POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

Transcript

1 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ Kary Mullis (Nobel Χημείας, 1993) in vitro τεχνική ( molecular photocopying ) Εφαρμογή σε όλους τους τομείς της Βιολογίας

2 Στις περισσότερες περιπτώσεις η ποσότητα του γενετικού υλικού (DNA/RNA) που έχει απομονωθεί είναι τόσο χαμηλή που δεν επιτρέπεται η απευθείας ανίχνευση της εκάστοτε παραμέτρου. Στην περίπτωση αυτή, είναι απαραίτητος ο πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας-στόχου, ώστε αυτή να μπορεί να ανιχνευτεί. Αυτό επιτυγχάνεται με την τεχνολογία της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης Polymerase Chain Reaction (PCR)

3 Η αντίδραση PCR, είναι μία εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος που επιτρέπει: την ανίχνευση ακόμη και ενός κυττάρου την παραγωγή (υπό άριστες συνθήκες) μεγάλης ποσότητας από την αλληλουχία στόχο μέσω της επανάληψης μίας σειράς γεγονότων (PCR κύκλων) Γιατί η PCR είναι τόσο δημοφιλής;» Απλότητα» Ταχύτητα» Ευαισθησία» Ειδικότητα» Αξιοπιστία

4 Σύνθεση πολλαπλών αντιγράφων μιας συγκεκριμένης DNA αλληλουχίας (αλληλουχίαστόχος) από οποιοδήποτε DNA εκμαγείο (DNA template) Τα αντιδραστήρια μας DNA (εκμαγείο, template) Εκκινητές (ολιγονουκλεοτίδια που καθορίζουν το τμήμα του DNA που θα πολλαπλασιαστεί) DNA πολυμεράση (Ένζυμο που καταλύει την σύνθεση των συμπληρωματικών κλώνων) Και τα 4 είδη των τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) Ιόντα / άλατα (Mg ++, PCR διάλυμα)

5 Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι 3 διαδοχικών βημάτων: Αποδιάταξη του DNA εκμαγείου Υβριδισμός των εκκινητών με την αλληλουχία-στόχο Σύνθεση συμπληρωματικών κλώνων με την βοήθεια της DNA πολυμεράσης

6

7 Η κλασσική PCR Η «κλασσική» PCR αποτελεί από το 1983 μέθοδο-κλειδί στην Έρευνα με πάνω από δημοσιεύσεις. Από το 1993 που τα δικαιώματα της PCR αγοράστηκαν από την Roche, η Roche επένδυσε και επενδύει εκατομμύρια για την ανάπτυξη εφαρμογών της PCR στον μοριακό έλεγχο και καθιέρωση της μεθόδου σαν μέθοδο αναφοράς στην Μοριακή Διάγνωση σε τομείς όπως η ιολογία, η μοριακή μικροβιολογία, η ογκολογία, η γενετική και ο μοριακός έλεγχος του μεταγγιζόμενου αίματος

8 Η Real Time PCR στον μοριακό έλεγχο του αίματος Στην Real Time PCR έχουμε ένα πολύ σημαντικό πλεονέκτημα : εκτός των εκκινητών (primers) χρησιμοποιούνται διαφορετικά ζευγάρια ιχνηθετών (Probes), σημασμένα με διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές έτσι ώστε να μπορούμε να μετρούμε ταυτόχρονα στο ίδιο σωληνάριο αντίδρασης διαφορετικές παραμέτρους (Multiplexing PCR). Επίσης, να διακρίνουμε την αλληλουχία στόχο από την αλληλουχία του εσωτερικό μάρτυρα (Internal Control), βασική προϋπόθεση για την εκτίμηση της απόδοσης της ανάλυσης (διάκριση ψευδώς θετικών). Οι διαφορετικές χρωστικές μετρούνται σε Κανάλια μέτρησης φθορισμού σχεδιασμένα για να μετρούν φθορισμό που εκπέμπεται σε διαφορετικά μήκη κύματος. (π.χ. 530nm, 640nm, 705nm)

9 PCR κύκλος: συγκροτείται από 3 επιμέρους τμήματα 1. Αποδιάταξη (Denaturation) 2. Επανασύνδεσης (Annealing) 3. Επιμήκυνσης (Elongation) Ένα τυπικό PCR περιλαμβάνει κύκλους

10 Αρχικό δίκλωνο μόριο (DNA template) Τέλος ενός κύκλου PCR Αλληλουχία- στόχος 2 νέες αλυσίδες DNA... 2 ν αντίγραφα της αλληλουχίας στόχου, έπειτα από ν κύκλους

11 Αντίδραση PCR : 1. Στάδιο - Denaturation Doublestranded DNA is separated into single strands ( > 90 C)

12 Αντίδραση PCR : 2. Στάδιο - Annealing

13 Αντίδραση PCR : 3. Στάδιο - Elongation 5 => 3 κατεύθυνση Nουκλεοτίδια Ένζυμο DNA-Polymerase 72 C

14 Ενίσχυση αλληλουχίας- στόχου μέσω της PCR 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon No. of ,048,576 No. Amplicon Cycles Copies of Target 30 1,073,741,824

15 Εφαρμογές της τεχνολογίας PCR Ογκολογία (π.χ. βασική έρευνα, εύρεση τροποποιημένων DNA αλληλουχιών) Μικροβιολογία/Ιολογία (π.χ. Ανίχνευση και ταυτοποίηση βακτηρίων, ιών, έλεγχος της ποιότητας των νερών) Έκφραση γονιδίων Γενετική (π.χ. ανίχνευση μεταλλάξεων, Φαρμακογενετική) Έλεγχος Τροφίμων (π.χ. παρουσία γενετικά τροποποιημένων οργανισμών, παθογόνων) Ιατροδικαστική

16 «Παράθυρο ελέγχου» με ανοσολογικά τεστ και με μοριακό έλεγχο

17

18 ΚΜΕ Αλεξανδρούπολη ΚΜΕ Ιωάννινα ΚΜΕ Λάρισα ΚΜΕ Θεσσαλονίκη Πληθυσμός : Αιμοληψίες : Εγχώριες αιμοληψίες: 617,462 Εισαγόμενες αιμοληψίες από Ελβετικό ΕΡ.Σταυρό: Δοθείσες αιμοληψίες (μεταγγίσεις) : 618,047 Κέντρα Μοριακού Ελέγχου (ΚΜΕ) : 9 ΚΜΕ Πάτρα Αθήνα Χ 3 ΚΜΕ»ΛΑΙΚΟ» ΚΜΕ «ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ» ΚΜΕ «ΕΚΕΑ» ΚΜΕ Κρήτη