Η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Transcript

1 Η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) 1

2 PCR: -βραβείο Nobel χημείας 1993 Η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR, Polymerase Chain Reaction) επινοήθηκε από τον Kary Mullis στα μέσα της δεκαετίας του 1980 Εφερε επανάσταση στη μοριακή γενετική Του απονεμήθηκε το βραβείο Nobel χημείας

3 Η PCR έλυσε το πρόβλημα του εντοπισμού των γονιδίων Ένα μεγάλο πρόβλημα που παρουσιάζει η ανάλυση γονιδίων είναι ότι λόγω της σπανιότητάς τους μέσα στο γονιδίωμα καθίσταται δύσκολος ο εντοπισμός και η απομόνωσή τους το ανθρώπινο γονιδίωμα, για παράδειγμα, έχει περίπου γονίδια. 3

4 PCR: αντιγραφή μίας αλληλουχίας DNA σε μεγάλες ποσότητες Με την PCR αυτό άλλαξε, καθώς μπορέσαμε να παραγάγουμε τεράστιες ποσότητες μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA χωρίς να χρειαστεί να καταφύγουμε σε κλωνοποίηση. 4

5 Απαραίτητη μία DNA πολυμεράση για την αντιγραφή DNA Στην PCR χρησιμοποιείται μια DNA πολυμεράση για τη σύνθεση (τον πολλαπλασιασμό) μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας αλληλουχίας DNA 5

6 Η PCR μιμείται την αντίγραφη (πολλαπλασιασμό) του DNA Κατά την αντιγραφή του DNA in vivo σχηματίζεται μία νέα έλικα DNA (κίτρινο) με καλούπι την μητρική έλικα (μπλε) Από 1 αρχικό μόριο DNA (δίκλωνο) παράγονται 2 νέα δίκλωνα μόρια DNA ίδια με το αρχικό 6

7 Εκκινητές: σηματοδοτούν το σημείο έναρξης αντιγραφής H αλληλουχία του DNA που αντιγράφεται βρίσκεται ανάμεσα στους εκκινητές (τμήματα DNA), οι οποίοι χρειάζονται για την έναρξη της σύνθεσης DNA 7

8 Αλληλουχία DNA- στόχος Το αρχικό υλικό για τη διεξαγωγή της PCR είναι ένα δείγμα DNA στο οποίο περιέχεται η αλληλουχία που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί Ονομάζεται η αλληλουχία στόχος (target DNA) 8

9 Πρώτο στάδιο: Απομόνωση DNA Η προετοιμασία που χρειάζεται να γίνει κατά την απομόνωση του DNA που θα χρησιμοποιηθεί ως στόχος για την PCR είναι σχετικά εύκολη (με εξαίρεση κάποια ειδικά δείγματα) 9

10 Υπάρχουν πολλά διαφορετικά πρωτόκολλα απομόνωσης DNA 10

11 PCR: πολύ υψηλή ευαισθησία Επειδή κατά την τεχνική της PCR γίνεται πολλαπλασιασμός του DNA, η αρχική ποσότητα DNA που χρειάζεται είναι πολύ μικρή: ακόμη και ένα μόνο μόριο DNA αρκεί 11

12 Στάδια PCR 1. Αποδιάταξη DNA (διαχωρισμός αλυσίδων) 2. Υβριδοποίηση (πρόσδεση) εκκινητών 3. Επιμήκυνση αλυσίδας 12

13 Αλληλουχία στόχος Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR=Polymerase chain reaction) Κάθε κύκλος περιλαμβάνει: 1. Διαχωρισμός αλυσίδων (94-96 ο C) 2. Υβριδισμός (πρόσδεση) εκκινητών (30-68 ο C) 3. Επιμήκυνση αλυσίδας με σύνθεση DNA (65-75 ο C) με την βοήθεια μίας θερμοανθεκτικής DNA πολυμεράσης 13

14 1 ο στάδιο: Θέρμανση για να επιτευχθεί αποδιάταξη του δίκλωνου DNA Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί μονόκλωνο DNA ως μήτρα για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού νέου κλώνου. Για να προκύψει μονόκλωνο DNA, αρκεί η θέρμανση του δίκλωνου DNA σε θερμοκρασία που πλησιάζει το σημείο βρασμού (>90 ο C) 14

15 Αποδιάταξη δίκλωνου DNA Θέρμανση για να διαχωριστούν οι δύο κλώνοι (αποδιάταξη DNA) 15

16 Και οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας του DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μήτρα για τη σύνθεση νέων μορίων. 16

17 2 ο στάδιο: Προσθήκη εκκινητών (υβριδοποίηση εκκινητών) Καθώς το ένζυμο χρειάζεται ένα τμήμα δίκλωνου DNA ώστε να ξεκινήσει («εκκινήσει») τη σύνθεση, προσθέτουμε στην αντίδραση δύο ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές (primers), μήκους νουκλεοτιδίων. Εκκινητής F Εκκινητής R 17

18 Υβριδοποίηση εκκινητών (πρόσδεση με την μήτρα) Καθένας από αυτούς είναι συμπληρωματικός με μια περιοχή του ενός από τους κλώνους του DNA-στόχου, ώστε να υβριδοποιείται (δηλαδή να προσδένεται) σε αυτή. Η υβριδοποίηση γίνεται αφού χαμηλώσει η θερμοκρασία της αντίδρασης 18

19 Οι εκκινητές οριοθετούν το τμήμα (γονίδιο) του DNA που θα αντιγραφεί Μπορούμε να καθορίσουμε τα σημεία έναρξης της σύνθεσης DNA in vitro προσθέτοντας στην αντίδραση εκκινητές που έχουν την κατάλληλη αλληλουχία, ώστε να υβριδοποιούνται με τη μήτρα σε συγκεκριμένες και επιθυμητές περιοχές 19

20 Οι εκκινητές επιλέγονται ούτως ώστε να υβριδοποιούνται εκατέρωθεν του τμήματος DNA (στα 3 άκρα) που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε. Για αυτό ο ένας εκκινητής ονομάζεται F (forward) και ο άλλος R (reverse) 20

21 3 ο στάδιο: Σύνθεση νέων κλώνων από την DNA πολυμεράση (επιμήκυνση) Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί τους εκκινητές για να ξεκινήσει με κατεύθυνση 5 προς 3, την σύνθεση νέων κλώνων 21

22 Οι εκκινητές: Ολιγονουκλεοτίδια μήκους νουκλεοτιδίων παρουσιάζουν συνήθως μεγάλη εξειδίκευση (προσδένονται δηλαδή με το DNA-στόχο αποκλειστικά σε μια μοναδική περιοχή με την οποία είναι συμπληρωματικά), εφόσον η υβριδοποίηση πραγματοποιείται κοντά στη θερμοκρασία τήξης τους (Τm) Η θερμοκρασία τήξης είναι αυτή στην οποία, στατιστικά, τα μισά μόρια του ολιγονουκλεοτιδίουεκκινητή ζευγαρώνουν με την αλληλουχία-στόχο, ενώ τα άλλα μισά δε σταθεροποιούνται πάνω σε αυτή και παραμένουν ελεύθερα. 22

23 Ο κύκλος της PCR 23

24 Taq πολυμεράση: θερμοανθεκτικό ένζυμο Χρησιμοποιείται η DNA πολυμεράση του βακτηρίου Thermus aquaticus, το οποίο ζει μέσα στο νερό σε θερμοκρασία 75 C, η βέλτιστη θερμοκρασία είναι οι 72 C, ενώ είναι αρκετά σταθερή ακόμη και στους 94 C. Το ένζυμο αυτό ονομάζεται πολυμεράση Taq και παραμένει ενεργό σε όλη τη διάρκεια των κύκλων του πολλαπλασιασμού. 24

25 Η PCR γίνεται σε Θερμοκυκλοποιητές Η πολυμεράση Taq επέτρεψε την αυτοματοποίηση της PCR με τη χρήση θερμοκυκλοποιητών, μηχανημάτων σχεδιασμένων να εκτελούν τα βήματα των κύκλων της PCR στους επιθυμητούς χρόνους και θερμοκρασίες 25

26 Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι PCR Oι κύκλοι θέρμανσης, προσκόλλησης των εκκινητών στη μήτρα και επέκτασής τους με αποτέλεσμα τη σύνθεση νέων μορίων DNA επαναλαμβάνονται πολλές φορές 26

27 Πραγματοποιείται εκθετική αύξηση του copy mumber (αριθμού των μορίων του DNA στόχου) μετά από πολλούς κύκλους PCR 27

28 μετά από n κύκλους το μείγμα της αντίδρασης περιέχει θεωρητικά έως 2 n δίκλωνα μόρια DNA τα οποία φέρουν αντίγραφα της αλληλουχίας που βρίσκεται ανάμεσα στους εκκινητές 28

29 Οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι της PCR 29

30 Προσοχή στις επιμολύνσεις! Η πολλαπλασιαστική ισχύς της PCR συνοδεύεται δυστυχώς από το μειονέκτημα ότι ακόμη και η παραμικρή μόλυνση του αρχικού υλικού μπορεί να έχει σοβαρές συνέπειες. 30

31 Συστάσεις για αποφυγή επιμολύνσεων στην PCR Χρήση 3 διαφορετικών χώρων για την διεξαγωγή της PCR Προετοιμασία δείγματος, PCR προετοιμασία PCR ανάλυση Με περιορισμένη πρόσβαση και μετακίνηση ανάμεσα στους χώρους αυτούς.

32 Συστάσεις για αποφυγή επιμολύνσεων στην PCR Η διεξαγωγή της PCR πρέπει να γίνεται σε θάλαμο νηματικής ροής Τα tips των πιπετών να είναι με φίλτρα

33 PCR 1. ΠΟΙΟΤΙΚΗ 2. ΠΟΣΟΤΙΚΗ (REAL TIME) 33

34 1.ΠΟΙΟΤΙΚΗ PCR 34

35 Το προιόν της ποιοτικής PCR (PCR product ή amplicon) εμφανίζεται σε ηλεκτροφόρηση με την τεχνική PCR παράγονται τόσο πολλά αντίγραφα, που είναι εύκολο στη συνέχεια να τα δει κανείς σε ένα πήκτωμα αγαρόζης βαμμένο με βρομιούχο αιθίδιο. 35

36 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 36

37 Τα αποτελέσματα της ποιοτικής PCR εμφανίζονται μόνο μετά από ηλεκτροφόρηση 37

38 Πραγματοποίηση ενός πειράματος PCR 38

39 39

40 40

41 41

42 42

43 43

44 Η ποσοτική PCR είναι πάντα Real Time PCR και ονομάζεται και qpcr 2. PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (REAL-TIME PCR) ΓΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΠΟΙΗΣΗ DNA 44

45 Μέτρηση DNA σε πραγματικό χρόνο Η χρήση ποσοτικών μεθόδων PCR πραγματικού χρόνου (real time PCR) επιτρέπει τη μέτρηση της ποσότητας των προϊόντων, και κατ επέκταση την παρακολούθηση του ρυθμού πολλαπλασιασμού ενός μορίου-στόχου, σε όλη τη διάρκεια της αντίδρασης PCR 45

46 46

47 47

48 Real-Time PCR Βασίζεται στην ανίχνευση και στην ποσοτικοποίηση φθορισμού που εκπέμπεται από ειδικά φθοριοχρώματα Ο φθορισμός αυξάνει όσο προχωράει η PCR αντίδραση 48

49 PCR Πραγματικού χρόνου Κατά τη διάρκεια της αντίδρασης μετράται ο φθορισμός που εκπέμπεται από ιχνηθέτες που υβριδίζουν με το παραγόμενο προϊόν της αντίδρασης. Ο φθορισμός που παράγεται σε κάθε κύκλο είναι ανάλογος του πληθυσμού των παραγόμενων αλληλουχιών σε κάθε θερμοδυναμικό κύκλο. 49

50 Ύστερα από μια αρχική φάση κατά την οποία δεν είναι ανιχνεύσιμο το προϊόν της PCR λόγω του ότι βρίσκεται σε πολύ μικρή ποσότητα, ακολουθεί μία εκθετική φάση κατά την οποία η ποσότητα του προϊόντος σχεδόν διπλασιάζεται σε κάθε βήμα. 50

51 Ποσοτική Real-Time PCR Συγκρίνοντας τον αριθμό των κύκλων που απαιτούνται για την έλευση της εκθετικής φάσης σε διαφορετικές αντιδράσεις, μπορούμε να προσδιορίσουμε την αρχική ποσότητα των μορίων που χρησιμοποιήθηκαν ως μήτρα στις αντιδράσεις 51

52 Αν υπάρχουν περισσότερα μόρια-στόχοι στην αρχή, θα χρειαστούν λιγότεροι κύκλοι για να αρχίσει η εκθετική φάση. 52

53 Φθορίζουσες χρωστικές Υπάρχουν αρκετές διαφορετικές προσεγγίσεις για τον προσδιορισμό της ποσότητας του προϊόντος της PCR που υπάρχει στο τέλος κάθε κύκλου, όλες βασίζονται στην ανίχνευση ενός φθοριοχρώματος ή φθορίζουσας ετικέτας (tag), η οποία συνδέεται σε κάθε μόριο που συντίθεται. 53

54 Τεχνολογίες Real-Time PCR (για εκπομπή φθορισμού) 1. Παράγοντες που προσδένονται σε δίκλωνο DNA (SYBR Green) 2. Ιχνηθέτες υβριδισμού (TaqMan probe) 54

55 1. Παράγοντες που προσδένονται σε δίκλωνο DNA (χρωστική SYBR Green). Χρωστική που εισχωρεί στην αύλακα του DNA και φθορίζει Σε αντιδράσεις που δεν απαιτείται ειδικότητα ως προς το προϊόν της αντίδρασης. 55

56 2. Ιχνηθέτες υβριδισμού TaqMan probe Είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο που φέρει μία φθορίζουσα ομάδα (reporter) στο ένα άκρο και μία ομάδα απορρόφησης φθορισμού στο άλλο (quencher). Στην διάταξη «βρόγχου» δεν εκπέμπεται φθορισμός γιατί ο quencher απορροφά (καταστέλλει) τον φθορισμό του reporter 56

57 Δρα σαν μοριακός φάρος (molecular beacon) Όταν όμως ο ιχνηθέτης θερμανθεί και υβριδοποιηθεί με την πολλαπλασιαζόμενη αλληλουχία του DNA, η διαμόρφωσή του αλλάζει και η φθορίζουσα ομάδα απομακρύνεται από την ομάδα απορρόφησης φθορισμού, οπότε εκπέμπει φως όταν ακτινοβολείται 57

58 Ο αυξανόμενος φθορισμός, που μετριέται καθώς προχωρά η αντίδραση και αυξάνεται η ποσότητα του μορίου-στόχου, είναι ένα μέτρο της αύξησης του αριθμού των πολλαπλασιαζόμενων μορίων. 58

59 Η ποσότητα του προϊόντος της PCR είναι τόσο χαμηλή κατά τους πρώτους κύκλους, που δεν μπορεί να προσδιοριστεί με βεβαιότητα, καθώς ο φθορισμός που παράγεται δεν υπερβαίνει αρκετά το χαμηλό ενδογενή φθορισμό (background fluorescence) των αντιδρώντων μορίων. 59

60 Όσο μεγαλύτερη είναι η αρχική ποσότητα του μορίου-στόχου, τόσο λιγότεροι κύκλοι απαιτούνται για να φτάσει η ποσότητα του προϊόντος σε ανιχνεύσιμα επίπεδα. 60

61 Μετράμε το Ct -threshold cycle Η αρχική αύξηση της ποσότητας του PCR προϊόντος συσχετίζεται άμεσα με την αρχική ποσότητα του νουκλεϊκού οξέος (της αλληλουχίας στόχου) που υπάρχει στο δείγμα μας 61

62 κατώφλι φθορισμού Ορίζεται ένα κατώφλι φθορισμού (threshold) και καταγράφωνται πόσοι κύκλοι PCR (PCR cycles) χρειάζονται για να φτάσει το κατώφλι αυτό το κάθε δείγμα (Ct - threshold cycle) 62

63 Πολύ DNA=μικρό Ct Όσο περισσότερα αντίγραφα υπάρχουν από μία συγκεκριμένη αλληλουχία στόχο σε ένα δείγμα, τόσο λιγότεροι κύκλοι θα χρειαστούν για να φτάσει ο φθορισμός στο όριο (κατώφλι). 63

64 Προσδιορισμός θετικώναρνητικών δειγμάτων 64

65 Cts < 29 πολύ θετικές αντιδράσεις (η αλληλουχία στόχος σε υψηλή συγκέντρωση) Cts of μέτρια ποσότητα αλληλουχίας στόχου Cts of αρνητικά δείγματα 65

66 Τα αποτελέσματα της Real Time PCR καταγράφονται σε Η/Υ. Δεν απαιτείται ηλεκτροφόρηση 66

67 Ανάλυση Melting curves 67

68 Πλεονεκτήματα Real-time PCR Δεν επηρεάζεται από ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων Η ενίσχυση παρακολουθείται συνεχώς σε κάθε κύκλο Δεν υφίσταται καμία διαδικασία μετά το τέλος της αντίδρασης (χαμηλός κίνδυνος επιμολύνσεων) Πιο σύντομοι θερμοδυναμικοί κύκλοι (30 λεπτά έως 2 ώρες) Μέτρηση δειγμάτων με μεγάλες διαφορές αρχικού νουκλεϊκού φορτίου Στις περιπτώσεις RT Real time PCR απαιτούνται 1000 φορές λιγότερα μόρια αρχικού RNA Αυξημένη ειδικότητα, ευαισθησία και επαναληψιμότητα Μικρή αύξηση του κόστους σε σχέση με την συμβατική PCR (εκτός του εξοπλισμού) 68