ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ. Βιοτεχνολογία. Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Διδάσκουσα: Αναπλ. Καθ. Άννα Ειρήνη Κούκκου

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Βιοτεχνολογία Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA Διδάσκουσα: Αναπλ. Καθ. Άννα Ειρήνη Κούκκου

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ

4 Μετασχηματισμός Μεταγωγή Σύζευξη

5 Μετασχηματισμός

6

7 ΜΕΤΑΓΩΓΗ T4 Βακτηριοφάγος κεφαλή κολλάρο τριχίδια κεντρικός σωλήνας περίβλημα ινες ουράς πλάκα βάσης ακίδες βάσης

8 Λυτικός κύκλος

9 Λυσιγόνος κύκλος

10 Σύζευξη

11

12 Βασικές αρχές της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA Κόψιμο του DNA σε συγκεκριμένες περιοχές με νουκλεάσες περιορισμού Ανάλυση αλληλουχίας όλων των νουκλεοτιδίων Υβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων Κλωνοποίηση του DNA Μηχανική του DNA

13 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες EcoR GAATTC CTTAAG G + AATTC CTTAA G------

14 Περιοριστικές ενδονουκλεάσες BamH GGATCC CCTAGG G + GATCC CCTAG G------

15 Περιοριστικός χάρτης

16 Το «Αχίλλειο κόψιμο» Μέθοδος που συνδυάζει το εξειδικευμένο κόψιμο μιας νουκλεάσης περιορισμού με την εξειδίκευση σύνδεσης άλλων μορίων που συνδέονται με DNA

17 Ηλεκτροφόρηση πηκτής διαχωρίζει το DNA ανάλογα με το μέγεθος

18 Κλωνοποίηση του DNA Φορείς κλωνοποίησης: μόρια DNA που περιέχουν μία αφετηρία αντιγραφής και τα οποία μπορούν να διπλασιαστούν στο κύτταρο ξενιστή Πλασμίδια :εξωχρωμοσωμικά, αυτόνομα διπλασιαζόμενα κυκλικά τμήματα DNA Πλασμίδια ως φορείς κλωνοποίησης Μόνο μία περιοχή στόχο για τουλάχιστον μία συγκεκριμένη ενδονουκλεάση Έναν ή περισσότερους επιλεγόμενους γενετικούς δείκτες Μία αφετηρία αντιγραφής (origin, ή ori)

19 Ανίχνευση μετασχηματισμένων

20 X-gal:5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galactopyranoside X-gal διασπάται από τη β-γαλακτοσιδάση σε γαλακτόζη και 5- βρομο-4-χλωρο-3-υδροξυ-ινδόλη το οποίο οξειδώνεται στη συνέχεια σε 5,5 -διβρωμο-4,4 -διχλωρο-indigo που είναι ένα μπλε αδιάλυτο προϊόν.

21 Άλλοι φορείς κλωνοποίησης Ιικοί φορείς (λ φάγος ο πιο συνηθισμένος) Μεγάλα τμήματα του DNA του φάγου λ δεν είναι απαραίτητα για μόλυνση του ξενιστή και μπορούν να αντικατασταθούν από ξένο DNA Μεταλλαγμένοι φάγοι ειδικά κατασκευασμένοι για κλωνοποίηση (π.χ. λgt-λβ, περιέχει μόνο 2 περιοριστικές θέσεις, EcoRI) Εισάγωνται πιο εύκολα στα βακτήρια από ότι τα πλασμίδια Κοσμίδια: υβρίδια πλασμιδιακών και ιικών φορέων Πλασμίδια με τις περιοχές cos (cohesive ends, άκρα του μορίου του λ DNA συμπληρωματικά) Λόγω συμπληρωματικότητας επιτρέπουν την κυκλοποίηση του λ DNA πριν την εισαγωγή του στο βακτηριακό DNA Επιτρεπτή η κλωνοποίηση μεγάλων τμημάτων DNA (μέχρι ~ 45 kb)

22 Μεταλλαγμένος φάγος λάμδα ως φορέας κλωνοποίησης

23 Γονιδιωματική βιβλιοθήκη- Κλωνοποίηση τυφλής στόχευσης ή ανασυνδυασμένο πλασμίδιο Κύτταρο ξενιστής Βακτηριακός κλώνος

24 Κλωνοποίηση cdna Ολικό RNA Απομόνωση mrna μέσω δέσμευσης σε ολιγο (dt) δεσμεύεται στη στήλη Έκλουση πολυ

25 Κλωνοποίηση cdna Σύνθεση cdna Ανάστροφη μεταγραφάση Το μόριο έχει τυφλά άκρα και η εισαγωγή του σε πλασμιδιακό ή ιικό γίνεται με κατάλληλες τεχνικές Κάθε κλώνος που προκύπτει καλείται cdna κλώνος φουρκέτα Ολόκληρη η συλλογή των κλώνων, cdna βιβλιοθήκη Si νουκλεάση

26 cdna βιβλιοθήκη -Κλωνοποίηση συμπληρωματικού DNA (Complementary DNA, cdna) Κατασκευάζεται από mrna με τη δράση της αντίστροφης μεταγραφάσης

27 Γονιδιακή σύνθεση-συνθετικό DNA Χρειάζεται να είναι γνωστή η πρωτεϊνική αλληλουχία πριν σχεδιαστεί ένα συνθετικό γονίδιο (μέχρι 500 αμινοξέα σύνθεση) Σύνθεση σε κατάλληλο μηχάνημα Figure 9.10

28 Σύγκριση των διαφορετικών στρατηγικών κλωνοποίησης Μέθοδος κλωνοποίησης Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα Τυφλής σκόπευσης κλωνοποίηση Εύκολη να γίνει Πολλοί διαφορετικοί κλώνοι Γονίδια με ιντρόνια δεν θα εκφραστούν σωστά σε βακτήρια Η έκφραση εξαρτάται από την αναγνώριση προαγωγέων από το βακτήριο Η επιλογή των κωδικονίων μπορεί να μην είναι ιδανική για το βακτήριο Κλωνοποίηση cdna Αν το επιθυμητό mrna βρίσκεται σε αφθονία Τα ιντρόνια δεν είναι πρόβλημα Δεν είναι πάντα άφθονο το επιθυμητό mrna Τεχνικά πιο δύσκολη Το κλωνοποιημένο γονίδιο πρέπει να τοποθετηθεί μετά έναν προαγωγέα Η επιλογή των κωδικονίων μπορεί να μην είναι ιδανική για το βακτήριο Γονιδιακή σύνθεση Δεν χρειάζεται επιλογή Η αλληλουχία προαγωγέων, RBS, μπορεί να βελτιωθεί Η επιλογή κωδικονίων μπορεί να βελτιστοποιηθεί Χρειάζεται να είναι γνωστή η πρωτεϊνική αλληλουχία

29 Εκφραση κλωνοποιημένων γονιδίων Μεταγραφή του DNA σε mrna (ο ρόλος του προαγωγέα) Μετάφραση του mrna σε μια πολυπεπτιδική αλληλουχία (RBS, Ribosome Binding Site) Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της πρωτεΐνης (αλληλουχίες σήματος, γλυκοσυλίωση)

30 Μεγιστοποίηση της έκφρασης Αριθμός αντιγράφων του πλασμιδιακού φορέα Ισχύς του προαγωγέα Αλληλουχία περιοχής σύνδεσης με το ριβόσωμα και το όμορο DNA Επιλογη των κωδικονίων στο κλωνοποιημένο γονίδιο Γενετική σταθερότητα του ανασυνδυασμένου στελέχους πρωτεόλυση

31 Υπερέκφραση ξένων πρωτεϊνών προκαλεί μεταβολικό φορτίο στο κύτταρο ξενιστή

32 Επιλογή των ανασυνδυασμένων κλώνων Γενετικές μέθοδοι (π.χ. συμπληρωματικότητα διατροφικών ανωμαλιών) Υβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων (in situ υβριδισμός) Επιλογή με βάση την παραγόμενη πρωτεΐνη (ιχνηλάτες)

33 Υβριδισμός νουκλεϊνικών οξέων

34 Επιλογή με βάση την παραγόμενη πρωτεΐνη

35

36 Ολιγονουκλεοτιδίου (ή σημείου) κατευθυνόμενη μετάλαξη (Sitedirected mutagenesis)

37 Μέθοδος Kunkel για βελτίωση αποτελεσματικότητας ολιγονουκλεοτιδίου κατευθυνόμενης μετάλλαξης που βασίζεται στην καταστροφή του φυσικού κλώνου

38 Μετάλλαξη κασέτας

39 Κατευθυνόμενη μετάλλαξη σημείου με την PCR 37

40 Κατευθυνόμενη μετάλλαξη σημείου με την PCR Σχεδιασμός δύο ζευγών μορίων πριμοδοτών εκ των οποίων το ένα μόριο έχει την μετάλλαξη και είναι συμπληρωματικά μεταξύ τους Επιμήκυνση με την DNA πολυμεράση Μετουσίωση και αναδιάταξη των αλυσίδων του DNA για παραγωγή ετερόδιπλων Μόνο το ένα ετερόδιπλο μπορεί να επιμηκυνθεί από 3 σε 5

41 Εφαρμογές γενετικής μηχανικής Figure 9.1

42 Τέλος Ενότητας

43 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

44 Σημειώματα

45 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ.

46 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκουσα: Αναπλ. Καθ. Άννα Ειρήνη Κούκκου. «Βιοτεχνολογία. Τεχνολογία ανασυνδυασμένου DNA». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

47 Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]