Σαγρή Χ.Ευθυμία. Department of Biochemistry and Biotechnology University of Thessaly

Transcript

1 Department of Biochemistry and Biotechnology University of Thessaly Laboratory of Molecular Biology and Genomics ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΣΗΜΑΝΤΙΚΟΤΕΡΟΥ ΠΑΡΑΣΙΤΟΥ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ, ΤΟΥ ΕΝΤΟΜΟΥ BACTROCERA OLEAE, ΜΕ ΕΜΦΑΣΗ ΣΤΑ ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΚΑΙ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΤΑ ΕΝΤΟΜΟΚΤΟΝΑ Σαγρή Χ.Ευθυμία Υπ. Διδάκτωρ Παν/μιου Θεσσαλίας Τμήμα: Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Γονιδιωματικής Επιβλέπων καθηγητής: Ματθιόπουλος Κων/νος

2 Η ΕΛΙΑ Ελαιόλαδο Βασικό στοιχείο της Μεσογειακής δίαιτας

3 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ Συνολικά 97 εκατομμύρια στρέμματα!

4 Το 98% της παγκόσμιας παραγωγής βρίσκεται στη λεκάνη της Μεσογείου

5 ΠΑΓΚΟΣΜΙΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΕΛΑΙΟΠΑΡΑΓΩΓΗΣ 45% 40% 35% 30% 25% 20% 3 η χώρα παγκοσμία στην παραγωγή ελαιόλαδου 15% 10% 5% 0% Ισπανία Ιταλία Ελλάδα Τουρκία Πορτογαλία Γαλλία Κύπρος Αργεντινή USA Σειρά1 42% 25% 15% 3% 1% 0,20% 0,10% 0,40% 0,04%

6 Ο ΔΑΚΟΣ ΤΗΣ ΕΛΙΑΣ Τάξη: Diptera Οικογένεια: Tephritidae Γένος: Bactrocera Μονοφάγο είδος Η ζημία είναι: ποσοτική και ποιοτική Οι απώλειες είναι δυνατό να υπερβούν το 30% της ολικής παραγωγής Οικονομικές ζημιές της τάξεως των $ παγκοσμίως

7 ΒΙΟΛΟΓΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Bactrocera oleae

8 ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ ΤΟΥ B. oleae Οργανοφωσφορικά εντομοκτόνα Πυρεθρίνες Spinosad Κίνδυνοι: Οικολογικές διαταραχές Δημιουργία και εξάπλωση ανθεκτικότητας Επιβλαβείς τοξικολογικές επιδράσεις Συνέπειες στην υγεία του ανθρώπου SIT (Sterile Insect Technique), τεχνική του στείρου εντόμου

9 SIT Απαραίτητη προϋπόθεση αποτελεσματικής εφαρμογής της SIT αποτελεί ο διαχωρισμός των δύο φύλων, ώστε να εξαπολύονται μόνο αρσενικά Γενετικός μετασχηματισμός

10 SIT Επιτυχής SIT στη Μεσογειακή μύγα (Tephritidae) λόγω ανάπτυξης μοριακών και γενετικών εργαλείων ενώ Στον δάκο μεγάλη έλλειψη μοριακών και γενετικών εργαλείων Αρχές του 70 αποτυχία της μεθόδου χαμηλή ανταγωνιστικότητα εργαστηριακών αρσενικών εντόμων σε σχέση με τα άγρια

11 ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΜΕΤΑΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΕΡΓΑΛΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗΝ SIT ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΤΟΠΩΝ ΦΥΛΟΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ

12 ΣΚΟΠΟΣ Διερεύνηση διαφορικής έκφρασης τρανσκριπτόματος και πρωτεόματος σε: Αρσενικά και θηλυκά άτομα δάκου με εντοπισμό και απομόνωση γονιδίων που εμπλέκονται σε μονοπάτια φυλοδιαχωρισμού Ευαίσθητα και ανθεκτικά στο εντομοκτόνο spinosad άτομα με σκοπό την αποκάλυψη μηχανισμών ανθεκτικότητας

13 1. ΤΡΑΝΣΚΡΙΠΤΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Ανάλυση του συνόλου της γονιδιακής έκφρασης Εξετάζει το επίπεδο έκφρασης ΟΛΩΝ των mrnas σε ένα δεδομένο κυτταρικό πληθυσμό

14 Complete SOLiD system RNA-sequencing RNA Extraction mrna selection Library preparation Data analysis Sequencing

15 ΣΥΝΑΡΜΟΛΟΓΗΣΗ Contig: μικρά διαβάσματα της αλληλουχίας με επικαλύψεις ώστε να συναρμολογούνται σε ένα μεγαλύτερο μετάγραφο

16 Συνολικά κατασκευάστηκαν 4 βιβλιοθήκες ΕΝΤΟΜΑ 1. Αρσενικά 2. Θηλυκά 3. Ευαίσθητα 4. Ανθεκτικά στο spinosad ΙΣΤΟΙ όργανα αναπαραγωγής (testis) κεφάλια (sp, acg) Εντοπισμός γονιδίων που υπερεκφράζονται

17 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Στατιστικά σημαντικά διαφορετικής έκφρασης γονίδια (MA-plot) RESISTANT-SENSITIVE

18 Διαφορές έκφρασης μεταξύ ευαίσθητων και ανθεκτικών εντόμων ποσοστό % ποσοστό %

19 2. ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Νέα προσέγγιση μελέτης των βιολογικών συστημάτων Ασχολείται με την ανάλυση του πρωτεόματος: του συνόλου των πρωτεϊνών ενός οργανισμού και ιδιαίτερα με τις δομές και τις λειτουργίες τους

20 2D GEL-PROTEOMICS Η πρωτεΐνη έλκεται κάτω δεξιά ή αριστερά ανάλογα με το μοριακό βάρος της

21 Διαφορές αρσενικών-θηλυκών εντόμων σε 2D-PAGE Συλλογή και κεφαλιών δάκου και διαχωρισμός πρωτεϊνών με 2D Ταυτοποίηση πρωτεϊνών μέσω βάσης δεδομένων της Drosophila melanogaster

22 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Spot no Table1. Proteins Identified by Mass Spectrometry after Separation by 2D-PAGE Protein name Accession no. Mw(kDa) pi Length (aa) 2 ArgK-PB FBpp IDH(Isocitrate Dehydrogenase) Q9VWH ε FBpp ζ FBpp Snap25 FBpp Ranbp21 FBpp Act87E FBpp Act5C FBpp CG30325-PA FBpp GstD1-PA FBpp GstD9-PA FBpp Jafrac 1-PB (Peroxiredoxin) FBpp

23 H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.

24