Εργαστηριακή άσκηση 3: Αιμοσυγκόλληση. Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

Transcript

1 Εργαστηριακή άσκηση 3: Αιμοσυγκόλληση Εργαστήριο Ανοσολογίας Εαρινό εξάμηνο 2019 Υπεύθυνες Διδάσκουσες: Βογιατζάκη Χρυσάνθη, Τσουμάνη Μαρία

2 Αιμοσυγκόλληση Ορισμός: Αιμοσυγκόλληση είναι ο σχηματισμός συγκολλήσεων-αθροισμάτων ερυθρών αιμοσφαιρίων ύστερα απο την ειδική αντίδραση ενός αντισώματος με ένα αντιγόνο. Tα ερυθροκύτταρα μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αντιδραστήρια παίζοντας τον ρόλο παθητικών φορέων αντιγόνων: α) είναι δυνατόν να προσδεθεί στην επιφάνειά τους σχεδόν κάθε αντιγόνο και β) τα σημασμένα ερυθροκύτταρα είναι από τους πιο ευαίσθητους δείκτες αντισωμάτων. Μπορεί να πραγματοποιηθεί: Επι πλακός: κατάλληλη για επείγοντα περιστατικά και εξωτερικούς χώρους, λιγότερο ευαίσθητη τεχνική, δεν έχει ευαισθησια για ασθενή αντιγόνα, δεν φαίνεται η αιμόλυση Σε σωληνάριο: μεγαλύτερη ευαισθησία σε σύγκριση με την τεχνική επι πλακός, δυνατότητα επώασης, η φυγοκέντρηση αυξάνει τις συγκολλήσεις, φαίνεται η αιμόλυση. Χρονοβόρα, αυξημένο κόστος Σε μικροσωληνάρια: γρήγορες και αξιόπιστες, χρησιμοποιούν υλικό απο gel ή μικροσφαιρίδια. Υπάρχουν οπές μέσα στο υλικό του σωληναρίου. Υποβάλλονται σε φυγοκέντρηση. Τα μεμονομένα ερυθροκύτταρα περνούν μέσα απο τις οπές και κατευθύνονται προς τον πυθμένα. Αντίθετα, όταν σχηματίζονται συμπλέγματα τότε αυτά παραμένουν στην επιφάνεια. Συστήματα μικροπλακών

3 Αρχή της μεθόδου Στην αιμοσυγκόλληση, ερυθροκύτταρα τα οποία έχουν ευαισθητοποιηθεί ή συζευχθεί με αντιγόνο (ευαισθητοποιημένα ερυθροκύτταρα) επωάζονται με αντίσωμα και δείγμα. Μετά την επώαση, προσδιορίζεται ο βαθμός αιμοσυγκόλλησης. Στη μέθοδο αυτή, το αντιγόνο στο δείγμα ανταγωνίζεται με το αντιγόνο που έχει συζευχθεί με τα ερυθροκύτταρα για τη σύνδεση τους με το αντίσωμα Μία άλλη παραλλαγή της αιμοσυγκόλλησης είναι η αντίστροφη παθητική αιμοσυγκόλληση στην οποία καθαρισμένο αντίσωμα συζευγνύεται με τα ερυθροκύτταρα. Η συγκόλληση παρατηρείται όταν το αντιγόνο ή το δείγμα προστίθεται στο σύστημα Ημιποσοτικός προσδιορισμός FS. Chu. Ιmmunoassays/Principles. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition (Second Edition) 2003, Pages

4 Αιμοσυγκόλληση με συστήματα μικροπλακών 96-well plate Εαν υπάρξουν συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος (συγκολλήσεις) τότε τα ερυθρά αιμοσφαίρια παραμένουν στα τοιχώματα (διάχυτος κύκλος) Εαν δεν υπάρξει αντίδραση τότε τα ερυθρά αιμοσφαίρια κυλούνε προς τον πυθμένα σχηματίζοντας μια κουκίδα στο κέντρο Πραγματοποιούνται διαδοχικές αραιώσεις

5 Γιατί πραγματοποιούνται διαδοχικές αραιώσεις στην αιμοσυγκόλληση; Στη ζώνη ισοδυναμίας περιέχεται η σωστή αναλογία αντιγόνου-αντισώματος οδηγώντας στον σχηματισμό συγκολλήσεων αντιγόνου-αντισώματος ορατών με γυμνό μάτι. Σε υψηλές συγκεντρώσεις αντισώματος, το σύμπλεγμα αντιγόνου-αντισώματος δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί-κάθε επίτοπος σε ένα αντιγόνο μπορεί να προσδεθεί σε ένα μόνο αντίσωμα.

6 Εφαρμογές αιμοσυγκόλλησης Καθορισμός της ομάδας αίματος (ΑΒΟ) και του παράγοντα Rh - Τα αντιγόνα των ομάδων αίματος του συστήματος ΑΒΟ (ABO blood-group antigens), είναι γλυκολιπίδια που εκφράζονται στα ερυθροκύτταρα. Οι ελάχιστες διαφορές στα τελικά κατάλοιπα σακχάρων τα οποία είναι προσκολλημένα σε αυτά τα επιφανειακά γλυκολιπίδια, διακρίνουν τα αντιγόνα της ομάδας αίματος Α από εκείνα της ομάδας Β. Αποτελεί παράδειγμα διασταυρωτής αντίδρασης. Διάγνωση του ιού της γρίπης Δεν απαιτείται ειδικός εξοπλισμός, Ταχεία μέθοδος, Μέτρια ευαισθησία

7 Διεξαγωγή της εργαστηριακής άσκησης Δοκιμασία αιμοσυγκόλλησης του ωχρού τρεπονήματος ή έμμεση αιμοσυγκόλληση για σύφιλη (ΤΡΗΑ = Treponema Pallidum Heamag Lumination Assay) Η Σύφιλη είναι μία λοιμώδης πολυσυστηματική μεταδοτική νόσος που οφείλεται στο Treponema pallidum pallidum Μεταδίδεται από άνθρωπο σε άνθρωπο με τη σεξουαλική επαφή (επίκτητη σύφιλη) και μέσω του πλακούντα από την έγκυο στο νεογνό (συγγενής σύφιλη) Η εργαστηριακή διερεύνηση της συφιλιδικής λοίμωξης στηρίζεται: (α) στην αναζήτηση του T. pallidum σε υλικό από τις βλάβες του δέρματος και των βλεννογόνων ή των διογκωμένων λεμφαδένων και (β) στον προσδιορισμό ειδικών και μη ειδικών αντισωμάτων στον ορό και το εγκεφαλονωτιαίο υγρό του ασθενούς Η TPHA αποτελεί τρεπονημική ορολογική μέθοδο

8 Αρχή της μεθόδου Μονιμοποιημένα ερυθροκύτταρα πτηνών επιστρώνονται με τμήματα του T. pallidum που έχουν αντιγονικές ιδιότητες. Κατά την διάρκεια της δοκιμασίας τα αντισώματα του εξεταζόμενου, εφόσον έχουν αντισώματα για το T. pallidum συγκολλούν τα ερυθροκύτταρα μεταξύ τους και σχηματίζουν χαρακτηριστική εικόνα αιμοσυγκόλλησης πάνω σε πλάκα μικροτιτλοδότητησης.

9 Υλικά TPHA Test Cells:Μονιμοποιημένα ερυθροκύτταρα πτηνών. Ευαισθητοποιημένα με αντιγόνα του Troponema pallidum. Έτοιμα προς χρήση TPHA Control Cells: Μονιμοποιημένα ερυθροκύτταρα πτηνών. Έτοιμα προς χρήση Διαλύτης: Έτοιμος προς χρήση Θετικός Μάρτυρας: Προ-αραιωμένος 1:20. Έτοιμος προς χρήση Αρνητικός Μάρτυρας: Προ-αραιωμένος 1:20. Έτοιμος προς χρήση Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου πριν τη χρήση Τα ΤPHA Test Cells και TPHA Control Cells πρέπει να ομογενοποιηθούν πριν τη χρήση

10 Πειραματική πορεία Ποιοτικός προσδιορισμός Κάθε δείγμα χρειάζεται τρία πηγαδάκια. To δείγμα εξετάζεται σε αραίωση 1:20. Συνεπώς στο πηγαδάκι 1, προσθέστε 190 μl διαλύματος εργασίας και 10 μl δείγματος και αναμείξτε (τελικός όγκος στο well 1:200 μl). Μεταφέρετε 25 μl από το πηγαδάκι 1 στα πηγαδάκια 2 και 3. Προσθέστε 75 μl από το Control Cells στο πηγαδάκι 2. Προσθέστε 75 μl από το Τest Cells στο πηγαδάκι 3. Χτυπήστε ελαφρά την πλάκα για να αναμείξετε τα συστατικά επιμελώς. Καλύψτε την πλάκα και επωάστε για 45 με 60 λεπτά

11 Πειραματική πορεία Ημιποσοτικός προσδιορισμός Πραγματοποιούνται διαδοχικές αραιώσεις. Κάθε δείγμα απαιτεί 9 πηγαδάκια της πλάκας τιτλοδότησης. Προσθέστε 190 μl διαλύματος εργασίας στο πηγαδάκι 1. Προσθέστε 25 μl διαλύματος εργασίας στα πηγαδάκια από το 4 έως το 9. Πραγματοποιήστε αραίωση 1/20 προσθέτοντας 10 μl ορού στο πηγαδάκι 1. Αναμείξτε. Μεταφέρετε 25 μl από την αραίωση 1/20 στα πηγαδάκια 2, 3 και 4. Αναμείξτε την αραίωση 1/40 μέσα στο πηγαδάκι 4 και μεταφέρετε 25 μl από αυτό στο πηγαδάκι 5. Επαναλάβετε αυτό το βήμα μέχρι να ολοκληρωθούν οι διαδοχικές αραιώσεις απορρίπτοντας 25 μl από το πηγαδάκι που έγινε η τελευταία αραίωση. Προσθέστε 75 μl από το Τest Cells στα πηγαδάκια 3, 4, 5, 6, 7, 8 και 9. Προσθέστε 75 μl από το Control Cells στο πηγαδάκι 2. Χτυπήστε ελαφρά την πλάκα για να αναμείξετε τα συστατικά επιμελώς. Καλύψτε την πλάκα και επωάστε για 45 με 60 λεπτά

12 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL Wells Discard Διαλύτης Ορός Control cells Test cells 190μL 10μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 25μL 75μL 75μL 75μL 75μL 75μL 75μL 75μL 75μL 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280

13 Ανάγνωση και ερμηνεία αποτελεσμάτων Ισχυρώς θετικό (4+). Ομοιόμορφο στρώμα κυττάρων καλύπτει ολόκληρη τη βάση του πηγαδιού, μερικές φορές με πτυχωτές ακμές. Θετικό (3+). Ομοιόμορφο στρώμα κυττάρων καλύπτει μερικώς τη βάση του πηγαδιού. Θετικό (2+). Ομοιόμορφο στρώμα κυττάρων περιτριγυρισμένα από ένα δακτύλιο κυττάρων. Αδύναμα θετικό (1+). Μικρότερο στρώμα κυττάρων, τα οποία περιτριγυρίζονται από ένα αρκετά μικρότερο ευκρινή δακτύλιο κυττάρων. Αμφισβητούμενο (+/-). Καλά καθορισμένο κομβίο κυττάρων με διαυγή κέντρο. Αρνητικό (-). Συμπαγής μάζα κυττάρων στη βάση του πηγαδιού. To θετικό αποτέλεσμα δοκιμασίας αιμοσυγκόλλησης. Θετικό αποτέλεσμα υπάρχει μέχρι το πηγαδάκι 6 όπου φαίνεται ορατή αιμοσυγκόλληση.

14 Παρατηρήσεις Ψευδώς θετικά αποτελέσματα (διασταυρούμενα αντισώματα) Η παρουσία μη ειδικών αντισωμάτων (διασταυρούμενα αντισώματα) μπορεί να προκαλέσουν την συγκόλληση των Τest Cells και Control Cells χωρίς να υπάρχουν στο δείγμα του ασθενούς πραγματικά αντισώματα έναντι της ωχράς σπειροχαίτης.