Οδηγίες χρήσης. Σειρά SSP Dynal AllSet + και CombiSet +

Transcript

1 Οδηγίες χρήσης Σειρά SSP Dynal AllSet + και CombiSet

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Περιλαµβάνονται στο κιτ προσδιορισµού τύπου... 4 Αποθήκευση ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 5 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ DYNAL...5 ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Συλλογή και προετοιµασία δειγµάτων Προετοιµασία της ενίσχυσης µε PCR Ενίσχυση µε PCR Ανίχνευση προϊόντων PCR µε χρήση ηλεκτροφόρησης σε πήκτωµα αγαρόζης... 9 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ.. 10 Έλεγχος ποιότητας Εσωτερικός έλεγχος ανάλυσης Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Ερµηνεία µε χρήση του λογισµικού Dynal SSPTool.. 11 Ο ΗΓΟΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗΣ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΕΓΓΥΗΣΗ.. 14 ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΑΥΤΟ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ / ΕΓΓΡΑΦΟ. 14 ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΑΥΤΟ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ / ΕΓΓΡΑΦΟ.. 14 ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ Σελίδα 2 από 15

3 Για in vitro διαγνωστική χρήση ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Προσδιορισµός τύπου του DNA των αλληλοµόρφων HLA τάξης Ι ή τάξης ΙΙ. ΙΑΚΡΙΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΥΠΟΥ Κιτ χαµηλής διακριτικότητας: Τα αλληλόµορφα διακρίνονται σε γενικό επίπεδο (επίπεδο οµάδας αλληλοµόρφων), η οποία συµφωνεί κατά κανόνα µε τις ορολογικά διαπιστωµένες ειδικότητες. Κιτ υψηλής διακριτικότητας: Κιτ προσδιορισµού υποτύπου τα οποία παρέχουν υψηλή διακριτικότητα µε προσδιορισµό γονοτύπου σε επίπεδο αλληλοµόρφου. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Σχεδόν όλες οι τεχνικές προσδιορισµού τύπου που βασίζονται στο DNA χρησιµοποιούν την τεχνική PCR 1 προκειµένου να ενισχυθεί ο προς διερεύνηση γενετικός τόπος HLA. Στις περισσότερες µεθόδους προσδιορισµού τύπου µε βάση το DNA, η τεχνική PCR αποτελεί ένα βήµα ενίσχυσης πριν τον προσδιορισµό, προκειµένου να αυξηθεί η ποσότητα του DNA-στόχου. Στη συνέχεια, η διαδικασία προσδιορισµού τύπου του HLA περιλαµβάνει οπωσδήποτε ένα βήµα µετά την ενίσχυση, κατά το οποίο διακρίνονται τα διάφορα αλληλόµορφα. Σε αντίθεση µε άλλες µεθόδους που βασίζονται στην PCR, η µεθοδολογία SSP 2,3,4,5 που χρησιµοποιεί η Dynal Biotech Ltd AllSet + και CombiSet + SSP, επιτυγχάνει τη διάκριση των διάφορων αλληλοµόρφων κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της PCR. Με τον τρόπο αυτό, ο χρόνος επεξεργασίας µετά την ενίσχυση περιορίζεται σε ένα απλό στάδιο ανίχνευσης µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα. ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ Η µέθοδος SSP της Dynal είναι µια τεχνική που βασίζεται στην PCR και χρησιµοποιεί εκκινητές ειδικής αλληλουχίας (Sequence Specific Primers SSP) για τον προσδιορισµό τύπου µε βάση το DNA. Τα προϊόντα SSP της Dynal συνίστανται σε οµάδες µιγµάτων εκκινητών, καθένα από τα οποία περιέχει ένα ή περισσότερα ειδικά ζεύγη εκκινητών (τους ειδικούς εκκινητές για το αλληλόµορφο και/ή την οµάδα αλληλοµόρφων), καθώς και ένα ζεύγος εκκινητών ελέγχου που αντιστοιχεί σε µη αλληλοµορφικές αλληλουχίες των δειγµάτων. Το ζεύγος εκκινητών ελέγχου λειτουργεί ως εσωτερικός έλεγχος της PCR, προκειµένου να ελεγχθεί η αποδοτικότητα της ενίσχυσης µε PCR. Η µέθοδος SSP της Dynal βασίζεται στην αρχή ότι οι εκκινητές µε πλήρη συµφωνία αλληλουχίας θα εµφανίζουν υψηλότερη απόδοση κατά την αντίδραση PCR απ ότι οι εκκινητές µε µία ή περισσότερες ασυµφωνίες στο 3 άκρο. Η ειδικότητα του συστήµατος προσδιορισµού τύπου αποτελεί µέρος του βήµατος ενίσχυσης µε PCR και, έτσι, η επεξεργασία των δειγµάτων µετά την ενίσχυση περιορίζεται στο ελάχιστο. Ο εντοπισµός των αλληλοµόρφων συνίσταται απλά στο να διαπιστωθεί κατά πόσον έλαβε χώρα ενίσχυση ή όχι, δηλαδή στην παρατήρηση και την ανίχνευση της ενίσχυσης µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. Η τεχνική PCR-SSP παρέχει υψηλό βαθµό διακριτικότητας, καθώς κάθε ζεύγος εκκινητών ανιχνεύει δύο συνδεδεµένες πολυµορφικές θέσεις, µε τοποθέτηση cis η µία προς την άλλη. Η µέθοδος διαθέτει υψηλή ευαισθησία, ειδικότητα και επαναληψιµότητα. Σελίδα 3 από 15

4 ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ Αντιδραστήρια που παρέχονται σε όλα τα κιτ AllSet + SSP ή CombiSet + SSP της Dynal Είδος 1. ίσκοι PCR µε προκατανεµηµένα και αποξηραµένα µίγµατα εκκινητών SSP Περιγραφή Κάθε κυψελίδα του δίσκου PCR περιέχει το προϊόν της αποξήρανσης ενός διαλύµατος εκκινητών SSP που περιλαµβάνει εκκινητές ειδικούς για συγκεκριµένα αλληλόµορφα και/ή οµάδες, καθώς και ένα ζεύγος εκκινητών ελέγχου που αντιστοιχεί σε µη αλληλοµορφικές αλληλουχίες. Το ζεύγος ελέγχου ενισχύει ένα τµήµα ενός συντηρητικού γονιδίου που εντοπίζεται σε όλα τα δείγµατα. 2. Καλύµµατα PCR Καλύµµατα για τη στεγανοποίηση των δίσκων PCR 3. Κύριο µίγµα (ο αριθµός των φιαλιδίων που περιέχει το κιτ εξαρτάται από τον αριθµό των αντιδράσεων PCR ανά ανάλυση βλ. πίνακα στη διπλανή στήλη) Αριθµός αντιδράσεων PCR ανά ανάλυση Αριθµός φιαλιδίων κύριου µίγµατος που περιέχει το κιτ (1,8 ml το καθένα) Συγκέντρωση 1x, έτοιµο για χρήση. Το κύριο µίγµα έχει βελτιστοποιηθεί για χρήση µε την DNA πολυµεράση AmpliTaq (Roche Molecular Systems, Inc.) Μπορείτε να λάβετε πληροφορίες για το ιδιοσκεύασµα επικοινωνώντας µε τη διεύθυνση hla@dynalbiotech.com 4. Οδηγίες χρήσης του προϊόντος / Φυλλάδιο πληροφοριών προϊόντος ειδικό για τη συγκεκριµένη παρτίδα 5. Φύλλο ερµηνείας Οδηγίες χρήσης και φυλλάδιο πληροφοριών προϊόντων ειδικό για τη συγκεκριµένη παρτίδα (BSPI) Φύλλο εργασίας για τον καθορισµό του αλληλοµόρφου ή της οµάδας αλληλοµόρφων που ταυτοποιούν τα αντίστοιχα µίγµατα εκκινητών. Φύλαξη 1. Οι δίσκοι PCR και το κύριο µίγµα πρέπει να φυλάσσονται σε θερµοκρασία 2-8 C. 2. Μην καταψύχετε τα αντιδραστήρια. 3. Εφόσον φυλάσσονται κατάλληλα, αυτά τα αντιδραστήρια και µίγµατα εκκινητών παραµένουν σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στο φυλλάδιο πληροφοριών προϊόντος για τη συγκεκριµένη παρτίδα. Σελίδα 4 από 15

5 ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 1. Για in vitro διαγνωστική χρήση 2. Όλες οι εργασίες µε τις µεθόδους SSP AllSet + και CombiSet + της Dynal θα πρέπει να εκτελούνται µε χρήση ορθής εργαστηριακής πρακτικής και µε βάση τις τοπικές κατευθυντήριες οδηγίες, π.χ. τα πρότυπα EFI ή τις οδηγίες CPA. 3. Προειδοποίηση βιολογικού κινδύνου Να χειρίζεστε όλα τα δείγµατα σαν δυνητικά µολυσµατικό υλικό. Κατά την εκτέλεση όλων των εργασιών θα πρέπει να φοράτε κατάλληλα γάντια και εξοπλισµό προστασίας. 4. Προειδοποίηση βιολογικού κινδύνου Θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωλήνες µε βιδωτά πώµατα για την προετοιµασία του δείγµατος, προκειµένου να αποτραπεί η εκτίναξη σταγονιδίων δείγµατος και πιθανή µόλυνση. 5. Προειδοποίηση βιολογικού κινδύνου: Ο χειρισµός όλων των δειγµάτων θα πρέπει να γίνεται ως εάν ήταν µολυσµατικά, µε χρήση ασφαλών εργαστηριακών διαδικασιών όπως αυτές που περιγράφονται στο έντυπο Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 6 και στο έγγραφο M29-T της NCCLS 7. Καθαρίστε και απολυµάνετε σχολαστικά όλες τις επιφάνειες εργασίας µε διάλυµα χλωρίνης (NaClO) 1%. Αποστειρώστε όλον τον εξοπλισµό και τα υλικά που έχουν έρθει σε επαφή µε κλινικά δείγµατα, προτού τα απορρίψετε. 6. Προειδοποίηση βιολογικού κινδύνου: Το βρωµιούχο αιθίδιο που χρησιµοποιείται για τη χρώση του DNA είναι δυνητικό καρκινογόνο. Να φοράτε πάντοτε γάντια νιτριλίου κατά τον χειρισµό διαλυµάτων βρωµιούχου αιθιδίου και πηκτωµάτων που έχουν υποβληθεί σε χρώση. 7. Προσοχή: Να φοράτε γυαλιά προστασίας από την υπεριώδη ακτινοβολία και να µην κοιτάζετε απευθείας προς την πηγή υπεριώδους ακτινοβολίας µε γυµνούς οφθαλµούς, κατά την παρατήρηση και τη φωτογράφηση των πηκτωµάτων. 8. Προσοχή: Οι πιπέτες που χρησιµοποιούνται για ενέργειες µετά την PCR δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται και για ενέργειες πριν την PCR. 9. Προσοχή: Μόλυνση. Αποφύγετε τη µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων όταν λαµβάνετε µερίδες από τα φιαλίδια των αντιδραστηρίων. Να φοράτε πάντοτε γάντια, ώστε να αποφευχθεί ο κίνδυνος µόλυνσης του δείγµατος. Συνιστάται η χρήση στείρων αναλώσιµων πιπετών και ρυγχών πιπέτας (tips) µε φίλτρο. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια µε ενδείξεις θολερότητας ή µικροβιακής µόλυνσης. 10. Προσοχή: Απόρριψη: Απορρίψτε τα µη χρησιµοποιηµένα αντιδραστήρια και τα απόβλητα σύµφωνα µε τους ισχύοντες κρατικούς, οµοσπονδιακούς, πολιτειακούς και τοπικούς κανονισµούς. 11. Το δελτίο δεδοµένων ασφαλείας υλικού (MSDS) διατίθεται για λήψη από τη διεύθυνση ή κατόπιν αιτήµατος από τον τοπικό αντιπρόσωπο της Dynal Biotech. ( είτε τα στοιχεία επικοινωνίας που παρατίθενται στην τελευταία σελίδα του ενθέτου αυτού). ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΕΙΤΑΙ ΑΛΛΑ ΕΝ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ DYNAL BIOTECH: 1. Χειροκίνητες πιπέτες (π.χ. Eppendorf, Gilson) 2. Αναλώσιµα ρύγχη πιπέτας µε φίλτρο για τις πιπέτες αυτές 3. Αναδευτήρας περιδίνησης (vortex) 4. Μικροφυγόκεντρος 5. Βάση φύλαξης δίσκου µικροσωληναρίων PCR 6. Σύστηµα PCR GeneAmp 9600 ή 9700 της Perkin-Elmer ή άλλος εγκεκριµένος θερµοκυκλοποιητής µε αντίστοιχες προδιαγραφές 7. Θερµαντικό στοιχείο / φούρνος µικροκυµάτων για τη θέρµανση των διαλυµάτων αγαρόζης 8. Συσκευή ηλεκτροφόρησης (π.χ. Electro-Fast Stretch 108 Complete, AB-0708, της ABgene) 9. Συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας 10. Σύστηµα τεκµηρίωσης φωτογραφιών/εικόνων πηκτωµάτων 11. Ανασυνδυασµένη Taq πολυµεράση (η Dynal συνιστά την πολυµεράση AmpliTaq ) 12. Αγαρόζη κατάλληλη για ηλεκτροφόρηση 13. Βρωµιούχο αιθίδιο Σελίδα 5 από 15

6 ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η διαδικασία αυτή θα πρέπει να εκτελείται σε δύο χώρους του εργαστηρίου (πριν και µετά την ενίσχυση µε PCR), όπως αναφέρεται στις παρακάτω οδηγίες. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΕΙΓΜΑΤΟΣ Προσοχή: Να χειρίζεστε όλα τα δείγµατα ως ικανά να µεταδώσουν λοιµογόνους παράγοντες. α. Η ΧΡΗΣΗ ΗΠΑΡΙΝΙΣΜΕΝΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΕΝ ΣΥΝΙΣΤΑΤΑΙ 8 β. Η αποµόνωση του DNA από τα ανθρώπινα εµπύρηνα κύτταρα µπορεί να γίνει µε οποιαδήποτε µέθοδο προτιµάτε. γ. Για τα καλύτερα δυνατά αποτελέσµατα από την ενίσχυση PCR-SSP και τον προσδιορισµό τύπου, χρησιµοποιήστε DNA υψηλής καθαρότητας (λόγος OD 260:280 1,6-1,8). δ. Η τελική συγκέντρωση του DNA πριν από τη διαδικασία PCR-SSP θα πρέπει να είναι περίπου 50ng/µl. ε. Το αποµονωµένο DNA θα πρέπει να αραιωθεί σε απεσταγµένο H 2 0. στ. Το DNA µπορεί να αποθηκευτεί σε θερµοκρασία -20 C ή χαµηλότερη για παρατεταµένα χρονικά διαστήµατα (> 1 έτος) χωρίς δυσµενείς συνέπειες στα αποτελέσµατα. Το DNA που αποθηκεύεται σε θερµοκρασία +4 για µεγάλο διάστηµα αποικοδοµείται και προκαλεί τεχνήµατα, π.χ. µη ειδική ενίσχυση. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ PCR (εκτελείται στο χώρο για εργασίες πριν την PCR) Για να εκτελέσετε έναν µοναδικό προσδιορισµό τύπου, παρασκευάστε το παρακάτω µίγµα PCR. Συµβουλευτείτε τον πίνακα στην επόµενη σελίδα για τους απαιτούµενους όγκους (ανάλογα µε τον αριθµό των αντιδράσεων PCR σε κάθε ανάλυση) Κύριο µίγµα DNA δείγµατος (σε συγκέντρωση 50 ng/µl) DNA πολυµεράση AmpliTaq (σε συγκέντρωση 5 i.u./µl) Αναµείξτε καλά Μεταφέρετε 10 µl του παραπάνω µίγµατος PCR σε κάθε κυψελίδα του δίσκου SSP Dynal AllSet + ή CombiSet + Τοποθετήστε τα καπάκια PCR και κλείστε καλά για να βεβαιωθείτε ότι οι σωλήνες είναι πλήρως σφραγισµένοι. Μπορείτε να χρησιµοποιήσετε κάποιο εργαλείο τοποθέτησης καπακιών. Μπορείτε επίσης να χρησιµοποιήσετε αυτοκόλλητα φύλλα στεγανοποίησης, συµβατά µε PCR. Τα δείγµατα είναι πλέον έτοιµα για ενίσχυση µε PCR. Φυλάξτε τα υπόλοιπα των αντιδραστηρίων του κιτ σε θερµοκρασία 2-8 C Σελίδα 6 από 15

7 Πίνακας υπολογισµού για µίγµατα PCR: Αντιδράσεις PCR ανά ανάλυση Κύριο µίγµα (µl) DNA δείγµατος (µl) AmpliTaq (µl) ,6 0, ,4 0, ,2 0, ,0 0, ,8 0, ,6 1, ,4 1, ,2 1, ,0 1, ,8 1, ,4 2, ,2 2, ,0 2, ,8 2, ,6 2, ,6 3, ,2 3, ,0 4, ,8 4, ,6 4, ,0 9,00 ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για τους µονούς αριθµούς αντιδράσεων PCR ανά ανάλυση, οι οποίοι δεν αναφέρονται στον παραπάνω πίνακα, θα πρέπει να χρησιµοποιήσετε τον επόµενο ζυγό αριθµό (εάν π.χ. έχετε 13 αντιδράσεις PCR ανά ανάλυση, θα πρέπει να ανατρέξετε στους υπολογισµούς για 14 αντιδράσεις). Σελίδα 7 από 15

8 ΙΑΤΑΞΗ ΙΣΚΟΥ Ο σωστός προσανατολισµός του δίσκου διασφαλίζεται από το µίγµα εκκινητών της κυψελίδας υπ αριθµόν 1 (που υποδεικνύεται επίσης από τη χρήση µπλε χρωστικής), η οποία επισηµαίνεται µε τον αριθµό παρτίδας που βρίσκεται τυπωµένος στο πλάι π.χ HLA-X ΑΛΛΟΙ ΑΡΙΘΜΟΙ ΠΟΥ ΤΥΧΟΝ ΑΝΑΓΡΑΦΟΝΤΑΙ ΑΝΑΓΛΥΦΑ ΣΤΟΝ ΠΛΑΣΤΙΚΟ ΙΣΚΟ, Π.Χ. 1,2,3, ΘΑ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ ΑΓΝΟΗΘΟΥΝ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΕΝΙΣΧΥΣΗΣ PCR (εκτελείται στο χώρο για εργασίες µετά την PCR) 1. Τοποθετήστε τον δίσκο SSP AllSet + ή CombiSet + στον θερµοκυκλοποιητή. Προγραµµατίστε τον θερµοκυκλοποιητή µε τις παρακάτω παραµέτρους: Βήµατα Θερµοκρασία Χρόνος Ενέργεια ( C) (δευτ.) Βήµα αποδιάταξης Α Αποδιάταξη 10 κύκλοι Αποδιάταξη Υβριδοποίηση 20 κύκλοι Προέκταση Αποδιάταξη Υβριδοποίηση Προέκταση Για πληροφορίες σχετικά µε τον συγκεκριµένο θερµοκυκλοποιητή, ανατρέξτε στο εγχειρίδιο του κατασκευαστή. 2. Ξεκινήστε το πρόγραµµα. 3. Όταν ολοκληρωθεί το πρόγραµµα, αφαιρέστε τα δείγµατα από τον θερµοκυκλοποιητή. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μην φέρετε το ενισχυµένο DNA στον χώρο των εργασιών πριν την ενίσχυση PCR. Σελίδα 8 από 15

9 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ PCR ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Σηµείωση: Συνιστάται η χρήση του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος για την παρασκευή του πηκτώµατος και για την ηλεκτροφόρηση: εάν δηλαδή χρησιµοποιήσετε διάλυµα ΤΒΕ 0,5x στο πήκτωµά, χρησιµοποιήστε επίσης ΤΒΕ 0,5x ως το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης. 1. Παρασκευάστε πήκτωµα αγαρόζης 2% (κ.β.) (ABgene MultiABgarose, AG-0100c) σε ρυθµιστικό διάλυµα TBE 0,5 x. α) ιαλύστε την αγαρόζη (2g/100ml ρυθµιστικού διαλύµατος TBE 0,5 x), βράζοντας το ρυθµιστικό διάλυµα σε φούρνο µικροκυµάτων µέχρι πλήρους διάλυσης. Ψύξτε στους 60 C. Προσθέστε βρωµιούχο αιθίδιο µέχρι τελικής συγκέντρωσης 0,5 µg/ml πηκτώµατος. β) Χύστε σε µήτρα ποσότητα διαλύµατος επαρκή για πήκτωµα πάχους 3-4 mm, µε οπές πλάτους 3 mm. Αφήστε το να πήξει επί 15 λεπτά τουλάχιστον. 2. α) Μεταφέρετε το πήκτωµα αγαρόζης σε µονάδα ηλεκτροφόρησης µε πλήρη εµβάπτιση. Το πήκτωµα θα πρέπει να καλύπτεται από διάλυµα TBE 0,5 x σε βάθος 1-2 mm περίπου. Αφαιρέστε προσεκτικά το χτένι. Μεταφέρετε ολόκληρη την ποσότητα του προϊόντος της PCR κατευθείαν και προσεκτικά στο πήκτωµα. 3. Εκτελέστε την ηλεκτροφόρηση σε ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ 0,5 x. Ηλεκτροφορήστε τα µικρά πηκτώµατα (minigel πηκτώµατα µε απόσταση µεταξύ των ηλεκτροδίων µικρότερη από 10 cm) επί 10 λεπτά υπό ένταση 15V/cm και τα µεγαλύτερα πηκτώµατα επί 15 λεπτά υπό ένταση 10V/cm. Για να υπολογίσετε την τάση, µετρήστε την απόσταση (σε εκατοστά) ανάµεσα στα ΗΛΕΚΤΡΟ ΙΑ, στο λουτρό ηλεκτροφόρησης (το µήκος του πηκτώµατος ΕΝ ΕΧΕΙ ΣΗΜΑΣΙΑ). 4. Εξετάστε το πήκτωµα υπό υπεριώδες φως και φωτογραφήστε το για τεκµηρίωση. 1. Η ίδια ποσότητα ρυθµιστικού διαλύµατος ΤΒΕ 0,5 x µπορεί να ξαναχρησιµοποιηθεί, αλλά η απόδοση κατά την ηλεκτροφόρηση πιθανόν να βελτιωθεί εάν χρησιµοποιηθεί νέα ποσότητα. ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΗ: Το βρωµιούχο αιθίδιο είναι ισχυρός µεταλλαξιγόνος παράγοντας. Να φοράτε γάντια νιτριλίου και προστατευτικά γυαλιά όταν χειρίζεστε πηκτώµατα ή διαλύµατα που περιέχουν βρωµιούχο αιθίδιο. Σελίδα 9 από 15

10 ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ 1. Λόγω της υψηλής αναλυτικής ευαισθησίας της PCR, απαιτείται εξαιρετική προσοχή για τη διαφύλαξη της καθαρότητας των αντιδραστηρίων του κιτ και των µιγµάτων ενίσχυσης. Βεβαιωθείτε ότι η πορεία των εργασιών στο εργαστήριο είναι µονόδροµη και ότι δεν µεταφέρονται αµπλικόνια PCR στο χώρο προετοιµασίας της PCR. Η καθαρότητα των αντιδραστηρίων διαφυλάσσεται µόνο µε την εφαρµογή ορθής εργαστηριακής πρακτικής και η απόδοση της ανάλυσης είναι εγγυηµένη µόνον εφόσον τηρούνται αυστηρά οι διαδικασίες που καθορίζονται στο παρόν ένθετο συσκευασίας. 2. Η ανάλυση AllSet + και CombiSet + της Dynal έχει αναπτυχθεί µε χρήση δειγµάτων ολικού, µη ηπαρινισµένου αίµατος ή δειγµάτων αποµονωµένου DNA µόνον. Η απόδοσή της µε άλλα δείγµατα δεν έχει αξιολογηθεί. 3. Το δείγµα του DNA αποτελεί τη µήτρα για τη διαδικασία ενίσχυσης PCR και η ποιότητά του, ως προς την καθαρότητα και τη συγκέντρωση, πρέπει να εµπίπτει στην κλίµακα που καθορίζεται σε αυτήν τη διαδικασία. 4. Το προϊόν αυτό µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε οποιονδήποτε εγκεκριµένο θερµοκυκλοποιητή, εφόσον οι προδιαγραφές του οργάνου είναι ισοδύναµες των προδιαγραφών ενός συστήµατος PCR GeneAmp 9600 ή 9700 της Perkin-Elmer. 5. Βεβαιωθείτε ότι όλα τα όργανα και ο λοιπός εξοπλισµός έχουν βαθµονοµηθεί σύµφωνα µε τις συστάσεις του κατασκευαστή. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Έλεγχος ποιότητας Ο έλεγχος της ποιότητας και η ανανέωση των προϊόντων προσδιορισµού τύπου δειγµάτων ιστού µε βάση το DNA είναι πολύ σηµαντικά στοιχεία. Τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια πρέπει να ελέγχονται εκτενώς µέσω σύγκρισης µε γνωστά δείγµατα DNA από κυτταρικές γραµµές. Τα διαλύµατα εκκινητών πρέπει να ελέγχονται τόσο µε θετικά όσο και µε αρνητικά δείγµατα DNA µε αλληλουχίες υψηλής οµοιότητας. Η διαδικασία ελέγχου ποιότητας γίνεται ως εξής: Έλεγχος της σύνθεσης των εκκινητών έναντι οµάδας καλά χαρακτηρισµένων δειγµάτων DNA από κυτταρικές γραµµές Έλεγχος ειδικών διαλυµάτων εκκινητών έναντι οµάδας θετικών και αρνητικών δειγµάτων DNA Έλεγχος ολόκληρου του σετ SSP Έλεγχος του τελικού προϊόντος Εσωτερικός θετικός έλεγχος της αντίδρασης PCR Το ζεύγος εκκινητών ελέγχου 9 περιλαµβάνεται προκειµένου να επιβεβαιωθεί η απόδοση της αντίδρασης PCR. Το ζεύγος αυτό περιλαµβάνεται στην αντίδραση PCR προκειµένου να επιβεβαιώσει την απόδοσή της. Η παρουσία του επιβεβαιώνει το γεγονός ότι τυχόν απουσία ειδικής ενίσχυσης, σε κάποια δεδοµένη αντίδραση, οφείλεται πραγµατικά στην απουσία του συγκεκριµένου πολυµορφισµού στο δείγµα του DNA και όχι στην αποτυχία της ενίσχυσης PCR. Λόγω της διαφορετικής συγκέντρωσης και της διαφορετικής θερµοκρασίας υβριδοποίησης των διαφορετικών ζευγών εκκινητών, σε σύγκριση µε το ζεύγος εκκινητών εσωτερικού ελέγχου: - Η ένταση της ζώνης ελέγχου συχνά µειώνεται παρουσία ειδικής ενίσχυσης και - Οι εκκινητές εσωτερικού ελέγχου είναι πιο ευαίσθητοι σε µη ιδανικές συνθήκες PCR και µπορούν να χρησιµοποιηθούν για τον έλεγχο της απόδοσης της PCR. Η αποτυχία ενίσχυσης των τµηµάτων εσωτερικού ελέγχου σε λωρίδες όπου δεν παρατηρείται ειδική ενίσχυση θα πρέπει να θεωρείται ένδειξη ότι το σύστηµα δεν είναι ιδανικό. Ανατρέξτε στην ενότητα αντιµετώπισης προβληµάτων για τα πιθανά αίτια και τις ενέργειες διόρθωσης. Ειδικές πληροφορίες σχετικά µε τον εσωτερικό θετικό έλεγχο βρίσκονται στο ειδικό φυλλάδιο πληροφοριών προϊόντος για τη συγκεκριµένη παρτίδα, το οποίο παρέχεται µε κάθε κιτ. Σελίδα 10 από 15

11 ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αλληλόµορφα εντοπίζονται µε βάση την παρουσία ειδικών προϊόντων PCR. Η ειδική ενίσχυση σε κάποια λωρίδα υποδεικνύει ότι το δείγµα DNA περιέχει το αλληλόµορφο, ή ένα από τα αλληλόµορφα της οµάδας αλληλοµόρφων, που καθορίζει το ζεύγος εκκινητών στη συγκεκριµένη αντίδραση PCR. Ο πίνακας ερµηνείας που συνοδεύει κάθε παρτίδα µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να διαπιστωθεί το αλληλόµορφο ή η οµάδα αλληλοµόρφων που αναγνωρίζουν τα αντίστοιχα διαλύµατα εκκινητών. Σε πολλά κιτ SSP Dynal AllSet + ή CombiSet +, αλλά όχι σε όλα, κάθε αλληλόµορφο ή οµάδα αλληλοµόρφων ενισχύεται από περισσότερα από ένα διαλύµατα εκκινητών. Πρέπει οπωσδήποτε να ελεγχθεί εάν όλα τα άλλα διαλύµατα εκκινητών, που θα πρέπει να είναι θετικά για το συγκεκριµένο αλληλόµορφο ή οµάδα αλληλοµόρφων, είναι πράγµατι θετικά. Παρότι τα αλληλόµορφα εντοπίζονται µε βάση την παρουσία προϊόντος PCR, το σχετικό µέγεθος των προϊόντων PCR µπορεί να συµβάλλει στην ερµηνεία του προσδιορισµού τύπου µε τη µέθοδο SSP. Το κατά προσέγγιση µέγεθος των ειδικών προϊόντων της PCR µπορεί να χρησιµοποιηθεί για να διακριθεί η αληθής θετική ενίσχυση από: - τεχνήµατα από ολιγοµερή εκκινητών (διµερή εκκινητών) - µεταφορά από παρακείµενες κυψελίδες - µη ειδική ενίσχυση Στον πίνακα ερµηνείας που συνοδεύει κάθε κιτ SSP Dynal AllSet + και CombiSet + SSP, δίνεται η αλληλουχία των τριών τερµατικών νουκλεοτιδίων, τα οποία καθορίζουν την ειδικότητα του 3 άκρου τόσο του ορθόδροµου όσο και του ανάδροµου εκκινητή. Για τα προϊόντα HLA τάξης Ι, δίνεται η θέση του νουκλεοτιδίου στο 2ο, το 3ο ή το 4ο εξόνιο που αντιστοιχεί στο 3 άκρο των εκκινητών. Για τα κιτ SSP AllSet + HLA τάξης ΙΙ, δίνεται η θέση του κωδικονίου που αντιστοιχεί στο 3 άκρο των εκκινητών. Εάν διατίθεται η αλληλουχία κάποιου νέου αλληλοµόρφου, που δεν περιλαµβάνεται στον πίνακα ερµηνείας, µπορούν να χρησιµοποιηθούν τα διαθέσιµα στοιχεία αλληλουχίας των εκκινητών για να προσδιοριστεί το πρότυπο ενίσχυσης του νέου αλληλοµόρφου. Στην περίπτωση αυτή, επικοινωνήστε µε το τµήµα τεχνικών υπηρεσιών µέσω hla@dynalbiotech.com ή µέσω φαξ: Ερµηνεία µε χρήση του λογισµικού Dynal SSPTool Το λογισµικό Dynal SSPTool έχει σχεδιαστεί ειδικά για την υποβοήθηση της ερµηνείας των αποτελεσµάτων. Όλοι οι πίνακες ερµηνείας για τις διαφορετικές παρτίδες των κιτ SSP AllSet + και CombiSet + εισάγονται στη βάση δεδοµένων του λογισµικού. Η βάση δεδοµένων ενηµερώνεται συνεχώς, µε την κυκλοφορία κάθε νέας παρτίδας προϊόντων. Για βοήθεια και πληροφορίες σχετικά µε την εισαγωγή αποτελεσµάτων και τη χρήση του λογισµικού, συµβουλευτείτε την ενότητα βοήθειας του λογισµικού SSPTool. Για να παραγγείλετε ένα δωρεάν αντίτυπο του λογισµικού Dynal SSPTool (κωδικός προϊόντος ), επικοινωνήστε µε τον τοπικό αντιπρόσωπο της Dynal Biotech. Σελίδα 11 από 15

12 Ο ΗΓΟΣ ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗΣ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ ΠΡΟΒΛΗΜΑ ΑΙΤΙΑ ΕΝΕΡΓΕΙΑ ΑΠΟΚΑΤΑΣΤΑΣΗΣ Απουσία ενίσχυσης (ούτε ενίσχυση του τµήµατος εσωτερικού ελέγχου ούτε ειδική ενίσχυση) Υπερβολικά µικρή ποσότητα DNA Το DNA περιέχει αναστολείς PCR, π.χ. πρωτεΐνες, αιθανόλη (από τη διαδικασία κατακρήµνισης). Το DNA αποµονώθηκε από ηπαρινισµένο αίµα. ΤΟ DNA διαλύθηκε σε ρυθµιστικό διάλυµα µε EDTA. Τυχαία αποτυχία της ενίσχυσης Εάν τα καπάκια των σωληναρίων PCR δεν είναι καλά κλεισµένα, η ενίσχυση θα αποτύχει λόγω εξάτµισης Σφάλµατα κατά τη µεταφορά στο πήκτωµα Χρήση µη βαθµονοµηµένων πιπετών Βεβαιωθείτε ότι ο όγκος και η συγκέντρωση του DNA που προστέθηκε ήταν τα κατάλληλα. Μετρήστε την ποιότητα του DNA. Ακολουθήστε αυστηρά τη µέθοδο αποµόνωσης DNA που συνιστά ο προµηθευτής. οκιµάστε µια εναλλακτική µέθοδο αποµόνωσης DNA. Επαναλάβετε την αποµόνωση του DNA. Χρησιµοποιήστε µη ηπαρινισµένο αίµα ή δοκιµάστε µια διαδικασία επεξεργασίας µε ηπαρινάση (βλ. αναφ. 8). Επαναλάβετε τη διαδικασία αποµόνωσης του DNA και διαλύστε το DNA σε στείρο νερό. Βεβαιωθείτε ότι όλα τα καπάκια είναι καλά κλεισµένα. Χρησιµοποιήστε εργαλείο τοποθέτησης καπακιών. Βεβαιωθείτε ότι τοποθετήθηκε δείγµα στον σωστό αριθµό οπών και ότι κάθε οπή περιέχει περίπου τον ίδιο όγκο µίγµατος PCR. Να βαθµονοµείτε τακτικά όλες τις πιπέτες, σύµφωνα µε τις συστάσεις του προµηθευτή. Σφάλµατα κατά τη µεταφορά µε πιπέτα Εκτελέστε τη µεταφορά µε µεγαλύτερη προσοχή. Ανεπαρκής ανάµιξη του DNA του δείγµατος, της πολυµεράσης Taq ή των προπαρασκευαστικών µιγµάτων PCR Αναµίξτε µε στιγµιαία περιδίνηση πριν τη χρήση. Ασθενές σήµα από τα τµήµατα Μετρήστε την ποιότητα του DNA. Επαναλάβετε τη διαδικασία αποµόνωσης DNA χαµηλής καθαρότητας εσωτερικού ελέγχου DNA µε πρόσφατα παρασκευασµένα διαλύµατα. Μη ειδική ενίσχυση («σκάλες» ή κηλίδες) Η ένταση των σηµάτων ενίσχυσης µειώνεται µε το χρόνο Μικρή ποσότητα DNA Υπερβολικά υψηλή θερµοκρασία υβριδοποίησης, ο θερµοκυκλοποιητής δεν έχει βαθµονοµηθεί Η ποσότητα θερµοσταθερής DNA πολυµεράσης είναι υπερβολικά µικρή Η ποιότητα της θερµοσταθερής DNA πολυµεράσης είναι χαµηλή DNA χαµηλής καθαρότητας (Κάποια µίγµατα εκκινητών δίνουν συχνότερα µη ειδική ενίσχυση δείτε τις υποσηµειώσεις του συγκεκριµένου πίνακα ειδικότητας) Το διάλυµα βρωµιούχου αιθιδίου που χρησιµοποιήθηκε για τη χρώση του πηκτώµατος είναι παλιό Μετρήστε τη συγκέντρωση του DNA και ρυθµίστε σε 50 ng/µl. Βαθµονοµήστε τον θερµοκυκλοποιητή και ελέγξτε το πρόγραµµα της PCR. Οι θερµοκυκλοποιητές που χρησιµοποιούνται τακτικά σε διαδικασίες SSP- PCR θα πρέπει να βαθµονοµούνται κάθε 6 µήνες. Χρησιµοποιήστε περισσότερο ένζυµο στις αντιδράσεις PCR. Χρησιµοποιήστε πολυµέραση Amplitaq της Perkin-Elmer. Όλα τα τµήµατα µε µέγεθος µεγαλύτερο από το τµήµα εσωτερικού ελέγχου µπορούν να αγνοηθούν. Ελέγξτε την ποιότητα του DNA. Επαναλάβετε τη διαδικασία αποµόνωσης του DNA. Η απουσία DNA µπορεί επίσης να προκαλέσει την εµφάνιση κηλίδων. Παρασκευάστε νέο διάλυµα βρωµιούχου αιθιδίου για να πετύχετε καλύτερη χρώση του πηκτώµατος. Μία από τις λυχνίες υπεριώδους ακτινοβολίας έχει σπάσει. Ελέγξτε τη συσκευή υπεριώδους φωτός. Ψευδώς αρνητική ενίσχυση Ψευδώς θετική ενίσχυση Παράδοξα πρότυπα ενίσχυσης Ασαφείς, θολές ζώνες Υπερβολικά υψηλή θερµοκρασία υβριδοποίησης, ο θερµοκυκλοποιητής δεν έχει βαθµονοµηθεί Πιθανόν να οφείλεται σε µόλυνση DNA χαµηλής καθαρότητας Υπερβολικά χαµηλή θερµοκρασία υβριδοποίησης Ο θερµοκυκλοποιητής δεν είναι βαθµονοµηµένος Χρησιµοποιείται λανθασµένος πίνακας ερµηνείας Το πρότυπο ενίσχυσης περιλαµβάνει ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσµα Νέο αλληλόµορφο που δεν περιλαµβάνεται στον πίνακα ερµηνείας Το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης πιθανόν να είναι θερµό Το χτένι που χρησιµοποιήθηκε δηµιουργεί οπές υπερβολικά µεγάλου πάχους Το αµπλικόνιο δεν µεταφέρεται Το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης έχει διαφορετική σωστά στο πήκτωµα περιεκτικότητα από το ρυθµιστικό διάλυµα του πηκτώµατος Το ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροφόρησης δεν είναι συµβατό µε το αµπλικόνιο της PCR Φυσαλίδες αέρα στην πιπέτα Βαθµονοµήστε τον θερµοκυκλοποιητή και ελέγξτε το πρόγραµµα της PCR. Οι θερµοκυκλοποιητές που χρησιµοποιούνται τακτικά σε διαδικασίες SSP- PCR θα πρέπει να βαθµονοµούνται κάθε 6 µήνες. Χρησιµοποιήστε γάντια, ρύγχη πιπέτας µε βύσµατα φίλτρου, διαφορετικούς χώρους για τις ενέργειες πριν και µετά την PCR. Σωστός χειρισµός του δείγµατος σε όλα τα βήµατα. Ελέγξτε εάν υπάρχει µόλυνση, χρησιµοποιώντας τους εκκινητές ελέγχου µόλυνσης της Dynal (κωδικός προϊόντος ). Μετρήστε την ποιότητα του DNA. Επαναλάβετε τη διαδικασία αποµόνωσης DNA µε πρόσφατα παρασκευασµένα διαλύµατα. Βαθµονοµήστε τον θερµοκυκλοποιητή και ελέγξτε το πρόγραµµα της PCR. Οι θερµοκυκλοποιητές που χρησιµοποιούνται τακτικά σε διαδικασίες SSP- PCR θα πρέπει να βαθµονοµούνται κάθε 6 µήνες. Βεβαιωθείτε ότι ο αριθµός παρτίδας του προϊόντος που χρησιµοποιείται είναι ο ίδιος µε του πίνακα ερµηνείας που χρησιµοποιείται. Ελέγξτε εάν όλα τα προϊόντα ειδικής ενίσχυσης έχουν το σωστό µέγεθος ή εάν κάποιο τέχνηµα (µεταφορά υλικού, διµερές εκκινητή) έχει παρερµηνευτεί ως προϊόν ενίσχυσης. Επαναλάβετε τη διαδικασία προσδιορισµού τύπου. Εάν το νέο πρότυπο ενίσχυσης αναπαράγεται, επικοινωνήστε µε τον τοπικό αντιπρόσωπο της Dynal Biotech για πληροφορίες σχετικά µε το πρότυπο ενίσχυσης αλληλοµόρφων που έχουν περιγραφεί πρόσφατα. Χρησιµοποιήστε το συνιστώµενο ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ. Ηλεκτροφορήστε υπό χαµηλότερη τάση. Χρησιµοποιήστε λεπτά χτένια (4x1 mm) Χρησιµοποιήστε το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα για το πήκτωµα και την ηλεκτροφόρηση Συνιστάται ρυθµιστικό διάλυµα ΤΒΕ 0,5 x Εκτελέστε τη µεταφορά µε κατάλληλο τρόπο Σελίδα 12 από 15

13 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1) Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science Dec 20;230(4732): ) Wu, D. Y., Ugozzoli, L., Pal, B. K. & Wallace, R. B. (1989). Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A 86(8), ) Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C. & Markham, A. F. (1989). Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17(7), ) Olerup, O. & Zetterquist, H. (1992). HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantation [see comments]. Tissue Antigens 39(5), ) Bunce, M., O'Neill, C. M., Barnardo, M. C. N. M., Krausa, P., Browning, M. J., Morris, P. J. & Welsh, K. I. (1995b). Phototyping: Comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers (PCR- SSP). Tissue Antigens 46(5), ) Richmond, Y. and McKinney, W. (eds.) Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. HHS Publication Number (CDC) ) National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of Laboratory Workers from Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue. Tentative Guideline. NCCLS Document M29-T Villanova, PA:NCCLS, ) Satsangi J, Jewell DP, Welsh K, Bunce M, Bell JI.Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet Jun 11;343(8911): ) Bein G, Glaser R, Kirchner H. Rapid HLA-DRB1 genotyping by nested PCR amplification. Tissue Antigens Feb;39(2):68-73 Σελίδα 13 από 15

14 ΕΓΓΥΗΣΗ Στον αρχικό αγοραστή και µόνον παρέχεται η εγγύηση ότι τα προϊόντα συµφωνούν µε την ποσότητα και το περιεχόµενο που αναγράφεται στο φιαλίδιο και στις εξωτερικές ετικέτες, καθ όλη την αναφερόµενη διάρκεια ζωής. Η υποχρέωση της Dynal Biotech και το αποκλειστικό δικαίωµα αποζηµίωσης του αγοραστή σύµφωνα µε την εγγύηση αυτήν είναι είτε η αντικατάσταση, µε έξοδα της Dynal Biotech, των προϊόντων µε ελαττωµατική κατασκευή, τα οποία και θα επιστραφούν στη Dynal Biotech µε προπληρωµένα έξοδα αποστολής, είτε, κατά την κρίση της Dynal Biotech, η επιστροφή του κόστους αγοράς. Οι αξιώσεις για τυχόν ζηµιές προϊόντων κατά τη µεταφορά θα πρέπει να απευθύνονται στην εταιρεία µεταφοράς. Η εγγύηση αυτή δεν ισχύει για τα προϊόντα που έχουν υποστεί τροποποίηση από τρίτους, εκτός της Dynal Biotech, ούτε για προϊόντα που έχουν υποστεί κακή χρήση ή χειρισµό. ΟΛΕΣ ΟΙ ΑΛΛΕΣ ΕΓΓΥΗΣΕΙΣ, ΡΗΤΕΣ, ΕΜΜΕΣΕΣ Ή ΝΟΜΟΘΕΤΗΜΕΝΕΣ, ΑΠΟΚΛΕΙΟΝΤΑΙ ΙΑ ΤΟΥ ΠΑΡΟΝΤΟΣ, ΣΥΜΠΕΡΙΛΑΜΒΑΝΟΜΕΝΩΝ, ΜΕΤΑΞΥ ΑΛΛΩΝ, ΤΩΝ ΕΓΓΥΗΣΕΩΝ ΕΜΠΟΡΕΥΣΙΜΟΤΗΤΑΣ Ή ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΤΗΤΑΣ ΓΙΑ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΟ ΣΚΟΠΟ. Η µέγιστη οικονοµική ευθύνη της Dynal Biotech περιορίζεται σε κάθε περίπτωση στην τιµή των προϊόντων που πώλησε η Dynal Biotech. Η DYNAL BIOTECH ΕΝ ΕΙΝΑΙ ΥΠΕΥΘΥΝΗ ΣΕ ΚΑΜΙΑ ΠΕΡΙΠΤΩΣΗ ΓΙΑ ΟΠΟΙΕΣ ΗΠΟΤΕ ΕΙ ΙΚΕΣ, ΤΥΧΑΙΕΣ Ή ΠΑΡΕΠΟΜΕΝΕΣ ΖΗΜΙΕΣ. Ορισµένες δικαιοδοσίες δεν επιτρέπουν τον περιορισµό των εγγυήσεων ή των δικαιωµάτων αποζηµίωσης λόγω παραβίασης, σε ορισµένες συναλλαγές. Στις δικαιοδοσίες αυτές πιθανόν να µην ισχύουν οι προαναφερόµενοι περιορισµοί. εν επιτρέπεται η ανασυσκευασία, η αλλαγή της σύστασης ή η µεταπώληση του προϊόντος αυτού, σε οποιαδήποτε µορφή, χωρίς τη γραπτή άδεια της Dynal Biotech Ltd., Μ. Βρετανία. ΕΜΠΟΡΙΚΑ ΣΗΜΑΤΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΑΥΤΟ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ / ΕΓΓΡΑΦΟ Το Dynal είναι σήµα κατατεθέν της DYNAL BIOTECH A.S.A, Όσλο, Νορβηγία Τα AllSet και AllSet + είναι εµπορικά σήµατα της DYNAL BIOTECH A.S.A, Όσλο, Νορβηγία Το DynaMix είναι εµπορικό σήµα της DYNAL BIOTECH Ltd., Μ. Βρετανία Τα CombiSet και CombiSet + είναι εµπορικά σήµατα της DYNAL BIOTECH., Μ. Βρετανία Το SSPTool είναι εµπορικό σήµα της DYNAL BIOTECH A.S.A, Όσλο, Νορβηγία Το AmpliTaq είναι σήµα κατατεθέν της Roche Molecular Systems, Inc., Η.Π.Α. Το Electro-Fast είναι σήµα κατατεθέν της Advanced Biotechnologies Ltd (ABgene ) Το GeneAmp είναι εµπορικό σήµα της Roche Molecular Systems, Inc., Η.Π.Α. ΕΥΡΕΣΙΤΕΧΝΙΕΣ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝΤΑΙ ΣΕ ΑΥΤΟ ΤΟ ΠΡΟΪΟΝ / ΕΓΓΡΑΦΟ * Τα προϊόντα Dynal SSP πωλούνται κατόπιν αδείας από τη ZENECA Ltd. ARMS στο πλαίσιο της ευρωπαϊκής ευρεσιτεχνίας αρ και της αντίστοιχης κατοχυρωµένης παγκόσµιας ευρεσιτεχνίας. Το ARMS είναι εµπορικό σήµα της ZENECA Ltd. ** Το προϊόν αυτό έχει βελτιστοποιηθεί για χρήση στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR ) η οποία καλύπτεται από διπλώµατα ευρεσιτεχνίας στην κατοχή της Roche Molecular Systems Inc. και της F. Hoffmann-La Roche Ltd (Roche ). Με την αγορά του προϊόντος αυτού, δεν µεταβιβάζεται στον αγοραστή καµία άδεια χρήσης της διαδικασίας PCR, ούτε ρητά ούτε έµµεσα, στο πλαίσιο των ευρεσιτεχνιών αυτών. Περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε την αγορά άδειας εκτέλεσης της διαδικασίας PCR µπορείτε να λάβετε επικοινωνώντας, στις Ηνωµένες Πολιτείες, µε τον ιευθυντή Αδειοδότησης της Roche Molecular Systems,, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, και, εκτός των Ηνωµένων Πολιτειών, µε τον Υπεύθυνο Αδειοδότησης PCR, F. Hoffman-La Roche Ltd, Grenzacherstr. 124, DH-4070 Basel, Ελβετία. Κατασκευάζεται από την Dynal Biotech Ltd., Μ. Βρετανία. Αναπτύχθηκε από την Dynal Biotech Ltd., Μ. Βρετανία. Σελίδα 14 από 15

15 ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ Dynal Biotech Ltd., 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral, CH62 3QL, Μ. Βρετανία Αρ. τηλ.: , αρ. φαξ: Internet: Dynal Biotech A.S.A DYNAL BIOTECH GmbH PO Box 114 Smestad, Bramfelder Chaussee 41 N-0309, Όσλο, Νορβηγία Αµβούργο, Γερµανία Αρ. τηλ.: Αρ. τηλ.: Αρ. φαξ: Αρ. φαξ: Internet: Dynal Biotech Inc. Dynal Biotech S.A. HLA Diagnostics Division Centre de Transfert de I U.T.C., 555 Andorra Glen Court 66 Avenue de Landshut Suite 5 Lafayette Hill, PA 19444, Η.Π.Α Compiègne, Γαλλία Χωρίς χρέωση: DYNAL TT ( ) Αρ. τηλ.: Αρ. τηλ.: Αρ. φαξ: Αρ. φαξ: dynal.france@wanadoo.fr hla.us.cust.serv@dynalbiotech.com Dynal Biotech Pty PO Box 204, Carlton South, Victoria 3053, Australia Αρ. τηλ.: Αρ. τηλ.: Αρ. φαξ: NZ Freecall: techserv@dynal.com.au Για πληροφορίες σχετικά µε τους αντιπρόσωπους της Dynal παγκοσµίως, επικοινωνήστε µε την Dynal Biotech Ltd Πνευµατικά δικαιώµατα 2003 Dynal Biotech Ltd., Μ. Βρετανία. Με την επιφύλαξη παντός δικαιώµατος Τυπώθηκε στις Αναθ. 000 Σελίδα 15 από 15