hcg+ß-irma KIP KIP0984

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1 hcg+ßirma KIP0981 KIP0984 DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2 B1348 LouvainlaNeuve Belgium

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3 en Read entire protocol before use. hcg+β IRMA I. INTENDED USE Immunoradiometric assay for the in vitro quantitative measurement of human chorionic gonadotropin in serum and plasma. This kit is not intended to be used for the risk evaluation of trisomy 21. II. GENERAL INFORMATION A. Proprietary name : DIAsource hcg+β IRMA kit B. Catalog number : KIP0981 : 96 tests KIP0984 : 4 x 96 tests C. Manufactured by : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 LouvainlaNeuve, Belgium. For technical assistance or ordering information contact : Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) III. CLINICAL BACKGROUND A. Biological activities hcg is a glycoprotein synthesised by the syncytiotrophoblast of the placenta throughout pregnancy. hcgmolecular weight 37.9 kda comprises two subunits. The hcg α subunit molecular weight 14.9 Kda is chemically similar to the α subunits of FSH, LH and TSH hormones. The hcg β subunit molecular weight 23.0 kda has a structure similar to that of the LH β subunit, differing by only a few epitopes. hcg has biological characteristics similar to LH. During pregnancy, hcg stimulates the remaining corpus luteum and the placental tissue to secrete the various steroid hormones. In addition to its stimulating action on the luteal and placental tissue, hcg, by crossing the placenta, is essential to differentiate the genital tractus of the fetus, which occurs around the 7th week of pregnancy. B. Clinical application of hcg+β IRMA Diagnostic and monitoring test in pregnancy hcg and its free subunits α and β appear in the serum and urine of pregnant women about 9 days following ovulation. The hcg level then increases rapidly to reach a peak between the 8th and the 12th week. Tumour marker test in trophoblastic tumours Hydatiform moles and choriocarcinomas may secrete large amounts of native hcg and its two free subunits α and β into the peripheral blood circulation. Tumour marker test in nontrophoblastic cancers 10 to 15 % of the breast, lung, and digestive tract cancers release hcg and/or either of its two constitutive subunits α and β.

4 IV. PRINCIPLES OF THE METHOD The DIAsource hcg+β IRMA is an immunoradiometric assay based on coatedtube separation in which several monoclonal antibodies directed against distinct epitopes of hcg have been used. Mabs 1 the capture antibodies are attached to the lower and inner surface of the plastic tube. Calibrators or samples added to the tubes will at first show low affinity for Mabs 1. Addition of Mabs 2, the signal antibody labelled with 125 I, will complete the system and trigger the immunological reaction. After washing, the remaining radioactivity bound to the tube reflects the antigen concentration. V. REAGENTS PROVIDED Reagents Anti hcg+β 125 I (monoclonal antibodies) in TRIS Buffer with bovine serum albumin, sodium azide (< 0.1 %) and inert red dye Calibrators 16 in bovine serum and thymol (see exact value on vial labels) Calibrator 0 in bovine serum and azide (0,5 %) WASH SOLN CONC Wash solution (TRISHCl) Controls 1 and 2 in human serum with thymol Quantity 96 tests Quantity 4x96 tests Colour Code Reconstitution 2 x 48 8 x 48 grey Ready for use 1 vial 5.5 ml 450 kbq 6 vials lyophil. 3 vials 1 vial 2 vials lyophil. 4 vials 5.5 ml 4 x 450 kbq 2 x 6 vials lyophil. 8 vials 3 vials 2 x 2 vials lyophil red yellow yellow brown silver Ready for use Add 0.5 ml distilled water Ready for use Dilute 70x with distilled water (use a magnetic stirrer). Add 0.5 ml distilled water Note: Also use the content of the zero calibrator for dilutions of samples. 1 miu of the calibrator preparation is equivalent to 1 miu of 4 th IS 75/589 VI. SUPPLIES NOT PROVIDED The following material is required but not provided in the kit : 1. Distilled water 2. Pipettes for delivery of: 50 μl and 500 μl (the use of accurate pipettes with disposable plastic tips is recommended) 3. 5 ml automatic syringe (Cornwall type) for washing 4. Aspiration system (optional) 5. Vortex mixer 6. Magnetic stirrer 7. Tube shaker (400 rpm) 8. Any gamma counter capable of measuring 125 I may be used (minimal yield 70%). VII. Tubes coated with anti hcg+β (monoclonal antibodies) CAL CAL CONTROL 125 I N 0 N REAGENT PREPARATION 1. Calibrators 16: Reconstitute the calibrators with 0.5 ml distilled water. 2. Controls : Reconstitute the controls with 0.5 ml distilled water. 3. Wash solution : Prepare an adequate volume of Working Wash Solution by adding 69 volumes of distilled water to 1 volume of wash solution (70x). Use a magnetic stirrer to homogenize. Discard unused Working Wash Solution at the end of the day. VIII. STORAGE AND EXPIRATION DATING OF REAGENTS Before opening or reconstitution, all kit components are stable until the expiry date, indicated on the label, if kept at 2 to 8 C. After reconstitution, calibrators and controls are stable for 7 days at 28 C. For longer storage periods, aliquots should be made and kept at 20 C for 3 months. Avoid subsequent freezethaw cycles. Freshly prepared Working Wash solution should be used on the same day. After its first use, tracer is stable until expiry date, if kept in the original wellclosed vial at 2 to 8 C. Alterations in physical appearance of kit reagents may indicate instability or deterioration. IX. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION. Serum or plasma samples must be kept at 28 C.. If the test is not run within 24h., storage at 20 C is recommended. Avoid subsequent freezethaw cycles.. Serum and heparinized or EDTA plasma provide similar results. y(serum) = 1.03x (HEP. plasma) r = 0.99 n = 30 y(serum) = 1.00x (EDTA plasma) 0.47 r = 0.99 n = 30 X. PROCEDURE A. Handling notes Do not use the kit or components beyond expiration date. Do not mix materials from different kit lots. Bring all the reagents to room temperature prior to use. Thoroughly mix all reagents and samples by gentle agitation or swirling. In order to avoid crosscontamination, use a clean disposable pipette tip for the addition of each reagent and sample. High precision pipettes or automated pipetting equipment will improve the precision. Respect the incubation times. Prepare a calibrator curve for each run, do not use data from previous runs. B. Procedure 1. Label coated tubes in duplicate for each calibrator, control, specimen. For the determination of the total activity label two plain plastic tubes. 2. Briefly vortex calibrators, controls, specimens and dispense 50 μl of each into the respective tubes. 3. Dispense 50 μl of antihcg+β 125 I tracer to all tubes, including the uncoated tubes for total counts. 4. Shake the rack containing the tubes gently by hand to liberate any trapped bubbles. 5. Incubate for 30 min. at room temperature on a tube shaker (400 rpm). Respect carefully the incubation time. 6. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). Be sure that the plastic tip of the aspirator reaches the bottom of the coatedtube in order to remove all the liquid. 7. Wash tubes with 2 ml Working Wash solution (except total counts). Avoid foaming during the addition of the Working Wash solution. 8. Aspirate (or decant) the content of each tube (except total counts). 9. Wash tubes again with 2 ml Wash solution (except total counts) and aspirate (or decant). 10. After the last washing, let the tubes stand upright for two minutes and aspirate the remaining drop of liquid. 11. Count tubes in a gamma counter for 60 seconds. XI. CALCULATION OF RESULTS 1. Calculate the mean of duplicate determinations. 2. On semi logarithmic or linear graph paper plot the c.p.m. (ordinate) for each calibrator against the corresponding concentration of hcg+β (abscissa) and draw a calibration curve through the calibrator points, reject the obvious outliers. 3. Read the concentration for each control and sample by interpolation on the calibration curve. 4. Computer assisted data reduction will simplify these calculations. If automatic result processing is used, a 4parameter logistic function curve fitting is recommended. XII. TYPICAL DATA The following data are for illustration only and should never be used in place of the real time calibrator curve. hcg+β IRMA cpm B/T (%) Total count Calibrator 0.0 miu/ml 5.5 miu/ml 16.6 miu/ml 54.0 miu/ml miu/ml miu/ml miu/ml

5 XIII. PERFORMANCE AND LIMITATIONS A. Detection Limit Twenty zero standards were assayed along with a set of other calibrators. The sensitivity, defined as the apparent concentration two standard deviations above the average counts at zero binding, was 1.6 mu/ml. B. Specificity FSH LH TSH αhcg βhcg Crossreactive hormones were added to a low hcg+β value serum and to a high value calibrator (150 miu/ml). The apparent hcg+β response was measured. Added hormones CAL miu/ml 250 miu/ml 250 μiu/ml fmol/ml 1000 fmol/ml Observed hcg values 9.8 miu/ml 11.3 miu/ml 10.9 miu/ml 10.3 miu/ml 11.0 miu/ml miu/ml CAL 2 Observed hcg values 284 miu/ml 292 miu/ml 262 miu/ml 290 miu/ml 252 miu/ml 699 miu/ml This demonstrates that the hcg+βirma does not cross react with FSH, LH, TSH, αhcg and presents a 100 % crossreaction with the free βchain of hcg. Note : Using the following molecular weights 37.9 kda (hcg), 23.0 kda (βhcg) and 14.9 kda (αhcg), the molar equivalents are : hcg : 1000 fmol = 37.9 ng 325 miu 1st IRP 75/537 βhcg : 1000 fmol = 23.0 ng αhcg : 1000 fmol = 14.9 ng C. Precision INTRA ASSAY Serum N <X> ± S.D. A B ± ± 3.0 CV (%) INTER ASSAY Serum N <X> ± S.D. C D ± ± 12.6 CV (%) E. Time delay between last calibrator and sample dispensing As shown hereafter, assay results remain accurate even when a sample is dispensed 30 minutes after the calibrator has been added to the coated tubes. Serum 1 Serum 2 F. Hook effect TIME DELAY 0' 10' 20' 30' A Hook effect can be observed above miu/ml. Samples from pregnant women can yield such high concentrations. Therefore, it is advisable, in cases where an accurate quantitative result of the hcg concentration should be obtained (e.g. follow up of pregnancies), to test 3 dilutions as indicated in the scheme below. A: undiluted B: 17x diluted (25 µl of A µl zero calibrator) C: 289x diluted (25 µl of B µl zero calibrator) Screening for pregnancies should be tested undiluted. XIV. LIMITATIONS Specimens from patients who have received preparations of mouse monoclonal antibodies for diagnosis or therapy may contain human antimouse antibodies (HAMA). Such specimens may show either falsely elevated or depressed values when tested with assay kits which employ mouse monoclonal antibodies. Heterophilic antibodies in human serum can react with reagent immunoglobulins, interfering with in vitro immunoassays. Patients routinely exposed to animals or animal serum products can be prone to this interference and anomalous values may be observed in case of the presence of heterophelic antibodies. Carefully evaluate the results of patients suspected of having these antibodies. If results are not consistent with other clinical observations, additional information should be required before diagnosis. D. Accuracy Sample Serum Added hcg RECOVERY TEST Recovered Recovery (%) 102 XV. INTERNAL QUALITY CONTROL If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on the vial label, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the discrepancy has been given. If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be kept frozen in aliquots. Do not freezethaw more than twice. Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the samples should rely on Good Laboratory Practises DILUTION TEST Sample Dilution Theoretical Concent. Serum 1 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Samples were diluted with zero calibrator Measured Concent XVI. REFERENCE INTERVALS The values provided below are given only for guidance; each laboratory should establish its own normal range of values. Pregnancy cutoff: The cutoff for pregnancy determination, defined as the apparent concentration three standard deviations above the average counts of 97 samples from nonpregnant women, was 4.6 miu/ml. It is recommended to retest samples between the cutoff and 10 miu/ml. XVII. PRECAUTIONS AND WARNINGS Safety For in vitro diagnostic use only. This kit contains 125 I (halflife: 60 days),emitting ionizing X (28 kev) and γ (35.5 kev) radiations. This radioactive product can be transferred to and used only by authorized persons; purchase, storage, use and exchange of radioactive products are subject to the legislation of the end user's country. In no case the product must be administered to humans or animals. All radioactive handling should be executed in a designated area, away from regular passage. A log book for receipt and storage of radioactive materials must be kept in the lab. Laboratory equipment and glassware, which could be contaminated with radioactive substances should be segregated to prevent cross contamination of different radioisotopes.

6 Any radioactive spills must be cleaned immediately in accordance with the radiosafety procedures. The radioactive waste must be disposed of following the local regulations and guidelines of the authorities holding jurisdiction over the laboratory. Adherence to the basic rules of radiation safety provides adequate protection. The human blood components included in this kit have been tested by European approved and/or FDA approved methods and found negative for HBsAg, anti HCV, antihiv1 and 2. No known method can offer complete assurance that human blood derivatives will not transmit hepatitis, AIDS or other infections. Therefore, handling of reagents, serum or plasma specimens should be in accordance with local safety procedures. All animal products and derivatives have been collected from healthy animals. Bovine components originate from countries where BSE has not been reported. Nevertheless, components containing animal substances should be treated as potentially infectious. Avoid any skin contact with reagents (sodium azide as preservative). Azide in this kit may react with lead and copper in the plumbing and in this way form highly explosive metal azides. During the washing step, flush the drain with a large amount of water to prevent azide buildup. Do not smoke, drink, eat or apply cosmetics in the working area. Do not pipette by mouth. Use protective clothing and disposable gloves. XVIII. BIBLIOGRAPHY 1. BRAUNSTEIN G.D., RASOR J., ADLER D., DANZER H., WADE H.E., (1976) Serum chorionic gonadotropin levels throughout normal pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126: MANCINI G. et al., (1992) hcg, AFP and V E 3 pattern in the 1420th weeks of Down's syndrome pregnancies. Prenatal Diagnost., 12(7): WHITEHEAD N. et al., (1993) Elevated material serum human chorionic gonadotropin increases the chance of adverse pregnancy outcome. Am. J. Obstet. Gynecol., 169(5): XIX. Calibrators (05) Samples Tracer Incubation Separation Washing solution Separation Washing solution Separation SUMMARY OF THE PROTOCOL TOTAL COUNTS ml 0.05 CALIBRATORS ml SAMPLE(S) ml minutes at room temperature with shaking at 400 rpm aspirate (or decant) 2.0 aspirate (or decant) 2.0 aspirate (or decant) 2. CHEN F., SETSUKO G., YOSHIHITO F., YUTAKA T., (1987) Radioimmunoassay of the serum free βsubunit of human chorionic gonadotropin in trophoblastic disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 64: DAWOOD M.Y., SASCENA B.B., LANDESMAN R., (1977) Human chorionic gonadotropin and its subunit in hydatidiform mole and choriocarcinoma. Obstet. Gynecol., 50: HAY D.L., (1982) Chorionic gonadotropin. Clin. Biochem., 3: GASPARD V.J., REUTER A.M., DEVILLE J.L., VRINDTS GEVAERT Y., BAGSHAWE K.D., FRANCHIMONT P., (1980) Serum concentration of human chorionic gonadotropin and its alpha and beta subunit II Trophoblastic tumours. Clin. Endocrinol. (Oxf.), 13: PIERCE J.G., PARSONS T.F., (1981) Glycoprotein hormones : structure and function. Annu. Rev. Biochem., 50:465. Counting DIAsource Catalogue Nr : KIP0981 KIP0984 Count tubes for 60 seconds P.I. Number : /en Date of issue : /1 Revision date :

7 fr Lire entièrement le protocole avant utilisation. hcg+βirma I. BUT DU DOSAGE Trousse de dosage radioimmunologique pour la mesure quantitative in vitro de la gonadotropine chorionique (hcg) dans le sérum et le plasma humain. Cette trousse n'est pas destinée à être utilisée pour évaluer le risque de trisomie 21. II. INFORMATIONS GENERALES A. Nom du produit : DIAsource hcg+βirma kit B. Numéro de catalogue : KIP0981 : 96 tests KIP0984 : 4 x 96 tests C. Fabriqué par : DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 LouvainlaNeuve, Belgium. III. CONTEXTE CLINIQUE Pour une assistance technique ou une information sur une commande : Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) A. Activités biologiques La hcg est une glycoprotéine synthétisée par le syncytiotrophoblaste du placenta lors de la grossesse. Le poids moléculaire de la hcg est 37.9 kda et comprend deux sousunités. La sousunité hcg α poids moléculaire 14.9 kda est chimiquement similaire aux sousunités α des hormones FSH, LH et TSH. La sousunité hcg β poids moléculaire 23.0 kda a une structure similaire à celle de la sousunité LH β, qui n est différente que par quelques épitopes. La hcg a des caractéristiques similaires à celles de la LH. Lors de la grossesse, la hcg stimule le corps jaune restant et le tissu placentaire à sécréter les différentes hormones stéroïdes. En plus de son action stimulante sur le tissu lutéal et placentaire, la hcg, en traversant le placenta, est essentielle pour différentier le tractus génital du fœtus, qui apparaît vers la 7ième semaine de la grossesse. B. Application clinique Test d évaluation et test diagnostique pour la grossesse La hcg et ses sousunités libres α et β apparaissent dans le sérum et l urine de femmes enceintes après environ 9 jours après l ovulation. Puis, le taux en hcg augmente rapidement pour atteindre un sommet entre la 8ième et la 12ième semaine. Test de marqueur de tumeur pour des tumeurs trophoblastiques Des môles hydatiformes et des choriocarcinomes peuvent sécréter de grandes quantités de hcg native et de ses deux sousunités libres α et β dans la circulation sanguine périphérique. Test de marqueur de tumeur pour des cancers nontrophoblastiques 10 à 15 % des cancers du sein, du poumon et de l intestin sécrètent de la hcg et/ou ses deux sousunités constitutives α et β.

8 IV. PRINCIPES DU DOSAGE VIII. STOCKAGE ET DATE D EXPIRATION DES REACTIFS La trousse DIAsource hcg+βirma est une trousse de dosage radioimmunologique basée sur la séparation en tube recouvert d'anticorps dans lequel différents anticorps monoclonaux, dirigés contre des épitopes distinctes de la hcg ont été utilisés. Mabs1, les anticorps de capture, sont attachés sur la surface basse et interne du tube plastic. Les calibrateurs ou les échantillons ajoutés dans les tubes présenteront dans un premier temps une faible affinité pour Mabs1. L addition de Mab2, l anticorps de détection marqué avec l 125 I, complètera le système et déclenchera la réaction immunologique. Suite au lavage, la radioactivité restante liée au tube reflètera la concentration de l antigène. V. REACTIFS FOURNIS Reactifs TRACEUR: anti hcg+β marquée à l 125 Iodine (anticorps monoclonal) dans un tampon TRIS avec de l'albumine bovine, de l azide de sodium (<0,1%) et un colorant rouge inactif Calibrateur zéro dans du sérum bovin avec de l azide (0,5 %) Calibrateur N = 1 à 6 (cfr. Valeurs exactes sur chaque flacon) dans du sérum bovin avec du thymol Solution de Lavage (TRIS HCl) Contrôles N = 1 ou 2 dans du sérum humain avec du thymol Note: VI. Tubes recouverts avec l anti hcg+β (anticorps monoclonal) WASH CAL CAL SOLN CONTROL 125 I 0 N CONC N 96 tests Kit 96 tests Kit Code Couleur Reconstitution 2 x 48 8 x 48 Gris Prêt à l emploi 1 flacon 5,5 ml 450 kbq 3 flacons 6 flacons lyophilisés 1 flacon 2 flacons lyophilisés 4 flacons 5,5 ml 4x450 kbq 8 flacons 2x6 flacons lyophilisés 3 flacons 2x2 flacons lyophilisés Rouge Jaune Jaune Brun Gris Prêt à l emploi Prêt à l emploi Ajouter 0,5 ml d eau distillée Diluer 70 x avec de l eau distillée (utiliser un agitateur magnétique). Ajouter 0,5 ml d eau distillée 1. Utiliser le calibrateur zéro pour la dilution des échantillons miu de la préparation du calibrateur est équivalent à 1 miu de 4 th IS 75/589 MATERIELS NON FOURNIS Le matériel mentionné cidessous est requis mais non fourni avec la trousse: 1. Eau distillée 2. Pipettes pour distribuer: 50 μl et 500 μl (l utilisation de pipettes précises et de pointes en plastique est recommandée) 3. Agitateur vortex 4. Agitateur magnétique 5. Agitateur de tubes (400 rpm) 6. Seringue automatique de 5 ml (type Cornwall) pour les lavages 7. Système d aspiration (optionnel) 8. Tout compteur gamma capable de mesurer l 125 I peut être utilisé (rendement minimum 70%). Avant l ouverture ou la reconstitution, tous les composants de la trousse sont stables jusqu à la date d expiration, indiquée sur l étiquette, si la trousse est conservée entre 2 et 8 C. Après reconstitution, les calibrateurs et les contrôles sont stables pendant 7 jours entre 2 et 8 C. Pour de plus longues périodes de stockage, des aliquots devront être réalisés et ceuxci seront gardés à 20 C pendant 3 mois au maximum. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. La Solution de Lavage préparée doit être utilisée le jour même. Après la première utilisation, le traceur est stable jusqu à la date d expiration, si celuici est conservé entre 2 et 8 C dans le flacon d origine correctement fermé. Des altérations dans l apparence physique des réactifs de la trousse peuvent indiquer une instabilité ou une détérioration. IX. PREPARATION ET STABILITE DE L ECHANTILLON Les échantillons de sérum ou de plasma doivent être gardés entre 2 et 8 C. Si le test n est pas réalisé dans les 24 heures, un stockage à 20 C est recommandé. Eviter des cycles de congélation et décongélation successifs. Le sérum, le plasma hépariné ou le plasma traité avec l EDTA donne des résultats similaires y(sérum) = 1,03x (HEP. Plasma) + 0,07 r = 0,99 n = 30 y(sérum) = 1,00x (EDTA Plasma) 0,47 r = 0,99 n = 30 X. MODE OPERATOIRE A. Notes de manipulation Ne pas utiliser la trousse ou ses composants après avoir dépassé la date d expiration. Ne pas mélanger du matériel provenant de trousses de lots différents. Mettre tous les réactifs à température ambiante avant utilisation. Mélangez tous les réactifs et les échantillons sous agitation douce. Pour éviter toute contamination croisée, utiliser une nouvelle pointe de pipette pour l addition de chaque réactif et échantillon. Des pipettes de haute précision ou un équipement de pipetage automatique permettent d augmenter la précision. Respecter les temps d incubation. Préparer une courbe d étalonnage pour chaque nouvelle série d expériences, ne pas utiliser les données d expériences précédentes. B. Mode opératoire 1. Identifier les tubes recouverts fournis dans la trousse, en double pour chaque calibrateur, échantillon, contrôle. Pour la détermination de l activité totale, identifier 2 tubes non recouverts d anticorps. 2. Agiter au vortex brièvement les calibrateurs, les contrôles et les échantillons. Puis distribuer 50 μl de chacun d eux dans leurs tubes respectifs. 3. Distribuer 50 μl de traceur dans chaque tube. 4. Agiter légèrement le portoir de tube manuellement pour libérer toute bulle d air emprisonnée. 5. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante sous agitation continue (400 rpm). Respecter strictement le délai d incubation. 6. Aspirer (ou décanter) le contenu de chaque tube (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale). Assurezvous que la pointe utilisée pour aspirer le liquide des tubes atteint le fond de chacun d eux pour éliminer toute trace de liquide. 7. Laver les tubes avec 2 ml de Solution de Lavage (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale) et aspirer. Eviter la formation de mousse pendant l addition de la Solution de Lavage. 8. Aspirer (ou décanter) le contenu de chaque tube (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale). 9. Laver les tubes à nouveau avec 2 ml de Solution de Lavage (à l exception des tubes utilisés pour la détermination de l activité totale) et aspirer (ou décanter). 10. Après le dernier lavage, laisser les tubes droits pendant 2 minutes et aspirer (ou décanter) le reste de liquide. 11. Placer les tubes dans un compteur gamma pendant 60 secondes pour quantifier la radioactivité. VII. PREPARATION DES REACTIFS XI. CALCUL DES RESULTATS A. Calibrateurs 16: Reconstituer les calibrateurs avec 0,5 ml d eau distillée. B. Contrôles : Reconstituer les contrôles avec 0,5 ml d eau distillée. C. Solution de Lavage : Préparer un volume adéquat de Solution de Lavage en ajoutant 69 volumes d eau distillée à 1 volume de Solution de Lavage (70x). Utiliser un agitateur magnétique pour homogénéiser. Eliminer la Solution de Lavage non utilisée à la fin de la journée. 1. Calculer la moyenne de chaque détermination réalisée en double. 2. Dessiner sur un graphique linéaire ou semilogarithmique les cpm (ordonnées) pour chaque calibrateur contre la concentration correspondante en hcg+β (abscisses) et dessiner une courbe de calibration à l aide des points de calibration, écarter les valeurs aberrantes.

9 3. Lire la concentration pour chaque contrôle et échantillon par interpolation sur la courbe de calibration. 4. L analyse informatique des données simplifiera les calculs. Si un système d analyse de traitement informatique des données est utilisé, il est recommandé d utiliser la fonction «4 paramètres» du lissage de courbes. D. Exactitude Echantillon TEST DE RECUPERATION hcg+β ajoutée hcg+β récupérée Récupération (%) XII. DONNEES TYPES Les données représentées cidessous sont fournies pour information et ne peuvent jamais être utilisées à la place d une courbe d étalonnage. Sérum 1 50,0 100,0 200,0 400,0 52,1 101,7 209,0 417,1 102 hcg+β IRMA cpm B/T (%) Activité totale Calibrateur 0,0 miu/ml 5,5 miu/ml 16,6 miu/ml 54,0 miu/ml 153,0 miu/ml 307,0 miu/ml 585,0 miu/ml ,07 0,38 0,85 2,76 8,66 16,90 31,68 TEST DE DILUTION Echantillon Dilution Concent. théorique Sérum 1 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/ ,6 281,8 140,9 70,5 35,2 17,6 8,8 4,4 Concent. Mesurée 563,6 260,2 126,4 62,6 34,1 18,1 8,7 4,8 XIII. PERFORMANCE ET LIMITES A. Sensibilité Vingt calibrateurs zéro ont été testés en parallèle avec un assortiment d autres calibrateurs. La limite de détection, définie comme la concentration apparente située 2 déviations standards audessus de la moyenne déterminée à la fixation zéro, était de 1,6 miu/ml. B. Spécificité Des hormones crossréactives ont été ajoutées à un sérum à valeur hcg+β basse et à un calibrateur à valeur élevée (150 miu/ml). La réponse hcg+β a été mesurée. FSH LH TSH αhcg βhcg Hormones ajoutées CAL miu/ml 250 miu/ml 250 μiu/ml fmol/ml 1000 fmol/ml Valeurs hcg observées 9,8 miu/ml 11,3 miu/ml 10,9 miu/ml 10,3 miu/ml 11,0 miu/ml 361,0 miu/ml CAL 2 Valeurs hcg observées 284 miu/ml 292 miu/ml 262 miu/ml 290 miu/ml 252 miu/ml 699 miu/ml Ceci démontre que la hcg+βirma ne présente pas de réaction croisée avec FSH, LH, TSH, αhcg et présente une réaction croisée de 100 % avec la chaîne β libre de la hcg. Note : En utilisant les poids moléculaires suivants 37.9 kda (hcg), 23.0 kda (βhcg) et 14.9 kda (αhcg), les équivalents molaires sont : hcg : 1000 fmol = 37.9 ng 325 miu 1st IRP 75/537 βhcg : 1000 fmol = 23.0 ng αhcg : 1000 fmol = 14.9 ng C. Précision INTRAESSAI Sérum N <X> ± SD A B ,3 ± 1,2 245,9 ± 3,0 CV (%) 1,8 1,2 INTERESSAI Sérum N <X> ± SD C D SD : Déviation Standard; CV: Coéfficient de variation ,2 ± 2,2 149,6 ± 12,6 CV (%) 6,2 8,4 L échantillon a été dilué avec le calibrateur zéro. E. Délai entre la distribution du dernier calibrateur et celle de l échantillon Comme montré cidessous, les résultats d un essai restent précis même quand un échantillon est distribué 30 minutes après que le calibrateur ait été ajouté aux tubes avec l anticorps. Serum 1 Serum 2 31,2 144,1 DELAI 0' 10' 20' 30' 31,1 142,4 30,9 140,5 31,4 143,5 F. Effet crochet Un effet crochet peut être observé audessus de miu/ml. Les échantillons de femmes enceintes peuvent comprendre ces concentrations. Voilà pourquoi il est recommandé, dans les cas où un résultat quantitatif précis de la concentration en hcg doit être obtenu (p.e. observation de grossesses), de tester 3 dilutions comme indiqué dans le schéma cidessous. A: Non dilué B: Dilué 17x (25 µl de A µl du calibrateur zéro) C: Dilué 289x (25 µl de B µl du calibrateur zéro) Les tests de grossesse doivent être testés non dilués. XIV. LIMITATIONS Les échantillons de patients ayant reçu des préparations d'anticorps monoclonaux de souris pour un diagnostic ou comme traitement peuvent contenir des anticorps humains antisouris (HAMA). De tels échantillons peuvent montrer des valeurs soit faussement élevées soit faussement basses lorsqu'ils sont analysés avec des trousses d'analyses utilisant des anticorps monoclonaux de souris. Des anticorps hétérophiles dans le sérum humain peuvent réagir avec le réactif immunoglobulines, interférant ainsi avec les méthodes d'analyse immunologiques in vitro. Les patients couramment en contact avec des animaux ou des produits de sérum animal peuvent être sujets à ces interférences. Des valeurs anormales peuvent être observées en cas de présence d'anticorps hétérophiles. Évaluer soigneusement les résultats des patients suspectés d'avoir ces anticorps. Si les résultats ne sont pas cohérents avec les autres observations cliniques, des informations supplémentaires doivent être demandées avant de poser le diagnostic.

10 XV. CONTROLE DE QUALITE INTERNE Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans l intervalle spécifié sur l étiquette du flacon, les résultats ne peuvent pas être utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la nonconformité. Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d échantillons contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. Les critères d acceptation pour les écarts des valeurs in duplo des échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes. XVI. VALEURS ATTENDUES Les valeurs sont données à titre d information; chaque laboratoire doit établir ses propres écarts de valeurs. Limite pour la grossesse: La limite pour la détermination de la grossesse, définie comme la concentration apparente trois déviations standards audessus des comptages moyens de 96 échantillons de femmes non enceintes, était 4,6 miu/ml. Il est recommandé de retester les échantillons compris entre le cutoff et 10 miu/ml. XVII. PRECAUTIONS ET AVERTISSEMENTS Sécurité Pour utilisation en diagnostic in vitro uniquement. Cette trousse contient de l 125 I (demivie: 60 jours), une matière radioactive émettant des rayonnements ionisants X (28 kev) et γ (35.5 kev). Ce produit radioactif peut uniquement être reçu, acheté, possédé ou utilisé par des personnes autorisées; l achat, le stockage, l utilisation et l échange de produits radioactifs sont soumis à la législation du pays de l'utilisateur final. Ce produit ne peut en aucun cas être administré à l homme ou aux animaux. Toutes les manipulations radioactives doivent être exécutées dans un secteur désigné, éloigné de tout passage. Un journal de réception et de stockage des matières radioactives doit être tenu à jour dans le laboratoire. L'équipement de laboratoire et la verrerie, qui pourrait être contaminée avec des substances radioactives, doivent être isolés afin d éviter la contamination croisée de plusieurs isotopes. Toute contamination ou perte de substance radioactive doit être réglée conformément aux procédures de radio sécurité. Les déchets radioactifs doivent être placés de manière à respecter les réglementations en vigueur. L'adhésion aux règles de base de sécurité concernant les radiations procure une protection adéquate. Les composants de sang humain inclus dans ce kit ont été évalués par des méthodes approuvées par l Europe et/ou la FDA et trouvés négatifs pour HBsAg, l antihcv, l antihiv1 et 2. Aucune méthode connue ne peut offrir l'assurance complète que des dérivés de sang humain ne transmettront pas d hépatite, le sida ou toute autre infection. Donc, le traitement des réactifs, du sérum ou des échantillons de plasma devront être conformes aux procédures locales de sécurité. Tous les produits animaux et leurs dérivés ont été collectés d'animaux sains. Les composants bovins proviennent de pays où l ESB n'a pas été détectée. Néanmoins, les composants contenant des substances animales devront être traités comme potentiellement infectieux. L azide de sodium est nocif s il est inhalé, avalé ou en contact avec la peau (l azide de sodium est utilisé comme agent conservateur). L azide dans cette trousse pouvant réagir avec le plomb et le cuivre dans les canalisations et donner des composés explosifs, il est nécessaire de nettoyer abondamment à l eau le matériel utilisé. Ne pas fumer, ni boire, ni manger ni appliquer de produits cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Ne pas pipeter avec la bouche. Utiliser des vêtements protecteurs et des gants à usage unique. 3. DAWOOD M.Y., SASCENA B.B., LANDESMAN R., (1977) Human chorionic gonadotropin and its subunit in hydatidiform mole and choriocarcinoma. Obstet. Gynecol., 50: HAY D.L., (1982) Chorionic gonadotropin. Clin. Biochem., 3: GASPARD V.J., REUTER A.M., DEVILLE J.L., VRINDTS GEVAERT Y., BAGSHAWE K.D., FRANCHIMONT P., (1980) Serum concentration of human chorionic gonadotropin and its alpha and beta subunit II Trophoblastic tumours. Clin. Endocrinol. (Oxf.), 13: PIERCE J.G., PARSONS T.F., (1981) Glycoprotein hormones : structure and function. Annu. Rev. Biochem., 50: MANCINI G. et al., (1992) hcg, AFP and V E 3 pattern in the 1420th weeks of Down's syndrome pregnancies. Prenatal Diagnost., 12(7): WHITEHEAD N. et al., (1993) Elevated material serum human chorionic gonadotropin increases the chance of adverse pregnancy outcome. Am. J. Obstet. Gynecol., 169(5): XIX. RESUME DU PROTOCOLE Calibrateurs (06) Echantillons, Contrôles Traceur Incubation Séparation Solution de Lavage Séparation Solution de Lavage Séparation Comptage DIAsource Catalogue Nr : KIP0981 KIP0984 ACTIVITE TOTALE (ml) CALIBRA TEURS (ml) ECHANTIL LON(S) CONTROLES (ml) 30 minutes à température ambiante sous agitation continue (400 rpm) Aspiration 2,0 Aspiration 2,0 Aspiration Temps de comptage des tubes: 60 secondes P.I. Number : /fr Revision nr : /1 XVIII. BIBLIOGRAPHIE Date de revision : BRAUNSTEIN G.D., RASOR J., ADLER D., DANZER H., WADE H.E., (1976) Serum chorionic gonadotropin levels throughout normal pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126: CHEN F., SETSUKO G., YOSHIHITO F., YUTAKA T., (1987) Radioimmunoassay of the serum free βsubunit of human chorionic gonadotropin in trophoblastic disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 64:313.

11 de Vor Gebrauch des Kits lesen Sie bitte diese Packungsbeilage. hcg+βirma I. VERWENDUNGSZWECK Ein RadioImmunoassay für die quantitative in vitro Bestimmung von humanem Choriongonadotropin (hcg) in Serum und Plasma. Dieser Kit ist nicht zur Evaluierung des Risikos auf Trisomie 21 bestimmt. II. ALLGEMEINE INFORMATION A. Handelsbezeichnung : DIAsource hcg+βirma Kit B. Katalognummer : KIP0981 : 96 Tests KIP0984: 4 x 96 Tests C. Hergestellt von: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 LouvainlaNeuve, Belgien. Für technische Unterstützung oder Bestellungen wenden Sie sich bitte an: Tel : +32 (0) Fax : +32 (0) Für Deutschland : Kostenfreie Rufnummer : Kostenfreie Faxnummer : Ordering : ordering@diasource.be III. KLINISCHER HINTERGRUND A. Biologische Aktivität hcg ist ein Glykoprotein, das während der gesamten Schwangerschaft durch die Synzytiotrophoblasten der Plazenta gebildet wird. hcg Molekulargewicht 37.9 kda umfasst zwei Untereinheiten. Die hcgα Untereinheit Molekulargewicht 14.9 kda ist chemisch den α Untereinheiten der Hormone FSH, LH und TSH ähnlich. Die hcgβuntereinheit Molekulargewicht 23.0 kda hat eine Struktur, die jener der LHβ Untereinheit ähnelt und sich nur in einigen Epitopen unterscheidet. hcg hat biologische Eigenschaften, die jenen von LH ähneln. Während der Schwangerschaft stimuliert hcg das verbleibende Corpus luteum und das Plazentagewebe dazu, die verschiedenen Steroidhormone zu sezernieren. Neben der Stimulierung des Luteal und Plazentagewebes ist hcg, das die Plazenta durchquert, entscheidend zur Differenzierung des Tractus genitalis des Fötus, die um die 7. Schwangerschaftswoche stattfindet. B. Klinische Anwendung Diagnostischer und Kontrolltest während der Schwangerschaft hcg und seine freien Untereinheiten α und β scheinen in Serum und Harn schwangerer Frauen etwa 9 Tage nach der Ovulation auf. Der hcgspiegel steigt dann rasch an, um zwischen der 8. und 12. Woche eine Spitze zu erreichen. Tumormarkertest bei trophoblastischen Tumoren Acephalocystes racemosae und Choriokarzinome können große Mengen an nativem hcg und den beiden freien Untereinheiten α und β in den peripheren Blutkreislauf sezernieren. Tumormarkertest bei nicht trophoblastischen Krebserkrankungen 10 bis 15 % der Brust, Lungen und Verdauungstraktkrebs geben hcg und/oder eine der beiden Untereinheiten α und β ab.

12 IV. GRUNDSÄTZLICHES ZUR DURCHFÜHRUNG VIII. AUFBEWAHRUNG UND LAGERUNG DER REAGENZIEN Der DIAsource hcg+ßirma ist ein immunoradiometrischer Assay in beschichteten Röhrchen, in denen einige monoklonale Antikörper verwendet wurden, die gegen bestimmte Epitopen von hcg gerichtet sind. Mabs1, die FängerAntikörper, haften an der unteren inneren Oberfläche des Plastikröhrchens. In die Röhrchen zugegebene Kalibratoren oder Proben zeigen zuerst eine niedrige Affinität zu Mabs1. Zugabe von Mab2, des mit 125 I markierten Signalantikörpers, vervollständigt das System und triggert die immunologische Reaktion. Nach dem Waschen gibt die verbleibende, an den Röhrchen haftende Radioaktivität die Antigenkonzentration wieder. V. MITGELIEFERTE REAGENZIEN Vor dem Öffnen oder der Rekonstitution sind die Reagenzien des Kits bis zum laufdatum (Angaben auf Etikett) bei Lagerung bei 2 C bis 8 C stabil. Nach der Rekonstitution sind die Kalibratoren und Kontrollen bei 2 C bis 8 C 7 Tage stabil. Aliquots müssen bei längerer Aufbewahrung bei 20 C eingefroren werden und sind dann max. 3 Monate stabil. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Frisch zubereitete Waschlösung sollte am selben Tag benutzt werden. Nach der ersten Benutzung ist der Tracer bei Aufbewahrung im Originalgefäß und bei 2 bis 8 C bis zum laufdatum stabil. Veränderungen im Aussehen der Kitkomponenten können ein Anzeichen für Instabilität oder Zerfall sein. Reagenzien Mit anti hcg+βbeschichtete Röhrchen (monoklonale Antikörper) TRACER: 125 Iodmarkiertes AntihCG+ß (monoklonale Antikörper) in TRIS Puffer mit Rinderserumalbumin, Azid (<0,1%) und inertem roten Farbstoff CAL NullKalibrator in Rinderserum mit Azid (0,5%) CAL 125 I Kalibrator N = 1 bis 6 (genaue Werte auf Gefäßetiketten) in Rinderserum mit Thymol 0 N 96 Test Kit 4 x 96 Test Kit Farbcode Rekonstitution 2 x 48 8 x 48 Grau gebrauchsfertig 1 Gefäß 5,5 ml 450 kbq 3 Gefäße 6 Gefäße lyophil. 4 Gefäße 5,5 ml 4x450 kbq 8 Gefäße 2 x 6 Gefäße lyophil. Rot Gelb Gelb gebrauchsfertig gebrauchsfertig 0,5 ml dest. Wasser zugeben IX. PROBENSAMMLUNG UND VORBEREITUNG Serum oder Plasmaproben müssen bei 28 C aufbewahrt werden. Falls der Test nicht innerhalb von 24 Std. durchgeführt wird, ist die Aufbewahrung bei 20 C erforderlich. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. Serumproben, EDTA oder heparinisiertes Plasma liefern ähnliche Ergebnisse. y(serum) = 1,03x (HEP. Plasma) + 0,07 r = 0,99 n = 30 y(serum) = 1,00x (EDTA Plasma) 0,47 r = 0,99 n = 30 X. DURCHFÜHRUNG A. Bemerkungen zur Durchführung Verwenden Sie den Kit oder dessen Komponenten nicht nach laufdatum. Vermischen Sie Materialien von unterschiedlichen Kit Chargen nicht. Bringen Sie alle Reagenzien vor der Verwendung auf Raumtemperatur. Mischen Sie alle Reagenzien und Proben gründlich durch sanftes Schütteln oder Rühren. Verwenden Sie saubere WegwerfPipettenspitzen, um Kreuzkontamination zu vermeiden. Präzisionspipetten oder ein automatisches Pipettiersystem erhöhen die Präzision. Achten Sie auf die Einhaltung der Inkubationszeiten. Erstellen Sie für jeden Durchlauf eine Standardkurve, verwenden Sie nicht die Daten von früheren Durchläufen. Waschlösung (TRIS HCl) Kontrollen N = 1 oder 2 Humanserum mit Thymol Bemerkung: VI. 1 Gefäß 2 Gefäße lyophil. 3 Gefäße 2 x 2 Gefäße lyophil. Braun Silber 70 x mit dest. Wasser verdünnen (Magnetrührer benutzen). 0,5 ml dest. Wasser zugeben 1. Benutzen Sie NullKalibrator zur Probenverdünnung miu der Kalibratorzubereitung ist äquivalent zu 1mIU 4 th IS 75/589 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL Folgendes Material wird benötigt, aber nicht mit dem Kit mitgeliefert: 1. Dest. Wasser 2. Pipetten: 50 μl und 500 μl (Verwendung von Präzisionspipetten mit WegwerfPlastikspitzen wird empfohlen) ml automatische Spritze (Cornwall Typ) zum Waschen. 4. saugsystem (optional). 5. Vortex Mixer 6. Magnetrührer 7. RöhrchenSchüttler (400 rpm) 8. Jegl. GammaCounter, der 125 I messen kann, kann verwendet werden. (minimal Yield 70%) VII. WASH SOLN CONTROL N CONC VORBEREITUNG DER REAGENZIEN A. Kalibratoren 16: Rekonstituieren Sie die Kalibratoren mit 0,5 ml dest. Wasser. B. Kontrollen : Rekonstituieren Sie die Kontrollen mit 0,5 ml dest. Wasser. C. Waschlösung: Bereiten Sie ein angemessenes Volumen Waschlösung aus einem Anteil Waschlösung (70 x) mit 69 Anteilen dest. Wasser zu. Verwenden Sie einen Magnetrührer zum gleichmäßigen Durchmischen. Werfen Sie die nicht benutzte Waschlösung am Ende des Tages weg. B. Durchführung 1. Beschriften Sie je 2 beschichtete Röhrchen für jeden Kalibrator, jede Probe und Kontrolle. Zur Bestimmung der Gesamtaktivität beschriften Sie 2 normale Röhrchen. 2. Vortexen Sie Kalibratoren, Proben und Kontrollen kurz und geben Sie jeweils 50 μl in ihre Röhrchen. 3. Geben Sie 50 μl des Tracers in jedes Röhrchen. 4. Schütteln Sie vorsichtig die Halterung mit den Röhrchen um Blasen zu entfernen. 5. Inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur, dabei schütteln (400 rpm). Inkubationszeit genauestens einhalten. 6. Saugen Sie den Inhalt jedes Röhrchens ab (oder dekantieren Sie) (außer Gesamtaktivität). Vergewissern Sie sich, dass die Plastikspitze des saugers den Boden des beschichteten Röhrchens erreicht, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen. 7. Waschen Sie die Röhrchen mit 2 ml Waschlösung (außer Gesamtaktivität) und saugen Sie ab (oder dekantieren Sie). Vermeiden Sie Schaumbildung bei Zugabe der Waschlösung. 8. Saugen Sie den Inhalt jeden Röhrchens (außer Gesamtaktivität) ab. 9. Waschen Sie die Röhrchen mit 2 ml Waschlösung (außer Gesamtaktivität) und saugen Sie ab (oder dekantieren Sie). 10. Lassen Sie nach dem letzten Waschen die Röhrchen 2 Minuten aufrecht stehen und saugen Sie den verbleibenden Flüssigkeitstropfen ab. 11. Werten Sie die Röhrchen in einem GammaCounter 60 Sekunden aus. XI. BERECHNUNG DER ERGEBNISSE 1. Berechnen Sie den Durchschnitt aus den Doppelbestimmungen. 2. Tragen Sie auf semilogarithmischem oder linearem Millimeterpapier den c.p.m. (Ordinate) für jeden Standard gegen die entsprechende Konzentration hcg+β (szisse) ein und zeichnen Sie eine Standardkurve durch die Standardpunkte, schließen Sie offensichtliche Ausreißer aus. 3. Berechnen Sie die Konzentration für jede Kontrolle und Probe durch Interpolation aus der Standardkurve. 4. Computergestützte Methoden können ebenfalls zur Erstellung der Kalibrationskurve verwendet werden. Falls die Ergebnisberechnung mit dem Computer durchgeführt wird, empfehlen wir die Berechnung mit einer 4 Parameter Kurvenfunktion.

13 XII. TYPISCHE WERTE VERDÜNNUNGSTEST Die folgenden Daten dienen nur zu Demonstrationszwecken und können nicht als Ersatz für die Echtzeitstandardkurve verwendet werden. Probe Verdünn. Theoret. Konzent. Gemess. Konzent. hcg+βirma cpm B/T (%) Gesamtaktivität Kalibrator 0,0 miu/ml 5,5 miu/ml 16,6 miu/ml 54,0 miu/ml 153,0 miu/ml 307,0 miu/ml 585,0 miu/ml ,07 0,38 0,85 2,76 8,66 16,90 31,68 XIII. LEISTUNGSMERKMALE UND GRENZEN DER METHODIK A. Nachweisgrenze Zwanzig NullKalibratoren wurden zusammen mit einem Satz anderer Kalibratoren gemessen. Die Nachweisgrenze, definiert als die scheinbare Konzentration bei zwei Standardabweichungen über dem gemessenen Durchschnittswert bei Nullbindung, entsprach 1,6 miu/ml. B. Spezifität Kreuzreaktive Hormone wurden einem Serum mit niedrigem hcg+βwert und einem Kalibrator mit hohem Wert (150 miu/ml) zugesetzt. Die gezeigte hcg+β Reaktion wurde gemessen. FSH LH TSH αhcg βhcg Zugesetzte Hormone CAL miu/ml 250 miu/ml 250 μiu/ml fmol/ml 1000 fmol/ml Beobachtete hcg Werte 9,8 miu/ml 11,3 miu/ml 10,9 miu/ml 10,3 miu/ml 11,0 miu/ml 361,0 miu/ml CAL 2 Beobachtete hcgwerte 284 miu/ml 292 miu/ml 262 miu/ml 290 miu/ml 252 miu/ml 699 miu/ml Das zeigt, dass der hcg+βirma keine Kreuzreaktion mit FSH, LH, TSH oder αhcg aufweist und eine 100% Kreuzreaktion mit der freien βkette des hcg aufweist. Hinweis: Mit den Molekulargewichten 37.9 kda (hcg), 23.0 kda (βhcg) und 14.9 kda (αhcg), sind die molaren Äquivalente: hcg : 1000 fmol = 37,9 ng 325 miu 1st IRP 75/537 βhcg : 1000 fmol = 23,0 ng αhcg : 1000 fmol = 14,9 ng C. Präzision INTRA ASSAY Serum N <X> ± SD A B ,3 ± 1,2 245,9 ± 3,0 CV (%) 1,8 1,2 INTER ASSAY Serum N <X> ± SD C D SD : Standardabweichung; CV: Variationskoeffizient 35,2 ± 2,2 149,6 ± 12,6 CV (%) 6,2 8,4 Serum 1 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/ ,6 281,8 140,9 70,5 35,2 17,6 8,8 4,4 Die Proben wurden mit NullKalibrator verdünnt. 563,6 260,2 126,4 62,6 34,1 18,1 8,7 4,8 E. Zeitverzögerung zwischen letzter Kalibrator und Probenzugabe Es wird im Folgenden gezeigt, dass die Genauigkeit der Tests selbst dann erhalten bleibt, wenn die Probe 30 Minuten nach Zugabe des Kalibrators in die beschichteten Röhrchen zugefügt wird. Serum 1 Serum 2 31,2 144,1 ZEITDIFFERENCE 0' 10' 20' 30' 31,1 142,4 30,9 140,5 31,4 143,5 F. HookEffekt Über miu/ml kann ein HookEffekt beobachtet werden. Proben von schwangeren Frauen können so hohe Konzentrationen ergeben. Es wird daher empfohlen, in Fällen, in denen ein exaktes quantitatives Resultat der hcg Konzentration erreicht werden soll (z.b. Followup von Schwangerschaften), 3 Verdünnungen nach dem unten stehenden Schema zu testen. A: nicht verdünnt B: 17x verdünnt (25 µl von A µl NullKalibrator) C: 289x verdünnt (25 µl von B µl NullKalibrator) Screening für Schwangerschaften sollte nicht verdünnt durchgeführt werden. XIV. ANWENDUNGSGRENZEN Proben von Patienten, die Zubereitungen von monoklonalen Maus Antikörpern zur Diagnose oder Therapie erhalten haben, können humane AntiMaus Antikörper (HAMA) enthalten. Solche Proben können entweder falsch erhöhte oder zu niedrige Werte ergeben, wenn sie mit Testsystemen getestet werden, die monoklonale Maus Antikörper enthalten. Heterophile Antikörper im humanen Serum können mit Immunglobulinen der Reagenzien reagieren und so mit in vitro Immunoassays interferieren. Patienten, die routinemäßigen Umgang mit Tieren oder Tierseren haben, können zu dieser Interferenz neigen und so können anormale Werte in Gegenwart von heterophilen Antikörpern beobachtet werden. Ergebnisse von Patienten, bei denen diese Antikörper vermutet werden, müssen sorgfältig evaluiert werden. Wenn die Ergebnisse nicht mit anderen klinischen Beobachtungen übereinstimmen, sollten weitere Informationen vor der Diagnosestellung ermittelt werden. D. Genauigkeit XV. INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE Probe WIEDERFINDUNGSTEST Zugeg. hcg+ß Serum 1 50,0 100,0 200,0 400,0 Wiedergef. hcg+ß 52,1 101,7 209,0 417,1 Wiedergefunden (%) 102 Entsprechen die IstWerte nicht den auf den Fläschchen angegebenen Soll Werten, können die Werte, ohne treffende Erklärung der weichungen, nicht weiterverarbeitet werden. Falls zusätzliche Kontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte. Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis beruhen.

14 XVI. REFERENZ INTERVALLE Diese Werte sind nur Richtwerte; jedes Labor muss seinen eigenen Normalwertbereich ermitteln. SchwangerschaftsCutoffWert: Der CutoffWert für die Bestimmung einer Schwangerschaft, definiert als die deutliche Konzentration drei Standardabweichungen über den Durchschnittszählungen von 96 Proben von nicht schwangeren Frauen, betrug 4,6 miu/ml. Es wird empfohlen Proben, die zwischen dem CutoffWert und 10 miu/ml liegen, erneut zu testen. XVII. VORSICHTSMASSNAHMEN UND WARNUNGEN Sicherheit Nur für diagnostische Zwecke. Dieser Kit enthält 125 I (Halbwertzeit: 60 Tagen), das ionisierende X (28 kev) und γ (35.5 kev) Strahlungen emittiert. Dieses radioaktive Produkt kann nur an autorisierte Personen abgegeben und darf nur von diesen angewendet werden; Erwerb, Lagerung, Verwendung und Austausch radioaktiver Produkte sind Gegenstand der Gesetzgebung des Landes des jeweiligen Endverbrauchers. In keinem Fall darf das Produkt an Menschen oder Tieren angewendet werden. Der Umgang mit radioaktiven Substanzen sollte fern von Durchgangsverkehr in einem speziell ausgewiesenen Bereich stattfinden. Ein Logbuch für Protokolle und Aufbewahrung muss im Labor sein. Die Laborausrüstung und die Glasbehälter, die mit radioaktiven Substanzen kontaminiert werden können, müssen ausgesondert werden, um Kreuzkontaminationen mit unterschiedlichen Radioisotopen zu verhindern. Verschüttete radioaktive Substanzen müssen sofort den Sicherheitsbestimmungen entsprechend entfernt werden. Radioaktive fälle müssen entsprechend den lokalen Bestimmungen und Richtlinien der für das Labor zuständigen Behörden gelagert werden. Das Einhalten der Sicherheitsbestimmungen für den Umgang mit radioaktiven Substanzen gewährleistet ausreichenden Schutz. Die menschlichen Blutkomponenten in diesem Kit wurden mit europäischen und in den USA erprobten FDAMethoden getestet, sie waren negativ für HBsAG, antihcv und antihiv 1 und 2. Keine bekannte Methode kann jedoch vollkommene Sicherheit darüber liefern, dass menschliche Blutbestandteile nicht Hepatitis, AIDS oder andere Infektionen übertragen. Deshalb sollte der Umgang mit Reagenzien, Serum oder Plasmaproben in Übereinstimmung mit den Sicherheitsbestimmungen erfolgen. Alle tierischen Produkte und deren Derivate wurden von gesunden Tieren gesammelt. Komponenten von Rindern stammen aus Ländern, in denen BSE nicht nachgewiesen wurde. Trotzdem sollten Komponenten, die tierische Substanzen enthalten, als potenziell infektiös betrachtet werden. Vermeiden Sie Hautkontakt mit den Reagenzien (Natriumazid als Konservierungsmittel). Das Azid in diesem Kit kann mit Blei oder Kupfer in den flussrohren reagieren und so hochexplosive Metallazide bilden. Spülen Sie während der Waschschritte den fluss gründlich mit viel Wasser, um die Metallazidbildung zu verhindern. Bitte rauchen, trinken, essen Sie nicht in Ihrem Arbeitsbereich, und verwenden Sie keine Kosmetika. Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. Verwenden Sie Schutzkleidung und Wegwerfhandschuhe. 5. GASPARD V.J., REUTER A.M., DEVILLE J.L., VRINDTS GEVAERT Y., BAGSHAWE K.D., FRANCHIMONT P., (1980) Serum concentration of human chorionic gonadotropin and its alpha and beta subunit II Trophoblastic tumours. Clin. Endocrinol. (Oxf.), 13: PIERCE J.G., PARSONS T.F., (1981) Glycoprotein hormones : structure and function. Annu. Rev. Biochem., 50: MANCINI G. et al., (1992) hcg, AFP and V E 3 pattern in the 1420th weeks of Down's syndrome pregnancies. Prenatal Diagnost., 12(7): WHITEHEAD N. et al., (1993) Elevated material serum human chorionic gonadotropin increases the chance of adverse pregnancy outcome. Am. J. Obstet. Gynecol., 169(5): XIX. ZUSAMMENFASSUNG DES PROTOKOLLS Kalibratoren (05) Proben, Kontrollen Tracer Inkubation Trennung Waschlösung Trennung Waschlösung Trennung Gamma Counter DIAsource Katalognummer : KIP0981 KIP0984 GESAMT AKTIVITÄT (ml) KALIBRA TOREN (ml) PROBE(N) KONTROLLEN (ml) 30 Minuten. bei Raumtemperatur mit Schütteln (400 rpm) absaugen (oder dekant.) 2,0 absaugen (oder dekant.) 2,0 absaugen (oder dekant.) 60 Sekunden messen Beipackzettelnummer: /de Nummer der Originalausgabe: /1 Revisionsdatum : XVIII. LITERATUR 1. BRAUNSTEIN G.D., RASOR J., ADLER D., DANZER H., WADE H.E., (1976) Serum chorionic gonadotropin levels throughout normal pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126: CHEN F., SETSUKO G., YOSHIHITO F., YUTAKA T., (1987) Radioimmunoassay of the serum free βsubunit of human chorionic gonadotropin in trophoblastic disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 64: DAWOOD M.Y., SASCENA B.B., LANDESMAN R., (1977) Human chorionic gonadotropin and its subunit in hydatidiform mole and choriocarcinoma. Obstet. Gynecol., 50: HAY D.L., (1982) Chorionic gonadotropin. Clin. Biochem., 3:35.

15 nl Lees het hele protocol vóór gebruik. hcg+βirma I. BEOOGD GEBRUIK Immunoradiometrische testkit voor de in vitro kwantitatieve meting van humaan chorionisch gonadotrofine (hcg )in serum en plasma. Deze testkit mag niet worden gebruikt bij de evaluatie van het risico op trisomie 21. II. ALGEMENE INFORMATIE A. Gedeponeerd handelsmerk: DIAsource hcg+βirma kit B. Catalogusnummer: KIP0981: 96 testen KIP0984: 4 x 96 testen C. Geproduceerd door: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 LouvainlaNeuve, België. Voor technische assistentie of voor bestelinformatie kunt u contact opnemen met: Tel.: +32 (0) Fax: +32 (0) III. KLINISCHE ACHTERGROND A. Biologische activiteiten hcg is een glycoproteïne dat gesynthetiseerd wordt door de syncytiotrofoblast van de placenta gedurende de zwangerschap. Het moleculair gewicht van hcg is 37,9 kda het bevat twee subunits. De hcg α subunit moleculair gewicht 14,9 kda is chemisch gelijkaardig aan de α subunits van FSH, LH en TSH hormonen. De hcg β subunit moleculair gewicht 23,0 kda heeft een structuur gelijkaardig aan die van de LH β subunit, waarvan het slechts in enkele epitopen verschilt. hcg heeft biologische eigenschappen gelijkaardig aan die van LH. Gedurende de zwangerschap stimuleert hcg het overgebleven corpus luteum en het weefsel van de placenta om de verschillende steroïde hormonen af te scheiden. Naast zijn stimulerende werking op het luteale weefsel en dat van de placenta is hcg, door het kruisen van de placenta, essentieel om de genitale tractus van de foetus te differentiëren, wat voorkomt rond de 7de week van de zwangerschap. B. Klinische toepassing Diagnostische en observerende test bij zwangerschap hcg en zijn vrije subunits α en β komen voor in het serum en de urine van zwangere vrouwen ongeveer 9 dagen na de ovulatie. Het hcggehalte verhoogt dan snel om een piek te bereiken tussen de 8ste en de 12de week. Tumor marker test bij trofoblast tumoren Hydatiforme moedervlekken en choriocarcinoom kunnen grote hoeveelheden natief hcg en zijn twee vrije subunits α en β in de perifere bloedcirculatie afscheiden. Tumor marker test bij nontrofoblast kankers 10 tot 15 % van de borst, long, en darmkankers geven hcg en/of zijn twee constitutieve subunits α and β vrij.

16 IV. BESCHRIJVING VAN DE METHODE VIII. OPSLAG EN VERVALDATUM VAN REAGENTIA hghirma van DIAsource is een immunoradiometrische test die gebaseerd is op een scheiding aan de hand van een gecoate buis, waarin verschillende monoklonale antilichamen gebruikt zijn, gericht tegen verschillende epitopen van hcg. Mabs1, de invangantilichamen, zijn onderaan aan het binnenoppervlak van de plastic buis gehecht. Kalibrators of monsters die toegevoegd worden aan de tubes zullen aanvankelijk een lage affiniteit vertonen voor Mabs1. Toevoeging van Mab2, het signaalgenererend antilichaam dat gelabeld werd met 125 I, zal het systeem vervolledigen en de immunologische reactie teweegbrengen. Na de wasfase geeft de overblijvende radioactiviteit, gebonden aan de buis, de antigeenconcentratie weer. V. GELEVERDE REAGENTIA Vóór opening of reconstitutie zijn alle kitcomponenten houdbaar tot de vervaldatum, zoals vermeld op het etiket, indien zij bewaard werden bij 2 tot 8 C. Na reconstitutie zijn de kalibrators en de controles gedurende 7 dagen houdbaar bij 2 tot 8 C. Voor een langere bewaartermijn moeten aliquots gemaakt worden, die bij 20 C bewaard moeten worden voor maximaal 3 maanden. Vermijd opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien Een vers bereide werkwasoplossing moet op dezelfde dag nog gebruikt worden. Na het eerste gebruik is de tracer houdbaar tot de vervaldatum, indien bewaard bij 2 tot 8 C in de oorspronkelijke, goed afgesloten flacon. Wijzigingen in het fysieke aspect van kitreagentia kunnen wijzen op instabiliteit of op een kwaliteitsvermindering. Reagentia TRACER: AntihCG+β (monoklonale antilichamen) gelabeld met 125 jood in TRIS buffer met bovien serumalbumine, azide (< 0,1%) en een inerte rode kleurstof Nulkalibrator in bovien serum met azide (0,5 %) Kalibrator N = 1 tot 6 (raadpleeg de flaconetiketten voor de exacte waarden) in bovien serum met thymol Wasoplossing (TRIS HCl) Controles N = 1 of 2 in humaan serum met thymol Opmerking: VI. Kit met 96 testen Kit met 4 x 96 testen Kleurcode Reconstitutie 2 x 48 2 x 48 grijs Klaar voor gebruik 1 flacon 5,5 ml 450 kbq 3 vials 6 flacons, gevriesdroogd 1 flacon 2 flacons, gevriesdroogd 4 flacons 5,5 ml 4x450 kbq 8 vials 2 x 6 flacons, gevriesdroogd 3 flacons 2 x 2 flacons, gevriesdroogd rood geel geel bruin zilver Klaar voor gebruik Klaar voor gebruik 0,5 ml gedestilleerd water toevoegen 70 x met gedestilleerd water verdunnen (gebruik een magnetische roerder). 0,5 ml gedestilleerd water toevoegen 1. Gebruik Nulkalibrator voor monsterverdunningen 2. 1 mie van de kalibratorbereiding is gelijk aan 1 mie van de 3 rd IS 75/537 NIET MEEGELEVERDE MATERIALEN De volgende materialen zijn noodzakelijk maar worden niet meegeleverd met de kit: 1. Gedestilleerd water. 2. Pipetten voor een volume van 50 µl en 500 µl (het gebruik van nauwkeurige pipetten met plastic wegwerptips wordt aanbevolen). 3. Automatische spuit van 5 ml (type Cornwall) voor de wasfase. 4. Afzuigsysteem (facultatief). 5. Vortexmenger. 6. Magnetische roerder. 7. Schudder voor de buisjes (400 rpm) 8. Een gammateller die geschikt is voor de bepaling van 125 I (rendement van ten minste 70%). VII. buizen gecoat met antihcg+β (monoklonale antilichamen) WASH CAL CAL CONTROL SOLN 125 I 0 N N CONC BEREIDING VAN HET REAGENS A. Kalibrators 16: Reconstitueer de kalibrators met 0,5 ml gedestilleerd water. B. Controles: Reconstitueer de controles met 0,5 ml gedestilleerd water. C. Werkwasoplossing: Bereid een voldoende hoeveelheid werkwasoplossing door 69 eenheden gedestilleerd water toe te voegen aan 1 eenheid wasoplossing (70 x). Gebruik een magnetische roerder voor de homogenisering. Op het eind van de dag moet de ongebruikte werkwasoplossing afgevoerd worden. IX. MONSTERAFNAME EN MONSTERBEREIDING Serum en plasma monsters moeten bij 2 tot 8 C bewaard worden. Indien de test niet binnen 24 uur uitgevoerd wordt, dan wordt aanbevolen om ze bij 20 C te bewaren. Vermijd opeenvolgende cycli van bevriezen en ontdooien Serum en plasma (EDTA en heparine) leveren vergelijkbare resultaten op. y(serum) = 1,03x (HEP. Plasma) + 0,07 r = 0,99 n = 30 y(serum) = 1,00x (EDTA Plasma) 0,47 r = 0,99 n = 30 X. PROCEDURE A. Opmerkingen bij de procedure Gebruik de kit of de componenten niet langer dan de aangegeven vervaldatum. Materialen van kits van verschillende loten mogen niet gemengd worden. Laat alle reagentia op kamertemperatuur komen vóór gebruik. Meng alle reagentia en monsters goed door ze voorzichtig te bewegen of door er voorzichtig mee te draaien. Om kruisbesmetting te vermijden, moet een propere wegwerpbare pipettip gebruikt worden voor toevoeging van elk reagens en monster. Pipetten met een grote precisie of geautomatiseerde pipetteerapparatuur zullen de precisie verhogen. Respecteer de incubatietijden. Bereid een kalibratiecurve voor elke run; men mag geen gegevens gebruiken van voorafgaande runs. B. Procedure 1. Etiketteer de gecoate buisjes in duplo voor elke kalibrator, voor elk monster, voor elke controle. Etiketteer 2 normale buizen voor de bepaling van de totaaltellingen. 2. Vortex de kalibrators, monsters en controles gedurende korte tijd en pipetteer 50 µl van elk in de desbetreffende buis. 3. Pipetteer 50 µl van de tracer in elke buis. 4. Schud het rek met de buizen voorzichtig met de hand zodat eventueel ingesloten luchtbellen vrijkomen. 5. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl er voortdurend mee geschud wordt (400 rpm). Respecteer nauwlettend de incubatietijd. 6. Zuig de inhoud van elke buis (met uitzondering van de totaaltellingen) op (of decanteer ). Zorg ervoor dat de plastic tip van de aspirator tot aan de bodem van de gecoate buis komt zodat alle vloeistof verwijderd wordt. 7. Was de buizen met 2 ml werkwasoplossing (met uitzondering van de totaaltellingen). Vermijd schuimvorming tijdens toevoeging van de werkwasoplossing. 8. Zuig de inhoud van elke buis (met uitzondering van de totaaltellingen) op (of giet het over). 9. Was de buizen nogmaals met 2 ml werkwasoplossing (met uitzondering van de totaaltellingen) en zuig op (of decanteer ). 10. Na de laatste wasfase moeten de buizen gedurende twee minuten rechtop blijven staan en zuig daarna de overblijvende vloeistof op. 11. Tel de buizen in een gammateller gedurende 60 seconden. XI. BEREKENING VAN DE RESULTATEN 1. Bereken het gemiddelde voor de bepalingen in duplo. 2. Zet de cpm (ordinaat) uit voor elke kalibrator tegen de overeenkomstige hcg+β concentratie (abscis) op semilogaritmisch of lineair millimeterpapier en teken een kalibratiecurve door de kalibratiepunten, waarbij de duidelijke uitschieters verworpen worden. 3. Lees door interpolatie de concentratie voor elke controle en voor elk monster op de kalibratiecurve. 4. Door computergestuurde gegevensreductie worden deze berekeningen vereenvoudigd. Indien de resultaten automatisch verwerkt worden, wordt de 4 parameter logistische functie aanbevolen voor de gepaste curve.

17 XII. KENMERKENDE GEGEVENS De volgende gegevens dienen enkel ter illustratie en mogen in geen geval gebruikt worden ter vervanging van de real time kalibratiecurve. Totaaltelling Kalibrator hcg+β IRMA cpm B/T (%) 0,0 mie/ml 5,5 mie/ml 16,6 mie/ml 54,0 mie/ml 153,0 mie/ml 307,0 mie/ml 585,0 mie/ml ,07 0,38 0,85 2,76 8,66 16,90 31,68 VERDUNNINGSTEST Monster Verdunning Theoretische concentratie (mie/ml) Serum 1 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Het staal is verdund met Nulkalibrator. 563,6 281,8 140,9 70,5 35,2 17,6 8,8 4,4 Concentratie die bepaald werd (mie/ml) 563,6 260,2 126,4 62,6 34,1 18,1 8,7 4,8 XIII. EIGENSCHAPPEN EN GRENZEN A. Detectielimiet Twintig nulkalibrators werden bepaald, samen met een reeks andere kalibrators. De detectielimiet, omschreven als de schijnbare concentratie van twee standaarddeviaties boven de gemiddelde tellingen bij nulbinding, bedroeg 1,6 mie/ml. B. Specificiteit Kruisreactieve hormonen warden toegevoegd aan een serum met een laag hcg+βgehalte en aan een kalibrator met een hoge waarde (150 mie/ml). De bijhorende hcg+β respons werd gemeten. F. Tijdspanne tussen de laatste kalibrator en distributie van het monster Zoals hieronder weergegeven wordt, blijven de resultaten van de bepaling nauwkeurig, zelfs wanneer een monster 30 minuten na toevoeging van de kalibrator in de gecoate buizen gepipetteerd wordt. Serum 1 (mie/ml) Serum 2 (mie/ml) 31,2 144,1 TIJDSPANNE 0' 10' 20' 30' 31,1 142,4 30,9 140,5 31,4 143,5 FSH LH TSH αhcg βhcg Toegevoegde hormonen CAL mie/ml 250 mie/ml 250 μie/ml fmol/ml 1000 fmol/ml Waargenomen hcg waarden 9,8 mie/ml 11,3 mie/ml 10,9 mie/ml 10,3 mie/ml 11,0 mie/ml 361,0 mie/ml CAL 2 Waargenomen hcg warden 284 mie/ml 292 mie/ml 262 mie/ml 290 mie/ml 252 mie/ml 699 mie/ml Dit toont aan dat de hcg+βirma niet kruisreageert met FSH, LH, TSH, αhcg en een kruisreactie van 100% vertoont met de vrije βketen van hcg. Nota : Bij gebruik van de volgende moleculaire gewichten 37.9 kda (hcg), 23.0 kda (βhcg) en 14.9 kda (αhcg), zijn de molaire equivalenten : hcg : 1000 fmol = 37.9 ng 325 mie 1st IRP 75/537 βhcg : 1000 fmol = 23.0 ng αhcg : 1000 fmol = 14.9 ng C. Precisie BINNEN EEN TEST Serum N <X> ± SD (mie/ml) A B ,3 ± 1,2 245,9 ± 3,0 TUSSEN TESTEN VC%) Serum N <X> ± SD (mie/ml) 1,8 1,2 C D SD: standaarddeviatie; VC: variatiecoëfficiënt D. Nauwkeurigheid Monster Toegevoegd hcg+β (mie/ml) Serum 1 50,0 100,0 200,0 400,0 RECOVERY TEST Recovery van hcg+β (mie/ml) 52,1 101,7 209,0 417,1 35,2 ± 2,2 149,6 ± 12,6 VC (%) 6,2 8,4 Recovery (%) 102 G. "Hook"effect Een Hook effect kan worden waargenomen boven mie/ml. Monsters van zwangere vrouwen kunnen zulke hoge concentraties opleveren. Daarom is het aan te raden, in gevallen waar een accuraat kwantitatief resultaat van de hcgconcentratie bekomen moet worden (vb. opvolgen van zwangerschappen), om 3 verdunningen te testen zoals aangegeven in het onderstaande schema. A: onverdund B: 17x verdund (25 µl van A µl nulkalibrator) C: 289x verdund (25 µl van B µl nulkalibrator) Screenings voor zwangerschappen moeten onverdund getest worden. XIV. BEPERKINGEN Specimens van patiënten die voor de diagnose of behandeling preparaten hebben gekregen van monoklonale antilichamen van muizen kunnen humane antimuisantilichamen (HAMA) bevatten. Dergelijke specimens kunnen ofwel valsverhoogde of valsverlaagde waarden vertonen wanneer ze met testkits worden getest waarbij gebruik wordt gemaakt van monoklonale antilichamen van muizen. Heterofiele antilichamen in humaan serum kunnen reageren met reagensimmunoglobulinen, wat een effect kan hebben op in vitro immunoassays. Patiënten die regelmatig aan dieren of dierlijke serumproducten worden blootgesteld, kunnen vatbaar zijn voor een dergelijk effect, terwijl afwijkende waarden kunnen worden waargenomen wanneer heterofiele antilichamen aanwezig zijn. Beoordeel de resultaten zorgvuldig van patiënten van wie vermoed wordt dat ze deze antilichamen hebben. Als de resultaten niet overeenstemmen met andere klinische waarnemingen moet bijkomende informatie worden verkregen voordat de diagnose wordt gesteld. XV. INTERNE KWALITEITSCONTROLE Indien de resultaten, die verkregen werden voor controle 1 en/of controle 2, niet binnen het bereik vallen zoals vermeld op het flaconetiket, dan mogen de resultaten niet gebruikt worden tenzij een bevredigende uitleg gegeven wordt voor de discrepantie. Indien gewenst, kan elk laboratorium zijn eigen pools voor controlemonsters maken, die dan in aliquots bewaard moeten worden in de diepvriezer. Aanvaardingscriteria voor het verschil tussen de resultaten in duplo van monsters moeten steunen op gangbare laboratoriumpraktijken.

18 XVI. REFERENTIEINTERVALS Deze waarden worden slechts als leidraad gegeven; elk laboratorium moet zijn eigen normaal bereik van waarden uitmaken. Zwangerschapsgrens: De grens voor de bepaling van zwangerschap, gedefinieerd als de bijhorende concentratie drie standaard deviaties boven de gemiddelde tellingen van 96 stalen van niet zwangere vrouwen, was 4,6 mie/ml. Het is aanbvolen om stalen met een resultaat tussen 0 en 10 mie/ml te hertesten. XVII. VOORZORGSMAATREGELEN EN WAARSCHUWINGEN Veiligheid Uitsluitend voor in vitro diagnostisch gebruik. Deze kit bevat 125 I (halfwaardetijd: 60 dagen), dat ioniserende X (28 kev) en γ stralen (35.5 kev) uitzendt. Dit radioactieve product mag enkel overhandigd worden aan en gebruikt worden door bevoegd personeel; ontvangst, opslag, gebruik en overdracht van radioactieve producten zijn onderworpen aan de wetgeving van het land van de eindgebruiker. In geen geval mag het product toegediend worden aan mensen of dieren. Alle handelingen met radioactief materiaal moeten plaatsvinden in een daartoe bestemde ruimte, waar uitsluitend bevoegd personeel toegelaten wordt. Een logboek met ontvangst en opslag van radioactieve materialen moet worden bijgehouden in het laboratorium. Laboratoriumapparatuur en glaswerk, dat eventueel gecontamineerd werd met radioactieve bestanddelen, moeten worden gesegregeerd om kruisbesmetting van verschillende radioisotopen te vermijden. Als radioactief materiaal gemorst werd, dan moet dat onmiddellijk gereinigd worden in overeenstemming met de procedure voor stralingsveiligheid. Het radioactieve afval moet worden weggegooid in overeenstemming met de plaatselijke voorschriften en richtlijnen van de autoriteiten waaronder het laboratorium valt. Naleving van de basisregels van stralingsveiligheid zorgt voor een juiste bescherming. De componenten, afkomstig van menselijk bloed, in deze kit werden getest door in Europa goedgekeurde en/of door de Amerikaanse FDA goedgekeurde methoden op aanwezigheid van HBsAg, antihcv, antihiv1 en 2 en gaven een negatief resultaat. Geen enkele bekende methode kan echter volledige garantie bieden dat derivaten van menselijk bloed geen hepatitis, aids of andere infecties overdragen. Daarom moet men reagentia, serum of plasmamonsters behandelen in overeenstemming met de plaatselijke veiligheidsprocedures. Alle producten en derivaten van dierlijke oorsprong zijn afkomstig van gezonde dieren. Boviene componenten komen uit landen waar BSE niet gerapporteerd werd. Toch moeten componenten die bestanddelen van dierlijke oorsprong bevatten, behandeld worden als potentieel infectieus materiaal. Vermijd dat de reagentia (natriumazide als conserveermiddel) in contact komen met de huid. Azide in deze kit kan reageren met lood en koper in de afvoerleidingen en op die manier zeer explosieve metaalaziden vormen. Tijdens de wasfase moeten de afvoerleidingen ruimschoots met water nagespoeld worden om ophoping van azide te vermijden. Niet roken, drinken, eten of cosmetica aanbrengen in de werkruimte. Niet met de mond pipetteren. Draag beschermende kleding en gebruik wegwerphandschoenen. XVIII. BIBLIOGRAFIE 1. BRAUNSTEIN G.D., RASOR J., ADLER D., DANZER H., WADE H.E., (1976) Serum chorionic gonadotropin levels throughout normal pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 126: GASPARD V.J., REUTER A.M., DEVILLE J.L., VRINDTS GEVAERT Y., BAGSHAWE K.D., FRANCHIMONT P., (1980) Serum concentration of human chorionic gonadotropin and its alpha and beta subunit II Trophoblastic tumours. Clin. Endocrinol. (Oxf.), 13: PIERCE J.G., PARSONS T.F., (1981) Glycoprotein hormones : structure and function. Annu. Rev. Biochem., 50: MANCINI G. et al., (1992) hcg, AFP and V E 3 pattern in the 1420th weeks of Down's syndrome pregnancies. Prenatal Diagnost., 12(7): WHITEHEAD N. et al., (1993) Elevated material serum human chorionic gonadotropin increases the chance of adverse pregnancy outcome. Am. J. Obstet. Gynecol., 169(5): XIX. SAMENVATTING VAN HET PROTOCOL Kalibrators (0 6) Monsters, Controles Tracer Incubatie Scheiding Werkwasoplossing Scheiding Werkwasoplossing Scheiding Telling DIAsource catalogusnummer: KIP0981 KIP0984 TOTAAL TELLINGEN (ml) KALIBRA TORS (ml) MONSTER(S) CONTROLES (ml) 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl er voortdurend mee geschud wordt (400 rpm) opzuigen (of decanteren) 3,0 opzuigen (of decanteren) 3,0 opzuigen (of decanteren ) Tel de buisjes gedurende 60 seconden Nummer van de bijsluiter: /nl Revisienummer: /1 Revisie datum : CHEN F., SETSUKO G., YOSHIHITO F., YUTAKA T., (1987) Radioimmunoassay of the serum free βsubunit of human chorionic gonadotropin in trophoblastic disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 64: DAWOOD M.Y., SASCENA B.B., LANDESMAN R., (1977) Human chorionic gonadotropin and its subunit in hydatidiform mole and choriocarcinoma. Obstet. Gynecol., 50: HAY D.L., (1982) Chorionic gonadotropin. Clin. Biochem., 3:35.

19 el Διαβάστε ολόκληρο το πρωτόκολλο πριν από τη χρήση. hcg+β IRMA Ι. ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ Ραδιοανοσολογικός προσδιορισμός για την ποσοτική μέτρηση in vitro της χοριακής γοναδοτροπίνης (hcg) σε ανθρώπινο ορό και πλάσμα. Αυτό το κιτ δεν προορίζεται για την αξιολόγηση κινδύνου τρισωμίας 21. II. ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ A. Εμπορική ονομασία: hcg+βirma της DIAsource B. Αριθμός καταλόγου: KIP0981 : 96 προσδιορισμοί KIP0984 : 4 x 96 προσδιορισμοί Γ. Κατασκευάζεται από την: DIAsource ImmunoAssays S.A. Rue du Bosquet, 2, B1348 LouvainlaNeuve, Belgium. Για τεχνική βοήθεια ή πληροφορίες σχετικά με παραγγελίες επικοινωνήστε στα: Τηλ.: +32 (0) Fax: +32 (0) III. ΚΛΙΝΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ A. Βιολογική δράση Η hcg είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται από τη συγκυτιοτροφοβλάστη του πλακούντα καθ' όλη τη διάρκεια της κύησης. Η hcg μοριακό βάρος 37.9 kda περιλαμβάνει δύο υπομονάδες. Η υπομονάδα α της hcg μοριακό βάρος 14.9 kda είναι χημικά παρόμοια με τις υπομονάδες α των ορμονών FSH, LH και TSH. Η β υπομονάδα της hcg μοριακό βάρος 23.0 kda έχει δομή παρόμοια με εκείνη της β υπομονάδας της LH, διαφέροντας μόνο ως προς μερικούς επιτόπους. Η hcg έχει βιολογικά χαρακτηριστικά παρόμοια με εκείνα της LH. Κατά τη διάρκεια της κύησης, η hcg διεγείρει το εναπομείναν ωχρό σωμάτιο και τον ιστό του πλακούντα ώστε να λάβει χώρα έκκριση των διαφόρων στεροειδών ορμονών. Εκτός από τη διεγερτική της δράση στο ωχρό σωμάτιο και τον ιστό του πλακούντα, η hcg, διασχίζοντας τον πλακούντα, είναι σημαντική για τη διαφοροποίηση της γεννητικής οδού του εμβρύου, κάτι που συμβαίνει περίπου την 7η εβδομάδα της κύησης. B. Κλινική εφαρμογή του προσδιορισμού hcg+β IRMA Διαγνωστική αξία και αξία παρακολούθησης κατά την κύηση Η hcg και οι ελεύθερες υπομονάδες της α και β εμφανίζονται στον ορό και τα ούρα εγκύων γυναικών περίπου 9 ημέρες μετά την ωοθυλακιορρηξία. Στη συνέχεια, τα επίπεδα της hcg αυξάνονται ταχέως και φθάνουν στο ανώτατο σημείο τους μεταξύ της 8ης και της 12ης εβδομάδας. Εξέταση δείκτη όγκων σε τροφοβλαστικούς όγκους Οι υδατιδώδεις μήλες και τα χοριοκαρκινώματα ενδέχεται να εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες φυσικής hcg και των δύο υπομονάδων της α και β στην περιφερική κυκλοφορία του αίματος. Εξέταση δείκτη όγκων σε μη τροφοβλαστικούς καρκίνους 10 έως 15 % των καρκίνων του μαστού, του πνεύμονα και της πεπτικής οδού προκαλούν έκλυση της hcg ή/και οποιασδήποτε από τις δύο συστατικές υπομονάδες της α και β.

20 IV. ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ Ο προσδιορισμός hcg+β IRMA της DIAsource είναι ένας ανοσοραδιομετρικός προσδιορισμός, που βασίζεται στο διαχωρισμό επιστρωμένων σωληναρίων, κατά τον οποίο έχουν χρησιμοποιηθεί αρκετά μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι διακριτών επιτόπων της hcg. Το Mab 1, το αντίσωμα σύλληψης, προσκολλάται στην κάτω και εσωτερική επιφάνεια του πλαστικού σωληναρίου. Οι βαθμονομητές ή τα δείγματα που προστίθενται στα σωληνάρια θα επιδείξουν αρχικά χαμηλό βαθμό συγγένειας για το Mab 1. Προσθήκη Mab 2, του αντισώματος σήματος, το οποίο είναι σημασμένο με 125 I, θα ολοκληρώσει το σύστημα και θα ενεργοποιήσει την ανοσολογική αντίδραση. Μετά την πλύση, η υπολειπόμενη ραδιενέργεια, που είναι δεσμευμένη στο σωληνάριο, αντανακλά τη συγκέντρωση του αντιγόνου. V. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Αντιδραστήρια Κιτ 96 προσδιορισμών ΑντιhCG+b (μονοκλωνικά αντισώματα) σημασμένα με 125 Ι σε ρυθμιστικό διάλυμα TRIS με βόεια ορολευκωματίνη, αζίδιο του νατρίου (<0,1%) και αδρανής κόκκινη χρωστική Βαθμονομητές 0 σε βόειο ορό και αζίδιο (0,5 %) Βαθμονομητές 16 σε βόειο ορό και θυμόλη (δείτε ακριβή τιμή πάνω στις ετικέτες των φιαλιδίων) WASH SOLN CONC Διάλυμα πλύσης (TRIS HCl) Οροί ελέγχου 1 και 2 σε ανθρώπινο ορό με θυμόλη Κιτ 4x96 προσδιορισμών Χρωματικός κωδικός Ανασύσταση 2 x 48 8 x 48 γκρι Έτοιμο για χρήση 1 φιαλίδιο 5,5 ml 450 kbq 3 φιαλίδια 6 φιαλίδια λυοφιλ. 1 φιαλίδιο 2 φιαλίδια λυοφιλ. 4 φιαλίδια 5,5 ml 4x450 kbq 8 φιαλίδια 6 x 2 φιαλίδια λυοφιλ. 3 φιαλίδια 2 x 2 φιαλίδια λυοφιλ. κόκκινο κίτρινο κίτρινο καφέ ασημί Έτοιμο για χρήση Έτοιμο για χρήση Προσθέστε 0,5 ml απεσταγμένου νερού Αραιώστε 70x με απεσταγμένο νερό (χρησιμοποιήστε μαγνητικό αναδευτήρα). Προσθέστε 0,5 ml απεσταγμένου νερού Σημείωση: Χρησιμοποιήστε επίσης το περιεχόμενο του μηδενικού βαθμονομητή για αραιώσεις δειγμάτων. 1 miu του παρασκευάσματος του βαθμονομητή είναι ισοδύναμο με 1 miu of 4 ου IS 75/589 VI. ΑΝΑΛΩΣΙΜΑ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Τα ακόλουθα υλικά απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται στο κιτ: 1. Απεσταγμένο νερό 2. Πιπέτες για διανομή: 50 μl και 500 μl (συνιστάται η χρήση πιπετών ακριβείας με αναλώσιμα πλαστικά ρύγχη) 3. Αναμείκτης στροβιλισμού (τύπου vortex) 4. Μαγνητικός αναδευτήρας 5. Αναδευτήρας σωληναρίων (400 rpm) 6. Αυτόματη σύριγγα των 5 ml (τύπου Cornwall) για πλύση 7. Σύστημα αναρρόφησης (προαιρετικό) 8. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί οποιοσδήποτε απαριθμητής μετρητής γ ακτινοβολίας με δυνατότητα μέτρησης της 125 I (ελάχιστη απόδοση 70%). VII. CAL CAL Σωληνάρια επιστρωμένα με αντιhcg+β (μονοκλωνικά αντισώματα) 125 I CONTROL 0 N N ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟΥ A. Βαθμονομητές 16: Ανασυστήστε τους βαθμονομητές με 0,5 ml απεσταγμένου νερού. VIII. B. Οροί ελέγχου: Ανασυστήστε τους ορούς ελέγχου με 0,5 ml απεσταγμένου νερού. Γ. Διάλυμα πλύσης εργασίας: Προετοιμάστε επαρκή όγκο διαλύματος πλύσης εργασίας με προσθήκη 69 όγκων απεσταγμένου νερού σε 1 όγκο διαλύματος πλύσης (70x). Χρησιμοποιήστε μαγνητικό αναδευτήρα για την ομογενοποίηση. Απορρίψτε το μη χρησιμοποιημένο διάλυμα πλύσης εργασίας στο τέλος της ημέρας. ΦΥΛΑΞΗ ΚΑΙ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΛΗΞΗΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Πριν από το άνοιγμα ή την ανασύσταση, όλα τα συστατικά του κιτ παραμένουν σταθερά έως την ημερομηνία λήξης, η οποία αναγράφεται στην ετικέτα, εφόσον διατηρούνται σε θερμοκρασία 2 έως 8 C. Μετά την ανασύσταση, οι βαθμονομητές και οι οροί ελέγχου παραμένουν σταθεροί για μία εβδομάδα σε θερμοκρασία 2 έως 8 C. Για μεγαλύτερες περιόδους φύλαξης, πρέπει να σχηματίζονται κλάσματα/δόσεις μιας χρήσης και να διατηρούνται στους 20 C για 3 μήνες. Αποφεύγετε τη διαδοχική κατάψυξη και απόψυξη. Φρέσκο, παρασκευασμένο διάλυμα πλύσης εργασίας θα πρέπει να χρησιμοποιείται την ίδια ημέρα. Μετά την πρώτη χρήση του, ο ιχνηθέτης παραμένει σταθερός έως την ημερομηνία λήξης, εφόσον διατηρείται στο αρχικό, ερμητικά κλειστό φιαλίδιο σε θερμοκρασία 2 έως 8 C. Τυχόν μεταβολές της φυσικής εμφάνισης των αντιδραστηρίων του κιτ ενδέχεται να υποδηλώνουν αστάθεια ή αλλοίωση. IX. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Τα δείγματα ορού ή πλάσματος πρέπει να φυλάσσονται σε θερμοκρασία 28 C. Εάν η εξέταση δεν πραγματοποιηθεί εντός 24 ωρών, συνιστάται η φύλαξη στους 20 C. Αποφεύγετε τη διαδοχική κατάψυξη και απόψυξη. Ο ορός ή το πλάσμα (EDTA ή ηπαρίνη) παρέχουν παρόμοια αποτελέσματα. y(ορός) = 1,03x (ΗΠ. πλάσμα) + 0,07 r = 0,99 n = 30 y(ορός) = 1,00x (Πλάσμα με EDTA) 0,47 r = 0,99 n = 30 X. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ A. Σημειώσεις σχετικά με το χειρισμό Μη χρησιμοποιείτε το κιτ ή τα συστατικά μετά την ημερομηνία λήξης. Μην αναμειγνύετε υλικά από διαφορετικές παρτίδες κιτ. Φέρετε όλα τα αντιδραστήρια σε θερμοκρασία δωματίου πριν από τη χρήση. Αναμείξτε καλά όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα με απαλή ανακίνηση ή ανάδευση. Χρησιμοποιείτε ένα καθαρό αναλώσιμο ρύγχος πιπέτας για την προσθήκη κάθε διαφορετικού αντιδραστηρίου και δείγματος προκειμένου να αποφύγετε την επιμόλυνση. Η ακρίβεια βελτιώνεται με χρήση πιπετών υψηλής ακρίβειας ή αυτοματοποιημένου εξοπλισμού διανομής με πιπέτες. Τηρείτε τους χρόνους επώασης. Προετοιμάστε μια καμπύλη βαθμονόμησης για κάθε ανάλυση και μη χρησιμοποιείτε δεδομένα από προηγούμενες αναλύσεις. B. Διαδικασία 1. Σημάνετε επιστρωμένα σωληνάρια εις διπλούν για κάθε βαθμονομητή, δείγμα και ορό ελέγχου. Για τον προσδιορισμό των μετρήσεων του ιχνηθέτη 125 I ("total"), σημάνετε 2 κοινά (μη επιστρωμένα) σωληνάρια. 2. Αναμείξτε για λίγο (με αναμείκτη στροβιλισμού τύπου vortex) βαθμονομητές, ορούς ελέγχου και δείγματα και διανείμετε 50 μl από έκαστο σε αντίστοιχα σωληνάρια. 3. Διανείμετε 50 µl αντιhcg+β σημασμένης με 125 I σε κάθε σωληνάριο, συμπεριλαμβάνοντας τα μη επιστρωμένα σωληνάρια που αφορούν τις μετρήσεις του ιχνηθέτη 125 I ("total"). 4. Ανακινήστε απαλά με το χέρι τη βάση στήριξης των σωληναρίων. 5. Επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου αναδεύοντας (400 rpm). Τηρήστε με απόλυτη ακρίβεια το χρόνο επώασης. 6. Αναρροφήστε (ή μεταγγίστε) το περιεχόμενο κάθε σωληναρίου (με εξαίρεση εκείνα που αφορούν τις μετρήσεις του ιχνηθέτη 125 I ["total"]). Βεβαιωθείτε ότι το πλαστικό ρύγχος του αναρροφητή φθάνει στον πυθμένα του επιστρωμένου σωληναρίου προκειμένου να αφαιρεθεί όλη η ποσότητα του υγρού. 7. Πλύνετε τα σωληνάρια με 2 ml διαλύματος πλύσης εργασίας (με εξαίρεση εκείνα που αφορούν τις μετρήσεις του ιχνηθέτη 125 I ["total"]) και αναρροφήστε (ή μεταγγίστε). Αποφύγετε το σχηματισμό αφρού κατά τη διάρκεια της προσθήκης του διαλύματος πλύσης εργασίας. 8. Αναρροφήστε (ή μεταγγίστε) το περιεχόμενο κάθε σωληναρίου (με εξαίρεση εκείνα που αφορούν τις μετρήσεις του ιχνηθέτη 125 I ["total"]). 9. Πλύνετε τα σωληνάρια και πάλι με 2 ml διαλύματος πλύσης εργασίας (με εξαίρεση εκείνα που αφορούν τις συνολικές μετρήσεις) και αναρροφήστε (ή μεταγγίστε). 10. Μετά την τελευταία πλύση, αφήστε τα σωληνάρια σε όρθια θέση για δύο λεπτά και αναρροφήστε το υπόλοιπο υγρό. 11. Μετρήστε τα σωληνάρια σε μετρητή γ ακτινοβολίας για 60 δευτερόλεπτα.