This work is part of the Valorization of cheese dairy and winery wastes for the production of high added-value products project (19SMEs2009),

Transcript

1 This work is part of the Valorization of cheese dairy and winery wastes for the production of high added-value products project (19SMEs2009), implemented within the National Strategic Reference Framework (NSRF) and co-financed by National (Greek Ministry- General Secretariat of Research and Technology) and Community Funds (E.U.-European Social Fund)

2 Τυρόγαλα Είναι το προϊόν που λαμβάνεται με τη χρήση οξέων, πυτιάς και/ή φυσικοχημικών μεθόδων, κατά τη παραγωγή τυριών και καζεΐνης (κανονισμός 625/ Ε.Ε.) Η παγκόσμια παραγωγή τυρογάλακτος ξεπερνά τους 160 εκατομμύρια τόνους το χρόνο, με ένα ρυθμό αύξησης ~2%, ενώ η παραγωγή του στη χώρα μας υπερβαίνει τους 700 χιλιάδες τόνους ετησίως Αντιπροσωπεύει το 85-88% του βάρους του γάλακτος. Αποτελείται κυρίως από λακτόζη 4,5-5%w/v, υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες 0,6-0,8%w/v, λιπίδια 0,4-0,5%w/v και μεταλλικά άλατα 8-10% επί ξηρού και άλλα συστατικά όπως γαλακτικό και κιτρικό οξύ, μη-πρωτεϊνικά αζωτούχα συστατικά καθώς και βιταμίνες της ομάδας Β

3 Ο κύριος όγκος του εν λόγω αποβλήτου παράγεται κατά το στάδιο της δαίρεσης του τυροπήγματος Ο χαρακτηρισμός του ως ρυπαντής οφείλεται αφενός στο ότι παράγεται σε μεγάλες ποσότητες, που καθιστούν πρόβλημα τη διαχείρησή του και αφετέρου στα υψηλά BOD g/l και COD g/l, ενώ σε ορισμένες έρευνες βρέθηκε ότι περιέχει σε πολύ μικρές ποσότητες βαρέα μέταλλα (Pb, Kd, Al). Είναι πιθανή η ύπαρξη παθογόνων μικροοργανισμών Το αποτέλεσμα είναι να θέτει σε κίνδυνο τη φυσική δομή και τις χημικές ιδιότητες του εδάφους όταν απορρίπτεται σε αυτά ή φαινόμενα ευτροφισμού, δυσοσμίας και υποβάθμιση της ποιότητας των νερών όταν απορρίπτεται σε υδάτινους αποδέκτες.

4 Αξιοποίηση τυρογάλακτος: 1. Ζωοτροφή για μυρικαστικά και άλλα ζώα 2. Λίπασμα 3. Σκόνη τυρογάλακτος που χρησιμοποιείται ως πρόσθετο σε τρόφιμα ή στη Βιομηχανία καλλυντικών και φαρμάκων 4. Τυριά τυρογάλακτος 5. Παραγωγή αιθανόλης 6. Παραγωγή βιοαερίου 7. Παραγωγή μονοκυτταρικής πρωτεΐνης 8. Οργανικά οξέα, βιταμίνες και αμινοξέα 9. Μικροβιακά λιπίδια (παρούσα μελέτη)

5 Οινολάσπη Είναι το υπόλειμμα που σχηματίζεται στις δεξαμενές κατά τη ζύμωση, την αποθήκευση ή εγκεκριμένες επεξεργασίες του οίνου, καθώς και κατά το φιλτράρισμα ή την φυγοκέντρηση αυτού του προϊόντος (EEC No. 337/79) Η εγχώρια παραγωγή σταφυλιών ανέρχεται περίπου στα 1,6 εκατομμύρια τόννους, ενώ η παραγωγή οίνου περίπου στα 5 εκατομμύρια εκατόλιτρα, 40% κόκκινο κρασί και 60% λευκό Η οινολάσπη αποτελεί το 3,5-8,5% σε σχέση με την αρχική ποσότητα σταφυλιών και συνίσταται από μικροοργανισμούς (κυρίως ζύμες), αιθανόλη, τρυγικό οξύ, φαινολικές ενώσεις και ανόργανη ύλη Ο χαρακτηρισμός της ως απόβλητο οφείλεται στo υψηλό BOD 1740mg/L και 1970mg/L, καθώς και το COD 3112mg/L και 3997mg/L για τα λευκά και τα κόκκινα κρασιά αντίστοιχα. Επίσης οι φαινολικές ενώσεις που περιέχουν δύναται να είναι τοξικές για το περιβάλλον

6 Αξιοποίηση οινολάσπης: 1. Λίπανση εδάφους μετά από κομποστοποίηση 2. Ζωοτροφή μετά από κατάλληλη επεξεργασία 3. Παραγωγή τρυγικού οξέος 4. Παραγωγή αιθανόλης 5. Παραγωγή φαινολικών 6. Παραγωγή γλυκονικού οξέος, κιτρικού οξέος, καροτενοειδών μέσω ζυμώσεων στερεής φάσης 7. Παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων (παρούσα μελέτη)

7 ΤΑ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΑ ΕΛΑΙΑ Διάφοροι μικροοργανισμοί όταν καλλιεργούνται υπό ορισμένες συνθήκες αύξησης είναι δυνατόν να αποθηκεύσουν εντός των κυττάρων τους λίπος μέχρι και 70% (κ. β.) επί της ξηράς τους ουσίας Οι μικροοργανισμοί αυτοί καλούνται ελαιογόνοι (oleaginous) το δε λίπος μονοκυτταρικό λίπος (single-cell oil - SCO) ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΟ ΛΙΠΟΣ ΓΕΝΙΚΑ ΠΟΛΥΑΚΟΡΕΣΤΟ ΣΥΣΤΑΣΗ ΣΕ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ ΟΜΟΙΑΖΟΥΣΑ ΑΥΤΗΣ ΦΥΤΩΝ

8 Η Βιοτεχνολογία παραγωγής μικροβιακών ελαίων έχει εμπορική και βιομηχανική σημασία μόνο στην περίπτωση κατά την οποία το παραγόμενο μικροβιακό λίπος εμφανίζει σύσταση ή/και δομή η οποία να είναι σπανίως απαντώμενη στα διάφορα λίπη του Φυτικού ή του Ζωικού Βασιλείου 1. ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΑ ΕΞΩΤΙΚΩΝ ΛΙΠΩΝ (ΛΙΠΟΣ ΚΑΚΑΟ) 2. ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΛΙΠΟΥΣ ΜΕ ΑΣΥΝΗΘΗ ΠΟΛΥΑΚΟΡΕΣΤΑ ΛΙΠΑΡΑ ΟΞΕΑ (π.χ. γ-λινολενικο ΟΞΥ, ΑΡΑΧΙΔΟΝΙΚΟ ΟΞΥ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΑ EPO, ΛΙΠΟΥΣ ΦΑΛΑΙΝΑΣ κλπ) SCO ΩΣ ΤΡΟΦΙΜΟ Ή ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΟ ΣΚΕΥΑΣΜΑ

9 Τα τελευταία χρόνια υπάρχει μεγάλη προσπάθεια για μείωση του κόστους παραγωγής των SCO ώστε να χρησιμοποιηθούν ως «μη-συμβατικές» λιπαρές ύλες για παραγωγή βιολογικού πετρελαίου (βιοντήζελ) Αξιοποίηση υπολειμμάτων βιομηχανιών τροφίμων -Τυρόγαλα -Μελάσες -Λιγνοκυτταρινούχα υδρολύματα -Απόνερα πλούσια σε σάκχαρα -Υγρά απόβλητα ελαιουργίας -Απόβλητη γλυκερόλη

10

11 Συνεχόμενη αυξητική τάση της τιμής των καυσίμων τα τελευταία χρόνια

12

13 Σχηματικό διάγραμμα παραγωγής βιοντήζελ Κύριο απόβλητο της διεργασίας η βιομηχανική γλυκερόλη (γλυκερίνη)

14 «1 ης γενιάς» βιοκαύσιμα -Προερχόμενα από συμβατικές (εδώδιμες) λιπαρές πρώτες ύλες (π.χ. έλαιο ελαιοκράμβης, πυρηνέλαιο, σογιέλαιο κλπ) για την περίπτωση του βιοντήζελ, ή από ζύμωση εδωδίμων σακχάρων (π.χ. προερχόμενων από το καλαμπόκι ή το ζαχαροκάλαμο), για την περίπτωση της αιθανόλης -Αύξηση της τιμής των τροφίμων -Αδιανόητη η χρήση καλλιεργήσιμης γης για παραγωγή καυσίμων και όχι τροφίμων ΑΝΑΓΚΗ ΕΞΕΥΡΕΣΗΣ «ΜΗ-ΣΥΜΒΑΤΙΚΩΝ» ΚΑΥΣΙΜΩΝ

15 «2 ης γενιάς» βιοκαύσιμα -Αιθανόλη προερχόμενη από ζύμωση αποβλήτων (π.χ. υδρολυμένων λιγνοκυτταρινούχων υλικών, ΥΑΕ, απόβλητης μελάσας, κλπ) -Βιοντήζελ προερχόμενο από α) «ψημένα τηγανισμένα θερμικώς κατεργασμένα» λιπίδια, ακατάλληλα προς βρώση β) από απόβλητα λιπίδια σφαγείων και συναφών βιομηχανικών και βιοτεχνικών μονάδων (μονάδες παραγωγής κρεατοσκευασμάτων) γ) από έλαιο μικροοργανισμών το οποίο θα έχει παραχθεί κατά την αύξηση μικροοργανισμών σε υδρολύματα λιγνοκυτταρινών, σε απόβλητα βιομηχανιών τροφίμων (π.χ. τυρόγαλα ), σε γλυκερόλη και σε άλλα αρνητικού κόστους υλικά δ) από λίπος εντόμων που θα έχουν τραφεί από απορρίματα ε) από λίπος διαφόρων «μη συμβατικών» πηγών (π.χ. λίπος από κροκόδειλο, έλαιο από το φυτό Jatropha curcas, κλπ)

16 «3 ης γενιάς» βιοκαύσιμα Κυρίως αναφερόμαστε στο βιοντήζελ προερχόμενο από αυτοτρόφως αναπτυσσόμενα ελαιογόνα φύκη -Δέσμευση (sequestration) CO2 -Ταυτόχρονη μείωση αερίων εκπομπών «θερμοκηπίου» και παραγωγή ενός πλήρως «ανανεώσιμου» καυσίμου -Μειωμένη παραγωγή βιομάζας σε σχέση με τα 2 ης γενιάς λιπίδια ΣΥΝΕΧΗΣ ΕΡΕΥΝΑ ΣΤΟΝ ΤΟΜΕΑ

17 BIOXHMEIA ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΛΙΠΟΥΣ NADPH 2 NADPH 2 NAD NADH 2 Pyruvate NADP ME NADPH 2 -CO 2 MD c Oxaloacetate Malate ADP Citrate ATP ACL CH 3 COSCoA Malonyl-SCoA Glucose EMP NAD NADH 2 Biomass ATP a b c d ADP Pyruvate Oxaloacetate PD MD m Malate CS Citrate Ac Iso-citrate ICDH a-ketoglutarate CYTOSOL MITOCHONDRION CH 3 COSCoA Malate Succinate Succinyl-CoA NADP FFAs FAS ATP ADP Malate CH 3 COSCoA Iso-citrate ICL Glyoxylate + TRSP Succinate PEROXYSOME Citrate EXTRA-CELLULAR MEDIUM

18 Ταυτόχρονη αξιοποίηση των προαναφερθέντων αποβλήτων της Βιομηχανίας Τροφίμων προς παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων Διερεύνηση της ικανότητας μικροοργανισμών να αναπτύσσονται σε αυτά τα συνυποστρώματα, προς παραγωγή του επιθυμητού προϊόντος Αποτοξίνωση κατά το δυνατόν των εν λόγω αποβλήτων, ώστε να είναι λιγότερο επιβλαβής η απόδοσή τους στο περιβάλλον

19 Ο μικροοργανισμός που επιλέχθηκε ήταν η ζύμη Cryptococcus curvatus ATCC Το τυρόγαλο χρησιμοποιήθηκε ως πηγή άνθρακα (~120g/L), ενώ η οινολάσπη έπειτα από επεξεργασία, ώστε να παραλειφθεί το υδρόλυμά της, αποτέλεσε τη πηγή αζώτου(150, 250 και 400mg/L FAN) Πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες βυθού σε κωνικές φιάλες 250mL σε ανακινούμενο επωαστικό κλίβανο, καθώς και καλλιέργειες ημι-διαλείποντος έργου σε βιοαντιδραστήρα Προσδιορισμός αναγόντων σακχάρων με DNS Προσδιορισμός του αζώτου των ελεύθερων αμινομάδων και πεπτιδίων (FAN) Μελέτη μικροβιακού λίπους (με εκχύλιση, προσδιορισμός συγκέντρωσης, μεθυλεστεροποίηση και ποιοτικός προσδιορισμός σε αέριο χρωματογράφο)

20 Καλλιέργειες βυθού σε κωνικές φιάλες Πίνακας 1 Κινητικά δεδομένα της αύξησης διαφόρων στελεχών ζυμών σε καθαρή λακτόζη αρχικής συγκέντρωσης 30 g/l. Στέλεχος Χρόνος (h) Βιομάζα (g/l) Λακ con (g/l) Λιπίδια (g/l) Y L/X (%, w/w) Cryptococcus curvatus ATCC Cryptococcus curvatus NRRL Y Lipomyces starkeyi DSM Rhodosporidium toruloides DSM Rhodosporidium toruloides NRRL Y Rhodotorula glutinis NRRL YB

21 Λακτόζη (g/l) Βιομάζα (g/l) Λιπίδια (g/l) Λακτόζη (g/l) Βιομάζα, Λιπίδια (g/l) Χmax = 33,4 g/l YL/X = 21,0% YX/S = 0,29 g/g Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα 1 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις της βιομάζας (κυτταρική μάζα και λιπίδια), της λακτόζης και του μικροβιακού λίπους κατά την καλλιέργεια της ζύμης C. curvatus ATCC σε υδρόλυμα οινολάσπης Μerlot (FAN 150 mg/l) ως υγρό καλλιέργειας και συμπυκνωμένου τυρογάλακτος (λακτόζη ~120 g/l) ως πηγή ανθρακα Λακτόζη (g/l) Βιομάζα (g/l) Λιπίδια (g/l) Χmax=36,5 g/l YL/X = 9,5% YX/S = 0,38 g/g Λακτόζη (g/l) Βιομάζα, Λιπίδια (g/l) Χρόνος ζύμωσης (h) Διάγραμμα 2 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις της βιομάζας (κυτταρική μάζα και λιπίδια), της λακτόζης και του μικροβιακού λίπους κατά την καλλιέργεια της ζύμης C. curvatus ATCC σε υδρόλυμα οινολάσπης Μerlot (FAN 250 mg/l) ως υγρό καλλιέργειας και συμπυκνωμένου τυρογάλακτος (λακτόζη ~120 g/l) ως πηγή ανθρακα

22 Λακτόζη (g/l) Λακτόζη (g/l) Βιομάζα (g/l) Λιπίδια (g/l) Χρόνος ζύμωσης (h) Βιομάζα, Λιπίδια (g/l) Χmax = 33,6 g/l YL/X = 8,6% YX/S = 0,49 g/g Διάγραμμα 3 Μεταβολές στις συγκεντρώσεις της βιομάζας (κυτταρική μάζα και λιπίδια), της λακτόζης και του μικροβιακού λίπους κατά την καλλιέργεια της ζύμης C. curvatus ATCC σε υδρόλυμα οινολάσπης Μerlot (FAN 400 mg/l) ως υγρό καλλιέργειας και συμπυκνωμένου τυρογάλακτος (λακτόζη ~120 g/l) ως πηγή ανθρακα

23 Πίνακας 2 Συγκεντρωτικός πίνακας μέγιστων αποτελεσμάτων καλλιεργειών βυθού Χρόνος (h) C cons (g/l) Βιομάζα (g/l) 150 FAN 250 FAN 400 FAN C Λιπίδια YL/X cons Βιομάζα YL/X C cons Βιομάζα Λιπίδια (g/l) (%) Yx/s (g/g) (g/l) (g/l) Λιπίδια (g/l) (%) Yx/s (g/g) (g/l) (g/l) (g/l) YL/X (%) Yx/s (g/g) , , , ,49 Παρατηρούμε ότι οι μέγιστες τιμές παρουσιάζονται στις ίδιες ώρες καλλιέργειας, με τη διαφορά όμως πως στις δύο τελευταίες δεν είχαμε πλήρη κατανάλωση του υποστρώματος

24 Καλλιέργειες ημι-διαλείποντος έργου 80 Λακτόζη Βιομάζα Λίπος Βιομάζα άνευ λίπους FAN Λακτόζη, Λίπος Βιομάζα, Βιομάζα άνευ λίπους (g/l) FAN (mg/l) Χρόνος ζύμωσης (h) 0 Διάγραμμα 4 Κινητική ζύμωσης ημι-διαλείποντος έργου της ζύμης C. curvatus ATCC σε υγρό καλλιέργειας υδρόλυμα οινολάσπης και τυρογάλακτος.

25 Πίνακας 4 Σύνθεση λιπιδίων σε ζυμώσεις βυθού C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 α-c18:3 C20:0 C20:1 C22:1 96h FAN h FAN h FAN h FAN h FAN h FAN Πίνακας 5 Σύνθεση λιπιδίων σε ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 α-c18:3 C20:0 C20:1 C22:1 15h h h

26 Πίνακας 6 Σύνθεση λιπαρών οξέων στα λιπιδιακά κλάσματα σε ζυμώσεις ημιδιαλείποντος έργου C10 :0 C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 α-c18:3 C20:0 C20:1 C22:1 N (92.5%) - - 0,4 20,7 1,1 8,1 59,4 9,2 0, S-G (4,4%) - - 1,0 23,6 2,3 8,8 43,7 20,1 0, P (3,2%) - - 0,6 17,2 2,1 7,8 47,7 23,8 0,

27 Η ζύμη Cryptococcus curvatus ATCC παρουσιάζει πολύ καλή ανάπτυξη σε λακτόζη FAN αυξάνει τη παραγωγή βιομάζας που είναι πολύ καλό για τη παραγωγή Single-Cell Protein Υψηλή παραγωγή λιπιδίων και απόδοση σε συνυποστρώματα τυρογάλακτος-υδρολύματος οινολάσπης, συγκρίσιμες με τις υψηλές της διεθνούς βιβλιογραφίας Πολύ υψηλή παραγωγικότητα (QL) στις ζυμώσεις σε βιοαντιδραστήρα

28 Τα λιπίδια αποτελούνται κυρίως από ακόρεστα λιπαρά οξέα Το λίπος που παράγεται δύναται να χρησιμοποιηθεί στη παραγωγή 2ης γενιάς βιοντήζελ

29 Πίνακας 7 Σύγκριση αποτελεσμάτων με διεθνή βιβλιογραφία Fermentation type Strain Substrate CDW (g/l) Lipids (g/l) YL/X (%) YL/S (g/g) QL (g/l/h) Reference Shake flasks Cryptococcus curvatus KCTC Cheese whey Seo et.al., 2014 Batch Cryptococcus curvatus ATCC Deproteinized whey Daniel et.al., 1999 Batch Apiotrichum curvatum ATCC Wheypermeate Ykema et.al., 1988 Recycling Apiotrichum curvatum ATCC Wheypermeate Ykema et.al., 1988 Continuous Apiotrichum curvatum ATCC Wheypermeate Ykema et.al., 1988 Partial recycling Apiotrichum curvatum ATCC Wheypermeate Ykema et.al., 1988 Continuous Candida curvata D Lactose Evans&Ratledge, 1983 Batch Candida curvata D Lactose Evans&Ratledge, 1983 Shake flasks Cryptococcus curvatus ATCC Glycerol-Spent yeast lysate Ryu et.al., 2012 Fed-Batch Cryptococcus curvatus ATCC Cheese whey-wine lees hydrolysate This study CDW=Cell Dry Weight

30