο γένος Leucophae [5], όπως για παράδειγμα το είδος S. candicans αντιστοιχούσε στο Leucophae argosphacelus. Ο Bentham κατέταξε τα είδη στο γένος Marrubiastrum [6], ενώ αργότερα ο Bolle επανέφερε την ταξινόμηση που είχε προτείνει ο Λιναίος. Σήμερα, όλα τα είδη ανήκουν στο γένος Sideritis και η ταξινόμησή τους γίνεται με βάση τη φυτοχημική τους ανάλυση και όχι τόσο με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά τους.

10 2. ΒΟΤΑΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS. Τα φυτά του γένους Sideritis ανήκουν στην οικογένεια των Χειλανθών (Lamiaceae ) και είναι δικοτυλήδονα. Έχουν ποώδη ανάπτυξη, μονοετή ή πολυετή κύκλο ζωής και ο βλαστός τους είναι απλός ή διακλαδισμένος, αποξυλωμένος στη βάση του, καλυπτόμενος με χνούδι (εικ.1). Εικ. 1. Φυτά του γένους Sideritis Τα φύλλα, σε σχήμα λόγχης, είναι οδοντωτά ή ακέραια και τα άνθη είναι ερμαφρόδιτα, λευκά ή κίτρινα, σε ταξιανθία στάχεος. Επιπλέον, ο κάλυκας αποτελείται από 1 νευρώσεις και 5 οδόντες διατεταγμένους σε δύο χείλη και έχει σχήμα κώνου. Η στεφάνη είναι κίτρινη, κιτρινόλευκη, λευκή ή ροδόχροη με δύο χείλη, από τα οποία το επάνω αποτελείται από δύο συμφυή πέταλα και είναι δισχιδές και το κάτω καταλήγει σε τρεις λοβούς με το μεσαίο μεγαλύτερο. Έχει τέσσερις στήμονες, οι δύο μπροστινοί επιμηκέστεροι, το στύλο που καταλήγει σε δύο άνισα στίγματα και δίχωρη ωοθήκη που με ψευδή διαφράγματα γίνεται τετράχωρη. Ο καρπός είναι τέσσερα κάρυα που το καθένα περικλείει από ένα σπέρμα.

11 3. ΤΑΞΙΝΟΜΙΚΑ ΔΕΔΟΜΕΝΑ 3.1 Γεωγραφική εξάπλωση του γένους Sideritis. Το φυτό Sideritis ανήκει στα αρωματικά φυτά, λόγω τις περιεκτικότητας τους σε αιθέρια έλαια. Η κύρια ζώνη ανάπτυξης των ειδών του είναι οι παραμεσόγειες περιοχές και κυρίως η Ισπανία, οι Κανάριοι νήσοι, η Ιταλία, η Ελλάδα, η Γαλλία, τα παράλια της Βορείου Αφρικής ( Αλγερία, Μαρόκο και Αίγυπτο ), η Κύπρος και η Τουρκία [7] ( εικ. 2 ). Εικ.2. Σκιαγραφημένη περιοχή της Μεσογείου όπου απαντάται το γένος Sideritis. Από τις παραπάνω περιοχές ιδιαίτερο ενδιαφέρων παρουσιάζουν οι Κανάριοι Νήσοι και η Ισπανία, όπου λόγω των εδαφοκλιματικών συνθηκών, ευδοκιμούν πολλά είδη και μάλιστα αρκετά από αυτά είναι ενδημικά. Η βιβλιογραφία αναφέρει ότι τα είδη που υπάρχουν στα Κανάρια Νησιά διακρίνονται σε τρία υποείδη, με βάση τα

12 φυτοχημικά τους στοιχεία, την ύπαρξη δηλαδή τερπενίων και φλαβονοειδών [8]. Στην Ισπανία αναφέρονται περίπου 45 διαφορετικά είδη τα περισσότερα ενδημικά που βρίσκονται κυρίως στην Ιβηρική χερσόνησο. Από αυτά χρησιμοποιούνται ευρέως στη λαϊκή θεραπευτική με μορφή τσαγιού, ιδιαίτερα στην Ανδαλουσία όπου η χρήση του θεωρείται πανάκεια για όλες τις ασθένειες [9]. Στην Τουρκία αναφέρεται ένας μεγάλος αριθμός ενδημικών ειδών, περίπου 33, από αυτά όχι λιγότερα από 2 θεωρούνται σπάνια και είναι καταγεγραμμένα στην κατηγορία IUCN [1, 11]. Ενώ στην Ισπανία και στην Τουρκία τα είδη του Sideritis είναι άγρια, στην Ελλάδα περιλαμβάνονται τόσο τα άγρια όσο και τα καλλιεργούμενα είδη. Περίπου 183 taxa καλλιεργούμενων και 74 taxa άγριας συγκομιδής παράγονται ετησίως στη χώρα μας [12]. Επίσης, υπολογίζονται 17 ενδημικά είδη με εξάπλωση από τη Μακεδονία ως την Κρήτη και τα Ιόνια νησιά, σε ξερά, πετρώδη εδάφη, γενικά υποβαθμισμένα, σε υψόμετρο από 5 ως 2 μέτρα [13]. Η χρήση του Sideritis και εδώ αναφέρεται ως αφέψημα στη λαϊκή θεραπευτική και κυρίως στις ορεινές περιοχές. Τα διάφορα είδη παίρνουν το όνομά τους από τη περιοχή που φύονται, όπως τσάι βλάχικο, τσάι του Μαλεβού ή τσάι του Ταΰγετου, τσάι της Κρήτης, της Εύβοιας, του Ολύμπου, του Παρνασσού κ.λ.π.. Από τις υπόλοιπες περιοχές της Μεσογείου ενδιαφέρον παρουσιάζει η Κύπρος, όπου το είδος Sideritis perfoliata αναφέρεται ως ενδημικό και η Βαλκανική χερσόνησος όπου γίνεται και προσπάθεια καλλιέργειας κάποιων ειδών με οικονομικό ενδιαφέρον [14]. Τέλος, η γεωγραφική εξάπλωση του Sideritis περιλαμβάνει τη Μικρά Ασία, τη Συρία, την Ελβετία καθώς επίσης και το Μεξικό, το Λίβανο και το Περού.

13 3.2 Aυτοφυή είδη του γένους Sideritis στην Ελλάδα. Έγινε λόγος στον πρόλογο για τα είδη του Sideritis που είναι ενδημικά της Ελλάδας και αξίζει να αναφερθούμε έστω και επιγραμματικά σε αυτά. Από τα 17 λοιπόν που αυτοφύονται τα περισσότερο γνωστά είναι τα παρακάτω: Sideritis athoa: Η κοινή του ονομασία είναι βλάχικο ή αλλιώς μπεττόνικα, όπως το ονομάζουν στο Άγιο Όρος. Είναι πολυετής πόα με ύψος που φτάνει τα 4 εκ., και βλαστό όρθιο απλό ή διακλαδισμένο, ξυλώδη στη βάση του που καλύπτεται με αδενώδεις τρίχες. Απαντάται κυρίως στον Άθω, στην Πίνδο και στη Σαμοθράκη. Sideritis clandestine: Λέγεται και τσάι του Μαλεβού ή τσάι του Ταϋγέτου λόγω των περιοχών που αυτοφύεται, το Μαλεβό και τον Ταΰγετο Κυλλήνης. Όπως και στο προηγούμενο, ο βλαστός του φτάνει ως τα 4 εκ., και είναι απλός ή διακλαδισμένος. Sideritis syriaca: Αναφέρεται ως τσάι της Κρήτης, μαλοτήρας ή καλοκοιμηθιά και είναι επίσης πόα ύψους 5 εκ.. Ο βλαστός του είναι όρθιος, απλός, ισχυρός με πυκνό άσπρο χνούδι. Σε αρκετά μεγάλο ύψος, μέτρων, αυτοφύεται στα Λευκά Όρη και το Ψηλορείτη. Sideritis euboea: Κοινώς λέγεται και τσάι της Εύβοιας ή τσάι από το Δέλφι και είναι πόα ύψους 3-5εκ., με πυκνό λευκό χνούδι σε όλο το φυτό. Διακριτικά του είναι ο βλαστός με ξυλώδη βάση, ισχυρός, απλός ή διακλαδισμένος. Στην Εύβοια το συναντάμε σε υψόμετρο μέτρων. Sideritis scardica: Ονομάζεται και τσάι του Ολύμπου και είναι πόα με βλαστό απλό ή διακλαδισμένο, τετράγωνο, λίγο ξυλώδη στη βάση. Στον Όλυμπο, στον Κίσσαβο και στο Πήλιο, όπου φύεται, βρίσκεται σε βραχώδη μέρη ύψους πάνω από 1. μέτρα. Sideritis raeseri: Είναι το κοινό τσάι του Παρνασσού ή του Βελουχίου. Πολυετής πόα, ύψους ως και τα 4 εκ., με βλαστό απλό, σπάνια διακλαδισμένο, λεπτό, χνοώδη, λίγο ξυλώδη στη βάση. Τα κατώτερα φύλλα

14 είναι έμισχα ενώ τα ανώτερα άμισχα, λογχοειδή, πριονωτά με άσπρο χνούδι και άνθη έντονα κίτρινα σε ακραίες ταξιανθίες. Απαντάται κυρίως στις ορεινές περιοχές του νομού Μαγνησίας, σε μέρη ασβεστούχα, πετρώδη, μέτριας γονιμότητας, ξερικά. Ως κοινό χαρακτηριστικό είναι ότι όλα τα είδη αναπτύσσονται ως πόες και σε υψόμετρο μεγαλύτερο των 1. μέτρων. Όπως και τα περισσότερα είδη του γένους sideritis, επιβιώνουν σε απόκρημνες βραχώδεις περιοχές και είναι ανθεκτικά στην ξηρασία και στις χαμηλές θερμοκρασίες. 4. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS. Τα τελευταία 2 χρόνια γίνεται προσπάθεια για απομόνωση και ταυτοποίηση των συστατικών από διάφορα είδη του σιδερίτη και εντοπισμό των κυριoτέρων ουσιών που παρουσιάζουν βοτανικό και φαρμακολογικό ενδιαφέρον. Τα συστατικά αυτά μελετώνται ως προς τη δομή και τη δράση αλλά ταυτόχρονα αποτελούν ένα καλό χημειοταξινομικό δείκτη για την αναγνώριση και ταξινόμηση των ειδών. Ειδικά για τα είδη του γένους Sideritis η ταξινόμηση είναι δύσκολη λόγω της ισχυρής τάσης που έχουν για υβριδοποίηση [15]. Είναι σημαντικό να αναγνωρίζονται τα μητρικά φυτά από τα οποία προέρχονται τα υβρίδια, αλλά μόνο με τα μορφολογικά χαρακτηριστικά δεν είναι εφικτό. Για το λόγο αυτό με τη βιοχημική ανάλυση ξεκαθαρίζεται η σύσταση των φυτών και βάση αυτής γίνεται η ταξινόμηση. Στη σύσταση τους απαντώνται ενώσεις που ανήκουν στα πτητικά μονοτερπένια, τα οποία συναποτελούν με τα σεσκιτερπένια το αιθέριο έλαιο των φυτών, διτερπένια, τριτερπένια, στερόλες, κουμαρίνες, λιγνάνες, φλαβονοειδή και άλλες κατηγορίες ίσως μικρότερης σημασίας και περιεκτικότητας. 4.1 Αιθέρια έλαια. Στα συστατικά των αιθερίων ελαίων αποδίδονται ποικίλες φαρμακολογικές δράσεις, οι οποίες ήταν αντιληπτές από τα παλαιότερα χρόνια από τη λαϊκή θεραπευτική. Το «τσάι του βουνού» χρησιμοποιούνταν για την αναλγητική του

15 δράση, την αντιφλεγμονώδη, τη δράση ενάντια στο στρες, την αντισπασμωδική, τη διουρητική και γενικότερα ήταν το αφέψημα στις κρύες περιόδους λόγω της αντιμετώπισης των κρυωμάτων. Οι ενώσεις αυτές προσδιορίστηκαν ποσοτικά και ποιοτικά σε ορισμένα από τα είδη και μέσα από τις έρευνες προέκυψε ότι στην κατηγορία των αιθερίων ελαίων συμπεριλαμβάνονται τα μονοτερπένια, τα οξυγονούχα μονοτερπένια, τα σεσκιτερπένια, τα οξυγονούχα σεσκιτερπένια και άλλες πτητικές ενώσεις. α. Μονοτερπενια: Οι δομές των μονοτερπενίων έχουν στο σκελετό τους 1 άτομα άνθρακα αποτελούμενα από δύο μονάδες «ισοπρενίου» ενωμένες σε διάταξη κεφαλή ουρά. Παρόλο τη μικρή αλυσίδα τους, απαντώνται σε πολλές μορφές στα είδη του γένους Sideritis, άκυκλες ( π.χ. οκιμένιο στο είδος S.raeseri ) [16], μονοκυκλικές ( π.χ. π-κυμένιο στο είδος S.hirsuta ) [17], δικυκλικές ( 1,8-κινεόλη στο είδος S.leucantha ) [18] ή τρικυκλικές ( π.χ. τα πινένια στο είδος S.granatensis ) [19] χωρίς οξυγόνο στο μόριό τους ( π.χ. θουγένιο στο είδος S.scardica ) [2] ή οξυγονούχα ( π.χ. λιναλοόλη στο είδος S.angustifolia ) [21] ( εικ.3 ). O οκιμένιο π-κυμένιο 1,8-κινεόλη (-)-α- πινένιο HO θουγένιο λιναλοόλη Εικ.3. Διάφορες δομές μονοτερπενίων

16 Επίσης, τα οξυγονούχα μονοτερπένια των ειδών προέρχονται από πολλές χημικές ομάδες όπως είναι οι αλκοόλες ( π.χ. λιναλοόλη ), αλδεϋδες ( π.χ. μυρτενάλη ), κετόνες ( π.χ. κρυπτόνη ), εστέρες ( π.χ. οξικός βορνυλεστέρας ), αιθέρες ( π.χ. κινεόλη ). β. Σεσκιτερπένια: Τα σεσκιτερπένια αποτελούνται από 15 άτομα άνθρακα. Στα είδη του γένους Sideritis υπάρχουν σεσκιτερπενικές ενώσεις ως απλοί υδρογονάνθρακες ( π.χ.βισαβολένιο ), αλκοόλες ( π.χ. καδινόλη ) και κετόνες ( π.χ. δαμασκενόνη ) που είναι τα περισσότερο κοινά, καθώς και αυτά που χαρακτηρίζονται από την εμφάνιση γ-λακτονικού δακτυλίου και κατατάσσονται στις λακτόνες. Τα περισσότερα σεσκιτερπένια είναι κυρίως παράγωγα του γερμακρενίου, του γουαϊενίου, του ευδεσμανίου, του αρωμανδρενίου και του οξειδίου του καρυοφυλλενίου ( εικ.4 ) O Αρωμαδιένιο Γερμακρένιο Γουαϊένιο O Ευδεσμάνιο Οξείδιο του καρυοφυλλένιου Εικ.4. Βασικές δομές σεσκιτερπενίων

17 Στις αναλύσεις σε περιεκτικότητα πτητικών ενώσεων προσδιορίστηκαν πολλές ουσίες, οι οποίες δεν περιέχονται πάντα σε όλα τα είδη και με τις ίδιες αναλογίες. Σε έρευνα ενδημικών ειδών της Τουρκίας των S.phlomoides, S. vulcanica, S.caesarea, S. vuralii διαπιστώθηκε ότι οι κύριες ενώσεις σε κάθε ένα από αυτά είναι διαφορετικές. Στο είδος S. vuralii περιέχεται σε μεγαλύτερο ποσοστό το β- pinene, η 1,8-cineol και το α- pinene, ενώ στο είδος S.caesarea το β-caryophyllene υπερέχει των άλλων πτητικών ενώσεων. Στα S.phlomoides και S. vulcanica η κύρια ουσία είναι επίσης το β-caryophyllene αλλά σε αρκετά μεγαλύτερη ποσότητα από το προηγούμενο, ενώ στο S.phlomoides απαντάται σε σημαντική ποσότητα και η α- bisabolol [22]. Στο είδος S.mugronensis απαντώνται τόσο σεσκιτερπενικές ενώσεις ( candinols, δ-cadinene, bisabolol, β-caryophyllene ) όσο και τα μονοτερπένια ( sabinene, 1,8-cineol ) σε υψηλότερα επίπεδα από τις υπόλοιπες ουσίες [23]. Σε άλλες παρόμοιες έρευνες σε διάφορα είδη προκύπτουν ανάλογα συμπεράσματα με τα παραπάνω, ότι η σύσταση των αιθερίων ελαίων διαφοροποιείται αρκετά σε ποσότητα και ποικιλότητα χημικών δομών [24-26]. 4.2 Τερπένια. Η κατηγορία των τερπενίων μελετήθηκε σε μεγαλύτερο βαθμό από τις υπόλοιπες στα είδη του Sideritis και για το λόγω αυτό υπάρχουν αρκετά στοιχεία από τη βιβλιογραφία για τις δομές και την περιεκτικότητα τους στα εκχυλίσματά των φυτών. Από τη βιβλιογραφία προκύπτει το συμπέρασμα ότι στα υπέργεια τμήματα των φυτών συντίθενται όλες σχεδόν οι δομές των τερπενίων, από τα μονοτερπένια και τα σεσκιτερπένια τα οποία αναφέρθηκαν στα αιθέρια έλαια, τα άκυκλα διτερπένια, τα λαβδάνια, τα καουρένια, τα τετρακυκλικά, ως τα πεντακυκλικά διτερπένια και τα τριτερπένια Διτερπένια. Τα διτερπένια αποτελούν μια μεγάλη ομάδα ενώσεων που απαντούν στα εκχυλίσματα των ειδών του γένους Sideritis. Τα περισσότερα είδη ερευνήθηκαν για

18 την απομόνωση των διτερπενίων τους και από τις αναφορές των ερευνών αυτών διακρίνεται ότι στην πλειοψηφία τους οι ενώσεις της συγκεκριμένης κατηγορίας είναι παράγωγα πέντε βασικών δομών : (1) του ατισενίου, (2) του μανοϋλοξειδίου, (3) του καουρενίου, (4) του λαβδανίου και (5) του μπεϋερενίου (εικ.5 ). O Ατισένιο Μανούλοξείδιο Καουράνιο Λαβδάνιο Μπεύρένιο Εικ. 5. Βασικές δομές διτερπενίων. Στα παράγωγα του ατισενίου ανήκει η σιδεριτόλη η οποία απαντάται στο είδος S.reverchonii [27], η ατισιδεριτόλη και η ισοσιδεριτόλη που απομονώθηκαν από το είδος S.pusilla [28], η σερραδιόλη από το είδος S.serrata [29] και άλλες ακόμη ενώσεις που εντοπίστηκαν σε κάποια από τα είδη του Sideritis. Σε πολλά επίσης είδη συντίθενται τα παράγωγα του μανοϋλοξειδίου όπως είναι η ριβενόλη στα είδη S.varoi [3] και S.javalambrensis και η βαρόλη που απαντά στο τελευταίο είδος [31]. Επιπλέον, από τη χρωματογραφική ανάλυση των εκχυλισμάτων των S.canariensis [32, 33], S.nutans [34], S arborescens subsp paulii

19 [35], S.javalambensis [36], S.varoi subsp cuatrecasasii [37, 38], S.perfoliata [39] απομονώθηκαν παράγωγα του 13-επιμανοϋλοξείδιου σε ποικίλες δομές. Δομές με γενικό τύπο καουρένιου είναι αυτές που κυριαρχούν στα είδη και στα περισσότερα είναι οι κύριες σε ποσότητα και οι πιο ενδιαφέρουσες σε φαρμακολογική δράση. Τα συνηθέστερα διτερπένια είναι η σιδερόλη, η σιδεροξόλη, η σιδόλη, η ισοσιδόλη, η ευβόλη, η σιδεριδιόλη, η καντόλη Α και Β, η επικαντικαντιόλη, η καντικαντιόλη, η φολιόλη κ.α. [31, 32, 4-56]. Σχεδόν σε όλα τα είδη απαντώνται κάποιες από αυτές και φαίνεται να αποτελούν την κύρια μάζα του στερεού υπολείμματος του εξανίου και του χλωροφορμίου των φυτών. Σημαντικά δείχνουν να είναι και τα παράγωγα λαβδανίου τόσο από άποψη ποσότητας όσο και από άποψη δράσης των φυτών, όπως για παράδειγμα η βογατριόλη που απομονώθηκε πρώτα στο είδος S.mugronensis [57]. Το διτερπένιο αυτό ερευνήθηκε για τη φαρμακολογική του δράση και εξακριβώθηκε η αντιφλεγμονώδης δράση του [58]. Επίσης, το λαβδάνιο ent-6β,8α-dihydroxylabda- 13(16),14-diene που απομονώθηκε από τα είδη S.athoa, S.trojana, S.dichotoma, S.spilyea και S.argerea εμφανίζει αντιμικροβιακή δράση [45]. Στα περισσότερα είδη αναφέρεται η ύπαρξη λαβδανικών διτερπενίων όπως στα : S.gomerae, S.nutans, S.foetens, S.arborenscens, S.argyrea, S.hirsuta subsp nivalis, S.varoi, S.chamaedryfolia κ.α [3, 55, 59-64]. Επιπλέον, στην τελευταία κύρια κατηγορία των διτερπενίων που είναι αυτά με γενικό τύπο μπεϋερενίου, συγκαταλέγονται αρκετές ενώσεις που έχουν ως τώρα απομονωθεί. Η τομπαρόλη και η μπεουνόλη απομονώθηκαν από το είδος S.serrata [29] ενώ στο είδος S.pusilla subsp flavovirens υπάρχουν άλλα δύο σημαντικά διτερπένια αυτού του τύπου, η ταρτεσόλη και η φλαβοβιρόλη [65]. Τέλος, πέρα από τις παραπάνω βασικές κατηγορίες, απομονώθηκαν και διαφορετικών δομών διτερπένια, όπως η σιδνουτόλη από το είδος S.nutans, η τιγανόνη από το S.canariensis, η λαγκασκόλη και η λαγκασκοτριόλη από το S.serrata τα οποία απαντούν σε ποσότητες στο φυτικό εκχύλισμα [29, 34, 66, 67].

20 4.2.2 Τριτερπένια. Έρευνες που έχουν γίνει έδειξαν ότι στα φυτά του γένους Sideritis τα τριτερπένια που συντίθενται είναι ορισμένα και απαντούν στα περισσότερα είδη που μελετήθηκαν. Στην ανάλυση εννέα ειδών μόνο ένα, το S.gomerae, δεν περιείχε κανένα από τα γνωστά τριτερπένια, ενώ στα υπόλοιπα, S.argospachelus, S.bolleana, S.canariensis, S.candicans, S.desygnaphala, S.dendrochahorra και S.macrostachya απομονώθηκαν το σκουαλένιο, η α- και β- αμυρίνη, η ερυθροδιόλη, και τα οξέα ολεανικό και ουρσολικό (εικ. 6 ), [68]. Οι παραπάνω ενώσεις βρέθηκαν σε δύο taxa του είδους S.massoniana, μαζί με άλλες κατηγορίες ενώσεων, αποτέλεσαν ταξινομικό δείκτη των υποειδών [8]. CH 3 CH 3 HO HO α-αμυρίνη β-αμυρίνη CH 2 OH COOH HO HO ερυθροδιόλη ολεανικό οξύ

21 COOH COOH HO HO ουρσολικό οξύ γλουτινόλη σκουαλένιο Εικ. 6. Τριτερπένια που βρέθηκαν σε είδη του γένους Sideritis, Σε μια νεώτερη φυτοχημική ανάλυση απομονώθηκαν δύο νέα τριτερπένια, η ροϊπτελενόλη και η ροϊπτελενόνη από το είδος S.macrostachya, καθώς επίσης παρουσιάστηκε και η βιοσυνθετική οδός για το σχηματισμό τους ( εικ. 7 ), [69].

22 R Eικ. 7. R=β-ΟΗ, ροϊπτελενόλη R=Ο, ροϊπτελενόνη Φαρμακολογικά, δεν υπάρχουν πολλές αναφορές για τη δράση των τριτερπενίων. Σε έρευνα όμως, πάνω στο είδος S.taurica, αποκαλύπτεται αξιόλογη αναλγητική δράση του εκχυλίσματος του πετρελαϊκού αιθέρα, το οποίο περιέχει και τα τριτερπένια. Επίσης, το ίδιο εκχύλισμα εμφανίζει αντιφλεγμονώδη, αντιελκωτική και αντιπυρετική δράση σε μικρότερο βαθμό από τα πολικότερα εκχυλίσματα αλλά σε αξιόλογο ποσοστό [7]. 4.3 Φαινόλες Στις φαινόλες ανήκουν ομάδες ενώσεων που απαντούν ευρέως στα φυτά του γένους Sideritis και φαίνεται, από τις έρευνες, να είναι υπεύθυνες για μια μεγάλη ποικιλία φαρμακολογικών ιδιοτήτων. Η βασική δομή τους αποτελείται από ένα φαινολικό αρωματικό δακτύλιο που φέρει ομάδες υδροξυλίων σαν υποκαταστάτες κάποιων υδρογόνων του. Οι φαινόλες διαιρούνται, ανάλογα με το σκελετό τους στις εξής κατηγορίες: φαινολικά οξέα, ταννίνες, κουμαρίνες, λιγνάνες, κινόνες και σε μία μεγάλη, από άποψη δομών και φαρμακολογικού ενδιαφέροντος, ομάδα τα φλαβονοειδή.

23 4.3.1 Φαινολικά οξέα. Τα φαινολικά οξέα είναι πολικές ενώσεις που μπορεί να υπάρχουν στο φυτό ως απλά μόρια, άγλυκα, ή γλυκοσυλιωμένα ή συνδυασμένα μεταξύ τους δημιουργώντας μια ξεχωριστή ένωση. Τις πιο απλές δομές τους τις απαντάμε στα οξέα: καφεϊκό, φερουλικό, βενζοϊκό, βανιλλικό, γαλλικό, π-κουμαρικό, γεντισικό κ.α., ενώ το χλωρογενικό πιο σύνθετη ένωση από τα φαινολικά οξέα. Αποτελούν ομάδα με εξακριβωμένη φαρμακολογική δράση κυρίως την αντιοξειδωτική και την αντιφλεγμονώδη και για το λόγο αυτό παρουσιάζουν ενδιαφέρον. Σε μελέτες αναφέρεται ότι μεγαλύτερη δράση κατά των ελευθέρων ριζών έχουν τα είδη εκείνα που υπερέχουν σε περιεκτικότητα φαινολικών οξέων και φλαβονοειδών από τα άλλα του γένους Sideritis [71]. Μεταξύ των οξέων, σε μεγαλύτερη αναλογία βρέθηκε το υδροξυκινναμικό, το οποίο θεωρείται ισχυρός σαρωτής ελευθέρων ριζών. Σε μελέτη πάνω στο είδος S.cretica εκτός από το 4-υδροξυ κινναμικό οξύ σε μεγάλη ποσότητα παρελήφθηκε το p-υδροξυ βενζοϊκό και το ομοβανιλλικό. Επιπλέον, διαχωρίστηκαν τα: τρανς-κινναμικό, βανιλλικό, συριγκικό και φερουλικό [72]. Όσον αφορά την αντιφλεγμονώδη ιδιότητά τους αυτή εμφανίζεται υψηλή σε σχέση με το μάρτυρα, αλλά μικρότερης έντασης από τα φλαβονοειδή [73]. Στην παραπάνω έρευνα βρέθηκαν τρία παράγωγα του καφεϊκού οξέος, λαβαντουλιφολιοζίτης (1), βερμπασκοζίτης (3) και λευκοσκεπτοζίτης (4), και ένα του φερουλικού, μαρτυνοζίτης (2), ως τις δραστικές ουσίες κατά του οιδήματος (εικ. 8 ). R 2 O HO H3C HO O O O O OH O OH O OH OR 1 HO OR 3

24 R 1 R 2 R 3 1 H H Arabinose 2 CH 3 CH 3 H 3 H H H 4 H CH 3 H Εικ. 8. Πολυφαινολικές ενώσεις από το είδος S.lycia. Επιπλέον, αντιφλεγμονώδη δράση παρουσίασε και ένα παράγωγο της απιγενίνης και του κουμαρικού οξέος [74], το: απιγενίνη 7-(4-Ο-β-γλυκοσυλ-τρανσp-κουμαρο), που απομονώθηκε από το είδος S.raeseri και δίνει μια εξήγηση στο γιατί το τσάι του βουνού χρησιμοποιείται στη λαϊκή θεραπευτική ενάντια στις φγεγμονές. Τέλος, ένα φαινυλοπροπανοειδές που απομονώθηκε πρώτη φορά στο ίδιο είδος είναι το 1-Ο-[-[α]-μεθύλ-γ-(3,4 -διμεθοξυφενύλ)-προπύλ-ο-α-l-ραμνοπυρανοσύλ-(1 3)- β-d-(6-καφεόυλ) γλυκοπυρανοζίτης [75] Βιοσύνθεση φαινολικών οξέων. Η βιοσύνθεση των φαινολικών οξέων είναι η αυτή από την οποίαν προέρχονται όλες οι φαινολικές ενώσεις. Ως πρόδρομη ουσία θεωρείται το σικιμικό οξύ που μεταβολίζεται σταδιακά και μέσα από διάφορους μονοσακχαρίτες σε κινναμωμικό οξύ και στα παράγωγα του. Από το π-υδροξυκινναμωμικό οξύ, που είναι συνέχεια του προηγούμενου, λαμβάνονται τα υπόλοιπα φαινολικά οξέα, οι κουμαρίνες, οι λιγνάνες και οι φλαβόνες Κουμαρίνες και Λιγνάνες. Στα συστατικά των ειδών που απομονώθηκαν περιλαμβάνονται οι κουμαρίνες και οι λιγνάνες. Είναι γενικά γνωστές οι ιδιότητες των κουμαρινών ως σπασμολυτικά, ηρεμιστικά, διουρητικά και ως συστατικά στην αρωματοποιία, δεν βρέθηκαν όμως αναφορές για το γένος του Σιδερίτη. Οι ενώσεις που απαντώνται στα είδη του είναι η

25 σιδερίνη, που πρώτη φορά απομονώθηκε από το είδος S.canariensis το 1972 [76], η 7-διμεθυλ-σιδερίνη και το ακετυλιωμένο παράγωγο της [8]. Δεν θεωρούνται βάσιμοι χημειοταξινομικοί δείκτες, αλλά μαζί με τη λιγνάνη σεσαμίνη (+) παρουσιάζουν κάποιο οικολογικό ενδιαφέρον Φλαβονοειδή. Στις περισσότερες φαρμακολογικές ιδιότητες του Σιδερίτη αναφέρονται σαν δραστικά συστατικά οι φλαβόνες, με κύρια δράση την αντιοξειδωτική. Αυτές αποτελούν μια μεγάλη κατηγορία ενώσεων στο φυτό με ποικίλους χημικούς τύπους και απαντούν ως άγλυκα ( γενίνες ) ή γλυκοσυλιωμένες με ένα ή περισσότερα σάκχαρα ( γλυκοζίτες ). Οι βασικές δομές των φλαβονοειδών παρουσιάζονται στην παρακάτω εικόνα ( εικ. 9 ): HO O OH HO O OH HO O OH OH OH O OH O OH O OH φλαβόνη φλαβανόνη φλαβονόλη OH OH OH HO O HO O HO O OH O OH OH OH OH OH OH διυδροφλαβονόλη φλαβαν-3-όλη φλαβάν-3,4-διόλη

26 HO OH HO O OH HO + O OH OH OH O O OH χαλκόνη αουρόνη ανθοκυανιδίνη Εικ. 9. Δομές των φλαβονοειδών. Οι φλαβόνες είναι συνήθως από τις πολικότερες ενώσεις στο φυτό, ιδίως οι γλυκοσυλιωμένες μορφές τους, και εκχυλίζονται με πολικούς διαλύτες όπως ο οξικός αιθυλεστέρας και η βουτανόλη. Μετά την εκχύλιση και την απομόνωσή τους, κατά τη χρωματογράφιση παίρνουν χαρακτηριστικό χρώμα κίτρινο ή μαύρο, ανάλογα με την ουσία. Στο φυτό βρίσκονται οι μεν γενίνες εξωκυτταρικά στα φύλλα, τους νεαρούς βλαστούς και τους αδένες και οι δε γλυκοζίτες τους μέσα στα κενοτόπια του κυττάρου. Λόγω του ενδιαφέροντος που παρουσιάζουν φαρμακολογικά, πολλές έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην απομόνωση των φλαβονοειδών με χρωματογραφίες υψηλής ανάλυσης. Κατά την απομόνωση έχουν βρεθεί συνηθισμένοι τύποι, όπως η απιγενίνη ή ο μονογλυκοζίτης της αλλά και αρκετές ιδιαίτερες δομές που εντοπίζονται σε ορισμένα είδη. Από τα φλαβονοειδή που έχουν απομονωθεί στα είδη του Σιδερίτη τα περισσότερα ανήκουν στις φλαβόνες τύπου απιγενίνης ή λουτεολίνης. Από το είδος S.leucantha παρελήφθησαν δύο φλαβονοειδή τύπου λουτεολίνης, η μια εκ των οποίων έχει μεθοξύλια στις θέσεις 6 και 8 και ένα μόριο γλυκόζης στη θέση 7, και στην άλλη το υδρογόνο την θέσης 3 είναι επίσης υποκατεστημένο με μεθοξυ ομάδα [77]. Δύο ακόμη ουσίες που απομονώθηκαν από το παραπάνω είδος έχουν το βασικό σκελετό της λουτεολίνης. Η πρώτη φέρει υδροξύλιο και στη θέση 8, το οποίο είναι συνδεδεμένο με γλυκόζη ενώ τα υδροξύλια των 6 και 7 είναι μεθοξυλιωμένα και η δεύτερη έχει τη σύνδεση με το σάκχαρο στη θέση 7 και το υδροξύλιο της 8 παραμένει ελεύθερο [78]. Παρόμοια είναι και η ουσία που άλλη ομάδα ερευνητών

27 κατάφερε να διαχωρίσει από το είδος αυτό, η οποία φέρει μεθοξύλια στις θέσεις 6,7,8 [79]. Επιπλέον, στο εκχύλισμα τριών υποειδών του, var.serratifolia, var.incana, var.meridionalis, βρέθηκαν τα φλαβονοειδή ισοσκουτελαρεϊνη-7-ο- {αλοσιλ(1 2)γλυκοσίδης, λουτεολίνη, υπολαετίνη-8-ο-β-ο-γλυκοσίδης, χρυσοεριόλη, σιδεριτοφλαβόνη, ξανθομικρόλη, γκαρδενίνη D και δεσμετιλνομπιλετίνη [8-82]. Πολλές από τις παραπάνω μεθοξυφλαβόνες διαχωρίστηκαν και σε αλλά είδη του γένους Sideritis [83]. Τα παραπάνω φλαβονοειδή είναι συστατικά και άλλων ειδών του γένους Sideritis και απαντούν συχνά στα εκχυλίσματα τους. Η ισοσκουτελαρεϊνη-7-ο- {αλοσιλ(1 2)γλυκοζίτης και η λουτεολίνη απομονώθηκαν από τα: S.foetens, S. luteola, S.almeriensis, S. hirsuta, S.bourgeana, S.pusilla, S.ibanyeszii, S.cillensis και S.glauca [84]. Στα περισσότερα από αυτά βρέθηκε η χρυσοεριόλη και η σιδεριτοφλαβόνη, ενώ η υπολαετίνη-8-ο-β-ο-γλυκοζίτης απομονώθηκε μόνο από πέντε είδη ( S.leucantha var.serratifolia, S.leucantha var.incana, S.leucantha var.meridionalis, S.bourgeana και S.pusilla ) [82]. Μια συγκεντρωτική φυτοχημική ανάλυση σε δεκαπέντε διαφορετικά είδη του Σιδερίτη παρουσιάζει το διαχωρισμό εννέα φλαβονοειδών, τα οποία περιέχονται με διαφορετικές αναλογίες σε κάθε ένα φυτικό εκχύλισμα [85]. Στα είδη leucantha, flavovirens, pusilla, mugronensis, angustifolia, granatensis, glauca, incana, hirsuta, Montana, arborescens, tragoriganum, spinulosa και scordioides διαχωρίστηκαν έξι φλαβονοειδή τύπου λουτεολίνης: λουτεολίνη, χρυσοεριόλη, κιρσιλιόλη, σιδεριτοφλαβόνη, κιρσιλινεόλη και 5,4 -διυδροξυ-6,7,8,3 -τετραμέθοξυ φλαβόνη, και τρεις τύπου απιγενίνης: απιγενίνη, κιρσιμαριτίνη, ξανθομικρόλη. Επίσης, σε μελέτη είκοσι έξι ειδών των Κανάριων Νήσων και της Μαδέρας βρέθηκαν είκοσι επτά φλαβονοειδή, έντεκα σε μορφή άγλυκων και δεκαέξι γλυκοζίτες [84]. Σε δεκαπέντε διαφορετικά είδη έγινε προσπάθεια να προσδιοριστεί το % ανά ξηρό βάρος εκχυλίσματος της ισοσκουτελλαρεϊνης 7-γλυκοσυλ(1 2) ξυλοζίτη [81], από τα οποία μόνο τρία δεν περιείχαν την ένωση, ενώ έξι εμφάνισαν σημαντικές ποσότητες. Ενδιαφέρον παρουσιάζει και μια ακόμα έρευνα φλαβονοειδών στα είδη S.incana και S.angustifolia και στα υβρίδια που προκύπτουν από τον συνδυασμό τους [86]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι στα υβρίδια κληρονομούνται τα περισσότερα

28 φλαβονοειδή από τους δύο αρχικούς γενοτύπους, ακόμα και αν σε έναν από αυτούς δεν περιέχονται όλα. Φυτοχημικές αναλύσεις σε μεμονωμένα είδη έδωσαν τις κύριες ουσίες που περιέχονται στα εκχυλίσματα τους, όπως στο είδος S.hyssopifolia, στο οποίο τέσσερις φλαβόνες με ακετυλιωμένα σάκχαρα διαχωρίστηκαν για πρώτη φορά [87], στο είδος S.raeseri που βρέθηκε εκτός των άλλων ενώσεων μια νέα φλαβόνη συνδυασμένη με κουμαρικό οξύ [88] και στο είδος S.lycia στο οποίο μεταξύ των πολυφαινολικών του ενώσεων αναγνωρίστηκαν δυο παράγωγα της υπολαετίνης [73]. Από τον S.grandiflora, ένα ενδημικό είδος της νοτιοδυτικής Ιβηρικής χερσονήσου, διαχωρίστηκε η χρυσοεριόλη γλυκοσυλιωμένη στη θέση 7 του πρώτου δακτυλίου με δύο σάκχαρα, την άλογη και την γλυκόζη [89]. Τέλος, ερευνητές αναφέρουν την απομόνωση φλαβανονών από επτά είδη [9] Βιοσύνθεση φλαβονοειδών. Η βιοσύνθεση των φλαβονοειδών ξεκινά με την συμπύκνωση ενεργοποιημένου κινναμωμικού οξέος με τρία μόρια μηλονικού-coa. Αρχικά, το κινναμωμικό οξύ προέρχεται από τη μετατροπή αμινοξέων φαινυλαλανίνης ή τυροσίνης σε αυτό και του ακέτυλο-coa σε μηλονικού-coa. Κατά το σχηματισμό του κινναμωμικού οξέος πρόδρομη ένωση θεωρείται το σικιμικό οξύ που όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο, μεταβολίζεται σταδιακά σε υδροξυκινναμικό και τα παράγωγα του. Η συμπύκνωση του οξέος με το μηλονικό συνένζυμο οδηγεί στη σύνθεση χαλκόνης και έπειτα της φλαβόνης, η οποία είναι ο βασικός σκελετός για να προκύψουν όλα τα υπόλοιπα φλαβονοειδή (εικ.1).

29 ΦΑΙΝΥΛΑΛΑΝΙΝΗ O ΑΚΕΤΥΛΟ-COA OH 3 O CoAS O + CoAS O μηλονικό-coa ενεργοποιημένο κινναμωμικό οξύ OH HO OH OH O χαλκόνη OH HO O OH O φλαβόνη Εικ. 1. Σχηματική παράσταση της βιοσύνθεσης των φλαβονοειδών.

30 5. ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ SIDERITIS. Η σημαντικότητα των ειδών του γένους Sideritis έγκειται στις πολλαπλές τους φαρμακολογικές ιδιότητες, οι οποίες είναι αντικείμενο επιστημονικής μελέτης τα τελευταία χρόνια κυρίως. Από τις μελέτες αυτές προκύπτει ένα μεγάλο φάσμα δράσεων στον ανθρώπινο οργανισμό, που ήταν γνωστές στα παλαιότερα χρόνια με εμπειρικό τρόπο και τώρα γίνεται προσπάθεια να εξηγηθούν επιστημονικά, με πειράματα in vivo και in vitro. Οι δράσεις που έχουν μεγάλο ενδιαφέρον είναι η αντιφλεγμονώδης, η αναλγητική, η αντιμικροβιακή, η αντιοξειδωτική, η αντιελκωτική και ορισμένες άλλες που μελετήθηκαν λιγότερο. Στις παραπάνω ιδιότητες που εμφανίζουν τα φυτά του γένους Sideritis εμπλέκονται ορισμένες ουσίες ή ομάδες ουσιών όπως τα αιθέρια έλαια, τα διτερπένια, τα οργανικά οξέα και τα φλαβονοειδή. Σε ορισμένες περιπτώσεις έχει διευκρινιστεί ποια ουσία η ποιες εμφανίζουν τη συγκεκριμένη δράση ενώ σε πολλές περιπτώσεις χρειάζεται επιπλέον έρευνα για τον εντοπισμό τoυς. Παρακάτω θα αναφερθούν αναλυτικά οι κυριότερες δράσεις των ειδών του Sideritis. 5.1 Αντιφλεγμονώδης δράση. Από τη βιβλιογραφία φαίνεται ότι η αντιφλεγμονώδης δράση έχει απασχολήσει πολύ τους ερευνητές, διότι υπάρχουν πολλές μελέτες πάνω στην ιδιότητα αυτή των εκχυλισμάτων του γένους Sideritis. Σε κάποιες από αυτές δεν έχει εντοπισθεί ποια ουσία είναι η αιτία της δράσης αυτής, όπως για παράδειγμα στα είδη S.lotsyi και S.canariensis στα οποία βρέθηκε ότι το αιθανολικό εκχύλισμα και κυρίως το χλωροφορμιακό εμφανίζουν ιδιότητες κατά της φλεγμονής [91, 92]. Παρομοίως, στο είδος S.taurica περισσότερο δραστικό βρέθηκε το μίγμα που προκύπτει από το χλωροφορμιακό εκχύλισμα [93]. Στο S.javalambrensis αποδείχτηκε με πειράματα η δραστικότητα του εκχυλίσματος του εξανίου [94], ενώ επιπλέον έρευνες εντόπισαν ότι οι δραστικές ουσίες ανήκουν στις ομάδες των φλαβονοειδών, των τερπενίων και των λιπιδίων [95, 96]. Κυρίως τα διτερπένια ent-13-epi-12a-acetoxymanoyl-oxide και ent-8a-hydroxy-labda-13(16),14-dien συμμετέχουν στην αντιμετώπιση της φλεγμονής

31 [97]. Στο είδος S.candicans αναφέρονται ως υπεύθυνες κατά της φλεγμονής οι φυτοστερόλες, οι άλφα- και βήτα- αμυρίνες και τα διτερπένια, οι οποίες δεν έχουν εκλεκτική δράση κατά των διαφόρων παραγόντων που συμμετέχουν στη διαδικασία της φλεγμονής άλλα δρουν γενικά κατά του φαινόμενου αυτού [98]. Ένα άλλο διτερπένιο με έντονη αντιφλεγμονώδη δράση είναι η βογατριόλη που εντοπίσθηκε από έρευνα στο είδος S.mugronensis.. Στη συγκεκριμένη μελέτη αναφέρεται και ο 8- Ο-γλυκοζίτης της υπολαετίνης ως υπεύθυνη ουσία κατά της οξείας φάσης της φλεγμονής αλλά όχι τόσο δραστική στην χρόνια φάση [99]. Τέλος, στο είδος S.raeseri μελετήθηκαν τα εκχυλίσματα του οξικού αιθυλεστέρα και της μεθανόλης καθώς και η απιγενίνη 7-(4-Ο-β-γλυκόσυλ-trans-p- κουμαρικό), ουσία που απομονώθηκε από αυτά [74]. Τα αποτελέσματα εμφάνισαν ασθενή, σε σχέση με τις δραστικές ουσίες μάρτυρες, δράση των δύο εκχυλισμάτων και κυρίως του μεθανολικού, αλλά την ισοδύναμη δράση της απομονωμένης ακυλοφλαβόνης που αναφέρθηκε παραπάνω. 5.2 Αναλγητική δράση. Η εμφάνιση της αναλγητικής δράσης επίσης, μελετήθηκε σε κάποια από τα είδη του γένους Sideritis και γενικά προέκυψε το συμπέρασμα ότι ενώσεις λιγότερο πολικές, από αυτές που εμπλέκονται στην αντιφλεγμονώδη δράση, είναι υπεύθυνες για την ιδιότητα αυτή. Ειδικότερα, στο είδος S.lotsyi, που η μελέτη έγινε σε επίπεδο εκχυλισμάτων, περισσότερο δραστικά αποδείχτηκαν το μεθανολικό και το χλωροφορμιακό εκχύλισμα [91]. Στα ίδια συμπεράσματα κατέληξαν μελέτες στα είδη S. candicans, S. taurica και S.canariensis στα οποία η δράση οφείλεται στις φυτοστερόλες, τις α- και β αμιρίνες, τα διτερπένια με σκελετό καουρενίου, τα τριτερπένια και γενικότερα σε κατηγορίες ενώσεων των εκχυλισμάτων του χλωροφορμίου και του πετρελαϊκού αιθέρα [92, 93, 98]. 5.3 Αντιμικροβιακή δράση. Σημαντική θεωρείται, επίσης, και η αντιμικροβιακή δράση των ειδών του γένους Sideritis, διότι σε πολλά από αυτά παρατηρήθηκε έντονα η δυνατότητά τους

32 να αντιμετωπίζουν βακτήρια, ιούς, και ζύμες. Οι ενώσεις που φέρουν αυτή την ιδιότητα ανήκουν στα αιθέρια έλαια κυρίως. Σε μελέτη που έγινε σε πέντε taxa από την Ελλάδα οι μονοτερπενικοί υδρογονάνθρακες φαίνεται να εμφανίζουν τη δράση αυτή [1]. Η περιεκτικότητα των ειδών στα διάφορα μονοτερπένια είναι ανάλογη της εμφάνισης δραστικότητας καθώς μεγάλο ρόλο παίζει και το συγκεκριμένο αιθέριο έλαιο που εμπλέκεται στη δράση. Στα πέντε taxa που ερευνήθηκαν, περισσότερο δραστικά προέκυψαν αυτά που στο σύνολο των αιθέριων ελαίων τους περιέχουν σε μεγαλύτερο ποσοστό α-πινένιο και καρβακρόλη. Το είδος S.raeseri subsp. raeseri λόγω της πολύ χαμηλής περιεκτικότητας του στα δύο μονοτερπένια εμφανίστηκε αδρανές. Τα αιθέρια έλαια δοκιμάστηκαν στην αντιμετώπιση πολλών μικροοργανισμών όπως των Gram+ βακτηρίων P.aeruginosa, E.cloacae, K.pneumoniae, E.coli, και των ιών C.albicans, C.tropicallis, T.glabrata και ήταν αποτελεσματικά. Εκτός, από τα παραπάνω taxa ερευνήθηκαν και άλλα για την ίδια δράση όπως τα S.angustifolia, S.funkiana, S.javalambrensis, S.leucantha, S. mugronensis, S.tragoriganum [11], S.pusilla [71] και τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια, δείχνοντας έτσι ότι τα αιθέρια έλαια ευθύνονται για τη αντιμικροβιακή δυνατότητά τους. Επιπλέον, μελέτες απέδειξαν την δραστικότητα και στις ζύμες όπου το εκχύλισμα φαίνεται να εμποδίζει τη φυσιολογική ανάπτυξη του μικροοργανισμού. Ένα τέτοιο παράδειγμα είναι και η μελέτη της επίδρασης του υδατικού εκχυλίσματος στην ανάπτυξη του Yarrowia lipolytica [12] στο οποίο μετρώντας διάφορες παραμέτρους διαπιστώνεται η ασθενή δράση του φυτού στην αύξηση της φάσης υστέρησης του οργανισμού. 5.4 Αντιοξειδωτική δράση. Πολύς λόγος γίνεται για το φαινόμενο ορισμένων φυτών να μπλοκάρουν τις ελεύθερες ρίζες στον οργανισμό και οι έρευνες γύρω από το θέμα είναι αρκετές. Στα είδη του Sideritis έγιναν προσπάθειες για τη μέτρηση της αντιοξειδωτικής τους δράσης με τις συνηθισμένες μεθόδους του DPPH, Co(II) EDTA-induced luminol, BHT, BCBT κ.α. Από τα εκχυλίσματα ειδών του φυτού, αυτά του οξικού

33 αιθυλεστέρα και της βουτανόλης εμφάνισαν την ισχυρότερη δράση [13]. Το φαινόμενο αποδόθηκε στην ύπαρξη πολυφαινολικών ενώσεων στα συγκεκριμένα εκχυλίσματα, οι οποίες είναι υπεύθυνες για τη σάρωση ελευθέρων ριζών. Ειδικότερα, στο είδος S.javalambrensis από τα φλαβονοειδή που απομονώθηκαν, εμφάνισαν πιο έντονα την αντιοξειδωτική τους ικανότητα αυτά με ελεύθερο το περισσότερο όξινο υδροξύλιο τους, άρα η πολικότητα των ενώσεων αυξάνει τη δραστικότητα [14]. Δεν συνέβη όμως το ίδιο με τα φλαβονοειδή του S.raeseri, στα οποία η δραστικότητα τους δεν ήταν η αναμενόμενη [15]. Σε μια πιο γενική έρευνα που περιελάμβανε αρκετά από τα Μεσογειακά φυτά ο Sideritis παρουσίασε μέτρια, σε σύγκριση με τα υπόλοιπα γένη, αντιοξειδωτική ικανότητα [16], ενώ σε έρευνα μεταξύ φυτών της οικογένειας Lamiaceae, η δραστικότητα εμφανίστηκε σε συνάρτηση με την περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις [17]. 5.5 Άλλες δράσεις. Όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο, το τσάι του Σιδερίτη ήταν ευρέως γνωστό για τις ιδιότητες του κατά των κρυολογημάτων και ως αφέψημα ειδικά τους χειμερινούς μήνες. Επίσης, ήταν αντιληπτές οι καταπραϋντικές του ιδιότητες, οι αντιβηχικές, οι ηρεμιστικές και οι επιδράσεις του στις στομαχικές διαταραχές, το στρες και τις γαστροεντερικές ανωμαλίες [22]. Οι έρευνες καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι οι δράσεις των ειδών του Sideritis ποικίλουν και είναι αρκετές σε αριθμό. Οπωσδήποτε, τα είδη του αποτελούν καλό αντικείμενο έρευνας για περισσότερες εξακριβώσεις των ενώσεών τους και των δράσεων που εμφανίζουν.

34 6. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ Η χρήση των φυτών σαν φάρμακα είναι γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων μέσα από συγγράμματα και παραστάσεις που σώζονται. Σήμερα, μετά από τεράστια τεχνολογικά άλματα και προόδους πάνω στη τεχνολογία των φαρμάκων και των τροφίμων, διαπιστώνεται έντονα η επιθυμία των ανθρώπων να εμπιστευτούν τα φυσικά προϊόντα χωρίς την προσθήκη συνθετικών συστατικών. Είναι μια τάση της εποχής η οποία ανέκυψε από τις παρενέργειες των συνθετικών στον ανθρώπινο οργανισμό και στο φυσικό περιβάλλον. Δεν αποτελεί όμως πανάκεια η χρήση φυσικών ουσιών στη φαρμακολογία και τα τρόφιμα, διότι η χρήση τους μπορεί να έχει δυσάρεστες επιπτώσεις ή ακόμη και το θάνατο. Τόσο λοιπόν η θετική δράση τους όσο και η αρνητική εκφράζουν το γεγονός ότι στα φυτά εμπεριέχονται ενώσεις με δραστικές ικανότητες πολλές φορές ανώτερες των συνθετικών ενώσεων. Για να μελετηθεί η υπαίτια για τη δράση ουσία και ο μηχανισμός μέσω του οποίου ενεργεί θα πρέπει να απομονωθεί από τη δρόγη όπου εμπεριέχεται. Η απομόνωση και η ταυτοποίηση των συστατικών των φυτών είναι αντικείμενο της φαρμακογνωσίας. Η παρούσα διατριβή έγινε στα πλαίσια της φαρμακογνωσίας με σκοπό τη φυτοχημική ανάλυση του είδους S.syriaca. Η ανασκόπηση της βιβλιογραφίας πάνω στο συγκεκριμένο είδος έδειξε ότι ελάχιστα μελετήθηκε το προφίλ του όσον αφορά τις κύριες ενώσεις που συνθέτει και κυρίως τις πολυφαινολικές που εμφανίζουν τις περισσότερες δράσεις. Ένας ακόμη λόγος που συνετέλεσε στην επιλογή του συγκεκριμένου φυτού για μελέτη είναι το γεγονός ότι η χρήση του είναι ευρύτατα διαδεδομένη σε περιοχές της Ελλάδας ως αφέψημα με καταπραϋντικές για τον οργανισμό ιδιότητες. Στόχος, λοιπόν, είναι η όσο το δυνατόν καλύτερη παρουσίαση των συστατικών του και των φαρμακολογικών ιδιοτήτων του.

35 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 1 ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 1.1 Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας ( TLC ). Με τη χρωματογραφία λεπτής στιβάδας μπορεί να γίνει έλεγχος της πολυπλοκότητας του δείγματος, διαπίστωση για την απομόνωση των ουσιών ή παρασκευαστικά να διαχωριστούν οι ενώσεις μεταξύ τους. Γίνεται με τη χρήση γυάλινων ή αλουμινένιων πλακών πάνω στις οποίες υπάρχει μια λεπτή στιβάδα προσροφητικού υλικού. Μετά το σποτάρισμα ελάχιστης ποσότητας από το δείγμα του εκχυλίσματος του φυτού, η πλάκα τοποθετείται σε γυάλινους θαλάμους που περιέχουν διαλύτη ανάπτυξης της χρωματογραφίας. Ο διαλύτης διαποτίζει τη μεγαλύτερη επιφάνεια της πλάκας, καθώς ανεβαίνει. Οι πλάκες που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη έρευνα είναι οι εξής: Πλάκες από αλουμίνιο με προσροφητικό υλικό την κυτταρίνη ( cellulose ), διαστάσεων 2x2 cm, πάχος στιβάδας,1 mm, χωρίς δείκτη φθορισμού στα 254 και 366 nm (MERCK) Πλάκες αλουμινίου επικαλυμμένες με οξείδιο του πυριτίου ( Kieselgel 6 ), διαστάσεων 2x2 cm, πάχος στιβάδας,2 mm, με ή χωρίς δείκτη φθορισμού στα 254 και 366 nm (MERCK, Art 5553 DC) Ο έλεγχος των χρωματογραφικών πλακών γινόταν κάτω από το υπεριώδες φως στα 254 και 366 nm, πριν και μετά τον ψεκασμό τους με αντιδραστήρια. Χρησιμοποιήθηκαν τα εξής δύο αντιδραστήρια ψεκασμού:

36 1. Αντιδραστήριο ατμών αμμωνίας και 2. αντιδραστήριο Neu ( naturstoffreagenz A ), το οποίο παρασκευάζεται από την διάλυση 1 g διφαινυλοβορικού αμινοαιθυλεστέρα σε 1 ml μεθανόλης. 1.2 Χρωματογραφία στήλης Στην μέθοδο αυτή στηρίζεται η απομόνωση και η παραλαβή των ουσιών από το φυτικό εκχύλισμα. Διαθέτει πολλές περιπτώσεις στη χρήση της, από την απλή γυάλινη κολώνα πακτωμένη με το υλικό της στατικής φάσης διαμέσου της οποίας διέρχεται ο διαλύτης έκλουσης ως τις πιο σύγχρονες εκδοχές της όπως την υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης και την αεριοχρωματογραφία. Στην παρούσα εργασία οι περιπτώσεις της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκαν είναι οι παρακάτω: Χρωματογραφία σε γυάλινη στήλη με υλικό πλήρωσης το Πολυαμίδιο CC6 Macherey & Nagel, 7-16 μm ( πολυκαπρολακτάμη ). Η σκόνη του πολυαμιδίου κατεργάστηκε με απεσταγμένο νερό και μίγμα νερού μεθανόλης για την απομάκρυνση των ολιγομερών του. Αρχικά, δημιουργήθηκε αιώρημα πολυαμιδίου μέσα στο νερό που αναδεύονταν διαρκώς με μαγνητικό αναδευτήρα. Στη συνέχεια, αφήνονταν σε ηρεμία ώστε να καθιζάνει η σκόνη και να απομακρυνθεί το υπερκείμενο υγρό μαζί με τα ολιγομερή που παρέμεναν διαλυμένα. Η διαδικασία αυτή επαναλήφθηκε ωσότου το νερό μετά την αιώρηση να παραμένει διαυγές. Μετά την πάροδο 1 λεπτών, χρησιμοποιήθηκε μίγμα νερού- μεθανόλης, με αυξανόμενη την ποσοστιαία αναλογία της μεθανόλης στο διαλύτη ως και 1%. Το ίδιο επαναλήφθηκε και αντίστροφα επιστρέφοντας στο 1% νερό. Η επόμενη ενέργεια ήταν η πλήρωση της στήλης με το πολυαμίδιο σε μορφή αιωρήματος.

37 Χρωματογραφία σε γυάλινη στήλη και υλικό πλήρωσης silica gel 6H ( 7736 ) και silica gel (9385 ). Σκόνη silica διαλυμένη σε εξάνιο, έδωσε ένα μίγμα το οποίο κατά την πάκτωσή του στη στήλη σχημάτισε μια ζελατινοειδή στατική φάση. Το προς διαχωρισμό δείγμα, αφού διαλύθηκε σε MeOH, αναμίχθηκε με ορισμένη ποσότητα προσροφητικού και μετά την εξάτμιση του διαλύτη τοποθετήθηκε με προσοχή πάνω από τη στατική φάση. Χρωματογραφία με υλικό πλήρωσης Shephadex LH-2 ( υδροξυπροπυλιωμένη δεξτράνη ). Το υλικό πακτώθηκε στη στήλη διαλυμένο σε μεθανόλη και ο όγκος του αναλογούσε σε βάρος δείγματος 5:1. Το δείγμα μεταφέρθηκε πάνω από τη στατική φάση διαλυμένο στη μικρότερη δυνατή ποσότητα μεθανόλης, ώστε να μην υπάρχουν αιωρήματα και να επιτευχθεί η καλύτερη κατανομή μέσα στο Shephadex. Χρωματογραφία αντίστροφης φάσης σε στήλη RP-8 (4 63μm), prepcaked for liquid chromatography Size B (31 25). 2 ΑΝΑΛΥΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Φασματοφωτομετρία υπεριώδους ορατού. Μετά την απομόνωση και τον χρωματογραφικό έλεγχο των ουσιών λήφθηκαν τα φάσματά τους υπό μορφή διαλυμάτων με φασματοφωτόμετρο HITACHI 2. Τα διαλύματα των ουσιών τοποθετήθηκαν σε κυψελίδες χαλαζία 1 mm QS. Τα φάσματα παρελήφθησαν με τη σειρά που αναφέρονται οι παρακάτω διαλύτες: 1. Μεθανόλη 2. Μεθανόλη και μεθοξυλικό νάτριο 3. Μεθανόλη και διάλυμα τριχλωριούχου αργιλίου 5%

38 4. Μεθανόλη και διάλυμα τριχλωριούχου αργιλίου 5%, με προσθήκη σταγόνων 4Ν υδροχλωρικού οξέος. 5. Μεθανόλη μαζί με κρυστάλλους άνυδρου οξικού νατρίου. 6. Μεθανόλη μαζί με κρυστάλλους άνυδρου οξικού νατρίου και ελάχιστη ποσότητα από κεκορεσμένο διάλυμα βορικού οξέος. Η μέθοδος δίνει τις χαρακτηριστικές κορυφές απορροφήσεων κάθε ουσίας και η ανάγνωσή των φασμάτων εξηγεί ορισμένα από τα χαρακτηριστικά της δομής της. 2.2 Φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού. Περισσότερες πληροφορίες για τη διάταξη των ατόμων των ενώσεων δίνονται μέσα από τα φάσματα του πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR ). Σε αυτή τη φασματοσκοπία έχουμε δύο εκδοχές: πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό του πρωτονίου και του ατόμου του άνθρακα, οπότε λαμβάνονται ξεχωριστής μορφής φάσματα με διαφορετικές πληροφορίες το καθένα. Επιπλέον, στη μέθοδο αυτή δίνεται η δυνατότητα να ληφθούν φάσματα δύο διαστάσεων π.χ. Η 1 -Η 1, Η 1 C 13. Σε όλα τα φάσματα η κλίμακα εκφράζεται σε μονάδες δ σε ppm, οι οποίες αντιστοιχούν στις χημικές μετατοπίσεις των ατόμων. Η σύζευξη των ατόμων του Η 1 δίνεται σε μονάδες J (Hz ). Στην παρούσα εργασία λήφθηκαν φάσματα NMR Η 1 και δύο διαστάσεων COSY (Η 1 -Η 1 ) και HMBC (Η 1 C 13 ), στα οποία χρησιμοποιήθηκε φασματόμετρο Brucker 3 Hz και 5 Hz. 2.3 Τεχνική LC-DAD-MS (ESI+). Αφορά μια τεχνική που έχει τη δυνατότητα να κάνει διαχωρισμό των ουσιών ενός δείγματος και να δώσει για κάθε μια από αυτές το χρόνο κατακράτησης στη στήλη υγρής χρωματογραφίας, το φάσμα υπεριώδους ορατού και τα θραύσματα που προκύπτουν από τη διάσπασή της.

39 Τα φάσματα για κάποιες από τις ενώσεις του πειράματος λήφθηκαν σε Finnigan MAT Spectra System P4pump με UV6LP diode array ανιχνευτή και Finnigan AQA φασματόμετρο μάζας. Η χρωματογραφική στήλη ήταν 125 x 2 mm Superspher 1-4 RP 18 ( Macherey-Nagel ), με μέγεθος τεμαχιδίων 4μm, ρυθμό έκλουσης.33 ml/min και όγκο ένχυσης 5ul. Η καταγραφή έγινε στα 34, 29, και 365 nm, η θερμοκρασία για την MS-ESI(+) ανάλυση ήταν 45 C και η τάση στον αναλυτή μάζας 2 και 8 ev. Οι διαλύτες έκλουσης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν μίγμα μεθανόλης και οξικού οξέος και η αναλογία τους αυξομειώνονταν κατά τη διάρκεια της χρωματογράφισης. Χρησιμοποιήθηκαν δύο προγράμματα α) το πρόγραμμα με μίγμα μεθανόλης οξικού οξέος 2% και βαθμωτή έκλουση που είχε ως εξής: (A) AcOH 2% και (B) MeOH, 9 % A στα 2 min, % Α στα 37 min, % Α στα 42 min, 9 % Α στα 45 min, 9 % Α στα 5 min και β) το πρόγραμμα με μίγμα μεθανόλης οξικού οξέος 2,5% και βαθμωτή έκλουση: 9% (Α) min, 9% (A) 1 min, % (A) 16 min και % (A) 21 min, με το οποίο έγινε έλεγχος καθαρότητας των απομονωθέντων ουσιών. 2.4 Μέτρηση αντιοξειδωτικής ικανότητας. Η αντιοξειδωτική ικανότητα αναλύθηκε με δύο μεθόδους: την μέθοδο του DPPH και της χημειοφωταύγειας της λουμινόλης. Η πρώτη στηρίζεται στη μέτρηση της σάρωσης της ελεύθερης ρίζας DPPH από τις αντιοξειδωτικές ουσίες που περιέχονται στα εκχυλίσματα των φυτών. Χρησιμοποίηθηκε η σταθερή οξειδωτική ελεύθερη ρίζα με αζωτούχο κέντρο, DPPH, η οποία απορροφά στα 515 nm και ανάγεται από τα αντιοξειδωτικά του φυτού. Η αναγωγή καταγράφηκε από τη μείωση της απορρόφησης της ρίζας στα 515 nm, η μέτρηση της οποίας έγινε σε φασματοφωτόμετρο υπεριώδους ορατού ( UV-Vis ), HITACHI 2. Η δεύτερη μέθοδος ελέγχει έμμεσα την αντιοξειδωτική δράση των ουσιών και στηρίζεται στην καταγραφή του εκπεμπόμενου φωτός το οποίο προέρχεται από τον σχηματισμό Ο 2 - και ΟΗ- από Η 2 Ο 2. Ο σχηματισμός ενεργών μορφών οξυγόνου καταλύεται από το σύμπλοκο Co(II)-EDTA. Η ένταση του φωτός ενισχύεται από τη λουμινόλη ( μόριο ανιχνευτής ή φωτοπολλαπλασιαστής ) και καταγράφεται αφού

40 φτάσει σε ένα πλατώ από φωτοπολλαπλασιαστή και αντιστοιχεί αντιστρόφως ανάλογα στην αντιοξειδωτική ικανότητα των δειγμάτων του φυτού. Όλες οι μετρήσεις έγιναν σε φθορισμόμετρο JENWAY ( Jenway Gransmore Felster Dunmow Essex CM6 3 LB ), model 62, με τη χρήση μόνο του φωτοπολλαπλασιαστή.

41 ΚΥΡΙΩΣ ΕΡΕΥΝΑ 1. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΗΣ ΔΡΟΓΗΣ Η συλλογή της δρόγης έγινε στην Κρήτη, στην περιοχή του Αγίου Μάμα, στα Λευκά Όρη. Μετά την παραλαβή της τεμαχίστηκε αδρομερώς, μετρήθηκε το βάρος της στα ( 38 gr ). και εκχυλίστηκε σε συσκευή Soxhlet διαδοχικά με τους παρακάτω διαλύτες : πετρελαϊκό αιθέρα, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Τα παραπάνω εκχυλίσματα συμπυκνώθηκαν υπό κενό μέχρι ξηρού και έδωσαν πράσινο στερεό υπόλειμμα βάρους 5,397 gr., 3,1857 gr και 47,86 gr αντίστοιχα. 2. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Ακολούθως, έγινε έλεγχος των εκχυλισμάτων με τη μέθοδο της χρωματογραφίας λεπτής στιβάδας σε πλάκες κελουλόζης 2x2 ( Merck 5552 ) και διαλύματα ανάπτυξης α) 15 % HOAc, β) MeOH:HOAc:H2O ( 5:45:5 ), γ) EtOAc:HOAc:H 2 O ( 8:2:4 ). Οι πλάκες παρατηρήθηκαν στο υπεριώδες φως ( 254 και 366 nm ) πριν και μετά την έκθεσή τους σε πυκνούς ατμούς αμμωνίας και τον ψεκασμό τους με αντιδραστήριο Neu. Από τα αποτελέσματα της χρωματογραφικής ανάλυσης φαίνεται ότι στο μεθανολικό εκχύλισμα συγκεντρώνονται κυρίως οι πολυφαινολικές ενώσεις με χαρακτηριστικά Rf και φθορισμούς των κηλίδων που σχηματίζουν, γεγονός που μας οδήγησε στη μελέτη του συγκεκριμένου εκχυλίσματος. 3. ΚΑΤΑΝΟΜΕΣ ΤΟΥ ΜΕΘΑΝΟΛΙΚΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΟΣ. Ένας επιπλέον διαχωρισμός επιτυγχάνεται με τις κατανομές χρησιμοποιώντας κατά σειρά διαλύτες αυξανόμενης πολικότητας, όπως περιγράφεται στη μέθοδο Charaux. Οι διαλύτες είναι ο αιθέρας, ο οξικός αιθυλεστέρας και η βουτανόλη.

42 Αρχικά, 1,5 lit απεσταγμένου νερού θερμάνθηκε μέχρι το σημείο βρασμού και προστέθηκε στο στερεό υπόλειμμα του εκχυλίσματος. Το υδατικό διάλυμα διηθήθηκε εν θερμώ και αφού ψύχθηκε, εκχυλίσθηκε με αιθέρα ( 5 x 2 ml ). Τα αιθερικά εκχυλίσματα συμπυκνώθηκαν υπό κενό μέχρι ξηρού και έδωσαν ένα σκούρο πράσινο στερεό υπόλειμμα βάρους 1,5 gr. Η ίδια διαδικασία εφαρμόστηκε και για τον οξικό αιθυλεστέρα και τη βουτανόλη. Το εκχύλισμα του οξικού αιθυλεστέρα συμπυκνώθηκε στο ½ του αρχικού του όγκου και σχημάτισε ίζημα το οποίο διαχωρίστηκε με διήθηση. Το ίζημα και το διήθημα κρατήθηκαν χωριστά και τα βάρη τους ήταν 1,37 gr και 4,53 gr αντίστοιχα. Το διάλυμα της βουτανόλης συμπυκνώθηκε υπό κενό δίνοντας ένα στερεό υπόλειμμα 6,7 gr. Το υδατικό διάλυμα που έμεινε μετά από τις κατανομές έδωσε στερεό υπόλειμμα βάρους 3,98 gr. Ακολούθησε χρωματογραφικός έλεγχος των τεσσάρων στερεών υπολειμμάτων που προέκυψαν, σε πλάκες κελουλόζης και διαλύτες ανάπτυξης : 15 % HOAc, 3% HOAc, EtOAc:AcOH:H 2 O (8:2:4 ) και CH 2 CI 2 :AcOH:H 2 O (5:45:5 ). Οι πλάκες παρατηρήθηκαν στο υπεριώδες φως ( 254 και 366 nm ) πριν και μετά την έκθεσή τους σε πυκνούς ατμούς αμμωνίας καθώς και μετά από ψεκασμό με Neu και υπολογίστηκε το Rf των κηλίδων που σχηματίστηκαν. Πίνακας 1. Χρωματογραφικός έλεγχος των στερεών υπολειμμάτων του εκχυλίσματος της μεθανόλης που προέκυψαν από κατανομές. Οξικός αιθυλεστέρας ( διήθημα ). AcOH 3 % Rf Χρώμα κηλίδας NH3 Neu.15 υποκίτρινο υποκίτρινο ροζ.22 >> >> >>.32 >> >> >>.48 μαύρο μαύρο μαύρο.52 υποκίτρινο υποκίτρινο υποκίτρινο.62 υποκίτρινο γαλάζιο γαλάζιο.68 υποκίτρινο πράσινο πράσινο.75 υποκίτρινο πράσινο πράσινο