ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΑΡΩΣΕΩΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ GC/MS, ΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΛΕΓΧΟΥ DOPING ΠΟΛΥΞΕΝΗ ΚΙΟΥΣΗ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2011

2

3 ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΣΑΡΩΣΕΩΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ GC/MS, ΓΙΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΣΕ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑ ΕΛΕΓΧΟΥ DOPING ΠΟΛΥΞΕΝΗ ΚΙΟΥΣΗ Α.Μ.: ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ: Μ. Κουππάρης, Καθηγητής, ΕΚΠΑ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ: 1. Μ. Κουππάρης, Καθηγητής, ΕΚΠΑ, Επιβλέπων 2. Α. Καλοκαιρινός, Καθηγητής, ΕΚΠΑ 3. Τ. Αττά-Πολίτου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, ΕΚΠΑ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: 1. Μ. Κουππάρης, Καθηγητής, ΕΚΠΑ, Επιβλέπων 2. Α. Καλοκαιρινός, Καθηγητής, ΕΚΠΑ 3. Τ. Αττά-Πολίτου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, ΕΚΠΑ 4. Κ. Ευσταθίου, Καθηγητής, ΕΚΠΑ 5. Α. Οικονόμου, Επίκουρος Καθηγητής, ΕΚΠΑ 6. Ν. Θωμαΐδης, Επίκουρος Καθηγητής, ΕΚΠΑ 7. E. Μπακέας, Επίκουρος Καθηγητής, ΕΚΠΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 20/12/2011

4

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Βασική απαίτηση για τα εργαστήρια ελέγχου ντόπινγκ αποτελεί η ικανότητα ανίχνευσης ενός μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες, σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις και σε διάφορα βιολογικά υγρά, όπως τα ούρα. Τα περισσότερα εργαστήρια ελέγχου ντόπινγκ σήμερα χρησιμοποιούν για το σκοπό αυτό διαφορετικές παρασκευαστικές και αναλυτικές πορείες. Η ανάπτυξη μιας ενιαίας μεθόδου σαρώσεως με κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης θα ήταν επιθυμητή, καθώς θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντική εξοικονόμηση χρόνου, κόστους και ανθρώπινου δυναμικού. Η παρούσα εργασία, που εκπονήθηκε στο πλαίσιο του χρηματοδοτούμενου ερευνητικού προγράμματος από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Καταπολέμησης του Ντόπινγκ (World Anti-Doping Agency, WADA), εξετάζει την ανάπτυξη μιας ενιαίας μεθόδου σαρώσεως για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών με την τεχνολογία αεριοχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών χρόνου πτήσης ιόντων (Gas Chromatography/Time of Flight Mass Spectrometry, GC/TOFMS). Η μέθοδος σάρωσης θα πρέπει να περιλαμβάνει κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης. Η πρώτη περιλαμβάνει τα στάδια της υδρόλυσης, εκχύλισης και παραγωγοποίησης. Μετά από εκτεταμένη βιβλιογραφική αναζήτηση που αφορά τα παραπάνω στάδια παρατίθενται αρχικά τα σημαντικότερα αντιδραστήρια που έχουν χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων, καθώς και οι παράμετροι που επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Στη συνέχεια, παρουσιάζεται μια βιβλιογραφική ανασκόπηση μεθόδων που έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών σε διάφορα βιολογικά υγρά με τη χρήση προσροφητικών υλικών με διαφορετικές ιδιότητες. Το πειραματικό πρωτόκολλο για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης επικεντρώθηκε στο σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων. Αρχικά εξετάστηκε η εφαρμογή ενός ιδιαίτερα ισχυρού αντιδραστηρίου (MSTFA/NH 4 I/PrSH) το οποίο έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγοποίηση των αναβολικών στεροειδών. Τα πρώτα αποτελέσματα, οδήγησαν στην εφαρμογή αντίδρασης παραγωγοποίησης δυο σταδίων, με σκοπό την προστασία των ευαίσθητων υδροξυλομάδων που φέρουν ουσίες, όπως οι ephedrine και cortisol. Ακολούθησε βελτιστοποίηση της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης με τη μελέτη των εξής παραμέτρων: συγκέντρωση του

6 αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, χρόνος επώασης, θερμοκρασία επώασης, χρήση βελτιωτικών μέσων, όπως καταλύτη (TMCS) και διαλύτη (ACN), καθώς και εφαρμογή εναλλακτικών μεθόδων θέρμανσης, όπως τα μικροκύματα. Η βελτιστοποιημένη πορεία παραγωγοποίησης δυο σταδίων, συνολικής διάρκειας 20 min που εφαρμόστηκε σε δείγματα ούρων αθλητών, εμβολιασμένα με τις υπό προσδιορισμό ουσίες, επέτρεψε την ανίχνευση 190 απαγορευμένων ουσιών σε συγκέντρωση ίση με το Ελάχιστο Απαιτούμενο Όριο Απόδοσης/Επίδοσης (Minimum Required Performance Level, MRPL). Το πειραματικό πρωτόκολλο για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης περιλαμβάνει τέσσερις σειρές πειραμάτων. Αρχικά εξετάστηκαν πρωτόκολλα εκχύλισης στερεάς φάσης και υγρό-υγρό εκχύλισης, σε μη υδρολυμένα ούρα. Παρά το μεγάλο αριθμό προσροφητικών υλικών (πολυμερή και silica) με διαφορετικές ιδιότητες (υδρόφοβα-υδρόφιλα-μικτού τύπου) που εξετάστηκαν, κανένα δεν αποδείχθηκε κατάλληλο για εφαρμογή σε μέθοδο σάρωσης, καθώς δεν εκχύλιζαν όλες τις εξεταζόμενες ουσίες ή παρουσίαζαν πολύ χαμηλές ανακτήσεις. Ένα επιπλέον πρόβλημα που προέκυψε μετά την εφαρμογή εκχύλισης στερεάς φάσης ήταν η ατελής παραγωγοποίηση των μελετούμενων ουσιών, ως αποτέλεσμα της ανεπαρκούς απομάκρυνσης των ενώσεων της μήτρας. Συνδυασμός εκχύλισης στερεάς φάσης και υγρό-υγρό εκχύλισης οδήγησε σε καθαρισμό του υποβάθρου και ικανοποιητικά αποτελέσματα σε ό,τι αφορά την ικανότητα ανίχνευσης των μελετούμενων ουσιών. Τα πρωτόκολλα αυτά, καθώς και πρωτόκολλα μόνο με υγρό-υγρό εκχύλιση δοκιμάστηκαν σε υδρολυμένα ούρα. Από το σύνολο των δοκιμών που πραγματοποιήθηκαν εννέα πρωτόκολλα που παρουσίασαν στις προηγούμενες σειρές πειραμάτων τις υψηλότερες ανακτήσεις και τη μικρότερη διακύμανση των αποτελεσμάτων, εφαρμόστηκαν για την εκχύλιση του συνόλου των εξεταζομένων ουσιών σε δείγματα ούρων στο MRPL. Τελικά, επιλέχθηκε εκχύλιση με διαιθυλαιθέρα, ως αποτέλεσμα του σταδίου αυτού για την εφαρμογή ενιαίας μεθόδου εκχύλισης. Η εφαρμογή ενιαίας μεθόδου σαρώσεως περιλαμβάνει την ανάλυση δειγμάτων ούρων αθλητών που παρασκευάστηκαν με την ενιαία παρασκευαστική πορεία, με ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης με GC/TOFMS. Για το σκοπό αυτό προσδιορίστηκαν αρχικά οι χρόνοι ανάσχεσης, καθώς και τα κύρια διαγνωστικά ιόντα για το σύνολο των μελετούμενων ουσιών. Ακολούθως προσαρμόστηκαν μακροεντολές στο λογισμικό του

7 οργάνου για την αυτοματοποίηση της επεξεργασίας των αποτελεσμάτων. Για την ομάδα των διεγερτικών ναρκωτικών ουσιών δημιουργήθηκε βιβλιοθήκη φασμάτων τριμεθυλοσιλυλο παραγώγων κατόπιν εφαρμογής της ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης. Η βιβλιοθήκη αυτή περιλαμβάνει όλες τις μελετούμενες ουσίες, το φάσμα μαζών, όπως αυτό προέκυψε μετά την ανάλυση με GC/TOFMS, καθώς και τα κύρια διαγνωστικά ιόντα ανά ουσία. Στη συνέχεια, δείγματα ούρων αθλητών εμβολιάστηκαν με τις υπό προσδιορισμό ουσίες σε συγκέντρωση ίση με το MRPL. Από τις 183 ουσίες που εξετάστηκαν σε δείγματα ούρων, προσδιορίστηκαν επιτυχώς με λόγο S/N μεγαλύτερο του 3, 169 απαγορευμένες ουσίες με εξαιρετική ακρίβεια προσδιορισμού μαζών. Μέρος των ουσιών που απέτυχαν να ανιχνευθούν με GC/TOFMS, ανιχνεύονται με LC/TOFMS. Η ενιαία μέθοδος σάρωσης επιτρέπει την ανίχνευση ενός μεγάλου αριθμού ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών, με εξαιρετικές δυνατότητες λόγω της υψηλής διαχωριστικής ικανότητας και της ακρίβειας προσδιορισμού μαζών με λειτουργία πλήρους σάρωσης. ΘΕΜΑΤΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ: Αναλυτική Χημεία ΛΕΞΕΙΣ ΚΛΕΙΔΙΑ: Ανάλυση ντόπινγκ, μέθοδος σάρωσης, τριμεθυλοσιλυλο-παράγωγα, υγρό-υγρό εκχύλιση, εκχύλιση στερεάς φάσης, GC/TOFMS.

8

9 ABSTRACT Critical requirement in doping control laboratories is the identification of a large number of prohibited substances with different properties, in low concentrations, found in different biological fluids, such as urine. Nowadays, most doping control laboratories follow different sample preparation and the respective analytical procedures for this purpose. The development of a unified screening method is necessary for saving cost, time and human resources. The present work, carried out in the framework of WADA funded research project, investigates the development of a unified screening method for the identification of prohibited substances, in athlete urine samples, through the use of GC/TOFMS technology. The screening method includes a common sample preparation and the respective analytical protocol. The first involves the hydrolysis, extraction and derivatisation steps. Following an extensive bibliographical review on these steps, the most important chemical reagents that have been used in the formation of TMSderivatives, as well as the parameters that affect the derivatization reaction yield, are being presented. In addition, a bibliographical review for the extraction of prohibited substances identified in various biological fluids is described, using sorbents with different properties. The experimental protocol for the development of a unified derivatization method was focused on the formation of TMS-derivatives. At first, the application of a quite strong reagent (MSTFA/NH 4 I/PrSH), which has been widely used in the derivatization of anabolic steroids, was studied. The preliminary results showed the way to the application of a two-step derivation reaction, for the protection of sensitive hydroxylgroups of substances such as ephedrine and cortisol. The optimization of the proposed derivatization procedure was carried out on the following parameters: concentration of the derivatization reagent, incubation time and temperature, use of means for the enhancement of derivatization process such as catalyst (TMCS) and solvent (ACN), as well as the application of alternative heating methods, e.g. microwaves. The optimized two-step procedure, with a total duration of 20 min that was applied in athlete urine samples spiked with the substances under investigation, allowed for the detection of 190

10 prohibited substances in a concentration equal to the Minimum Required Performance Level (MRPL). The experimental protocol for the development of a unified extraction procedure includes four experiment series. At first, the solid phase and liquid-liquid extraction protocols were studied. In spite of the large number of sorbents (polymers and silica) with different properties (hydrophobic, hydrophilic, mixed mode) that were tested, no one proved to be adequate for the application in a screening method, since they did not extract all compounds or the recovery was too low. An additional problem occurred after the implementation of solid phase extraction, was the incomplete derivatization of the compounds of interest, as a result of the extraction of the matrix compounds in parallel with the analytes of interest. The combination of solid phase and liquid-liquid resulted in a cleaner background and satisfying results in regard to the detection of the compounds of interest. The aforementioned protocols together with those of exclusive liquid-liquid extraction were tested on hydrolyzed urine. As a result of these tests, nine protocols giving high recovery and low variance were applied for the extraction of the total number of compounds in urine samples at MRPL. Eventually, LLE with diethylether as extraction solvent was selected for the application of a unified extraction method. The application of the unified method includes the analysis by GC/TOFMS, of urine samples that were prepared by the unified sample preparation procedure. For this reason, the retention times with the main diagnostic ions for the compounds of interest, were firstly defined. Macros were modified in the instrument software for the automation of data processing. A spectrum library of TMS-derivatives was developed for stimulants and narcotics following the application of the unified derivatization method. The library includes the compounds of interest, the mass spectrum as it was received from GT/TOFMS analysis, as well as the main diagnostic ions per compound. Then, the athletes urine samples were spiked with the compounds of interest at a concentration level of MRPL. 169 prohibited substances were identified with S/N greater than 3 and excellent mass accuracy out of 183 substances that were studied in urine samples. Part of those substances that were not identified with GC/TOFMS can be identified with LC/TOFMS.

11 The unified screening method allows for the identification of large number of substances in athletes urine samples with good performance due to its high resolution and mass accuracy in full scan mode. Thematic area: Analytical Chemistry Keywords: Doping analysis, screening method, trimethylsilyl-derivatives, Liquid- Liquid extraction, Solid Phase Extraction, GC/TOFMS.

12

13 Στο πιο όμορφο προσωπάκι που δε χορταίνω να κοιτώ...στο γιο μου Κωνσταντίνο!

14 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ελέγχου Doping του ΟΑΚΑ σε συνεργασία με το Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Χημικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών, στο πλαίσιο ερευνητικού προγράμματος χρηματοδοτούμενου από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Καταπολέμησης του Ντόπινγκ (WADA). Ευχαριστώ θερμά τον πρώην Διευθυντή του Εργαστηρίου Ελέγχου Doping Δρ. Κ. Γεωργακόπουλο, για την ευκαιρία που μου έδωσε να συμμετάσχω στο ερευνητικό πρόγραμμα (με την εκπόνηση της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής), παράλληλα με την εργασία μου στο εργαστήριο. Η ερευνητική του εμπειρία, καθώς και οι εύστοχες παρατηρήσεις του αποδείχτηκαν πολύτιμα εργαλεία καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας διατριβής. Τον ευχαριστώ επίσης, για την πρόταση του εξαιρετικά ενδιαφέροντος θέματος αφού με αυτό τον τρόπο μου δόθηκε η ευκαιρία να ασχοληθώ με διαφορετικές αλλά και σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τον Δρ. Γ. Αγγελή και τον νυν Διευθυντή του Εργαστηρίου Δρ. Μ. Λυρή για την ουσιαστική συμμετοχή τους, στην παρούσα διατριβή και ιδιαίτερα στο τμήμα της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης. Τους ευχαριστώ πολύ για τη σωστή καθοδήγηση, τις χρήσιμες παρατηρήσεις τους, καθώς και για το χρόνο που διέθεσαν. Η υποστήριξή τους στη συντήρηση και τη σωστή λειτουργία των οργάνων GC/MS και HRMS που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη εργασία, ήταν πολύ σημαντική για τη διεξαγωγή των πειραμάτων. Τέλος, θέλω να επισημάνω ότι μέσα από εποικοδομητικές συζητήσεις και την εμπειρία τους, με βοήθησαν στην επίλυση αρκετών τεχνικών ή επιστημονικών προβλημάτων. Προς τον επιβλέποντα Καθηγητή κ. Μ. Α. Κουππάρη εκφράζω τις θερμές μου ευχαριστίες για την ουσιαστική επιστημονική του βοήθεια και καθοδήγηση. Το ενδιαφέρον και η κατανόησή του υπήρξαν πολύτιμα, ιδίως κατά το στάδιο της συγγραφής της παρούσας διατριβής, η οποία έλαβε την τελική της μορφή με τις εύστοχες παρατηρήσεις του.

15 Στα μέλη της Συμβουλευτικής Επιτροπής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Τ. Αττά- Πολίτου και τον Καθηγητή κ. Α. Καλοκαιρινό, εκφράζω τις ευχαριστίες μου για τη συνεργασία τους και τη διόρθωση της παρούσας διατριβής. Θα ήθελα, επίσης, να ευχαριστήσω όλα τα μέλη της Εξεταστικής Επιτροπής για το χρόνο που αφιέρωσαν καθώς και για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους. Τις ευχαριστίες μου επίσης εκφράζω στις κα Σ. Λούη και κα Φ. Χλαπάνα, καθώς και σε όλους τους συναδέλφους μου στο Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ του ΟΑΚΑ. Ευχαριστώ την κα Αθηνά Βουρούδη, Χημικό, για τη συνεργασία μας στο τμήμα της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου εκχύλισης. Προς το συμφοιτητή μου και φίλο, κ. Νεκτάριο Μήλιο, Δρ. Χημικό, εκφράζω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες τόσο για την ηθική υποστήριξη για την ολοκλήρωση της διατριβής, όσο και για τις εύστοχες παρατηρήσεις του στη διαμόρφωση του τελικού κειμένου. Τελειώνοντας, θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότερες ευχαριστίες στο σύζυγό μου Γιώργο, Δρ. Χημικό Μηχανικό, τόσο για την υπομονή που επέδειξε όσο και για τη συνδρομή του για τη διαμόρφωση του τελικού κειμένου. Προς τους γονείς μας θα πω απλά ένα μεγάλο ευχαριστώ, που είναι πάντα εδώ...να μας στηρίζουν. Ελπίζω και εύχομαι, να σταθούμε με την ίδια θέρμη, κατανόηση και αγάπη στα παιδιά μας! Αθήνα, Δεκέμβριος 2011 Πολυξένη Κιούση

16

17 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΝΤΟΠΙΝΓΚ Ιστορική αναδρομή Επιτροπές ελέγχου και καταπολέμησης του ντόπινγκ Ορισμός του Ντόπινγκ Απαγορευμένες ουσίες και μέθοδοι Μεταβολισμός απαγορευμένων ουσιών Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών Ελάχιστο Απαιτούμενο Όριο Απόδοσης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Σκοπός Αντιδράσεις παραγωγοποίησης Σίλυλο-παράγωγα Σίλυλο-παράγωγα στον έλεγχο ντόπινγκ Άλλες κατηγορίες παραγώγων Άλλες κατηγορίες παραγώγων στον έλεγχο ντόπινγκ Παράγοντες που επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ Υγρό-υγρό εκχύλιση και εκχύλιση στερεάς φάσης Εφαρμογές εκχύλισης στερεάς φάσης στον έλεγχο ντόπινγκ Εκχύλιση στερεάς φάσης απλού και πολλαπλών σταδίων (One step-multiple steps SPE extraction) Προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica Μη πολικά προσροφητικά υλικά Πολικά προσροφητικά υλικά Προσροφητικά υλικά μικτού τύπου Προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε πολυμερή Μη πολικά πολυμερή προσροφητικά υλικά Πολυμερή προσροφητικά υλικά με πολικές ιδιότητες Πολυμερή προσροφητικά υλικά μικτού τύπου Σύγκριση προσροφητικών υλικών βασιζόμενα σε silica και πολυμερή Νέας τεχνολογίας πληρωτικά υλικά Ανόργανα υλικά (Inorganic oxides) Υλικά με βάση τον άνθρακα (Carbon-based) Περιορισμένης πρόσβασης υλικά (Restricted access materials, RAM)

18 3.7.4 Προσροφητικά υλικά ανοσοσυγγένειας (Immunoaffinity Sorbents, ΙΑΕ) Προσροφητικά υλικά μοριακής αποτύπωσης (Moleculary Imprinted Polymers, MIPs) Μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) Αυτοματοποιημένες τεχνικές εκχύλισης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4.ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ-ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ ΙΟΝΤΩΝ Εισαγωγή Οργανολογία στη φασματομετρία μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Σύστημα εισαγωγής δείγματος Πηγή Ιόντων Αναλυτής Μαζών Ανιχνευτής Ιόντων Διάταξη ψηφιοποίησης Διάταξη του GC/TOFMS-Premier ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ Εισαγωγή Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Αντιδραστήρια Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Εργαστηριακές Συσκευές Αναλυτικός εξοπλισμός Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης Πειραματικός σχεδιασμός Πειραματικά πρωτόκολλα παραγωγοποίησης Προετοιμασία πειραμάτων Προκαταρκτικά πειράματα -Παραγωγοποίηση σε ένα και δύο στάδια Μελέτη παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης Εφαρμογή στο σύνολο των ουσιών Αποτελέσματα Συζήτηση Εισαγωγή Προκαταρκτικά πειράματα -Παραγωγοποίηση σε ένα και δύο στάδια Μελέτη παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης Εφαρμογή στο σύνολο των ουσιών

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ Εισαγωγή Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Αντιδραστήρια Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Εργαστηριακές Συσκευές Αναλυτικός εξοπλισμός Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης Πειραματικός σχεδιασμός Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης Προετοιμασία πειραμάτων Προκαταρκτικά πειράματα-εκχύλιση σε μη υδρολυμένα ούρα Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με LLE και συνδυασμό SPE και LLE Εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων στο σύνολο των υπό μελέτη ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών και συγκέντρωση ίση με το MRPL Αποτελέσματα Συζήτηση Εισαγωγή Προκαταρκτικά πειράματα-εκχύλιση σε μη υδρολυμένα ούρα Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με LLE και συνδυασμό SPE και LLE Εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων στο σύνολο των υπό μελέτη ουσιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ GC/TOFMS Εισαγωγή Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Αντιδραστήρια Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Εργαστηριακές Συσκευές Αναλυτικός εξοπλισμός Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφική μέθοδος ανάλυσης

20 7.4 Πειραματικό πρωτόκολλο ανάλυσης ουσιών με GC/TOFMS Προετοιμασία πειραμάτων Ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων και μεταβολικών δειγμάτων Ανάλυση δειγμάτων ούρων αθλητών με GC/TOFMS στο MRPL Αποτελέσματα Συζήτηση Εισαγωγή Ανάλυση πρότυπων διαλυμάτων και μεταβολικών δειγμάτων Ανάλυση δειγμάτων ούρων αθλητών με GC/TOFMS στο MRPL ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Εισαγωγή Συμπεράσματα Ενιαία μέθοδος παραγωγοποίησης Ενιαία μέθοδος εκχύλισης Ανάλυση απαγορευμένων ουσιών με GC/TOFMS Προοπτικές Βελτίωση των αποτελεσμάτων για τις ουσίες που δεν ανιχνεύθηκαν Επικύρωση της ενιαίας μεθόδου σάρωσης Εφαρμογή ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης για τη ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αλόγων Δυνατότητα αναδρομικής επεξεργασίας αποτελεσμάτων Βιβλιοθήκη Φασμάτων των TMS παραγώγων των διεγερτικών ναρκωτικών ΠΙΝΑΚΑΣ ΟΡΟΛΟΓΙΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΑΡΚΤΙΚΟΛΕΞΑ ΑΚΡΩΝΥΜΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 1: ΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΒΑΣΙΖΟΜΕΝΑ ΣΕ SILICA ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 2: ΠΡΟΣΡΟΦΗΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ ΒΑΣΙΖΟΜΕΝΑ ΣΕ ΠΟΛΥΜΕΡΗ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 3: ΣΥΝΟΨΗ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 4:ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΝΑΚΤΗΣΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΩΝ ΠΡΩΤΟΚΟΛΛΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ. 278 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 5: ΒΙΒΛΙΟΘΗΚΗ TMS ΦΑΣΜΑΤΩΝ ΤΩΝ ΔΙΕΓΕΡΤΙΚΩΝ- ΝΑΡΚΩΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΑΝΑΛΥΣΗ ΜΕ GC/TOFMS ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 6: ΕΝΔΕΙΚΤΙΚΑ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΗΜΑΤA ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΟΥΡΩΝ ΣΤΟ MRPL ΜΕ GC/TOFMS ΑΝΑΦΟΡΕΣ

21 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 2.1: Ιοντικό χρωματογράφημα και φάσμα μαζών της μη παραγωγοποιημένης ουσίας ephedrine Σχήμα 2.2: Διαφοροποίηση στο φάσμα μαζών μετά από παραγωγοποίηση της ουσίας MDMA (3,4-Methylenedioxymethylamphetamine), όπου (1) το φάσμα της μη παραγωγοποιημένης και (2) της παραγωγοποιημένης ουσίας Σχήμα 2.3: Αντίδραση παραγωγοποίησης των αναβολικών στεροειδών Σχήμα 2.4: Υποθετικός μηχανισμός δράσης του (EtS) 2 με τα 17-κετο-στεροειδή Σχήμα 2.5: Χαρακτηριστική δομή των αναβολικών στεροειδών Σχήμα 2.6: Παραγωγοποίηση της ephedrine και σχηματισμός του OTMS, NTFA παραγώγου Σχήμα 2.7: Αντίδραση σχηματισμού τριμεθυλο-παραγώγου της διουρητικής ουσίας bumetanide Σχήμα 3.1: Συνοπτική παρουσίαση εφαρμογών εκχύλισης στερεάς φάσης στον έλεγχο ντόπινγκ Σχήμα 3.2: Εκχύλιση στερεάς φάσης με χρήση προσροφητικών υλικών σε σειρά, όπου (1) :τρόπος χρήσεως 1 και (2): τρόπος χρήσεως Σχήμα 3.3: Μη πολικό προσροφητικό υλικό C Σχήμα 3.4: Μηχανισμός δράσης σε υδρόφοβα προσροφητικά υλικά Σχήμα 3.5: Τυπική αντίδραση κάλυψης των άκρων (σιλανοποίηση) Σχήμα 3.6: Υδρόφοβες και κατιοντανταλλακτικές αλληλεπιδράσεις με στήλες μικτού τύπου Σχήμα 3.7: Υδρόφοβες και ανιονανταλλακτικές αλληλεπιδράσεις με στήλες μικτού τύπου 80 Σχήμα 3.8: Isolute 101, Υδρόφοβο πολυμερές προσροφητικό υλικό St-DVB Σχήμα 3.9: Υδρόφιλα προσροφητικά υλικά με τροποποίηση της επιφάνειας του υδρόφοβου πολυμερούς St-DVB Σχήμα 3.10: α) Δομή του προσροφητικού υλικούisolute ENV+ β) αλληλεπιδράσεις με το ENV Σχήμα 3.11: Μηχανισμός δράσης του πολυμερούς προσροφητικού υλικού, μικτού τύπου Strata X-C Σχήμα 3.12: Σχηματική παράσταση των τεχνικών SPME με ίνα(α) και με σωλήνα (Β) Σχήμα 3.13: Σχηματική παρουσίαση των ολοκληρωμένων μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων με την τεχνική διαχωρισμού και ανίχνευσης Σχήμα 4.1: Ανιχνευτής MCP Σχήμα 4.2: Απεικόνιση GC/TOFMS με ορθογώνια επιτάχυνση και ανακλαστικό κάτοπτρο 102

22 Σχήμα 4.3: Φαινόμενο κορεσμού ανιχνευτή στο φασματόμετρο μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Σχήμα 5.1: Προετοιμασία του δείγματος ελέγχου STDC για ανάλυση απαγορευμένων ουσιών στις σειρές και Σχήμα 5.2: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, CMIX, CALD, 847, 471, BLANK για ανάλυση απαγορευμένων ουσιών της σειράς Σχήμα 5.3: Διάγραμμα ροής (πειραματικός σχεδιασμός) του πειραματικού πρωτοκόλλου για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών 125 Σχήμα 5.4: (A) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης σε: ένα στάδιο (1), δύο στάδια (2) και μετά τη βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης (3) (B) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης με MSTFA (C) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine bis-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης σε ένα στάδιο (1), δύο στάδια (2) και μετά την βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης (3) Σχήμα 5.5: (A) ιοντικό χρωματογράφημα για την ουσια cortisol, κατόπιν παραγωγοποίησης: A) σε ένα στάδιο και (B)σε δύο στάδια. Κορυφή 1: cortisol tetra-tms, κορυφή 2: cortisol pentatms Σχήμα 5.6: Παραγωγοποίηση της ουσίας cortisol με αντίδραση ενός και δυο σταδίων. Σχηματισμός των cortisol tetra-tms (1) και penta-tms (2) Σχήμα 5.7: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για τα διεγερτικά-ναρκωτικά: (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW και (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r) Σχήμα 5.8: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για τα αναβολικά στεροειδή: (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW και (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r) Σχήμα 5.9: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για το σύνολο των μελετούμενων ουσιών (sum RRF): (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW, (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r), (RRF(A) το RRF των αναβολικών, RRF(Δ-Ν) το RRF των διεγερτικών ναρκωτικών) Σχήμα 5.10: Ενιαία μέθοδος παραγωγοποίησης δυο σταδίων για το σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο παραγώγων Σχήμα 6.1: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALA, CALB για ανάλυση στις σειρές

23 Σχήμα 6.2: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, CMIX, 471, 847, BLANK για ανάλυση στη σειρά Σχήμα 6.3: Διάγραμμα ροής του πειραματικού πρωτοκόλλου για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 6.4: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Σ % Rec των πρωτοκόλλων 18a και 18d Σχήμα 6.5: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average(% Rec) των πρωτοκόλλων 18a και 18d Σχήμα 6.6: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων %CV (%Rec) ανάλυσης των πρωτοκόλλων 18a και 18d Σχήμα 6.7: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average (% Rec) των πρωτοκόλλων της φάσης ΙΙΙ Σχήμα 6.8: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων %CV (%Rec) ανάλυσης των πρωτοκόλλων φάσης ΙΙΙ Σχήμα 6.9: Ιοντικό χρωματογράφημα του δείγματος ελέγχου CALA μετα από SPE εκχύλιση και παραγωγοποίηση Σχήμα 6.10: Ιοντικό χρωματογράφημα του δείγματος ελέγχου CALA μετα από συνδυασμό SPE και LLE εκχύλισης και παραγωγοποίηση Σχήμα 6.11: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average (% Rec) των πρωτοκόλλων 34a και 34b Σχήμα 6.12: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average (% Rec) των πρωτοκόλλων Σχήμα 6.13: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων %CV (% Rec) των πρωτοκόλλων Σχήμα 7.1: Παράθυρο tuning και παρακολούθηση των μαζών 28 και Σχήμα 7.2: Πρότυπο φάσμα αναφοράς της ουσίας heptacosa Σχήμα 7.3: Βαθμονόμηση του φασματομέτρου μαζών με την ουσία heptacosa ("calibration") Σχήμα 7.4: Συνοπτική παρουσίαση της ενιαίας μεθόδου σαρώσεωςς απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 7.5: Ιοντικό χρωματογράφημα και φάσμα μαζών της ουσίας nor-ephedrine bis-tms 250

24 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 1.1: Δράση και παρενέργειες λήψης απαγορευμένων ουσιών...37 Πίνακας 1.2: Κατάλογος απαγορευμένων ουσιών και μεθόδων της WADA...39 Πίνακας 1.3: Αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στις φάσεις I και II του μεταβολισμού Πίνακας 1.4: Ελάχιστο απαιτούμενο όριο απόδοσης (minimum required performance level, MRPL)...43 Πίνακας 2.1: Αντιδραστήρια σχηματισμού τριμεθυλοσιλυλο παραγώγων...51 Πίνακας 2.2: Συνοπτική παρουσίαση σιλυλο-αντιδραστηρίων για την παραγωγοποίηση αναβολικών στεροειδών και κορτικοστεροειδών ουσιών...54 Πίνακας 2.3: Συνοπτική παρουσίαση σιλυλο-αντιδραστηρίων για την παραγωγοποίηση διεγερτικών-ναρκωτικών ουσιών και β2-αγωνιστών...55 Πίνακας 2.4: Συνοπτική παρουσίαση άλλων κατηγοριών παραγώγων στον έλεγχο ντόπινγκ...60 Πίνακας 3.1: Χαρακτηριστικές ομάδες πολυμερών προσροφητικών υλικών με πολικές ιδιότητες...83 Πίνακας 5.1: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου STDC Πίνακας 5.2: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CMIX Πίνακας 5.3: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου Πίνακας 5.4: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου Πίνακας 5.5: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALWADA Πίνακας 5.6: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALD Πίνακας 5.7: Αναλυτικές παράμετροι full scan GC/MS μεθόδου ανάλυσης διεγερτικών ναρκωτικών ουσιών (stnadi) Πίνακας 5.8: Αναλυτικές παράμετροι full scan GC/MS μεθόδου ανάλυσης αναβολικών ουσιών (ster2sc) Πίνακας 5.9: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων με GC/MS, ουσιών του STDC Πίνακας 5.10: Αναλυτικές παράμετροι SIR HRMS μεθόδου ανάλυσης αναβολικών ουσιών (aasteroids) Πίνακας 5.11: Πειραματικός σχεδιασμός για τη βελτιστοποίηση της ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών με τη μελέτη των παραμέτρων (A-D) Πίνακας 5.12: Εξεταζόμενες τιμές των παραμέτρων A-D για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών όπως σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε στην παρούσα διατριβή Πίνακας 5.13: Αναλύτες, σχηματιζόμενα παράγωγα και διαγνωστικά ιόντα που ανιχνεύονται με παραγωγοποίηση δύο σταδίων σε δείγματα ούρων αθλητών και full scan GC/MS ανάλυση:...146

25 Πίνακας 5.14: Αναλύτες, σχηματιζόμενα παράγωγα και διαγνωστικά ιόντα που ανιχνεύονται με παραγωγοποίηση δύο σταδίων σε δείγματα ούρων αθλητών και HRMS ανάλυση Πίνακας 6.1: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALA Πίνακας 6.2: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALΒ Πίνακας 6.3: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων ουσιών με LC/MS Πίνακας 6.4: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων ουσιών με GC/MS Πίνακας 6.5: Εξεταζόμενα προσροφητικά υλικά στηριζόμενα σε silica Πίνακας 6.6: Εξεταζόμενα προσροφητικά υλικά στηριζόμενα σε πολυμερές Πίνακας 6.7: Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης στερεάς φάσης σε υδρολυμένα ούρα Πίνακας 6.8: Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης, για το σύνολο των ουσιών Πίνακας 6.9: Αποτελέσματα παραγωγοποίησης με έλεγχο του λόγου R A Πίνακας 6.10: Αποτελέσματα εκχύλισης των δειγμάτων ελέγχου CMIX, 471, CALD με LC/MS Ion trap ανάλυση Πίνακας 6.11: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CMIX με HRMS ανάλυση Πίνακας 6.12: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου 847 με HRMS ανάλυση..208 Πίνακας 6.13: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CMIX με GC/MS ανάλυση Πίνακας 6.14: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου 471 με GC/MS ανάλυση 211 Πίνακας 6.15: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CALWADA με GC/MS ανάλυση Πίνακας 7.1: Αναλυτικές παράμετροι ενιαίας GC/TOFMS μεθόδου ανάλυσης απαγορευμένων ουσιών Πίνακας 7.2: Προσδιοριζόμενοι αναλύτες, σχηματιζόμενα παράγωγα και κύρια διαγνωστικά ιόντα των διεγερτικών ναρκωτικών ουσιών Πίνακας 7.3: Προσδιοριζόμενοι αναλύτες και κύρια διαγνωστικά ιόντα των αναβολικών ουσιών Πίνακας 7.4: Προσδιοριζόμενοι αναλύτες, χρόνος ανάσχεσης, σχετικός χρόνος ανάσχεσης, λόγος S/N και ακρίβεια προσδιορισμού μαζών για την ομάδα των διεγερτικών ναρκωτικών σε δείγματα ούρων στο MRPL Πίνακας 7.5: Προσδιοριζόμενοι αναλύτες, χρόνος ανάσχεσης, σχετικός χρόνος ανάσχεσης, λόγος S/N και ακρίβεια προσδιορισμού μαζών για την ομάδα των αναβολικών ουσιών σε δείγματα ούρων στο MRPL...244

26

27 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Ελέγχου Ντόπινγκ του Ο.Α.Κ.Α. σε συνεργασία με το Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας του Χημικού Τμήματος του Πανεπιστημίου Αθηνών, στο πλαίσιο ερευνητικού προγράμματος χρηματοδοτούμενου από τον Παγκόσμιο Οργανισμό Καταπολέμησης του Ντόπινγκ (WADA) με τίτλο "Application of Time-Of-Flight Mass Spectrometry for the Unification and Expansion of the Window of the Screening Methods of the WADA Laboratories". Ο στόχος της διατριβής εστιάζεται στην ανάπτυξη μιας ενιαίας μεθόδου σαρώσεως (screening) ταυτόχρονης ανίχνευσης μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών με την τεχνική αεριοχρωματογραφίας /φασματομετρίας μαζών (GC/MS). Καθώς τα περισσότερα εργαστήρια ελέγχου ντόπινγκ χρησιμοποιούν σήμερα διαφορετικές παρασκευαστικές και αναλυτικές πορείες για την ανίχνευση ενός μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών, σε αρκετά χαμηλές συγκεντρώσεις, καθίσταται σαφές ότι η ανάπτυξη μιας ενιαίας μεθόδου σαρώσεως θα ήταν επιθυμητή. Η πρωτοποριακή αυτή μέθοδος με κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης θα μπορούσε να οδηγήσει σε σημαντική εξοικονόμηση χρόνου, κόστους και ανθρώπινου δυναμικού. Η παρούσα διδακτορική διατριβή ξεκινά με την εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ στο Κεφάλαιο 1. Στη συνέχεια παρουσιάζονται βιβλιογραφικά δεδομένα που σχετίζονται με την παραγωγοποίηση των απαγορευμένων ουσιών με το σχηματισμό αφενός σιλυλο και αφετέρου άλλων παραγώγων, στο Κεφάλαιο 2. Στο Κεφάλαιο 3 επιχειρείται μια ανασκόπηση των μεθόδων εκχύλισης με ιδιαίτερη έμφαση στην εκχύλιση στερεάς φάσης και των εφαρμογών της, κυρίως στον έλεγχο ντόπινγκ. Οι βασικές αρχές της τεχνολογίας GC/TOFMS παρουσιάζονται στο Κεφάλαιο 4. Η παρουσίαση του πειραματικού μέρους ξεκινάει με την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης στο Κεφάλαιο 5. Η ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης περιγράφεται στο Κεφάλαιο 6, ενώ η ανάπτυξη ενιαίου σταδίου αναλυτική μέτρησης με GC/TOFMS στο Κεφάλαιο 7. Στα τρία αυτά Κεφάλαια 5, 6, 7 παρουσιάζεται αρχικά το πειραματικό πρωτόκολλο ενώ στη συνέχεια του κάθε κεφαλαίου παρατίθενται και σχολιάζονται τα αντίστοιχα αποτελέσματα. Τέλος στο Κεφάλαιο 8 συνοψίζονται τα κυριότερα συμπεράσματα της παρούσας ερευνητικής εργασίας, η οποία αποτελεί μια

28 πρωτοποριακή μελέτη ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου σαρώσεως και συζητούνται οι μελλοντικές προοπτικές εφαρμογής της.

29 ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

30

31 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Κεφάλαιο Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ

32 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΟΝ ΕΛΕΓΧΟ ΝΤΟΠΙΝΓΚ 1.1 Ιστορική αναδρομή Η προέλευση του όρου ντόπινγκ (doping) ανάγεται στην λέξη dop, η οποία αναφέρεται σε ιδιοπαρασκευαζόμενο αλκοολούχο ποτό που χρησιμοποιούταν ως διεγερτικό, σε θρησκευτικές τελετές φυλών της Νοτίου Αφρικής. Η χρήση σκευασμάτων που προκαλούν αύξηση της αθλητικής αποδόσεως είναι γνωστή από την αρχαιότητα (αθλητές Ολυμπιακών Αγώνων στην Ελλάδα, μονομάχοι στη Ρώμη), όπου οι αθλητές λάμβαναν διάφορες ουσίες, ενώ παράλληλα ακολουθούσαν ειδική διατροφή, προκειμένου να βελτιώσουν τις φυσικές τους ικανότητες 1,2. Η πιο παλιά αναφορά λήψης φαρμάκων σε αγώνες, αφορά κολυμβητικούς αγώνες στο Άμστερνταμ το 1865, ενώ την ίδια εποχή αρχίζει η διάδοση διεγερτικών (καφεΐνη, στρυχνίνη), στους ποδηλάτες 3,4. Η πρώτη ίσως αναφορά που σχετίζεται με θάνατο αθλητή οφειλόμενο σε χρήση απαγορευμένων ουσιών είναι το 1896 με το θάνατο του ποδηλάτη Arthur Linton πιθανόν λόγω χρήσης στρυχνίνης. Με την αναβίωση των Ολυμπιακών Αγώνων εμφανίζονται κρούσματα ντόπινγκ σε μαραθωνοδρόμους. Η ανακάλυψη στη δεκαετία του 1930 παραγώγων αμφεταμίνης οδηγεί σε έκρηξη του ντόπινγκ μετά το Β Παγκόσμιο πόλεμο κυρίως σε αθλήματα όπως η ποδηλασία με στόχο τη βελτίωση της αθλητικής επίδοσης. Στις δεκαετίες του 1940 και 1950 η αμφεταμίνη που παρασκευάζεται για πρώτη φορά το 1920 γίνεται το φάρμακο επιλογής με στόχο τη βελτίωση της αθλητικής επίδοσης. Θάνατοι αθλητών τη δεκαετία του 1960 λόγω αμφεταμινών ανέδειξαν τη σοβαρότητα και την εξάπλωση του φαινομένου του ντόπινγκ. Παρά το γεγονός ότι υπήρχαν υποψίες και ενδείξεις για τη χρήση διεγερτικών, δεν υπήρχαν κανονισμοί εναντίον του ντόπινγκ μέχρι τους Ολυμπιακούς αγώνες της Ρώμης το Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα του 23-χρονου Δανού ποδηλάτη Knud Jensen που πέθανε κατά τη διάρκεια του αγώνα των 100 Km λόγω χρήσης αμφεταμίνης, όπως αποκάλυψε η τοξικολογική ανάλυση μετά τη νεκροψίανεκροτομή. Μια νέα διάσταση του ντόπινγκ εμφανίστηκε στους αγώνες αυτούς και σχετίζεται με τη χρήση των αναβολικών στεροειδών. Η ιστορία του ντόπινγκ απόκτησε χαρακτήρα προβλήματος για την αθλητική κοινότητα, με τις αυξημένες επιδόσεις των αμερικανών αθλητών να αποδίδονται στη λήψη αναβολικών στεροειδών

33 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Ατομικές περιπτώσεις έχουν απασχολήσει την επικαιρότητα με πιο πολύκροτη εκείνη του δρομέα ταχύτητας Ben Johnson, από τον οποίο αφαιρέθηκε το χρυσό μετάλλιο στους αγώνες ταχύτητας 100 m στην Ολυμπιάδα της Σεούλ (1988) και όσες παγκόσμιες επιδόσεις είχε πραγματοποιήσει, μετά τη ανίχνευση αναβολικών στεροειδών στα ούρα του και την ομολογία του γιατρού του ότι τα χρησιμοποιούσε από το Η χρήση απαγορευμένων ουσιών έχει λάβει παγκόσμιες διαστάσεις και έχει στιγματίσει όλες σχεδόν τις μεγάλες αθλητικές διοργανώσεις των τελευταίων χρόνων με χαρακτηριστικά παραδείγματα την εύρεση 11 θετικών δειγμάτων τους Ολυμπιακούς Αγώνες του Σίδνευ το 2000 και 23 στους Ολυμπιακούς Αγώνες της Αθήνας το Επιτροπές ελέγχου και καταπολέμησης του ντόπινγκ Η πρώτη νομοθεσία για την καταπολέμηση της χρήσης φαρμάκων στον αθλητισμό παρουσιάστηκε από τη Γαλλική κυβέρνηση το 1963 και στη συνέχεια το 1965 από τη Βελγική. Το 1967 ιδρύεται η ιατρική επιτροπή της Διεθνούς Ολυμπιακής Επιτροπής (International Olympic Committee, ΔΟΕ), ενώ ο πρώτος έλεγχος αθλητών για τη λήψη απαγορευμένων ουσιών πραγματοποιήθηκε το 1968 στους Ολυμπιακούς αγώνες του Μεξικού 4. Εικόνα 1.1: WADA, παγκόσμιος οργανισμός καταπολέμησης του ντόπινγκ Τελικά, με την ίδρυση της ιατρικής επιτροπής της ΔΟΕ το 1967, καταρτίστηκε για πρώτη φορά μια λίστα με απαγορευμένες φαρμακευτικές ουσίες και ουσιαστικά ξεκίνησε ο συστηματικός έλεγχος των αθλητών για χρήση απαγορευμένων φαρμακευτικών ουσιών. Η λίστα αυτή περιελάμβανε αρχικά μόνο τα διεγερτικά και τα ναρκωτικά. Η προσθήκη των αναβολικών στη λίστα πραγματοποιήθηκε το 1974, όταν αναπτύχθηκε παράλληλα και η αντίστοιχη τεχνολογία για τη ανίχνευση αυτών 4,6. Αρχικά ο έλεγχος για τη ανίχνευση των αναβολικών γινόταν μόνο εντός αγώνων, κατά συνέπεια κάποιοι αθλητές έκαναν χρήση των ουσιών αυτών κατά τη διάρκεια των προπονήσεων και τα σταματούσαν πριν τον αγώνα προκειμένου να αποτραπεί η ανίχνευσή τους. Στη συνέχεια εισήχθηκε και ο έλεγχος εκτός αγώνων, οδηγώντας σε αποτελεσματικότερη

34 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ απόδοση του αγώνα κατά του ντόπινγκ. Το 1983 εισάχθηκε η ουσία testosterone στη λίστα της ΔΟΕ, η οποία αποτελεί την πρώτη ενδογενή ουσία που απαγορεύθηκε. Στους Ολυμπιακούς Αγώνες του Los Angeles το 1984 ο ποσοτικός προσδιορισμός για τη διεγερτική ουσία caffeine ενσωματώθηκε στη λίστα. Το 1985 απαγορεύθηκε το ντόπιγκ αίματος κυρίως σε αθλήματα κάλυψης μεγάλων αποστάσεων, όπως η ποδηλασία και το τρέξιμο. Η κατηγορία των β-ανταγωνιστών και διουρητικών προστέθηκε στη λίστα το 1985, ενώ η ουσία probenecid μαζί με άλλους καλυπτικούς παράγοντες, την πεπτιδική ορμόνη και την ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη (human chorionic gonadotropin, hcg) το Το 1989 η λίστα περιελάμβανε την νέα κατηγορία των πεπτιδικών ορμονών, όπως είναι η αυξητική ορμόνη (growth hormone, GH), και η ερυθροποιητίνη (erythropoietin, EPO) 4,6. Κάθε κατηγορία απαγορευμένων ουσιών μπορεί να επεκταθεί σε σχέση με την αναφερόμενη στη λίστα, με την εισαγωγή ενώσεων παρόμοιας δομής (related compounds). Μια άλλη διάσταση της λίστας της ΔΟΕ αφορά τις κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών υπό συγκεκριμένες συνθήκες, οπότε με αυτό τον τρόπο ετέθησαν περιορισμοί για την απαγόρευση συγκεκριμένων ουσιών σε συγκεκριμένα αθλήματα. Μέχρι το 2003, η ΔΟΕ ήταν υπεύθυνη για την κατάρτιση των κανονισμών ελέγχου φαρμακοδιέγερσης, τη Λίστα Απαγορευμένων Ουσιών, τον έλεγχο ποιότητας και τη διαπίστευση των Εργαστηρίων. Από το 2004, τα καθήκοντα αυτά ανήκουν στον Παγκόσμιο Οργανισμό Καταπολέμησης του Ντόπινγκ 7 (World Anti-Doping Agency, W.A.D.A.) που ιδρύθηκε το Πρόκειται για έναν ανεξάρτητο διεθνή οργανισμό που δημιουργήθηκε με στόχο τον έλεγχο, το συντονισμό και την προώθηση των ενεργειών καταπολέμησης του ντόπινγκ σε παγκόσμιο επίπεδο. Σήμερα, ο αριθμός των διαπιστευμένων από τον WADA, Εργαστηρίων ανέρχεται στα 32. Το Παγκόσμιο Πρόγραμμα Ελέγχου Ντόπινγκ δομείται σε τρία επίπεδα: 1. Παγκόσμιος Κώδικας Αντιντόπινγκ. 2. Διεθνή Πρότυπα (International Standards) 3. Οδηγίες Βέλτιστης Πρακτικής (Model Rules and Guidelines)

35 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Ο Παγκόσμιος Κώδικας Αντιντόπινγκ 8 και τα Διεθνή Πρότυπα 9 (καθορίζουν τις λεπτομέρειες εφαρμογής του Κώδικα) είναι δεσμευτικά και υποχρεωτικά κείμενα. Οι Οδηγίες Βέλτιστης Πρακτικής 10 είναι συνιστώμενες και η εφαρμογή τους προαιρετική. O Παγκόσμιος Κώδικας Αντιντόπινγκ, (WADA Code), παρέχει ουσιαστικά το πλαίσιο εναρμόνισης των πολιτικών, των κανονισμών και των ρυθμίσεων σχετικά με το αντιντόπινγκ εντός των αθλητικών οργανισμών και μεταξύ των δημοσίων φορέων. Όσον αφορά τα Διεθνή Πρότυπα, αυτά είναι τα εξής: ο Κατάλογος Απαγορευμένων ουσιών (Prohibited List), το Διεθνές Πρότυπο για τους Ελέγχους (International Standard for Testing), το Διεθνές Πρότυπο για τα Εργαστήρια (International Standard for Laboratories), το Διεθνές Πρότυπο για τις Εξαιρέσεις Χρήσης για Θεραπευτικούς Σκοπούς (International Standard for TUE) και το Διεθνές Πρότυπο για την Προστασία των Προσωπικών Δεδομένων (International Standard for the Protection of Privacy and Personal Information). O εθνικός φορέας για την καταπολέμηση του ντόπινγκ στην Ελλάδα είναι το Εθνικό Συμβούλιο Καταπολέμησης Ντόπινγκ (Ε.Σ.ΚΑ.Ν), το οποίο συγκροτήθηκε για πρώτη φορά τον Ιούλιο του Ο έλεγχος ντόπινγκ πραγματοποιείται στην Ελλάδα από το διαπιστευμένο Εργαστήριο Ελέγχου της Αθήνας, με έδρα το Ολυμπιακό Αθλητικό Κέντρο Αθηνών. 1.3 Ορισμός του Ντόπινγκ Ο όρος "doping" σηματοδοτούσε αρχικά μείγμα από όπιο και άλλα είδη ναρκωτικών ουσιών για χρήση σε αγώνες ιπποδρόμου. Σήμερα ο όρος αυτός ορίζεται ως η χορήγηση σε αθλητή ή χρήση από αυτόν ενός απαγορευμένου μέσου (ουσίας ή μεθόδου) με σκοπό την τεχνητή (παροδική ή μη) βελτίωση της αγωνιστικής του ικανότητας και απόδοσης κατά τη διάρκεια των αγώνων ή της προπονητικής διαδικασίας 4. Για τον αγγλικό όρο doping που έχει επικρατήσει διεθνώς έχει προταθεί ο ελληνικός όρος φαρμακοδιέγερση, ο οποίος όμως δεν αποδίδει επαρκώς το περιεχόμενο του αγγλικού όρου. Ο όρος αυτός είναι περιοριστικός μιας και το ντόπινγκ δεν επιτυγχάνεται μόνο με φάρμακα και δεν προκαλεί και απαραίτητα διέγερση. Έτσι έχει υιοθετηθεί και στην ελληνική βιβλιογραφία ο ξένος όρος ντόπινγκ

36 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Κώδικα Αντιντόπινγκ 8 (World Anti-Doping Code), ντόπινγκ είναι η παραβίαση ενός ή περισσότερων από τους κανονισμούς των άρθρων του Κώδικα, όπως συνοπτικά αναφέρονται παρακάτω: Παρουσία απαγορευμένης ουσίας ή μεταβολιτών της ή δεικτών σε δείγμα του αθλητή Χρήση ή απόπειρα χρήσης από τον αθλητή απαγορευμένης ουσίας ή απαγορευμένης μεθόδου Άρνηση ή αποτυχία, χωρίς επαρκή δικαιολόγηση, συμμετοχής στη διαδικασία δειγματοληψίας κατόπιν ειδοποίησης, όπως περιγράφεται από τους ισχύοντες κανονισμούς αντιντόπινγκ ή κατά οποιοδήποτε τρόπο αποφυγή της διαδικασίας δειγματοληψίας Παραβίαση των ισχύοντων κανονισμών διαθεσιμότητας του αθλητή για έλεγχο εκτός συναγωνισμού, συμπεριλαμβανόμενων της αποτυχίας υποβολής απαιτούμενων πληροφοριών διαμονής και της μη εμφάνισης του αθλητή για έλεγχο. Οποιοσδήποτε συνδυασμός τριών αποτυχιών υποβολής πληροφοριών διαμονής και/ή μη εμφανίσεων του αθλητή για έλεγχο εντός χρονικής περιόδου δεκαοχτώ μηνών αποτελούν παραβίαση κανονισμών αντιντόπινγκ Αλλοίωση ή απόπειρα αλλοίωσης οποιουδήποτε τμήματος του ελέγχου ντόπινγκ Κατοχή απαγορευμένων ουσιών ή μεθόδων Διακίνηση ή απόπειρα διακίνησης απαγορευμένων ουσιών Χορήγηση ή απόπειρα χορήγησης απαγορευμένης ουσίας εντός ή εκτός συναγωνισμού, ενθάρρυνση ή οποιασδήποτε μορφής συνενοχή σε παραβίαση ή απόπειρα παραβίασης οποιουδήποτε κανονισμού αντιντόπινγκ. Είναι χαρακτηριστικό ότι ο ορισμός αυτός αναφέρεται σε απαγορευμένες κατηγορίες ουσιών και όχι σε συγκεκριμένες ουσίες. Με τον τρόπο αυτό, ο Κώδικας μπορεί να περιλαμβάνει κάθε χρονική στιγμή όλες τις ουσίες που μπορεί να θεωρηθεί ότι αποτελούν αθέμιτο τρόπο βελτίωσης της αθλητικής απόδοσης, ακόμη και αν η ίδια η ύπαρξή τους ή η χρήση τους στον αθλητισμό δεν είναι ακόμη γνωστή Απαγορευμένες ουσίες και μέθοδοι Ο κατάλογος των απαγορευμένων ουσιών αποτελεί απαραίτητο συμπλήρωμα του Κώδικα και σημαντικό παράγοντα εναρμόνισης των διεθνών πρακτικών στον Έλεγχο Ντόπινγκ. Περιλαμβάνει όλες τις κατηγορίες φαρμακευτικών ουσιών και τις μεθόδους

37 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ που απαγορεύονται εντός και εκτός αγώνων. Αναθεωρείται μία φορά το χρόνο από τις Επιτροπές του WADA και η αναθεωρημένη έκδοση τίθεται σε ισχύ την 1 η Ιανουαρίου του αντίστοιχου έτους 11. Η ενσωμάτωση μιας φαρμακευτικής ουσίας σε μια από τις απαγορευμένες ομάδες του καταλόγου κρίνεται, με βάση τη δράση ή τη χημική δομή της, από την επιτροπή εργασίας καταλόγου απαγορευμένων ουσιών του WADA, που αποτελείται από ειδικούς επιστήμονες. Οι απαγορεύσεις που υφίστανται σχετικά με το ντόπινγκ έχουν ως σκοπό αφενός την προάσπιση της ηθικής και των δεοντολογικών κανόνων που επιβάλλουν την ευγενή άμιλλα και τον υγιή συναγωνισμό και αφετέρου την προάσπιση της υγείας τους από τις ανεπιθύμητες επιδράσεις που οι απαγορευμένες ουσίες μπορεί να προκαλέσουν. Η δράση και οι παρενέργειες λήψης απαγορευμένων ουσιών έχουν αποτελέσει αντικείμενο εκτεταμένων βιβλιογραφικών αναφορών Καθώς θεωρήθηκε ιδιαίτερα χρήσιμο να γίνει μια προσπάθεια ομαδοποίησης αυτών τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 1.1. Ακολούθως παρατίθεται στον Πίνακα 1.2, περίληψη του καταλόγου των απαγορευμένων ουσιών και των απαγορευμένων μεθόδων του WADA. Πίνακας 1.1: Δράση και παρενέργειες λήψης απαγορευμένων ουσιών Τύπος φαρμάκου Δράση Παρενέργειες Αναβολικά στεροειδή Χοριακή γοναδοτροπίνη Αυξητική ορμόνη Ερυθροποιητίνη Ινσουλίνη β2-αγωνιστές Προαγωγή σύνθεσης πρωτεϊνών Αύξηση σύνθεσης EPO, αύξηση αιματοκρίτη Αύξηση της μυϊκής μάζας Μείωση χρόνου αποκατάστασης μετά από προπόνηση Ελάττωση αισθήματος κόπωσης Διέγερση παραγωγής ενδογενούς τεστοστερόνης Αύξηση μυϊκής μάζας και μείωση μυϊκού λίπους Μείωση χρόνου αποκατάστασης μετά από προπόνηση Αύξηση μυϊκής δύναμης Αύξηση αριθμού ερυθροκυττάρων Αύξηση της απόδοσης με ελάττωση χρόνου επίδοσης Ως αναβολικό για την αύξηση της μυϊκής μάζας μέσω της σύνθεσης γλυκογόνου, λιπαρών οξέων και πρωτεϊνών Λόγω αναβολικών ιδιοτήτων Μείωση του σωματικού λίπους Άνδρες: ελάττωση ενδογενώς παραγόμενης τεστοστερόνης, ατροφία όρχεων, αζωοσπερμία, στείρωση Γυναίκες: δασυτριχισμός, αλλαγή χροιάς φωνής, ατροφία μήτρας, Γενικά: αύξηση επιθετικότητας και θυμού, βλάβη τοιχωμάτων αγγείων, αύξηση αρτηριακής πιέσεως, ηπατική δυσλειτουργία Κεφαλαλγία, μεταβολές διαθέσεως, κατάθλιψη, οίδημα Ακρομεγαλία, μυοπάθεια, παθήσεις στεφανιαίων, καρδιομυοπάθεια Υπέρταση, καρδιακή ανεπάρκεια, εγκεφαλικά επεισόδια Υπογλυκαιμία, σπασμοί, σοβαρές εγκεφαλικές βλάβες Ταχυκαρδία, πονοκέφαλο, ανωμαλίες καρδιακού ρυθμού

38 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Πίνακας 1.1 (συνέχεια) Ουσίες με αντιοιστρογονική δράση Διουρητικά Καλυπτικοί παράγοντες Διεγερτικά Ναρκωτικά Κορτικοστεροειδή β-αναστολείς Αντιστάθμιση των παρενεργειών από τη χρήση ΑΑΣ: Διακοπή μεταβολικής διαδικασίας των αναβολικών που οδηγεί σε παραγωγή οιστρογόνων Ενεργοποίηση υποθαλάμου προς απελευθέρωση ορμονών που προάγουν την παραγωγή τεστοστερόνης έναντι άλλων ανδρογόνων Ελάττωση σωματικού βάρους, ελάττωση συγκεντρώσεως άλλων απαγορευμένων ουσιών στα ούρα "Κάλυψη" απαγορευμένων ουσιών και μεταβολιτών τους Αύξηση εγρήγορσης, ελάττωση αισθήματος κόπωσης, αύξηση αγωνιστικής διάθεσης και επιθετικότητας Ικανότητα αγωνισμού μετά από τραυματισμό Αίσθημα ευφορίας Ελάττωση καρδιακού ρυθμού Μείωση αγωνιστικού στρες, για αθλήματα που απαιτούν ηρεμία Αφυδάτωση, διαταραχές ηλεκτρολυτών, μυϊκές κράμπες Ταχυκαρδία, αρρυθμίες, αύξηση αρτηριακής πιέσεως, διαταραχές πεπτικού, ανορεξία,αϋπνία, ψυχική και σωματική εξάρτηση, θάνατος Σωματική και ψυχική εξάρτηση, εθισμός Υπόταση, βραδυκαρδία, αίσθημα κόπωσης, μειωμένη αντοχή

39 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Πίνακας 1.2: Κατάλογος απαγορευμένων ουσιών και μεθόδων της WADA Ομάδα Υπο-ομάδα Παραδείγματα Εντός και εκτός αγώνων S1 Αναβολικά στεροειδή 1 Αναβολικά X ανδρογενή στεροειδή (α) εξωγενή Boldenone, clostebol, danazol, methandienone, methyltestosterone, methylstrienolone, stanozolol, tetrahydrogestrinone Απαγορευμένες Εντός αγώνων S2 Πεπτιδικές ορμόνες και σχετικές ουσίες (β) ενδογενή 2 Άλλοι αναβολικοί παράγοντες 1 Παράγοντες που διεγείρουν την ερυθροποίηση 2 Χοριακή γοναδοτροπίνη (HCG) και υποφυσιακές ορμόνες (LH) Testosterone, dehydroepiandrosterone, 19-norandrosterone Clenbuterol, εκλεκτικοί τροποποιητές υποδοχέα ανδρογόνων (SARMs), tibolone, zeranol, zilpaterol EPO, depo Genotrophin 3 Ινσουλίνες Rhinsulin 4 Κορτικοτροπίνες Andrenocorticotrophic hormone (ACTH) 5 Αυξητική ορμόνη (GH), αυξητικοί παράγοντες τύπου ινσουλίνης, μηχανοαυξητικοί παράγοντες κλπ. S3 β2-αγωνιστές Fenoterol, reproterol, brombuterol, bambuterol S4 Ανταγωνιστές και τροποποιητές ορμονών 1 Αναστολείς της αρωματάσης 2 Εκλεκτικοί τροποποιητές υποδοχέων οιστρογόνων (SERMs) 3 Άλλες ουσίες με αντιοιστρογονική δράση Anastrozole, letrozole, exemestane, formestane, testolactone Raloxifene, tamoxifen, toremifene Clomiphene, cyclophenil, fulvestrant X X X

40 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Πίνακας 1.2 (συνέχεια) S5 Διουρητικά και άλλοι καλυπτικοί παράγοντες S6 Διεγερτικά Μη εξειδικευμένα διεγερτικά 4 Παράγοντες που τροποποιούν τις λειτουργίες της μυοστατίνης Myostatin εμποδιστές 1 Καλυπτικοί παράγοντες Diuretics, probenecid, plasma expanders 2 Διουρητικά Acetazolamide, bumetanide, canrenone, furosemide Εξειδικευμένα διεγερτικά Adrafinil, amphetamine, cocaine, modafinil, benfluorex Ephedrine, ethamican, methylephedrine, octopamine, psedoephedrine, sibutramine, strychnine, tuaminoheptane S7 Ναρκωτικά Buprenorphine, fentanyl, X morphine S8 Κανναβινοειδή Marijuana, JWH-018, X S9 Γλυκοκορτικοστεροειδή Betamethasone, X dexamethasone, prednisolone M1 Αύξηση μεταφοράς 1 Ντόπινγκ αίματος Αυτόλογο, ομόλογο ή X οξυγόνου ετερόλογο αίμα 2 Τεχνητή αύξηση της πρόσληψης, μεταφοράς ή απόδοσης οξυγόνου Perfluorocarbons (PFCs), efaproxiral, τροποποιημένοι μεταφορείς οξυγόνου (HBOCs) M2 Φαρμακολογικοί, φυσικοί 1 Παραποίηση X και χημικοί χειρισμοί 2 Ενδομυϊκή έγχυση M3 Γονιδιακό ντόπινγκ Μεταφορά κυττάρων ή DNA, RNA X γενετικών στοιχείων Μεταβολή γονιδιακής έκφρασης GW1516, AICAR P1 Αλκοόλ X P2 β-αναστολείς Acebutolol, atenolol, bisopropol, metoprolol X X X Όπου Si (με i=1-9) οι κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών, Mi (με i=1-3) οι απαγορευμένες μέθοδοι και Pi (με i=1-2) απαγορευμένες ομάδες ουσιών σε συγκεκριμένα αθλήματα

41 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ 1.4 Μεταβολισμός απαγορευμένων ουσιών Η βιομετατροπή των απαγορευμένων ουσιών αποτελεί ένα εκτεταμένο πεδίο μελέτης και αυτό αντανακλάται στην ποικιλία των χημικών αντιδράσεων στις οποίες μπορούν να λάβουν μέρος κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού. Ο μεταβολισμός τους υποδιαιρείται σε δύο φάσεις : τη φάση I, που περιλαμβάνει αντιδράσεις δραστικών ομάδων και φάση II, που περιλαμβάνει αντιδράσεις σύζευξης. Ο διαχωρισμός μεταξύ των δύο φάσεων δίνεται στον Πίνακα 1.3. Κάθε πιθανή χημική αντίδραση της φάσης I, στην οποία μία ένωση συμμετέχει, μπορεί να καταλυθεί από συστήματα μεταβολικών ενζύμων. Στις περισσότερες περιπτώσεις το τελικό προϊόν περιέχει μία χημικά ενεργή δραστική ομάδα όπως -ΟΗ, -ΝΗ 2, -SH, - COOH κ.τ.λ.. Έτσι το προϊόν αυτό είναι χημικά ενεργό για να προχωρήσει στη δεύτερη φάση του μεταβολισμού. Στην πραγματικότητα, ο κύριος σκοπός της φάσης I είναι να προετοιμάσει την ουσία για την φάση II, και όχι για την απέκκρισή της από τον ανθρώπινο οργανισμό. Η φάση II ή σύζευξη περιλαμβάνει μια ποικιλία από ομάδες ενζύμων που δρουν σε διάφορους τύπους ενώσεων. Στη φάση II δημιουργούνται προϊόντα γενικά υδατοδιαλυτά και εύκολα απεκκρινόμενα. Πίνακας 1.3: Αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα στις φάσεις I και II του μεταβολισμού Φάση I Οξείδωση Αναγωγή Υδρόλυση Ενυδάτωση Διθειοακετυλίωση Ισομερίωση Φάση II Γλυκοζυλίωση / γλυκουρονίωση Σουλφονίωση Μεθυλίωση Ακετυλίωση Σύζευξη αμινοξέος Σύζευξη γλουταθειόνης Σύζευξη λιπαρού οξέος Συμπύκνωση 1.5 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών Η ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών πραγματοποιείται στο εργαστήριο ελέγχου ντόπινγκ με τον εξοπλισμό που απαιτείται από τo WADA για την κάλυψη όλων των κατηγοριών απαγορευμένων ουσιών. Ο αναλυτικός εξοπλισμός που χρησιμοποιείται έχει ήδη αναφερθεί 5 και συνοψίζεται παρακάτω: GC/MS, αεριοχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (τετράπολο) για την ανίχνευση διεγερτικών-ναρκωτικών, αναβολικών στεροειδών και διουρητικών

42 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ ουσιών με δυνατότητα παρακολούθησης του συνόλου (Full Scan) ή επιλεγμένων (Selective Ion Monitoring, SIM) ιόντων. GC/HRMS, αεριοχρωματογραφία φασματομετρία μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας για την ανίχνευση αναβολικών στεροειδών και β2-αγωνιστών, σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις, με εκλεκτική παρακολούθηση ιόντων (Selective Ion Recording, SIR). GC/TOFMS, αεριοχρωματογραφία φασματομετρία μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας χρόνου πτήσης ιόντων με δυνατότητα ανίχνευσης διαφορετικών ουσιών, με μέθοδο Full Scan. GC/C/IRMS, αεριοχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών λόγου ισοτόπων, με δυνατότητα διάκρισης μεταξύ ενδογενών και συνθετικών αναβολικών στεροειδών. LC/MS-Ion trap, υγροχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών με παγίδα ιόντων για την ανίχνευση κορτικοστεροειδών ουσιών με μέθοδο SIM. LC/QTOFMS, υγροχρωματογραφία φασματομετρία μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας χρόνου πτήσης ιόντων με δυνατότητα ανίχνευσης διαφορετικών ουσιών με μέθοδο Full Scan. Οι διαφορετικές παρασκευαστικές (συνολικά 4) διαδικασίες που εφαρμόζονται για την ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών έχουν αναφερθεί 5 και συνοψίζονται παρακάτω: Διεγερτικά και ναρκωτικά Διαδικασίες 1 και 2 Η εξέτασή τους περιλαμβάνει συνδυασμό δύο συμπληρωματικών αναλυτικών μεθόδων. Η διαδικασία 1 περιλαμβάνει αεριοχρωματογραφικό διαχωρισμό των μητρικών ενώσεων και των ασύζευκτων μεταβολιτών, ακολουθώντας ένα στάδιο εκχύλισης, σε βασικό περιβάλλον, και ανίχνευση με ανιχνευτή αζώτου-φωσφόρου. Ο προσδιορισμός με τη διαδικασία 2 βασίζεται σε ανάλυση με αεριοχρωματογραφία φασματομετρία μαζών του οργανικού βασικού εκχυλίσματος ούρων, μετά από όξινη ή ενζυμική υδρόλυση των δειγμάτων. Οι εκχυλιζόμενες ουσίες υφίστανται παραγωγοποίηση πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό. Διουρητικά: Διαδικασία 3 Ο προσδιορισμός βασίζεται στην ανάλυση με αεριοχρωματογραφία και ανιχνευτή φασματόμετρο μαζών του οργανικού βασικού εκχυλίσματος ούρων. Οι εκχυλιζόμενες διουρητικές ουσίες υφίστανται μεθυλίωση πριν το χρωματογραφικό διαχωρισμό

43 ΚΕΦ. 1 Εισαγωγή στον έλεγχο ντόπινγκ Αναβολικά στεροειδή και κορτικοστεροειδή: Διαδικασία 4 Ο προσδιορισμός βασίζεται στην ανάλυση με GC/MSD, GC/HRMS και LC/Ion Trap- MS του οργανικού βασικού εκχυλίσματος ούρων, μετά από ενζυμική υδρόλυση των γλυκουρονικών εστέρων των αναβολικών παραγόντων και εκχύλιση των κορτικοστεροειδών. Οι εκχυλιζόμενοι αναβολικοί παράγοντες υφίστανται παραγωγοποίηση πριν τη χρωματογραφική ανάλυση, ενώ τα κορτικοστεροειδή παραλαμβάνονται με ανασύσταση και αναλύονται στη συνέχεια με LC/Ion Trap-MS. 1.6 Ελάχιστο Απαιτούμενο Όριο Απόδοσης/Επίδοσης Για την εναρμόνιση του τρόπου έκδοσης αποτελεσμάτων από τα Εργαστήρια Ελέγχου Ντόπινγκ, ο WADA έχει καθορίσει ελάχιστο απαιτούμενο όριο απόδοσης/επίδοσης 19 για κάθε κατηγορία απαγορευμένων ουσιών. Αυτά τα ελάχιστα απαιτούμενα όρια απόδοσης (Minimum Required Performance Level, MRPL), υποχρεωτικά για όλα τα Εργαστήρια, δεν αποτελούν όρια ανίχνευσης ή ποσοτικοποίησης, αλλά αναλυτικές προδιαγραφές τεχνικής απόδοσης των εργαστηρίων κατά την πραγματοποίηση ελέγχων ρουτίνας και παρουσιάζονται στον παρακάτω πίνακα: Πίνακας 1.4: Ελάχιστο απαιτούμενο όριο απόδοσης/επίδοσης (minimum required performance level, MRPL) 19 Κατηγορία απαγορευμένων Ειδικά παραδείγματα και Συγκέντρωση ουσιών εξαιρέσεις Διεγερτικά s6 500 ng/ml Strychnine 200 ng/ml Ναρκωτικά s7 200 ng/ml Buprenorphine 10 ng/ml Fentanyl (and derivatives) 10 ng/ml Αναβολικοί παράγοντες s1 10 ng/ml Clenbuterol 2 ng/ml Methandienone mt 2 ng/ml Methyltestosterone mt 2 ng/ml Stanozolol mt 2 ng/ml Ορμονικοί ανταγωνιστές και 50 ng/ml τροποποιητές s4 β2-αγωνιστές s3 100 ng/ml β-αναστολείς p2 500 ng/ml Διουρητικά s5 250 ng/ml Γλυκοκορτικοστεροειδή s9 30 ng/ml Πεπτιδικές Ορμόνες, Αυξητικοί παράγοντες και σχετικές ουσίες s2 5 miu/ml mt: metabolite, si με i=1-7, 9: κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών, p2: απαγορευμένη ομάδα σε συγκεκριμένο άθλημα

44

45 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Κεφάλαιο Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών

46 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ 2.1 Σκοπός Οι απαγορευμένες ουσίες που ανιχνεύονται στα βιολογικά υγρά είναι συνήθως μόρια που συχνά περιέχουν μεσαίας πολικότητας ομάδες. Κατά τη διάρκεια της φάσης Ι του ανθρώπινου μεταβολισμού (βλ. υποκεφάλαιο 1.4), ο οποίος λαμβάνει χώρα κυρίως στο ήπαρ αλλά και σε άλλα όργανα, όπως τα νεφρά και οι πνεύμονες, πραγματοποιείται εισαγωγή διαφόρων ομάδων με σκοπό τη μετατροπή των ουσιών σε λιγότερο λιπόφιλα μόρια. Κατά τη διάρκεια της φάσης ΙΙ του μεταβολισμού, διεξάγονται επιπλέον αντιδράσεις σύζευξης με σκοπό τη μετατροπή τους σε πολικά μόρια με υδρόφιλο χαρακτήρα και την απέκκρισή τους στα ούρα. Η γλυκουρονίωση και η σουλφονίωση είναι οι αντιδράσεις σύζευξης του σταδίου αυτού. Η μετατροπή των πολικών αυτών μορίων σε αναλύτες κατάλληλους για ανάλυση με αεριο-χρωματογραφία επιτυγχάνεται με παραγωγοποίηση μετά από την επιλογή, τόσο του κατάλληλου αντιδραστηρίου, όσο και των συνθηκών παραγωγοποίησης (θερμοκρασία, ποσότητα αντιδραστηρίου, διάρκεια επώασης) 20. Κατά την αντίδραση παραγωγοποίησης ο αναλύτης (Α) και το αντιδραστήριο (R) αντιδρούν με σκοπό το σχηματισμό του προϊόντος (Π) σύμφωνα με την (2.1). Α+R Π (2.1) Το σχηματιζόμενο παράγωγο (Π) είναι πιο πτητικό σε σχέση με τον αναλύτη (Α). Σχεδόν πάντα οι μη πτητικές ουσίες υψηλής πολικότητας προσροφώνται στη χρωματογραφική στήλη ή αποσυντίθεται κατά την επαφή τους με αυτή, με αποτέλεσμα να εμφανίζονται ουρές στα χρωματογραφήματα (Σχήμα 2.1). Παρόμοια αποτελέσματα λαμβάνονται και όταν η συγκέντρωση του αναλύτη στο δείγμα είναι υψηλή. Η μετατροπή των πολικών ενώσεων σε λιγότερο πολικές βελτιώνει τη χρωματογραφική συμπεριφορά, ελαχιστοποιώντας την ανεπιθύμητη προσρόφηση των ουσιών στη χρωματογραφική στήλη. Η παραγωγοποιήση επίσης ενδείκνυται σε περιπτώσεις ουσιών που συνεκλούονται (απαραγωγοποίητες) ή σε περιπτώσεις που η απαραγωγοποίητη ουσία εμφανίζει "φτωχό" φάσμα μαζών 20 (Σχήμα 2.2). Η χημική δομή των ουσιών μεταβάλλεται μετά την παραγωγοποίηση, οπότε και τα σχηματιζόμενα θραύσματα τροποποιούνται. Στις περιπτώσεις ταυτοποίησης απαγορευμένων ουσιών απαιτούνται

47 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών τουλάχιστον 3 διαγνωστικά ιόντα με συγκεκριμένη αναλογία για την αξιόπιστη λήψη αποτελεσμάτων. Η αντίδραση παραγωγοποίησης µπορεί να πραγµατοποιηθεί πριν ή κατά τη διάρκεια της ανάλυσης. Η παραγωγοποίηση χρησιµοποιείται σε συνδυασμό με πολλές αναλυτικές, χρωµατογραφικές τεχνικές. Εφαρµόζεται όµως κυρίως στην αεριο- και λιγότερο στην υγρο-χρωµατογραφία. Η ανάγκη για σχηματισμό παραγώγων στην αεριοχρωματογραφία συνοψίζεται στους παρακάτω λόγους 22,23 : Μετατροπή των μη πτητικών ή χαμηλής πτητικότητας ουσιών σε πτητικές Δημιουργία ενός περισσότερο σταθερού προϊόντος (του παραγώγου), άρα βελτίωση της χρωματογραφικής του συμπεριφοράς επομένως και του σχήματος της κορυφής Μείωση της θερμικής αποσύνθεσης, της υπό εξέταση ουσίας στο φασματόμετρο μαζών Σχήμα 2.1: Ιοντικό χρωματογράφημα και φάσμα μαζών της μη παραγωγοποιημένης ουσίας ephedrine

48 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Σχήμα 2.2: Διαφοροποίηση στο φάσμα μαζών μετά από παραγωγοποίηση της ουσίας MDMA (3,4-Methylenedioxymethylamphetamine), όπου (1) το φάσμα της μη παραγωγοποιημένης και (2) της παραγωγοποιημένης ουσίας Σταθεροποίηση των ιόντων που σχηματίζονται στο φασματόμετρο μαζών και τα οποία αποτελούν θραύσματα της εξεταζόμενης ένωσης. Τα θραύσματα αυτά είναι χαρακτηριστικά της ένωσης και σαφώς διαφορετικά από αυτά που λαμβάνονται όταν η ουσία δεν έχει παραγωγοποιηθεί, επομένως αποτελούν σημαντικό στοιχείο για τον προσδιορισμό της δομής της. Τα παραγωγοποιημένα μόρια έχουν διαφορετικό μοριακό βάρος και έτσι αυτή η "μετατόπιση" των χαρακτηριστικών ιόντων προς μεγαλύτερες μάζες οδηγεί σε μείωση των παρεμποδίσεων από τις ενώσεις της μήτρας ή από τις ενώσεις που προκύπτουν από τη χρωματογραφική στήλη (column bleed) Αύξηση της ευαισθησίας και της εκλεκτικότητας της μεθόδου και χρήση αυτής για ποσοτικό προσδιορισμό (quantification) ή απλώς επιβεβαίωση (confirmation), με την εκλεκτική παρακολούθηση ενός ή περισσότερων συγκεκριμένων ιόντων. Σε αυτό το σημείο είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι κατά τη διάρκεια της παραγωγοποίησης μπορεί να πραγματοποιηθούν: ι) Παράπλευρες αντιδράσεις και ιι) Σχηματισμός περισσότερων του ενός παραγώγων, σε μόρια που φέρουν αρκετές δραστικές ομάδες 24. Ο σχηματισμός πολλαπλών παραγώγων οδηγεί σε μείωση της

49 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών ευαισθησίας, ωστόσο δεν αποτελεί σημαντικό πρόβλημα όταν η συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ουσίας είναι αρκετά υψηλή 20. Για να θεωρηθεί επιτυχής η αντίδραση παραγωγοποίησης πρέπει να είναι απλή, γρήγορη και να πραγματοποιείται σε ήπιες συνθήκες. Το σχηματιζόμενο παράγωγο πρέπει να σχηματίζεται με μεγάλη απόδοση και τα αποτελέσματα να είναι αναπαραγώγιμα. Οι σημαντικότερες μέθοδοι παραγωγοποίησης είναι η σιλανοποίηση, η αλκυλίωση και η ακυλίωση. Βιβλιογραφικές αναφορές 25 που αφορούν την παραγωγοποίηση έχουν αναφερθεί για όλες τις κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών, όπως για παράδειγμα τα αναβολικά στεροειδή, τα διεγερτικά-ναρκωτικά, τα κορτικοστεροειδή. Ταυτόχρονη ανίχνευση περισσότερων από μια ομάδων απαγορευμένων ουσιών έχουν αναφερθεί με ακετυλίωση των βασικών ουσιών 26 και με αλκυλίωση (μεθυλο-, αιθυλο-, προπυλο-) των όξινων 27 ουσιών. Ταυτόχρονη ανίχνευση όξινων, ουδέτερων και βασικών ουσιών έχει επίσης αναφερθεί, αλλά όχι για το σύνολο των απαγορευμένων ουσιών 28,29. Αντίθετα, οι εφαρμογές που αφορούν το στάδιο της ενιαίας παραγωγοποίησης σε διαδικασίες σάρωσης είναι περιορισμένες 30. Η αντίδραση παραγωγοποίησης στην περίπτωση ουσιών που φέρουν πολλές ομάδες μπορεί να ολοκληρωθεί σε ένα ή και σε δύο στάδια. Αντίδραση παραγωγοποίησης δύο σταδίων έχει αναφερθεί με σκοπό τη σταδιακή τροποποίηση ή την προστασία των δραστικών ομάδων που υπάρχουν στο μόριο. Για παράδειγμα στην περίπτωση μορίων που φέρουν υδροξυλομάδες και αμινομάδες ή κετονομάδες και αμινομάδες πραγματοποιείται η παραγωγοποίηση με εκλεκτική εισαγωγή των τριμεθυλοσιλυλο- (TMS) ομάδων στις υδροξυλομάδες ή κετονομάδες (MSTFA, BSTFA) και της ακετυλομάδας (TFAA) στην αμινομάδα 29,35. Βιβλιογραφικά έχει αναφερθεί ο σχηματισμός σιλυλο-παραγώνων σε αντίδραση δύο σταδίων για την ανίχνευση 51 απαγορευμένων ουσιών με τη χρήση των αντιδραστηρίων MTBSTFA και MSTFA

50 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών 2.2 Αντιδράσεις παραγωγοποίησης Σιλυλο-παράγωγα Η σιλανοποίηση (silylation) αποτελεί την περισσότερο εύχρηστη αντίδραση 33,37 για τη δημιουργία σταθερών, πτητικών παραγώγων και ανάλυση αυτών με αεριοχρωματογραφία-φασματομετρία μαζών. Τα παράγωγα αυτά σχηματίζονται με την αντικατάσταση του ενεργού H των ομάδων OH, -NH, -SH από την ομάδα του τριαλκυλο-πυριτίου (R3-Si- ). Η γενική αντίδραση σχηματισμού αυτών είναι: R3-Si-X +R'H R3-Si- R' +HX (2.2) Όπου η πιο συνηθισμένη περίπτωση είναι όταν R = CH 3 Με τη σιλανοποίηση τα οξέα µετατρέπονται σε TMS-εστέρες, οι αµίνες σε TMS-αµίδια και οι αλκοόλες σε TMS-αιθέρες. Το πρώτο αντιδραστήριο σιλανοποίησης που παρασκευάστηκε ήταν το Ν,Ο-δις-(τριμεθυλοσιλυλο)-ακεταμίδιο [N,O-bis (trimethylsilyl) acetamide, BSA] το 1963, ενώ ένα από τα πιο σηµαντικά αντιδραστήρια σιλανοποίησης είναι το Ν-μεθυλο-Ν-τριμεθυλοσιλυλο -τριφθοροακεταμίδιο [N-methyl- N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide, MSTFA] 20,22. Η ευκολία παραγωγοποίησης, των διαφόρων χαρακτηριστικών ομάδων για ένα δεδομένο αντιδραστήριο σιλανοποίησης είναι η εξής: Αλκοόλες >Φαινόλες >Καρβοξυλικά Οξέα >Αμίνες >Αμίδια. Λαμβάνοντας υπόψη τη στερεοχημική παρεμπόδιση, για την ευκολία παραγωγοποίησης των αλκοολών ισχύει: Πρωτοταγείς >Δευτεροταγείς >Τριτοταγείς. Τα πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για σιλανοποίηση σε αντίδραση ενός ή δυο σταδίων παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.1. Τα πλεονεκτήματα της σιλανοποίησης είναι τα εξής: Ικανότητα σχηματισμού σιλυλο-παραγώγων σε ένα μεγάλο αριθμό ουσιών Μεγάλος αριθμός των εμπορικά διαθέσιμων αντιδραστηρίων Απλή προετοιμασία Η πιο κοινή πορεία σχηματισμού σιλυλο - παραγώγων είναι ο σχηματισμός TMS παραγώγων τα οποία συνδυάζουν θερμική και χημική σταθερότητα, ενώ παράλληλα είναι πολύ πτητικά. Οι αντιδράσεις σχηματισμού των TMS παραγώγων είναι απλές και εμφανίζουν πολύ καλή αεριοχρωματογραφική συμπεριφορά. Τα παράγωγα αυτά είναι

51 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών ευαίσθητα στην υγρασία, για αυτό και πρέπει να μεταφέρονται σε αεροστεγώς κλεισμένα φιαλίδια (vial) επικαλυμένα με πώματα από Teflon. Τα TMS-αμίδια BSTFA και MSTFA αποτελούν ίσως τα πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για το σχηματισμό TMS παραγώγων 28, Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα συγκεκριμένα αντιδραστήρια, όσο και τα παραπροϊόντα τους, είναι πολύ πτητικές ενώσεις. Το MSTFA µπορεί να χρησιµοποιηθεί ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης όλων των πρωτικών οµάδων και επίσης µπορεί να χρησιµοποιηθεί χωρίς διαλύτη διότι λόγω της υψηλής πολικότητάς του διαλύει εύκολα ακόµη και ισχυρά πολικές οµάδες 41. Το BSTFA εμφανίζει παρόμοια συμπεριφορά με το BSA, αλλά επειδή η ομάδα που προσδένεται είναι το τριφθοροακεταμίδιο θεωρείται ότι παραγωγοποιεί γρηγορότερα και πλέον αποτελεσματικά. Τα παραπροϊόντα που παράγονται κατά την αντίδραση με BSTFA είναι περισσότερο πτητικά σε σχέση με του BSA, οπότε η παρεμπόδιση που προκαλείται στις κορυφές που εμφανίζονται στην αρχή του χρωματογραφήματος είναι σαφώς μικρότερη. Πίνακας 2.1: Αντιδραστήρια σχηματισμού σιλυλο παραγώγων 22,42 Αντιδραστήριο Αγγλική ορολογία Συντομογραφία N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide N,Ο-Bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide MSTFA BSTFA Τριμεθυλο-ιωδοσιλάνιο Trimethyliodosilane TMIS Τριμεθυλοχλωροσιλάνιο Trimethyl chloro silane TMCS Ν, Ο-δις-(τριμεθυλοσιλυλο)- ακεταμίδιο N,O-bis(trimethylsilyl) acetamide BSA Ν-μεθυλο-Ν-(τριμεθυλοσιλυλο) -ακεταμίδιο Ν-μεθυλο-Ν-(τερτ-βουτυλοδιμεθυλοσιλυλο)- τριφθοροακεταμίδιο N-methyl-N-(trimethylsilyl) acetamide N-methyl-(tertbutyldimethylsilyl)- trifluoro acetamide MSA MTBSTFA Τριμεθυλοσιλυλο-ιμιδαζόλιο Trimethylsilyl imidazole TMSIm επταφθοροβουτυραμίδιο Ν-μεθυλο-Ν-(τριμεθυλοσιλυλο)- τριφθοροακεταμίδιο Ν,Ο-δις-(τριμεθυλοσιλυλο)- τριφθοροακεταμίδιο Ν-μεθυλο-Ν-(τριμεθυλοσιλυλο)- N-methyl-N-trimethylsilylheptafluorobutyramide MSHFBA

52 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Η προσθήκη καταλυτών έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά για την επιτάχυνση της αντίδρασης, ιδίως σε περιπτώσεις όπου η παραγωγοποίηση δυσχεραίνεται, όπως για παράδειγμα σε στερεοχημικά παρεμποδισμένες ομάδες. Το TMCS, TMSIm, το TMIS και το οξικό κάλιο είναι οι πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενοι καταλύτες. Το αντιδραστήριο BSTFA με 1% TMCS έχει χρησιμοποιηθεί για την παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών και μεταβολιτών τους. Το TMSIm χρησιμοποιείται για την αντίδραση των υδροξυλομάδων και καρβοξυλομάδων, αλλά δεν παραγωγοποιεί τις αμινομάδες και δεν προάγει το σχηματισμό των enol-tms αιθέρων. Έχει χρησιμοποιηθεί επίσης ως καταλύτης σε συνδυασμό με το MSTFA για την παραγωγοποίηση παρεμποδισμένων ομάδων, όπως οι τριτοταγείς αλκοόλες. Μίγματα που συνδυάζουν διαφορετικά σιλυλο-αντιδραστήρια είναι εμπορικώς διαθέσιμα, όπως το μίγμα BSTFA: TMCS: TMSIm 20. Σε ουσίες που φέρουν ταυτόχρονα κετονομάδες και υδροξυλομάδες 24 έχουν χρησιμοποιηθεί αντιδραστήρια τα οποία δεν ευνοούν τη δημιουργία ενολ-αιθέρων, όπως για παράδειγμα το TMSIm ή προηγείται προστασία των κετονομάδων με τη δημιουργία παραγώγων μεθοξίμης. Το φάσμα μαζών των σχηματιζόμενων TMS αιθέρων με τη μέθοδο ιοντισμού δέσμης ηλεκτρονίων (electron impact, ΕΙ) χαρακτηρίζεται συνήθως από την απουσία ή την παρουσία με ασθενές σήμα του μοριακού ιόντος. Αντίθετα το ιόν [M-15] + το οποίο παράγεται από το μοριακό με απομάκρυνση ενός μεθυλίου βρίσκεται συχνά σε μεγαλύτερη αφθονία. Το ιόν επίσης με m/z 73 που αντιστοιχεί στην ομάδα TMS είναι παρόν στο φάσμα μαζών. Χαρακτηριστικά θραύσματα του φάσματος μαζών για ομάδες απαγορευμένων ουσιών, καθώς και οι σημαντικότερες οδοί θραυσματοποίησης έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά 25,43. Εκτός από τη χρήση αντιδραστηρίων που προάγουν το σχηματισμό παραγώγων TMS, αντιδραστήρια για το σχηματισμό τερτ-βουτυλοδιμεθυλοσιλυλο (Tert Butyldimethylsilyl, TBDMS) παραγώγων έχουν αναφερθεί 24,44. Τα TBDMS παράγωγα είναι σταθερότερα των αντίστοιχων TMS, πιο ανθεκτικά στην υδρόλυση και είναι τα δεύτερα σε σειρά, πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια για ανάλυση GC/MS. Μειονεκτούν στο ότι δεν παραγωγοποιούν εύκολα στερεοχημικώς παρεμποδισμένες ομάδες. Το MTBSTFA έχει χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό

53 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών παραγώγων TBDMS. Χρησιμοποιείται για την παραγωγοποίηση ουσιών που φέρουν - OH, -COOH, καθώς και για την παραγωγοποίηση πρωτοταγών και δευτεροταγών αμινών. Το φάσμα μαζών των ουσιών που φέρουν TBDMS στο μόριό τους χαρακτηρίζεται από την παρουσία του ιόντος [M-57], + με την απομάκρυνση της ομάδας TBDMS Σιλυλο-παράγωγα στον έλεγχο ντόπινγκ Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης που περιλαμβάνουν το σχηματισμό σιλυλοπαραγώγων πλεονεκτούν έναντι άλλων παραγώγων, λόγω μείωσης του συνολικού χρόνου ανάλυσης, καθώς και αύξησης του χρόνου ζωής της στήλης 28,45. Καθώς ως στόχος της παρούσας διατριβής, για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης τέθηκε ο σχηματισμός παραγώγων TMS, πραγματοποιήθηκε βιβλιογραφική αναζήτηση μεθόδων παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών προς αυτή την κατεύθυνση. Ακολούθως, έγινε προσπάθεια ομαδοποίησης των δεδομένων που προέκυψαν, σύμφωνα με τους Πίνακες 2.2 και 2.3. Στους πίνακες αυτούς παρουσιάζονται τα κυριότερα αντιδραστήρια που έχουν χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό σιλυλο- παραγώγων για τις διάφορες κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών ή για μεμονωμένες ουσίες με τη χρήση ενός ή περισσότερων αντιδραστηρίων και με την παρουσία ή μη καταλύτη. Οι κατηγορίες που εξετάστηκαν περιλαμβάνουν τις ομάδες των αναβολικών στεροειδών και των κορτικοστεροειδών (Πίνακας 2.2), καθώς και των διεγερτικών-ναρκωτικών και των β2-αγωνιστών αντίστοιχα (Πίνακας 2.3). Εφαρμογή παραγώγων TMS για την ανίχνευση ενδογενών και συνθετικών κορτικοστεροειδών έχει αναφερθεί με τη χρήση μίγματος BSA/TMSIm/TMCS και BSA/BSTFA παρουσία βασικού καταλύτη. Προσδιορισμός 6 ενδογενών και 17 συνθετικών κορτικοστεροειδών με την εφαρμογή TMS παραγώγων έχει αναφερθεί με εφαρμογή πορείας παραγωγοποίησης 2 σταδίων και με συνδυασμό άμεσης θέρμανσης και χρήσης θαλάμου μικροκυμάτων (MW)

54 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Πίνακας 2.2: Συνοπτική παρουσίαση σιλυλο-αντιδραστηρίων για την παραγωγοποίηση αναβολικών στεροειδών και κορτικοστεροειδών ουσιών Προσδιοριζόμενη ομάδα Συνθήκες παραγωγοποίησης Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/DTE 46 Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/EtSH 1000/2/3, στους 80 0 C για 30 min νορ- αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/PrSH 1000/5/2, στους 55 0 C για 30 min 47 Αναβολικά στεροειδή MSTFA+NH 4 I+αναγωγικό μέσο (DTE, EtSH, 2-mercaptoethanol) 20 Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/ DTE 1000/2/4, στους 65 0 C για 30 min 48 Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/ DTE 1000/2/4, στους 60 0 C για 15 min 49 Αναβολικά στεροειδή BSA-MSTFA/I 2 20/0,5, στους 60 0 C για 30 min 38 Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/EtSH 1000/2/6, στους 60 0 C για 30 min 50 Αναβολικά στεροειδή MSTFA/NH 4 I/2-mercaptoethanol 1000/2/6, στους 80 0 C για 60 min 51 Σάρωση απαγορευμένων ουσιών MSTFA/NH 4 I/EtSH 30 Αναβολικά στεροειδή και άλλες ουσίες MSTFA/NH 4 I/ DTE 1000/2/4 52 Κορτικοστεροειδή MSTFA/NH 4 I/ DTE 1000/2/4 60 min σε MW και TMSIm/BSA/TMCS 3/3/2 στους 70 0 C για 90 min 37 Παραγωγοποίηση όλων των ναρκωτικών ουσιών που αναφέρονται στη λίστα του WADA μαζί με ουσίες που ανήκουν στην ομάδα των διεγερτικών, καθώς και τις ουσίες formoterol και bambuterol που ανήκουν στην ομάδα των β2-αγωνιστών πραγματοποιήθηκε σε ούρα αθλητών με MSTFA στους 80 0 C για 10 min 57. Άλλες εφαρμογές παραγώγων TMS κυρίως σε ναρκωτικές ουσίες περιλαμβάνουν παραγωγοποίηση με BSTFA ή MSTFA με ή χωρίς προσθήκη καταλύτη 49,56,61. Επιπλέον τα αντιδραστήρια BSTFA και MTBSTFA έχουν χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό σιλυλο-παραγώγων των κανναβινοειδών. Η χρήση του MTBSTFA οδηγεί στο σχηματισμό ιδιαιτέρως σταθερών παραγώγων για πάνω από 10 ημέρες

55 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Πίνακας 2.3: Συνοπτική παρουσίαση σιλυλο-αντιδραστηρίων για την παραγωγοποίηση διεγερτικών-ναρκωτικών ουσιών και β2-αγωνιστών Προσδιοριζόμενη ομάδα Συνθήκες παραγωγοποίησης Ηρωίνη και μεταβολίτες της BSTFA+1%TMCS, στους 70 0 C για 20 min 20 Κοκαΐνη και μεταβολίτες της BSTFA+1%TMCS 20 Κοκαΐνη, ηρωίνη και μεταβολίτες (ούρα) BSTFA+1%TMCS, στους C για 30 min 54 Κοκαΐνη, ηρωίνη και μεταβολίτες BSTFA+1%TMCS, στους 60 0 C για 30 min 55 (μαλλιά) Διεγερτικά, ναρκωτικά και μεταβολίτες MSTFA +1%TMCS, στους 70 0 C για 20 min 56 της κοκαΐνης Διεγερτικά-ναρκωτικά MSTFA, στους 80 0 C για 10 min 57 Διεγερτικά-ναρκωτικά (51 ουσίες) MTBSTFA, στους 80 0 C για 30 min και MSTFA 36 Αμφεταμίνες MTBSTFA 20 Μορφίνη MSTFA+1% TMIS, στους 70 0 C για 20 min 58 β2-αγωνιστές MSTFA MSTFA+2%TMSIm MSTFA +1%TMCS MSTFA/NH 4 I/2-mercaptoethanol β2-αγωνιστές MSTFA, στους 60 0 C για 20 min Παραγωγοποίηση των β2-αγωνιστών και β-ανταγωνιστών με MSTFA έχει εφαρμοστεί σε μεθόδους σάρωσης 60,62. Το BSTFA έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την παραγωγοποίηση των αμινομάδων 55 με τις πρωτοταγείς να παραγωγοποιούνται πιο εύκολα σε σχέση με τις δευτεροταγείς. Το TMCS έχει χρησιμοποιηθεί ως καταλύτης σε αυτές τις αντιδράσεις. Στα μόρια που φέρουν πρωτοταγή αμινομάδα μπορεί να σχηματιστεί το μονο-tms παράγωγο ή το δις- TMS ή συνδυασμός και των δύο. Τα TMS παράγωγα των αναβολικών στεροειδών 46,49 σχηματίζονται με το μείγμα MSTFA με ιωδιούχο αμμώνιο (ammonium iodide, NH 4 I) και αιθανοθειόλη

56 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών (ethanethiol, EtSH) προς σχηματισμό του δραστικού TMIS (όξύ κατά Lewis) που σχηματίζεται in situ 20 με την αντίδραση του NH 4 I με το MSTFA (Σχήμα 2.3). Σχήμα 2.3: Αντίδραση παραγωγοποίησης των αναβολικών στεροειδών H αιθανοθειόλη χρησιμοποιείται ως αναγωγικό μέσο με σκοπό να ελαχιστοποιήσει το σχηματισμό του I 2, με την παραγωγή HI. Παρουσία της EtSH ως αναγωγικού μέσου συχνά έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό διαιθυλοδισουλφιδίου [diethyl disulfide, (EtS) 2 ] κατά τη διάρκεια της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Η παρουσία του (EtS) 2 μπορεί με τη σειρά της να οδηγήσει στη δημιουργία μη αναμενόμενου προϊόντος (artifact). Ο υποθετικός μηχανισμός δράσης 63 του (EtS) 2 με τους σχηματιζόμενους TMS ενολ-αιθέρες των 17-κετο στεροειδών παρουσιάζεται στο Σχήμα 2.4. Σχήμα 2.4: Υποθετικός μηχανισμός δράσης του (EtS) 2 με τα 17-κετο-στεροειδή Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιείται παραγωγοποίηση των 17-κετο στεροειδών 63 προς σχηματισμό TMS ενολ-αιθέρα. Στο δεύτερο στάδιο το TMS απομακρύνεται από το (EtS) 2, με ταυτόχρονη σύνδεση του (EtS) 2, με τον C16. Στο τρίτο στάδιο η 17 κετο ομάδα μετατρέπεται σε σιλυλοπαράγωγο από το in situ παραγόμενο TMIS

57 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Ο σχηματισμός του (EtS) 2 εξαρτάται από την ποσότητα του NH 4 I και του EtSH που προστίθενται μέσω του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, καθώς και από τις συνθήκες της παραγωγοποίησης, όπως η διάρκεια και η θερμοκρασία επώασης. Συνήθως το μίγμα MSTFA/NH 4 I/ EtSH χρησιμοποιείται σε αναλογία 1000:2:3 (v/w/v). Έλεγχος της επιτυχούς παραγωγοποίησης των αναβολικών στεροειδών επιτυγχάνεται με τον έλεγχο της παραγωγοποίησης των ενδογενών ουσιών androsterone και etiocholanolone που βρίσκονται σε όλα τα βιολογικά δείγματα 20. Παρακολούθηση των ιόντων με m/z 434 και m/z 272 αντιστοιχούν στο δις- και μονο-παράγωγο, αντίστοιχα. Η αντίδραση θεωρείται επιτυχής όταν το μονο- TMS παράγωγο απουσιάζει ή είναι παρόν σε πολύ μικρή αναλογία σε σχέση με το δις- TMS. Ιόντα χαρακτηριστικά των φασμάτων των αναβολικών στεροειδών είναι το m/z 90 (απομάκρυνση της TMS-OH), καθώς και τα ιόντα m/z 73 (TMS) και m/z 147 (2TMS) τα οποία όμως δεν είναι διαγνωστικά. Εκτός από την EtSH, η διθειοερυθριτόλη (dithioerythritol, DTE) 64, η 2- μερκαπτοαιθανόλη 38 (2-mercaptoethanol) και η προπανοθειόλη (propanethiol, PrSH) έχουν επίσης χρησιμοποιηθεί ως αναγωγικά μέσα 45. Το μίγμα MSTFA/NH 4 I/ DTE για την παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από τον Donike το Σήμερα η DTE αντικαθίσταται από την EtSH και την PrSH 42 προκειμένου να αποφευχθεί η παρεμποδιστική δράση της πρώτης στη χρωματογραφία καθώς και η ανάγκη για συχνή αντικατάσταση της χρωματογραφικής στήλης. Το MSTFA 20,22 όπως αναφέρθηκε αποτελεί το πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο παρά το γεγονός ότι σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως για παράδειγμα σε μόρια που φέρουν τριτοταγείς αλκοόλες, απαιτείται χρήση και άλλου αντιδραστηρίου. Λαμβάνοντας υπόψη τη δομή των αναβολικών στεροειδών (Σχήμα 2.5) με την παρουσία ομάδας τριτοταγούς αλκοόλης στη θέση 17 εξηγείται η ανάγκη παρουσίας καταλύτη για την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Πολλές επίσης ουσίες από την ομάδα των αναβολικών φέρουν καρβοξυλική ομάδα στο μόριό τους

58 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Σχήμα 2.5: Χαρακτηριστική δομή των αναβολικών στεροειδών Παραγωγοποίηση 36 απαγορευμένων ουσιών (30 αναβολικά στεροειδή, 4 ναρκωτικά, 1 διουρητικό και 1 διεγερτικό) με σχηματισμό παραγώγων TMS έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά 52. Σχηματισμός παραγώγων TMS για τον προσδιορισμό 150 ουσιών αναφέρθηκε πρόσφατα 30 με χρήση του αντιδραστηρίου MSTFA/NH 4 I/EtSH και επώαση στους 80 0 C για 60 min Άλλες κατηγορίες παραγώγων I) Αλκυλίωση 22 Στις αντιδράσεις αλκυλίωσης πραγματοποιείται αντικατάσταση του ενεργού Η των ομάδων R-COOH, R-OH, R-NH-R, R-NH 2 με κάποιο αλκύλιο μέσω του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης. Η αλκυλίωση των -ΟΗ (περιλαµβανοµένου και αυτού της -CΟΟΗ), -SH, -ΝΗ (περιλαµβανοµένης και αυτής της -CΟΝΗ) οδηγεί σε λιγότερο πολικά παράγωγα µε αντικατάσταση του ενεργού τους υδρογόνου. Η αντίδραση αλκυλίωσης οδηγεί σε αιθέρες, εστέρες, θειεστέρες, αλκυλαµίνες και αλκυλαµίδια. Τα αντιδραστήρια αλκυλίωσης είναι κυρίως αλκυλοβρωµίδια ή ιωδίδια (π.χ. µεθυλοϊωδίδιο). Η αντίδραση πραγµατοποιείται παρουσία βάσης. Η αλκυλίωση ασθενώς όξινων οµάδων απαιτεί ισχυρό βασικό καταλύτη. Περισσότερο όξινες οµάδες (-ΟΗ) που περιέχονται στις φαινόλες και τα καρβοξυλικά οξέα απαιτούν λιγότερο ισχυρούς βασικούς καταλύτες. Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της αλκυλίωσης αφορά τους υδρογονάνθρακες με το σχηματισμό μεθυλο-παραγώγων τα οποία αποδεικνύονται ιδιαιτέρως χρήσιμα σε κάποιες εφαρμογές λόγω της μικρής αύξησης του μοριακού βάρους του

59 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών προσδιοριζόμενου μορίου. Αυτό είναι ιδιαίτερα χρήσιμο στην περίπτωση μορίων με πολλές δραστικές ομάδες. Επιπλέον οι σχηματιζόμενοι αλκυλο εστέρες εμφανίζουν εξαιρετική σταθερότητα για μεγάλο χρονικό διάστημα. Η αλκυλίωση έχει χρησιμοποιηθεί σε αντίδραση δυο σταδίων, με σκοπό προστασία συγκεκριμένων ομάδων. II) Ακυλίωση 22 Τα παράγωγα αυτά εμφανίζουν το πλεονέκτημα ότι είναι σχετικά σταθερά, ενώ παράλληλα μπορεί να χρησιμοποιηθεί μια μεγάλη ποικιλία αντιδραστηρίων. Ως μειονέκτημα θεωρείται η υψηλή τοξικότητα των αντιδραστηρίων αυτών. Η ακυλίωση είναι µια απλή συνήθης τεχνική παραγωγοποίησης των πολικών οµάδων ΟΗ, ΝΗ, SH προς σχηματισμό εστέρων, θειοεστέρων και αμιδίων. Τα ακυλο-παράγωγα σχηµατίζονται µε ακυλο-ανυδρίτες, ακυλο-αλογονίδια, ενεργά ακυλο-αµίδια, ανυδρίτες οξέων κ.α. με προσθήκη ομάδων αλογόνου στην προσδιοριζόμενη ουσία. Τα ακυλοαλογονίδια και οι ανυδρίτες οξέων σχηματίζουν και όξινα παραπροϊόντα, τα οποία πρέπει να αποµακρύνονται πριν την αεριο-χρωµατογραφική ανάλυση, διότι καταστρέφουν την στήλη. Οι ακυλιώσεις συνήθως πραγµατοποιούνται παρουσία πυριδίνης ή τετραϋδροφουρανίου. Οι αµίνες µπορούν να δράσουν ως καταλύτες στις αντιδράσεις ακυλίωσης. Ακυλο-αλογονίδια, όπως το τριφθοροακετυλο- και το επταφθοροβουτυρυλο- (heptafluorobutyryl) μπορούν να χρησιμοποιηθούν με σκοπό την μετατόπιση του χρόνου ανάσχεσης των προσδιοριζόμενων μορίων. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται σε αντιδράσεις ακετυλίωσης είναι τα εξής 66 : Φθοριομένοι ανυδρίτες όπως ο τριφθοροοξικός (trifluoroacetic anhydride-tfaa), ο πενταφθοροπροπιονικός (Pentafluoropropionic-PFPA), ο επταφθοροβουτυρικός (heptafluorobutyric-hfba) ανυδρίτης Φθοροακυλοϊμιδαζόλια όπως το τριφθορο-ακετυλοϊμιδαζόλιο (TFAI- Trifluoroacetylimidazole), το πενταφθορο-προπανυλοϊμιδαζολιο (PFPI- Pentafluoropropanylimidazole) και το επτα-φθοροβουτυροϊμιδαζόλιο (HFBI- Heptafluorobutyrylimidazole) Ν-μεθυλο-δις(τριφθοροακεταμίδιο), (MBTFA-N-Methyl-bis (trifluoroacetamide).το αντιδραστήριο αυτό χρησιμοποιείται κυρίως σε πρωτοταγείς και δευτεροταγείς αμινομάδες και λιγότερο σε υδροξυλομάδες. Εμφανίζει το πλεονέκτημα ότι δεν σχηματίζει όξινα παραπροϊόντα

60 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Τα παραπάνω αντιδραστήρια εμφανίζουν το πλεονέκτημα ότι τα σχηματιζόμενα παράγωγα είναι σταθερά, ενώ μειονεκτούν στο ότι τα ίδια τα αντιδραστήρια είναι ευαίσθητα στην υγρασία. Τα αντιδραστήρια αυτά σχηματίζουν όξινα παραπροϊόντα, ενώ θεωρούνται ιδιαίτερα τοξικά και οσμηρά. Η ακετυλίωση χρησιμοποιείται ευρέως ως αντίδραση παραγωγοποίησης στη χρωματογραφία και μάλιστα αποτελεί εναλλακτικό τρόπο παραγωγοποίησης αντί της σιλανοποίησης όταν οδηγεί στη δημιουργία περισσότερο σταθερών προϊόντων, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση πρωτοταγών αμινών. Η γενική αντίδράση ακετυλίωσης είναι η 2.3: O = R-C-X + RY-H O R-C-RY + H X = (2.3) Άλλες κατηγορίες παραγώγων στον έλεγχο ντόπινγκ Πίνακας 2.4: Συνοπτική παρουσίαση άλλων κατηγοριών παραγώγων στον έλεγχο ντόπινγκ Προσδιοριζόμενη ομάδα Διεγερτικά-ναρκωτικά-β2 αγωνιστές Αντιδραστήρια παραγωγοποίησης Αμίνες TFAA 20 Εφεδρίνη, ψευδο-εφεδρίνη, μεθυλεφεδρίνη TFAA, στους 70 0 C για 20 min 67 Ναρκωτικές ουσίες TFAA, στους 50 0 C για 30 min 65 Αμφεταμίνη-εφεδρίνες κυκλοεξάνιο υπό θέρμανση 68 Διεγερτικά-ναρκωτικά-β2αγωνιστές, MSTFA- MBTFA 69 Διεγερτικά-ναρκωτικά MSTFA- MBTFA 69 Διεγερτικά τύπου αμφεταμίνης HFBA 70 Κωδείνη, μορφίνη Methoxime-BSTFA 71 Ναρκωτικές ουσίες Μethoxime-propionic anhydride 72 β2 αγωνιστές MSTFA-TMSIm/MBTFA 59 Όξινες-ουδέτερες-βασικές ουσίες MSTFA-TMCS/MBTFA 61 Διουρητικά Διουρητικές ουσίες Μεθυλίωση κατά την εκχύλιση, CHCl 3 σε ακετόνη 27 Διουρητικές ουσίες Μεθυλο-παράγωγα, CH 3 I/ακετόνη/K 2 CO 3 73 Κορτικοστεροειδή Kορτικοστεροειδή Methoxime-TMS or acetylation

61 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Μετά από βιβλιογραφική αναζήτηση άλλων αντιδράσεων που έχουν εφαρμοστεί για την παραγωγοποίηση συγκεκριμένων απαγορευμένων ουσιών ή και ομάδων απαγορευμένων ουσιών πραγματοποιήθηκε ταξινόμηση των αποτελεσμάτων σύμφωνα με τον Πίνακα 2.4. Για τα διεγερτικά ναρκωτικά ακετυλίωση των αμινομάδων με οξικό ανυδρίτη παρουσία πυριδίνης έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά 26,27,36,69. Ακετυλίωση διεγερτικών ουσιών τύπου αμφεταμίνης έχει αναφερθεί με χρήση HFBA 30 ή άλλων αντιδραστηρίων 35. Παραγωγοποίηση με MSTFA/MBTFA 49 έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για ουσίες που φέρουν υδροξυλομάδα και αμινομάδα στο μόριό τους (Σχήμα 2.6). OH OTMS H TFA N N MSTFA/MBTFA Σχήμα 2.6: Παραγωγοποίηση της ephedrine και σχηματισμός του OTMS, NTFA παραγώγου Διάφορες αντιδράσεις παραγωγοποίησης έχουν χρησιμοποιηθεί για τους β2-αγωνιστές σε βιολογικά υγρά: TMS παράγωγα, ακετυλο -παράγωγα 75 ή και συνδυασμός αυτών, καθώς και σχηματισμός κυκλικών παραγώγων έχει προταθεί για τα μόρια που ανήκουν στην κατηγορία αυτή. Σύγκριση των TMS παραγώγων με διαφορετικά αντιδραστήρια, καθώς και η προσθήκη καταλύτη έχει αναφερθεί. Η απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης εξαρτάται από τη στερεοχημική παρεμπόδιση η οποία οφείλεται στους διαφορετικούς υποκαταστάτες που συνδέονται με το άτομο του αζώτου της β- φαινυλο-β-αιθανολαμίνης η οποία είναι κοινή ομάδα σε όλα τα μόρια. Οι υποκαταστάτες αυτοί διαφέρουν από μόριο σε μόριο επιτρέποντας το σχηματισμό Ν- TMS παραγώγων για τις ουσίες, όπου το Ν συνδέεται με πρωτοταγές άτομο C. Στην περίπτωση ύπαρξης δευτεροταγούς ατόμου C συνδεδεμένου με το Ν απαιτείται παρουσία καταλύτη, ενώ στην περίπτωση τριτοταγούς ατόμου δεν ευνοείται ο σχηματισμός ούτε με την προσθήκη καταλύτη, αλλά ούτε και με την αύξηση της θερμοκρασίας της αντίδρασης παραγωγοποίησης

62 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Η παραγωγοποίηση των διουρητικών ουσιών 33,50,73,76 πραγματοποιείται κυρίως με σχηματισμό μεθυλο-παραγώγων μέσω 3 διαφορετικών πορειών: μεθυλίωση κατά τη διάρκεια της εκχύλισης (extractive-methylation), πυρολυτική μεθυλίωση και μεθυλίωση με μεθυλοϊωδίδιο σε ακετόνη. Τα ίδια παράγωγα (μεθυλο) προκύπτουν και από τις τρεις παραπάνω πορείες με εξαίρεση την πυρολιτική μεθυλίωση, όπου για τις ουσίες bumetanide και furosemide σχηματίζονται τα τετραμεθυλοπαράγωγα και όχι τα τριμέθυλο που σχηματίζονται συνήθως. Σύγκριση των παραπάνω πορειών για την ανάλυση διουρητικών ουσιών σε δείγματα ούρων αποδεικνύει ότι μεθυλίωση με μεθυλοϊωδίδιο (Σχήμα 2.7) σε ακετόνη είναι η πλέον αποτελεσματική αντίδραση σε μεθόδους σάρωσης αφού παραγωγοποιεί ένα μεγάλο αριθμό ουσιών 76. Ανάλυση απαραγωγοποίητων διουρητικών ουσιών με GC/MS δεν έχει αναφερθεί λόγω της πολικότητας που εμφανίζουν οι ενώσεις αυτές. HOOC O S O NH 2 H 3 COOC O S N O NH O acetone/methyl-iodide potassium carbonate NH O H 3 C H 3 C Σχήμα 2.7: Αντίδραση σχηματισμού τριμεθυλο-παραγώγου της διουρητικής ουσίας bumetanide Τα προβλήματα που προκύπτουν μετά την εφαρμογή της μεθυλίωσης κατά τη διάρκεια της εκχύλισης, όπως η δυσκολία σχηματισμού μεθυλο-παραγώγων για κάποιες από τις ουσίες, καθώς και η υψηλή τοξικότητα του μεθυλοϊωδίου το οποίο χρησιμοποιείται, παρακάμπτονται με ανάλυση με LC-MS χωρίς την ανάγκη σχηματισμού παραγώγων 48. Η ανίχνευση των κορτικοστεροειδών με GC/MS εμφανίζει δυσκολίες, αφού οι ουσίες αυτές είναι θερμικά ασταθείς με χαμηλή πτητικότητα. Παραγωγοποίηση με συνδυασμό παραγώγων μεθοξίμης-tms αιθέρων έχει εφαρμοστεί ευρέως. Ακετυλίωση των παραπάνω ουσιών έχει αναφερθεί, αλλά με μη ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ανίχνευση αυτών στο MRPL. Το πρόβλημα αυτό αντιμετωπίζεται με την ανάλυση με LC-MS, όπου οι εξεταζόμενες ουσίες ανιχνεύονται απαραγωγοποίητες

63 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών Σε ουσίες όπως τα αναβολικά στεροειδή που φέρουν πολλαπλές δραστικές ομάδες, όπως για παράδειγμα υδροξυλικές και καρβονυλικές ομάδες μπορεί να πραγματοποιηθεί προστασία της καρβονυλικής ομάδας με σχηματισμό παραγώγου αλκυλοξίμης (συνήθως μεθυλοξίμης) και κατόπιν σχηματισμός TMS παραγώγων για τις υδροξυλομάδες. Εφαρμογή των ακυλο-παραγώγων είναι ενδιαφέρουσα για συγκεκριμένα αναβολικά στεροειδή και μεταβολίτες τους, όπως το stanozolol. Για τις ουσίες αυτές που φέρουν πυραζολικό δακτύλιο ο σχηματισμός τρι-, πεντα-, ή επταφθορο-αμιδίων σε συνδυασμό με τα σιλυλο-παράγωγα των υδροξυλομάδων οδηγεί σε σταθερά παράγωγα. 2.3 Παράγοντες που επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης Η αποτελεσματικότητα της αντίδρασης παραγωγοποίησης εξαρτάται από έναν αριθμό παραμέτρων συμπεριλαμβανομένων των συνθηκών παραγωγοποίησης, όπως το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης, τη θερμοκρασία, το χρόνο 77,78, καθώς και από παράγοντες που βελτιώνουν την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης παραγωγοποίησης, όπως η προσθήκη καταλύτη ή διαλύτη. Η εφαρμογή εκλεκτικής αντίδρασης παραγωγοποίησης ελαχιστοποιεί τη δημιουργία artifacts και ανεπιθύμητων προϊόντων 63. Βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης 32,41,51,53,79,80 περιλαμβάνει τη μελέτη των παραπάνω παραμέτρων με στόχο την αποφυγή ανεπιθύμητων αντιδράσεων 63 και την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης 77,81. Επιπλέον έχουν γίνει αρκετές αναφορές που σχετίζονται με τη βελτίωση της απόδοσης της αντίδρασης παραγωγοποίησης, είτε με την προσθήκη διαλύτη 66,82, είτε με εναλλακτικές μεθόδους θέρμανσης, όπως θάλαμο μικροκυμάτων (MW) 83,84. Η χρήση του θαλάμου μικροκυμάτων δημιουργεί συνθήκες παραγωγοποίησης ανάλογες με τις συμβατικές μεθόδους, αλλά σε πολύ μικρότερο χρονικό διάστημα 19,81, όπως για παράδειγμα στον προσδιορισμό διουρητικών ουσιών όπου από 3 ώρες που απαιτούνται με τη συμβατική θέρμανση, η παραγωγοποίηση ολοκληρώνεται σε 10 min με την εφαρμογή MW 73. Η συγκέντρωση επίσης του χρησιμοποιούμενου αντιδραστηρίου αποτελεί ένα πολύ σημαντικό παράγοντα. Το χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο προστίθεται συνήθως σε περίσσεια για την αποφυγή της μερικής παραγωγοποίησης του μορίου, η οποία μπορεί να οδηγήσει στην εμφάνιση πολλαπλών κορυφών στο λαμβανόμενο

64 ΚΕΦ. 2 Παραγωγοποίηση απαγορευμένων ουσιών χρωματογράφημα 20. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα μπορεί να προκύψουν όταν κάποια παρεμποδίζουσα ουσία από τη μήτρα του δείγματος "ανταγωνίζεται" την υπό προσδιορισμό ουσία για το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης. Αυτός είναι ένας σημαντικός λόγος όπου το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης προστίθεται σε περίσσεια. Όπως αναφέρθηκε στο εδάφιο η προσθήκη καταλυτών πραγματοποιείται με σκοπό την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης, ιδίως σε περιπτώσεις όπου η παραγωγοποίηση δυσχεραίνεται, όπως για παράδειγμα σε στερεοχημικώς παρεμποδισμένες ομάδες. Ένας άλλος παράγοντας που αυξάνει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης παραγωγοποίησης είναι η προσθήκη διαλύτη. Χρησιμοποιούμενοι διαλύτες για το σχηματισμό TMS ή TBDMS παραγώγων έχουν αναφερθεί 22,31,69,85, όπως ο οξικός αιθυλεστέρας, το ακετονιτρίλιο, η πυριδίνη και το διμεθυλοφορμαμίδιο. Οι διαλύτες αυτοί χρησιμοποιούνται μαζί με το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης με σκοπό την πραγματοποίηση της αντίδρασης, καθώς και την προστασία των προϊόντων από την υδρόλυση, λόγω έκθεσης στην υγρασία

65 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Κεφάλαιο Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών

66 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ H ανάλυση βιολογικών δειγμάτων για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών απαιτεί κατάλληλες διαδικασίες σάρωσης. Η εφαρμοζόμενη μέθοδος σάρωσης θα πρέπει να μπορεί να εφαρμοστεί για την ανίχνευση ενός μεγάλου αριθμού ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες. Η προκατεργασία των βιολογικών δειγμάτων είναι απαραίτητο στάδιο με σκοπό την εκχύλιση, την απομόνωση και την προσυγκέντρωση των υπό προσδιορισμό ουσιών. Η αναλυτική διαδικασία περιλαμβάνει τα εξής στάδια: δειγματοληψία, προετοιμασία του δείγματος, ανίχνευση και επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Ένα πολύ σημαντικό ποσοστό, της τάξεως του 80% του συνολικού χρόνου, απαιτείται για την ολοκλήρωση των σταδίων της δειγματοληψίας και της προετοιμασίας των δειγμάτων 86. Επομένως είναι φανερό, ότι η επιλογή της κατάλληλης μεθόδου προετοιμασίας των δειγμάτων μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την ταχύτητα της ανάλυσης. 3.1 Υγρό-υγρό εκχύλιση και εκχύλιση στερεάς φάσης Οι μέθοδοι εκχύλισης που χρησιμοποιούνται σε διαδικασίες σάρωσης περιλαμβάνουν μεγάλο αριθμό αναλυτών με υδρόφιλο ή υδρόφοβο χαρακτήρα, με βασικές, όξινες ή ουδέτερες ιδιότητες. Η ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών πραγματοποιείται σε ένα μεγάλο βαθμό σε δείγματα ούρων αθλητών. Τα ούρα αποτελούν το βιολογικό υγρό επιλογής σε μεθόδους σάρωσης για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών, μια και η συγκέντρωσή τους στα ούρα είναι υψηλότερη σε σχέση με άλλα βιολογικά υλικά 87. Εκτός από ούρα, πρόσθετα βιολογικά υλικά όπως πλάσμα, μαλλιά, σάλιο έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών στον έλεγχο ντόπινγκ και στην ιατροδικαστική τοξικολογία Η προτεινόμενη μέθοδος εκχύλισης σε διαδικασίες σάρωσης πρέπει να είναι ταχεία, επαναλήψιμη και να έχει ως αποτέλεσμα κλάσματα απαλλαγμένα, σε ένα σημαντικό ποσοστό, από τις παρεμποδίζουσες ουσίες της μήτρας. Η εκχύλιση στερεάς φάσης (Solid phase extraction, SPE) και η υγρό υγρό εκχύλιση (Liquid-Liquid extraction, LLE) έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως ως μέθοδοι εκχύλισης βιολογικών δειγμάτων στον έλεγχο ντόπινγκ. Παρόλο που τόσο η SPE, όσο και η LLE περιλαμβάνουν χρονοβόρα και επίπονα στάδια (εξάτμιση, ανασύσταση) εξακολουθούν να αποτελούν τις βασικές

67 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών διαδικασίες επιλογής προετοιμασίας βιολογικών δειγμάτων για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών. Στην LLE που αποτελεί την παραδοσιακή μέθοδο εκχύλισης, πραγματοποιείται παραλαβή των αναλυτών από το εξεταζόμενο δείγμα με κατάλληλο οργανικό διαλύτη σε κατάλληλο ph. Ο διαλύτης πρέπει να μην αναμιγνύεται με το δείγμα και να μην αντιδρά με τους αναλύτες. Οι ουσίες κατανέμονται μεταξύ οργανικού διαλύτη και δείγματος σε συγκεκριμένη αναλογία που εξαρτάται από το διαλύτη εκχύλισης, το ph, την αναλογία οργανικού διαλύτη-δείγματος. Λεπτομερής αναφορά των παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση της LLE έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά 86. Η LLE έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την προετοιμασία βιολογικών δειγμάτων ούρων και αίματος 100 στον έλεγχο ντόπινγκ, ενώ ευρεία είναι και η εφαρμογή της στην ιατροδικαστική τοξικολογία 101. Το γεγονός ότι η LLE εξακολουθεί να αποτελεί μέθοδο επιλογής εκχύλισης βιολογικών δειγμάτων αποδεικνύει ότι αποτελεί πρακτική και ευέλικτη πορεία με βασικό πλεονέκτημα την ευρεία δυναμική περιοχή και την αποφυγή απωλειών λόγω μηχανισμών ρόφησης. Ωστόσο η LLE παρουσιάζει κάποιους περιορισμούς 94,102,103 όπως: Ανάγκη επιλογής κατάλληλου διαλύτη που να μην αναμιγνύεται με το δείγμα Δυσκολία στην εκχύλιση πολικών και ιοντικών ενώσεων από υδατικά διαλύματα Χρήση μεγάλης ποσότητας οργανικών διαλυτών, με αποτέλεσμα αραιωμένο εκχύλισμα, συμπύκνωση μεγάλου όγκου οργανικού διαλύτη και επιβάρυνση της υγείας του προσωπικού των εργαστηρίων Δυσκολία αυτοματοποίησης Σχηματισμός γαλακτωμάτων Η SPE αποτελεί μια εναλλακτική τεχνική προετοιμασίας δειγμάτων που ελαχιστοποιεί τους περιορισμούς που προκύπτουν από την εφαρμογή της LLE. Προσφέρει αρκετά πλεονεκτήματα συγκρινόμενη με τις παραδοσιακές μεθόδους LLE, όπως : Καλύτερη ευαισθησία (λόγω καθαρότερων εκλουσμάτων) Βελτιωμένη εκλεκτικότητα Ικανοποιητική απομάκρυνση προσμίξεων της μήτρας Βελτιωμένη επαναληψιμότητα Αποφυγή σχηματισμού γαλακτωμάτων

68 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Μείωση της ποσότητας των χρησιμοποιούμενων διαλυτών Δυνατότητα αυτοματοποίησης Προσυγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ουσίας, από μεγάλους όγκους δειγμάτων. Σε πολλές περιπτώσεις η ευαισθησία των αναλυτικών μεθόδων δεν επαρκεί για μετρήσεις δειγμάτων στα οποία ο αναλύτης βρίσκεται σε εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις. Στις περιπτώσεις αυτές, μεγάλοι όγκοι δειγμάτων, αερίων ή υγρών, υπόκεινται σε SPE έτσι, ώστε η συνολική ποσότητα του αναλύτη να "παγιδευτεί" στον μικρό όγκο της στερεάς φάσης, από την οποία μπορεί να παραληφθεί εύκολα με μικρό όγκο διαλύτη, απαλλαγμένη συγχρόνως από άλλα συστατικά που θα παρεμπόδιζαν τη μέτρηση. Η SPE βασίζεται 109 στην κατανομή των ουσιών μεταξύ μιας υγρής (δείγμα) και μιας στερεής φάσης, όπου οι διαμοριακές δυνάμεις μεταξύ των δυο φάσεων επηρεάζουν την κατακράτηση και την έκλουση των αναλυτών. Μια ιδανική πορεία προετοιμασίας δειγμάτων με SPE περιλαμβάνει την εφαρμογή πρωτοκόλλου που επιτρέπει την κατακράτηση του αναλύτη στο προσροφητικό υλικό, την απομάκρυνση των ανεπιθύμητων προσμίξεων και την αποτελεσματική έκλουση του αναλύτη, με την επιλογή του κατάλληλου διαλύτη έκλουσης, στο τελικό στάδιο. Στους διαφορετικούς μηχανισμούς με τους οποίους πραγματοποιείται η κατακράτηση και η έκλουση των αναλυτών επιδρούν οι διαμοριακές δυνάμεις μεταξύ αναλύτη και στατικής φάσης, οι ενεργές θέσεις του προσροφητικού υλικού και η μήτρα του δείγματος. Η στατική φάση αποτελείται από πληρωμένο προσροφητικό υλικό. Το δείγμα διαπερνά το προσροφητικό, ενώ οι αναλύτες παραμένουν συνδεδεμένοι στην επιφάνειά του. Οι αναλύτες παραλαμβάνονται από τη στήλη με κατάλληλο μίγμα διαλυτών ή με θερμική εκρόφηση. Η SPE χρησιμοποιείται για την εκλεκτική εκχύλιση, προσυγκέντρωση και καθαρισμό των αναλυτών πριν από ανάλυση με χρωματογραφικές τεχνικές. Τα αναλώσιμα που διατίθενται σήμερα στο εμπόριο για την εφαρμογή της SPE είναι τριών τύπων 111 : φυσίγγια τύπου σύριγγας, δίσκοι και πλάκες 96 κυψελίδων (96-well plates). Τα φυσίγγια τύπου σύριγγας ποικίλλουν σε μέγεθος και ποσότητα προσροφητικού υλικού ανάλογα με τον όγκο του εξεταζόμενου δείγματος. Προβλήματα λόγω έμφραξης του προσροφητικού υλικού αντιμετωπίζονται σήμερα με ενσωμάτωση

69 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών φίλτρων στα φυσίγγια. Οι δίσκοι εκχύλισης στερεάς φάσης επιτρέπουν μεγαλύτερη ταχύτητα ροής με λιγότερους σχηματιζόμενους διαύλους. Οι πλάκες 96 κυψελίδων χρησιμοποιούνται για γρήγορη προετοιμασία δειγμάτων, καθώς επιτρέπουν την παράλληλη επεξεργασία τους κυρίως στη βιομηχανία και οι δίσκοι SPE 47 mm, για την κατεργασία μεγάλων όγκων περιβαλλοντικών δειγμάτων. Τα προβλήματα 112 που ανακύπτουν στις μεθόδους SPE είναι διαφορετικά από αυτά των LLE, με σημαντικότερα τα εξής: Οι ιδιότητες ρόφησης των προσροφητικών υλικών δεν είναι τόσο επαναλήψιμες, όσο οι ιδιότητες των διαλυτών Τα προσροφητικά παρουσιάζουν μεγαλύτερα ποσοστά ανεπιθύμητων προσμίξεων από ό,τι οι διαλύτες Τα προσροφητικά εμφανίζουν περιορισμένη χωρητικότητα ρόφησης, αδυναμία συγκράτησης των αναλυτών και έμφραξη των πόρων του προσροφητικού από ενώσεις της μήτρας του δείγματος. 3.2 Εφαρμογές εκχύλισης στερεάς φάσης στον έλεγχο ντόπινγκ Η SPE λόγω των πλεονεκτημάτων που αναφέρθηκαν έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την εκχύλιση βιολογικών δειγμάτων με σκοπό την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών, με την εφαρμογή μεγάλης ποικιλίας προσροφητικών υλικών με διαφορετικές ιδιότητες. Για τις ανάγκες της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε εκτενής βιβλιογραφική διερεύνηση δεδομένων που σχετίζονται με μεθόδους SPE απαγορευμένων ουσιών, κυρίως στον έλεγχο ντόπινγκ. Τα αποτελέσματα αυτής ομαδοποιήθηκαν και παρουσιάζονται στο Σχήμα

70 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Απλού σταδίου (1 προσροφητικό υλικό, 1 διαλύτης ή μίγμα) Εκχύλιση Στερεάς Φάσης Πολλαπλών σταδίων Silica Πολυμερή 1 προσροφητικό >1 διαλύτες >1 προσροφητικό >1 διαλύτες Υδρόφοβα C18 C18(NE) MO ΠΟ 118 Πολικά Μικτού τύπου κατιονανταλλάκτες HCX HCX-3 MO HCX-5 Certify ΠΟ κατιον + ανιόν Ιονανταλλάκτες ανιονανταλλάκτες ΗΑΧ Certify II MO ΠΟ (-) Υδρόφοβα Isolute 101 Licholut EN Abselut TOX MO (-) ΠΟ 136 Υδρόφοβα με πολικές ιδιότητες Focus Nexus Oasis HLB Isolut ENV+ Strata-X MO ΠΟ Μικτού τύπου Κατιόν Oasis MCX Strata-X-C MO ΠΟ Ανιόν Oasis MAX MO (-) ΠΟ 139 Silica Πολυμερή Παράλληλη Εν σειρά Υδρόφοβα Μικτού τύπου Υδρόφοβα MO (-) ΠΟ (-) MO 146 Κατιόν ΠΟ Κατιόν + ανιόν Ανιόν (-) MO (-) ΠΟ (-) Υδρόφοβα με πολικές ιδιότητες MO (-) ΠΟ (-) Μικτού τύπου MO (-) Κατιόν ΠΟ 144 Κατιόν + ανιόν MO (-) Ανιόν ΠΟ (-) MO 109 ΠΟ Σχήμα 3.1: Συνοπτική παρουσίαση εφαρμογών εκχύλισης στερεάς φάσης στον έλεγχο ντόπινγκ, ΜΟ:μια ομάδα ουσιών, ΠΟ:πολλές ομάδες ουσιών

71 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Όπως προκύπτει από το Σχήμα 3.1 η SPE μπορεί να εφαρμοστεί σε ένα ή περισσότερα στάδια και για μια ή περισσότερες ομάδες απαγορευμένων ουσιών. Στις πορείες του "ενός σταδίου" συμπεριλαμβάνονται οι πορείες στις οποίες η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός προσροφητικού υλικού και η έκλουση των αναλυτών με τη χρήση ενός διαλύτη ή μίγματος διαλυτών. Στις πορείες των "πολλαπλών σταδίων" η εκχύλιση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός ή δύο προσροφητικών υλικών και η έκλουση των αναλυτών με περισσότερους από έναν διαλύτες. Οι δυο βασικές κατηγορίες προσροφητικών υλικών που παρουσιάζονται στο παραπάνω σχήμα αναφέρονται σε υλικά βασιζόμενα σε silica (πηκτή SiO 2 ) ή σε πολυμερή που έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών. Υδρόφοβα, υδρόφιλα και προσροφητικά υλικά μικτού τύπου αποτελούν υποκατηγορίες των δυο βασικών κατηγοριών. Ποικίλες αναφορές που αφορούν την εφαρμογή μεθόδων SPE για την εκχύλιση συγκεκριμένων ουσιών ή ομάδων απαγορευμένων ουσιών παρουσιάζονται στο σχήμα αυτό. 3.3 Εκχύλιση στερεάς φάσης απλού και πολλαπλών σταδίων (One step-multiple steps SPE extraction) Η εκχύλιση των βιολογικών δειγμάτων μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη χρήση ενός ή δύο προσροφητικών υλικών και τη χρήση αντίστοιχα ενός ή περισσότερων διαλυτών. Η χρήση ενός προσροφητικού υλικού για την κατακράτηση των ουσιών και ενός διαλύτη ή μίγματος διαλυτών για την έκλουσή τους, αποτελεί εκχύλιση στερεάς φάσης απλού σταδίου. Αντίθετα, η χρήση ενός ή δυο προσροφητικών υλικών με τη χρήση περισσότερων του ενός διαλυτών αναφέρεται ως εκχύλιση πολλαπλών σταδίων. Η εφαρμογή δύο προσροφητικών υλικών μπορεί να πραγματοποιηθεί με "παράλληλη" χρήση ή με χρήση "σε σειρά" των προσροφητικών υλικών, όπως παρουσιάστηκε στο Σχήμα 3.1. Η συλλογή πολλαπλών κλασμάτων με τη χρήση ενός προσροφητικού υλικού ή δυο προσροφητικών υλικών που χρησιμοποιούνται σε σειρά συγκαταλέγεται στην εκχύλιση πολλαπλών σταδίων 105,159,162. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της εκχύλισης πολλαπλών σταδίων είναι η μεγάλη συλλογή δεδομένων που προκύπτουν από την εκχύλιση ενός μόνο δείγματος. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα αφενός τον αυξημένο αριθμό των αναλυτών που ανιχνεύονται σε

72 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών δείγματα περιορισμένου όγκου και αφετέρου την οικονομία σε αντιδραστήρια μιας και το δείγμα δεν χωρίζεται κατά τη διάρκεια της εκχύλισης. Ένα άλλο πλεονέκτημα που προκύπτει είναι η αποτελεσματικότερη απομάκρυνση προσμίξεων, αφού η τελική πορεία έχει ως αποτέλεσμα την έκλουση δύο ή περισσότερων κλασμάτων, οπότε και την αντίστοιχη "κλασμάτωση" των αρχικών παρεμποδιζουσών ουσιών. Ως μειονεκτήματα της εν σειρά χρήσης προσροφητικών υλικών έχουν αναφερθεί, ο επιπλέον χρόνος που απαιτείται για την εκχύλιση με χρήση προσροφητικών υλικών σε σειρά σε σχέση με την παράλληλη χρήση, με συνέπεια την αύξηση του συνολικού χρόνου ανάλυσης. Ένα δεύτερο μειονέκτημα αφορά τη μείωση της παραγωγικότητας και την ανάγκη επανάληψης της διαδικασίας, που προκύπτει από κάποια αποτυχία σε ένα από τα εφαρμοζόμενα στάδια της εν σειρά εκχύλισης. Η εν σειρά εκχύλιση πολλαπλών σταδίων βασίζεται στην εξής αρχή: το κλάσμα που απομακρύνεται από το πρώτο προσροφητικό υλικό κατά τη διάρκεια έκπλυσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση διαφορετικών αναλυτών με τη βοήθεια ενός δεύτερου προσροφητικού υλικού. SPE σε σειρά χρησιμοποιούνται όταν στο δείγμα περιέχονται αναλύτες που μπορούν να κατακρατηθούν με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και με μηχανισμούς ιοντανταλλαγής. Το κύριο πλεονέκτημα της τεχνικής αυτής είναι ότι κατά την ανάπτυξη μεθόδου επιτρέπεται η βελτιστοποίηση της μάζας του στρώματος του προσροφητικού, της ταχύτητας ροής και της επιλογής του διαλύτη του κάθε φυσιγγίου, με απώτερο σκοπό στη τελική μέθοδο να χρησιμοποιηθούν φυσίγγια διαστρωματωμένα ή μικτού τύπου. Εφαρμόζονται δυο τρόποι χρήσης της (Σχήμα 3.2): 1. Δείγματα με αναλύτες και προσμίξεις που κατακρατούνται με διαφορετικούς μηχανισμούς μπορούν εύκολα να διαχωριστούν χρησιμοποιώντας 2 φυσίγγια με διαφορετικό προσροφητικό. Οι ανεπιθύμητες προσμίξεις κατακρατούνται στην πρώτη στήλη, ενώ οι αναλύτες συγκεντρώνονται στη δεύτερη. Η πρώτη στήλη απορρίπτεται και οι αναλύτες εκλούονται από τη δεύτερη στήλη. Οι συνθήκες ρυθμίζονται ώστε να ευνοείται η κατακράτηση των αναλυτών στη δεύτερη στήλη. 2. Δείγματα που περιέχουν αναλύτες με διαφορετικές ιδιότητες ή αναλύτες που πρόκειται να αναλυθούν με διαφορετικές μεθόδους κατεργάζονται με τον τρόπο που περιγράφεται ακολούθως. Για παράδειγμα, αν μια κατιονανταλλακτική στήλη

73 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών τοποθετηθεί πάνω από μια υδρόφοβη οι βασικοί αναλύτες κατακρατούνται στην πρώτη και οι υδρόφοβοι στη δεύτερη στήλη. Οι στήλες αποχωρίζονται και οι αναλύτες εκλούονται ξεχωριστά. 1 2 Σχήμα 3.2: Εκχύλιση στερεάς φάσης με χρήση προσροφητικών υλικών σε σειρά, όπου (1) :τρόπος χρήσεως 1 και (2): τρόπος χρήσεως Προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica Το κύριο συστατικό των εμπορικώς διαθέσιμων προϊόντων εκχύλισης στερεάς φάσης είναι το προσροφητικό τους υλικό. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες του υλικού καθορίζουν την απόδοση της εκχύλισης και την ολική ποιότητα του διαχωρισμού. Τα προσροφητικά υλικά διατίθενται σε μεγάλη ποικιλία χημείας επιφανειών, μεγέθη πόρων, σωματιδίων, εμβαδών επιφάνειας και υλικών στήριξης. Το καλύτερο προσροφητικό υλικό για την εκάστοτε περίπτωση εξαρτάται κυρίως από τις ιδιότητες των αναλυτών και τη μήτρα του δείγματος. Τα προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica αποτελούν τα πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενα υλικά 112,163. Τα πληρωτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι από τροποποιημένη silica με διάφορες ομάδες (πολικές, μη πολικές, ιονανταλλάκτες). Οι στήλες μικτού τύπου εκμεταλλεύονται το διττό χαρακτήρα του υλικού τους και συνδυάζουν μηχανισμό αντίστροφης φάσης και ιοντανταλλαγή. Η πρόσδεση του αναλύτη στο προσροφητικό υλικό μπορεί να επιτευχθεί με διαφορετικούς μηχανισμούς, όπως για παράδειγμα δεσμούς υδρογόνου, αλληλεπιδράσεις διπόλου-διπόλου, υδρόφοβες και ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Η ενέργεια που απαιτείται για αυτές τις αλληλεπιδράσεις κυμαίνεται από 1-10 Kcal/mol για υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και Kcal/mol για τις ιοντικές ή ηλεκτροστατικές 86. Στο Παράρτημα 1 παρουσιάζονται προσροφητικά υλικά βασιζόμενα

74 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών σε silica με διαφορετικές ιδιότητες ή ίδιων ιδιοτήτων, αλλά με διαφορετική εταιρεία προέλευσης. Εκτός από την τροποποιημένη ομάδα που περιέχουν και που καθορίζει την κατηγοριοποίησή τους, αναφέρεται το ποσοστό της σύνδεσης στην επιφάνεια της silica του αντίστοιχου κορεσμένου υδρογονάνθρακα, καθώς επίσης και αν έχει υποστεί διαδικασία κάλυψης των άκρων. Στη συνέχεια ακολουθεί περιγραφή του μηχανισμού δράσης για τα μη πολικά, τα πολικά και τα μικτού τύπου προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica. Τα προσροφητικά υλικά που βασίζονται σε ιονανταλλαγή δεν αναλύονται, καθώς η χρήση τους μεμονωμένα, για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών είναι περιορισμένη. Ο μηχανισμός της ιονανταλλαγής αναπτύσσεται στα προσροφητικά υλικά μικτού τύπου που αποτελούν μίγμα υδρόφοβου με ισχυρό ανιόν ή κατιονανταλλάκτη Μη πολικά προσροφητικά υλικά Η εκχύλιση αντίστροφης φάσης χρησιμοποιείται για την παραλαβή υδρόφοβων και μέτρια πολικών ενώσεων από πολικά δείγματα (υδατικά), με χρήση υδρόφοβης στατικής φάσης. Τα πληρωτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως από τροποποιημένη silica με ομοιοπολικά συνδεδεμένες υδρόφοβες λειτουργικές ομάδες. Συνδέοντας τη silica με έναν κορεσμένο υδρογονάνθρακα (π.χ. μια -C18 αλυσίδα) η επιφάνειά της καθίσταται υδρόφοβη (Σχήμα 3.3). O Si O Si (CH 2 ) 17 CH 3 Si OH Σχήμα 3.3: Μη πολικό προσροφητικό υλικό C18 Η κατακράτηση οργανικών ενώσεων στην υδρόφοβη επιφάνεια οφείλεται κυρίως σε δυνάμεις Van der Waals, μεταξύ των δεσμών C H του αναλύτη και των αντίστοιχων δεσμών των ομάδων του προσροφητικού (Σχήμα 3.4). Εκχύλιση με υδρόφοβο προσροφητικό υλικό απαιτεί προκατεργασία του βιολογικού υγρού και ρύθμιση του ph, ώστε οι αναλύτες να είναι σε ουδέτερη μορφή πριν το στάδιο "φόρτωσης" του δείγματος. Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις απομακρύνονται με έκπλυση του δείγματος με

75 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών νερό ή κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Κλασμάτωση των ουσιών που βρίσκονται συνδεδεμένες στο προσροφητικό υλικό πραγματοποιείται με έκπλυση με κατάλληλη ποσότητα καθορισμένου μίγματος υδατικού-οργανικού διαλύτη. Το πρώτο κλάσμα αποβάλλεται και κατόπιν ακολουθεί έκπλυση της στήλης με ένα δεύτερο διαλύτη (υψηλότερη σύσταση του οργανικού διαλύτη σε σχέση με τον υδατικό) και συλλογή του κλάσματος 164. Σχήμα 3.4: Μηχανισμός δράσης σε υδρόφοβα προσροφητικά υλικά Η ισχύς των υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων είναι συνάρτηση του μήκους ανθρακικής αλυσίδας του προσροφητικού (π.χ. η C2 κατακρατά λιγότερο ισχυρά από την C18). Για την εκχύλιση ιοντιζόμενων αναλυτών το ph του δείγματος ρυθμίζεται, ώστε να παραμείνουν ουδέτεροι. Οι αναλύτες εκλούονται με οργανικούς διαλύτες, όπως η μεθανόλη ή το ακετονιτρίλιο, σε συνδυασμό με οξέα, βάσεις ή άλλους διαλύτες και οργανικούς τροποποιητές. Υδρόβοφα προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την εκχύλιση όξινων, ουδέτερων και βασικών ουσιών από βιολογικά δείγματα (πλάσμα, ούρα). Προσροφητικά υλικά C18 έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στο στάδιο καθαρισμού (clean up), σε δείγματα ούρων προκειμένου να επιτευχθούν καλύτερα και πιο επαναλήψιμα αποτελέσματα 94. Όλα τα υλικά τα οποία βασίζονται σε silica μετά τη διαδικασία της τροποποίησής τους εξακολουθούν να περιέχουν έστω και μικρό ποσοστό ελεύθερων υδροξυλομάδων, οι οποίες δρουν ως δευτερεύουσες θέσεις αλληλεπίδρασης. Οι δευτερεύουσες ιοντικές αλληλεπιδράσεις μπορεί να είναι χρήσιμες για το διαχωρισμό ή την κατακράτηση ισχυρά πολικών ουσιών ή προσμίξεων, αλλά μπορεί επίσης να προκαλέσουν μη

76 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών αντιστρεπτή δέσμευση της προσδιοριζόμενης ουσίας. Με σκοπό την ελαχιστοποίηση των δευτερευουσών αλληλεπιδράσεων, η συνδεδεμένη φάση υπόκειται σε αντίδραση κάλυψης των άκρων (endcapping) με την οποία οι ελεύθερες σιλανόλες μεθυλιώνονται, συνήθως με τριμεθυλοσιλυλο-ομάδες (TMS). Στο Σχήμα 3.5 παρουσιάζεται η αντίδραση κάλυψης των άκρων. Σχήμα 3.5: Τυπική αντίδραση κάλυψης των άκρων (σιλανοποίηση) Πολικά προσροφητικά υλικά Ο μηχανισμός κανονικής φάσης χρησιμοποιείται για την εκχύλιση πολικών αναλυτών από μέτρια ή καθόλου πολικά δείγματα, με τη βοήθεια πολικής στατικής φάσης. Η κατακράτηση στηρίζεται σε δεσμούς υδρογόνου, δυνάμεις διπόλου διπόλου και π π αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αναλυτών και της στατικής φάσης. Οι αναλύτες εκλούονται με πολικούς οργανικούς διαλύτες (π.χ. μεθανόλη ή ισοπροπανόλη) σε υδρόφοβους διαλύτες (πολικότερους από τη μήτρα του δείγματος) προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι αλληλεπιδράσεις αναλύτη-προσροφητικού υλικού. Τα πληρωτικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως από τροποποιημένη silica με πολικές ομάδες (π.χ. -CN, -NH 2, και -Diol), δηλαδή αντί απλών αλκυλομάδων, περιέχουν ομάδες όπως: CH 2 CH 2 CN, CH 2 CH 2 NH 2, CH 2 CH(OH)CH 2 OH, που προσδίδουν στη silica διαφορετικούς βαθμούς πολικότητας 95,164. Ακόμη και η μη τροποποιημένη silica χρησιμοποιείται ευρύτατα ως υποστηρικτικό υλικό στις προσδεμένες φάσεις, λόγω των ελεύθερων ομάδων σιλανόλης ( SiOH) που βρίσκονται στην επιφάνειά της. Το υλικό αυτό είναι εξαιρετικά υδρόφιλο και πρέπει να φυλάσσεται σε ξηρό μέρος

77 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Προσροφητικά υλικά μικτού τύπου Στην προσπάθεια να βελτιωθεί 165 η ανάκτηση πολικών αναλυτών οι οποίοι εμφανίζουν χαμηλές ανακτήσεις με τα υδρόφοβα προσροφητικά υλικά μια νέα κατηγορία προσροφητικών υλικών έκανε την εμφάνισή της 112 στα μέσα της δεκαετίας του Η νέα αυτή κατηγορία αναφέρεται ως προσροφητικά υλικά μικτού τύπου και είναι μίγμα υδρόφοβου προσροφητικού υλικού με ιονανταλλάκτη. Η εκχύλιση με προσροφητικά υλικά μικτού τύπου έχει το πλεονέκτημα ότι με χρήση ενός φυσιγγίου μπορεί να επιτευχθεί αποτελεσματική εκχύλιση ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες 87. Τα υδρόφοβα προσροφητικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι κυρίως τροποποιημένη silica με C18 ή C8 λειτουργικές ομάδες. Ανάλογα με την ομάδα που φέρει ο ιονανταλλάκτης (αρνητικά ή θετικά φορτισμένη) διαχωρίζονται σε κατιοανταλλάκτες και ανιονανταλλάκτες, αντίστοιχα. Εκλεκτική εκχύλιση 105,134 ουδέτερων-όξινων και βασικών ουσιών μπορεί να επιτευχθεί με προσροφητικά υλικά μικτού τύπου που φέρουν κατιον-ανταλλάκτη, αρκεί να γίνει κατάλληλη ρύθμιση του ph ώστε οι αναλύτες να είναι φορτισμένοι. Η επιλογή του ph είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς θα πρέπει, αφενός να επιτρέπει την εκχύλιση των ουσιών και αφετέρου, να εξασφαλίζει τη μέγιστη δυνατή απομάκρυνση των παρεμποδιζουσών ουσιών. Εμπορικά προσροφητικά υλικά που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία είναι τα Bond Elut Certify της εταιρείας Varian και τα Isolute Confirm HCX, HCX-3 και HCX-5 της εταιρείας Biotage 105,149. Τα Bond Elut Certify αποτελούνται από μίγμα περίπου 80% C8 και 20% προπυλο-βενζοσουλφονικό οξύ (SCX) συνδεδεμένα στη silica. Τα Isolute Confirm HCX αποτελούνται από μίγμα περίπου 80% C8 και 20% προπυλο-σουλφονικό οξύ συνδεδεμένα στη silica 128, ενώ τα HCX-3 και HCX-5 φέρουν αντίστοιχα τις ομάδες C18 and C4 στο υδρόφοβο τμήμα. Οι βασικές ουσίες κατακρατούνται στο προσροφητικό υλικό με δύο βασικούς μηχανισμούς, όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα

78 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Σχήμα 3.6: Υδρόφοβες και κατιοντανταλλακτικές αλληλεπιδράσεις με στήλες μικτού τύπου 111 Συγκράτηση των ουδέτερων και όξινων αναλυτών πραγματοποιείται λόγω μη πολικών αλληλεπιδράσεων (δυνάμεις Van Der Waals) 94,149. Ουσίες που φέρουν πολλαπλές ομάδες στο μόριό τους, ίσως να συγκρατούνται από τη στατική φάση λόγω δεσμών Η με τις ελεύθερες υδροξυλομάδες της στατικής φάσης. Η αρχική συγκράτηση των βασικών ουσιών στο προσροφητικό υλικό οφείλεται σε συνδυασμό μη πολικών αλληλεπιδράσεων με τις C8 ή C18 ομάδες, καθώς και στις ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις με τις σουλφονομάδες και τις ελεύθερες υδροξυλομάδες της στατικής φάσης. Όταν με κατάλληλη ρύθμιση του ph οι αναλύτες είναι σε ουδέτερη μορφή, εκλούονται οι όξινες ουσίες, ενώ οι βασικές εκτοπίζονται από τα αρχικά σημεία πρόσδεσης με την C8 και τις ελεύθερες υδροξυλομάδες. Ο κατιονανταλλάκτης διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην κατακράτηση των βασικών ουσιών στο προσροφητικό υλικό κατά τη διάρκεια των διαφόρων βημάτων και στη συνέχεια όταν ισχυροί διαλύτες, όπως η μεθανόλη χρησιμοποιούνται πριν το στάδιο της έκλουσης των βασικών ουσιών. Ουσίες που μπορούν να εκχυλιστούν με αυτά τα υλικά είναι εκείνες που φέρουν πρωτοταγή ή δευτεροταγή αμινομάδα η οποία θα αλληλεπιδράσει με την αρνητικά φορτισμένη ομάδα του κατιοανταλλάκτη. Βασικό παράγοντα στην εφαρμογή του παραπάνω πρωτοκόλλου αποτελεί η εφαρμογή του σταδίου ξήρανσης της στήλης μεταξύ των σταδίων εξουδετέρωσης και της έκλουσης των όξινων ουσιών προκειμένου να συγκρατηθούν οι βασικές ουσίες από τον κατιονανταλλάκτη (από τις αρνητικά φορτισμένες σουλφονομάδες). Υποθετικά, εάν οι σουλφονομάδες περιβάλλονται από μια υδατική σφαίρα που τις καθιστά απρόσιτες από τις βασικές ουσίες, τότε οι τελευταίες θα εκλουστούν μαζί με το κλάσμα των όξινων-ουδέτερων ουσιών ή σε κάποιο ενδιάμεσο στάδιο έκπλυσης

79 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Το πρωτόκολλο που προτείνεται στα προσροφητικά υλικά μικτού τύπου με κατιονανταλλάκτη περιλαμβάνει τη χρήση όξινου ρυθμιστικού στο στάδιο φόρτωσης του δείγματος ώστε οι βασικές ουσίες που είναι φορτισμένες να συγκρατούνται λόγω ιοντικών αλληλεπιδράσεων. Έκπλυση με μεθανόλη απομακρύνει τις μη φορτισμένες παρεμποδίζουσες ουσίες, ενώ οι βασικές εξακολουθούν να βρίσκονται συνδεδεμένες με το προσροφητικό υλικό λόγω ιονανταλλαγής. Έκλουση των εξεταζόμενων βασικών ουσιών επιτυγχάνεται με μεταβολή του ph και πραγματοποιείται συνήθως με μίγμα μεθανόλης-βάσης. Πειραματικά πρωτόκολλα με προσροφητικά μικτού τύπου που βασίζονται σε κατιοανταλλαγή έχουν ευρέως χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση απαγορευμένων ουσιών σε διαδικασίες σάρωσης σε διάφορα βιολογικά υγρά 95, όπως ούρα αθλητών 94,104,105, πλάσμα αθλητών 104,150, ούρα αλόγων 152,153,159 και πλάσμα αλόγου 147,149. Επιπλέον, τα προσροφητικά αυτά υλικά έχουν χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση συγκεκριμένων ομάδων ,128 απαγορευμένων ουσιών όπως αναβολικών στεροειδών, διεγερτικών και βασικών ουσιών. Τα προσροφητικά υλικά μικτού τύπου που φέρουν ανιονανταλλάκτη χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση ουσιών που φέρουν υδρόφοβες και όξινες ομάδες παρέχοντας εκχύλισμα υψηλού βαθμού καθαρότητας. Ο αρχικός μηχανισμός συγκράτησης των ουσιών οφείλεται σε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. Εμπορικά προσροφητικά υλικά που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία είναι τα Bond Elut Certify ΙΙ της εταιρείας Varian και τα Isolute Confirm HAX της εταιρείας Biotage 2. Τα προσροφητικά αυτά υλικά αποτελούνται από μίγμα περίπου 80% C8 και 20% τεταρτοταγείς αμίνες (20%) 134,135 συνδεδεμένα στη silica. Οι όξινες ουσίες κατακρατούνται στο προσροφητικό υλικό με δύο βασικούς μηχανισμούς όπως φαίνεται στο Σχήμα

80 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Σχήμα 3.7: Υδρόφοβες και ανιονανταλλακτικές αλληλεπιδράσεις με στήλες μικτού τύπου Τα προσροφητικά αυτά υλικά έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση όξινων ουσιών σε δείγματα ούρων και αίματος 134,135,139, Προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε πολυμερή Τα μειονεκτήματα που εμφανίζουν τα προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica ξεπεράστηκαν με τη χρήση πολυμερών προσροφητικών υλικών 112,136,141,143,163. Με τα υλικά αυτά πραγματοποιείται περισσότερο αποτελεσματική εκχύλιση των πολικών ουσιών εξαιτίας του υψηλού εμβαδού επιφάνειας και των υδρόφιλων ιδιοτήτων τους. Τα υλικά αυτά χρησιμοποιούνται για τη εκχύλιση όξινων, ουδέτερων, βασικών ουσιών από βιολογικά υγρά. Εμπορικά διαθέσιμα πολυμερή προσροφητικά υλικά με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά, όπως μέγεθος πόρων, εμβαδόν επιφάνειας παρουσιάζονται στο Παράρτημα Μη πολικά πολυμερή προσροφητικά υλικά Τα πολυμερή προσροφητικά υλικά ή ρητίνες, συνήθως συντίθενται από διακλαδισμένα συμπολυμερή 112,163 στυρενίου διβινυλοβενζολίου (St-DVB). Σε αντίθεση με την απλή silica, το απλό St-DVB είναι εξαιρετικά υδρόφοβο και ικανό για ισχυρές υδρόφοβες και π-π αλληλεπιδράσεις. Οι νεότερες "γενεές" των ρητινών St-DVB είναι υψηλά διακλαδισμένες (highly cross-linked) 166, με αμελητέα συρρίκνωση και διόγκωση, τα μεγέθη των σωματιδίων ελέγχονται προσεκτικά και τα πολυμερή καθαρίζονται εκτενώς με σκοπό την ελάττωση των ενδογενών, ανεπιθύμητων προσμίξεων. Τα προσροφητικά αυτά υλικά, όπως για παράδειγμα τα XAD1 και XAD2 86 έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες σε βιολογικά υγρά

81 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Άλλα προσροφητικά υλικά που ανήκουν στην κατηγορία αυτή είναι το 163 Lichrolut EN (Merck) και το Isolute 101 (Biotage) που παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.8. Μειονέκτημα αυτών των προσροφητικών υλικών είναι ότι λόγω της υδρόφοβων ιδιοτήτων τους δεν ενδείκνυνται για την εκχύλιση πολικών ουσιών. Το μειονέκτημα αυτό πυροδότησε την ανάπτυξη πολυμερών με υδρόφιλες ιδιότητες, ικανών για την εκχύλιση μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών με διαφορετικές ιδιότητες (όξινες ουδέτερες, βασικές). Σχήμα 3.8 : Isolute 101, Υδρόφοβο πολυμερές προσροφητικό υλικό St-DVB Πολυμερή προσροφητικά υλικά με πολικές ιδιότητες Όπως στη silica, έτσι και η πολικότητα της επιφάνειας του St-DVB μπορεί να τροποποιηθεί με την προσθήκη διάφορων λειτουργικών ομάδων. Προσροφητικά υλικά που συνδυάζουν μη πολικό σκελετό (ικανό για αντίστροφης φάσης μηχανισμό και π-π αλληλεπιδράσεις) με λειτουργικές ομάδες (που βελτιώνουν την ικανότητα διαβροχής και αυξάνουν τις πιθανές αλληλεπιδράσεις με τους αναλύτες) είναι ικανά για την κατακράτηση πολικών ενώσεων. Τα υδρόφιλα αυτά προσροφητικά λαμβάνονται με συμπολυμερισμό μονομερών με κατάλληλες λειτουργικές ομάδες ή εισάγοντας λειτουργικές ομάδες 141,170, (ακετυλομάδες, υδροξυλομάδες, σουλφονομάδες, βενζόϋλοομάδες) στο ήδη υπάρχον υδρόφοβο πολυμερές (Σχήμα 3.9)

82 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Σχήμα 3.9: Υδρόφιλα προσροφητικά υλικά με τροποποίηση της επιφάνειας του υδρόφοβου πολυμερούς St-DVB Τα προσροφητικά αυτά υλικά χρησιμοποιούνται για την εκχύλιση πολικών και μη ουσιών από υδατικά διαλύματα με αποτέλεσμα ιδιαίτερα καθαρά εκλούσματα και υψηλότερες ανακτήσεις. Το προσροφητικό υλικό 170,171 Oasis HLB (Waters) με εμβαδό επιφάνειας 800 m 2 /g είναι ένα συμπολυμερές αποτελούμενο από το υδρόφοβο μονομερές διβινυλοβενζόλιο και την υδρόφιλη βινυλοπυρολιδόνη (Πίνακας 3.1) 139,141,163. Λόγω της σύστασής του και την σταθερότητα που εμφανίζει σε ευρεία περιοχή ph καθίσταται ικανό για την εκχύλιση πολικών και μη πολικών ουσιών. Το προσροφητικό αυτό υλικό έχει χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με τη LLE για την εκχύλιση αναβολικών στεροειδών σε δείγματα ούρων 138 αθλητών. Στο εμπόριο επίσης διατίθενται φυσίγγια SPE από πολυμερή προσροφητικά υλικά στα οποία δεν απαιτείται στάδιο ενεργοποίησης και εξισορόπησης, όπως για παράδειγμα το Nexus της Varian 163. Το υλικό αυτό το οποίο συντίθεται από τα μεθακρυλικά μονομερή διβινυλοβενζόλιο (Πίνακας 3.1), αναφέρεται ως υψηλής ροής (high flow) και επιτυγχάνει: μείωση της συχνότητας εμφράξεων, αύξηση της ταχύτητας κατεργασίας δειγμάτων και ελάττωση των μηχανικών καταπονήσεων των ρομποτικών συστημάτων

83 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών εκχύλισης στερεάς φάσης. Το προσροφητικό αυτό υλικό με εμβαδό επιφάνειας 575 m 2 /g έχει χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση ή στο στάδιο καθαρισμού δειγμάτων ούρων αλόγων. Το προσροφητικό υλικό Strata X (Phenomenex) με εμβαδόν επιφάνειας 800 m 2 /g ανήκει στην κατηγορία των τροποποιημένων St-DVB προσροφητικών υλικών (Πίνακας 3.1) και στο οποίο η αλληλεπίδραση με τους αναλύτες βασίζεται σε υδρόφοβες, αρωματικές αλληλεπιδράσεις και δεσμούς Η. Πίνακας 3.1: Χαρακτηριστικές ομάδες πολυμερών προσροφητικών υλικών με πολικές ιδιότητες Πολυμερές Oasis HLB Λειτουργική ομάδα Nexus Strata-x Επίσης το προσροφητικό υλικό Isolute ENV+ (Biotage) συγκαταλέγεται στην κατηγορία των τροποποιημένων πολυμερών προσροφητικών υλικών. Το ENV+ 172, όπως φαίνεται και στο Σχήμα 3.10 είναι τροποποιημένο συμπολυμερές του St-DVB το οποίο φέρει υδροξυλομάδες ως λειτουργικές ομάδες με εμβαδόν επιφάνειας περίπου 1000 m 2 /g

84 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών α) β) Σχήμα 3.10: α) Δομή του προσροφητικού υλικούisolute ENV+ β) αλληλεπιδράσεις με το ENV Πολυμερή προσροφητικά υλικά μικτού τύπου Ανάλογα με τα προσροφητικά υλικά μικτού τύπου βασιζόμενα σε silica, αναπτύχθηκαν τα πολυμερή προσροφητικά υλικά τα οποία εμφανίζουν μεγαλύτερη επαναληψιμότητα λόγω των ιδιοτήτων τους. O μηχανισμός δράσης των προσροφητικών υλικών μικτού τύπου έχει ήδη περιγραφεί στο εδάφιο Το προσροφητικό υλικό Strata X-C (Phenomenex) ανήκει σε αυτή την κατηγορία και είναι κατιονανταλλάκτης με υδρόφοβο σκελετό από St-DVB συνδεδεμένο με σουλφονικό οξύ 143 (Σχήμα 3.11). Σχήμα 3.11: Μηχανισμός δράσης του πολυμερούς προσροφητικού υλικού, μικτού τύπου Strata X-C Το προσροφητικό υλικό MCX (Waters) έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση δειγμάτων ούρων 144,170 και έχει σύσταση ανάλογη με το προαναφερθέν προσροφητικό υλικό

85 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Τα πολυμερή αυτά συνίστανται για την εκχύλιση όξινων, ουδέτερων, βασικών ουσιών 144 ή την εκχύλιση β2-αγωνιστών και ανταγωνιστών 139, λόγω των σύνθετων ιδιοτήτων τους, με βελτιωμένη εκλεκτικότητα σε βιολογικά υγρά. Η ανάκτηση βασικών ουσιών με αυτά τα υλικά έχει αναφερθεί να είναι σημαντικά υψηλότερη συγκρινομένη, με τα αντίστοιχα προσροφητικά βασιζόμενα σε silica. Το προσροφητικό υλικό MAX (Waters) αποτελεί παράδειγμα ανιοανταλλάκτη και έχει χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών Σύγκριση προσροφητικών υλικών βασιζόμενα σε silica και πολυμερή Σύγκριση προσροφητικών υλικών βασιζόμενων σε silica με τα αντίστοιχα προσροφητικά St-DVB έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά από τους Poole F 112, Huck CW and Bonn GK 170. Τα υλικά που στηρίζονται σε silica είναι άκαμπτα, φθηνά, τροποποιούνται και παρασκευάζονται εύκολα, είναι σταθερά και απρόσβλητα συρρίκνωσης ή διόγκωσης από υδατικά διαλύματα και οργανικούς διαλύτες. Ωστόσο παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα, όπως: Παρουσία ενός σημαντικού αριθμού ελεύθερων υδροξυλομάδων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί κατά τη διάρκεια τροποποίησης της silica με διάφορες ομάδες ένα σημαντικό ποσοστό των υδροξυλομάδων παραμένει ελεύθερο ακόμη και μετά τη διαδικασία της κάλυψης των άκρων. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα ότι οι ελεύθερες αυτές ομάδες μπορεί να λειτουργήσουν ως κατιονανταλλάκτες δημιουργώντας ένα δευτερεύοντα μηχανισμό συγκράτησης 86,111 Τα προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica είναι ασταθή σε ακραίες τιμές ph (ph<2 και ph>7,5) Το προσροφητικό υλικό δεν πρέπει να ξηρανθεί πριν το στάδιο φόρτωσης του δείγματος προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η αλληλεπίδραση μεταξύ των προσδιοριζόμενων ουσιών και του προσροφητικού υλικού. Τα μειονεκτήματα αυτά οδήγησαν σε μια νέα τάξη πολυμερών προσροφητικών υλικών με ελάχιστη συρρίκνωση και διόγκωση λόγω διαβροχής με υδρόφιλες ή υδρόφοβες ιδιότητες, ανάλογα με τη σύνθεση του πολυμερούς. Αυτή η τάξη προσροφητικών δεν επηρεάζεται από τυχούσα ξήρανση πριν τη διαβίβαση του δείγματος. Τα πολυμερή

86 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών προσροφητικά υλικά είναι σταθερά σε ph 1-14, ενώ παράλληλα εμφανίζουν πλέον επαναλήψιμα αποτελέσματα λόγω απουσίας ελεύθερων υδροξυλομάδων 143,144, Νέας τεχνολογίας πληρωτικά υλικά Στα εδάφια που ακολουθούν παρουσιάζεται μια σύντομη αναφορά, στα νέας τεχνολογίας πληρωτικά υλικά που έχουν αναπτυχθεί με σκοπό τη βελτίωση των ιδιοτήτων των ήδη χρησιμοποιούμενων μεθόδων 173. Τα νέα προσροφητικά υλικά διαθέτουν μεγάλη χωρητικότητα, μεγαλύτερη υδροφοβικότητα, καλύτερη κατακράτηση υδρόφιλων ουσιών και διαβρέχονται με ύδωρ. Επιπλέον, εισάγονται, νέοι τρόποι χρήσης της SPE ώστε να αυξηθεί η ταχύτητα κατεργασίας δειγμάτων, η ανάκτηση και η επαναληψιμότητα των διαχωρισμών. Μεταξύ αυτών των καινοτομιών είναι οι πλάκες 96 κυψελίδων (96-well plates) 174,175, για την παράλληλη επεξεργασία δειγμάτων και οι δίσκοι SPE 47 mm, για την κατεργασία μεγάλων όγκων περιβαλλοντικών δειγμάτων Ανόργανα υλικά (Inorganic oxides) Τα πιο σημαντικά υλικά που συγκαταλέγονται σε αυτή την κατηγορία είναι η πυριτία, η αλουμίνα και το florisil, το οποίο αποτελείται από πυριτικό μαγνήσιο και το οποίο είναι ισχυρά πολικό υλικό. Εμφανίζουν μεγάλο εμβαδόν επιφάνειας, γεγονός που βελτιώνει την ικανότητα συγκράτησης ουσιών. Μειονέκτημα των υλικών αυτών αποτελεί η μη αντιστρεπτή προσρόφηση των αναλυτών που οδηγεί αυτόματα σε χαμηλές ανακτήσεις. Εφαρμογές των ανόργανων υλικών έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά Υλικά με βάση τον άνθρακα (Carbon-based) Άλλη ομάδα προσροφητικών υλικών που χρησιμοποιούνται στην SPE σχηματίζονται από μορφές του άνθρακα, όπως ο γραφιτικός άνθρακας (GCB, graphitized carbon black) και ο πορώδης γραφιτικός άνθρακας (PGC, porous graphitic carbon) 111,112. Τα υλικά αυτά έχουν μικρό εμβαδόν επιφάνειας που κυμαίνεται από m 2 /g, χαρακτηρίζονται από μεγάλη χωρητικότητα και πορώδη μορφή. Ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης είναι διαφορετικός από αυτόν που εφαρμόζεται στα σιλοξάνια και όπως έχει αναφερθεί τα υλικά αυτά είναι κατάλληλα για δέσμευση ουσιών με πολικές ομάδες στο μόριό τους. Το βασικό μειονέκτημά τους είναι η μη αντιστρεπτή δέσμευση αρκετών ουσιών. Τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα προσροφητικά από γραφίτη είναι τα

87 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών GCB που παρασκευάζονται με θέρμανση αιθάλης στους C. Τα PGC έχουν μέσο εμβαδόν επιφάνειας 120 m 2 /g. Λόγω της παρουσίας στο μόριό τους, θετικά φορτισμένων περιοχών μπορούν να θεωρηθούν ως προσροφητικά αντιστρόφου φάσεως και ανιοανταλλακτες 101,143, Περιορισμένης πρόσβασης υλικά (Restricted access materials, RAM). Τα υλικά αυτά είναι σχεδιασμένα ώστε να αποτρέπουν την πρόσβαση μακρομορίων, όπως για παράδειγμα πρωτεϊνών στο εσωτερικό των θέσεων προσρόφησης της συνδεδεμένης φάσης και χρησιμοποιούνται για την απομόνωση ουσιών μικρού μοριακού βάρους από τα βιολογικά υγρά. Σε αυτού του τύπου τις στήλες, η εσωτερική επιφάνεια καλύπτεται με συνδεδεμένο υλικό αντίστροφης φάσης και η εξωτερική με μη προσροφητικό, υδρόφιλο υλικό. Οι διφασικές αυτές στήλες επιτρέπουν τον αποτελεσματικό διαχωρισμό των εξεταζόμενων ουσιών από μακρομόρια του δείγματος. Φάρμακα και άλλα μικρά μόρια εισχωρούν στους πόρους της υδρόφοβης αντίστροφης φάσης, όπου κατακρατούνται, ενώ οι πρωτεΐνες και τα υπόλοιπα συστατικά της μήτρας αποκλείονται στην εξωτερική, υδρόφιλη φάση. Αρχικά αναπτύχθηκαν για την απομόνωση φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους από βιολογικά υγρά με ελάχιστη προκατεργασία δείγματος, αλλά βρήκαν εφαρμογή και στην απομόνωση φυτοφαρμάκων από επιφανειακά ύδατα, παρουσία μεγάλων ποσοτήτων χουμικών οξέων. Τα προσροφητικά αυτά συνδυάζουν μηχανισμούς αντίστροφης φάσης και αποκλεισμού μεγεθών 111,112, Προσροφητικά υλικά ανοσοσυγγένειας (Immunoaffinity Sorbents, ΙΑΕ) Οι περισσότερες εφαρμογές 176 των συγκεκριμένων υλικών, αναφέρονται σε αναλύσεις περιβαλλοντικών δειγμάτων. Εκχύλιση με τα συμβατικά προσροφητικά υλικά συνοδεύεται συνήθως από συνέκλουση παρεμποδιζουσών ουσιών, γεγονός το οποίο αποτελεί πολύ σημαντικό πρόβλημα στην περίπτωση που οι υπό προσδιορισμό αναλύτες βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Για το σκοπό αυτό έχουν χρησιμοποιηθεί τεχνικές ενζυμικού ανοσοπροσροφητικού προσδιορισμού (enzyme linked immunosobent assays, ELISA), η χρήση τους όμως είναι περιορισμένη λόγω της παρουσίας μη ειδικών αντισωμάτων. Σε αντίθετη περίπτωση η χρήση των προσροφητικών υλικών ανοσοσυγγένειας συνοδεύεται από υψηλή εκλεκτικότητα και επιτρέπει την εκχύλιση πολύπλοκων

88 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών βιολογικών δειγμάτων. Έχει χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών σε βιολογικά υγρά και φυτοφαρμάκων σε περιβαλλοντικά δείγματα. Τα αντισώματα, ειδικά στις ουσίες προς ανάλυση, προσδένονται σε κατάλληλο προσροφητικό υλικό για το σχηματισμό του λεγόμενου προσροφητικού υλικού ανοσοσυγγένειας, το οποίο είναι το υλικό πλήρωσης των χρησιμοποιούμενων φυσιγγίων. Ο διαχωρισμός επιτυγχάνεται με αλληλεπιδράσεις αντιγόνου αντισώματος παρέχοντας έτσι εκλεκτικές μεθόδους χωρίς τη συνέκλουση παρεμποδιζουσών ουσιών 80. Μειονεκτήματα της παρούσας τεχνικής θεωρούνται η έλλειψη ομογένειας και δραστικότητας των αντισωμάτων προερχομένων από διαφορετικές πηγές, η αδυναμία των αντισωμάτων να διαχωρίσουν την προσδιοριζόμενη ουσία από ουσίες με παρόμοια δομικά χαρακτηριστικά, οδηγώντας έτσι σε λανθασμένους υπολογισμούς της συγκέντρωσης, καθώς επίσης και σε ψευδώς θετικά και αρνητικά αποτελέσματα. Σε αυτή την περίπτωση απαιτείται πρόσθετη ανάλυση με χρωματογραφική τεχνική. Πρόσθετες πληροφορίες για τα συγκεκριμένα υλικά, καθώς και εφαρμογές τους σε βιολογικά υγρά 111 έχουν αναφερθεί βιβλιογραφικά 176, Προσροφητικά υλικά μοριακής αποτύπωσης (Moleculary Imprinted Polymers, MIPs) Η μοριακή αποτύπωση είναι μια τεχνολογία στην οποία οι θέσεις αναγνώρισης δημιουργούνται με συμπολυμερισμό των μονομερών με το πρότυπο μόριο. Ο αναλύτης απελευθερώνεται χημικά από τη μήτρα 78, δημιουργώντας κοιλότητες στο προσροφητικό υλικό, τα λεγόμενα "αποτυπώματα". Αυτές οι κοιλότητες αποτελούν τις θέσεις αναγνώρισης επιτρέποντας την πρόσδεση των αναλυτών. Οι συμπληρωματικές λειτουργικές ομάδες αντιστοιχούν στο αποτυπωμένο μόριο, όπως το αντίσωμα αντιστοιχεί δομικά στο αντιγόνο. Τα ΜΙΡ χρησιμοποιούνται επιτυχώς στο διαχωρισμό αμινοξέων, πεπτιδίων, πρωτεϊνών, φαρμάκων και χειρόμορφων ενώσεων, είναι αρκετά σταθερά για μακροχρόνια αποθήκευση, προετοιμάζονται εύκολα και είναι αρκετά φθηνά. Έτσι, αυτά θεωρούνται ως νέο τεχνητό μέσο συγγένειας. Τα ΜΙΡ παρουσιάζουν εξαιρετική εκλεκτικότητα υπό

89 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών συνθήκες κανονικής φάσης, ωστόσο σε πολικά διαλύματα οι δεσμοί υδρογόνου και άλλες πολικές αλληλεπιδράσεις που απαιτούνται για την εκλεκτική σύνδεση των αναλυτών υποβαθμίζονται. Γενικά το πλέον σοβαρό πρόβλημα των ΜΙΡ είναι η φτωχή συμπεριφορά τους σε μηχανισμούς αντίστροφης φάσης. Τελευταία αναπτύχθηκε μια νέα τάξη τους που είναι γνωστή ως πλαστικά αντισώματα 112. Εφαρμογή των ΜΙΡ για την ανάλυση βιολογικών δειγμάτων έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά 164, Μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (Solid Phase Microextraction, SPME) Η μικροεκχύλιση στερεάς φάσης (SPME, Solid Phase Microextraction) 179 είναι μια τεχνική εκχύλισης, ελεύθερη διαλυτών, στηριζόμενη στην προσρόφηση των αναλυτών σε ίνα από τηγμένη πυριτία, καλυμμένη με στατική φάση από πολυμερές υλικό (πολυδιμεθυλοσιλικόνες, πολυακρυλικά και συμπολυμερή) 180,181. Χρησιμοποιείται ήδη σε συνδυασμό με GC και LC και εφαρμόζεται με επιτυχία σε μεγάλη ποικιλία πτητικών και ημιπτητικών οργανικών ενώσεων από περιβαλλοντικά, βιολογικά και δείγματα τροφίμων. Τα πλεονεκτήματα της SPME είναι η απλότητα, η ταχύτητα, η ελάττωση των χρησιμοποιούμενων διαλυτών, το χαμηλό κόστος, η εύκολη αυτοματοποίηση και ο μικρότερος όγκος δείγματος. Δύο τύποι SPME χρησιμοποιούνται σήμερα: H κλασική SPME (fiber SPME) και η SPME σε σωλήνα, "In-tube" (Σχήμα 3.12). Η πρώτη κατηγορία περιλαμβάνει δυο διαφορετικούς τύπους, του: α) υπερκείμενου χώρου (headspace (HS) SPME) και β) άμεσης εμβάπτισης (direct immersion (DI) SPME). Η "In-tube" SPME 102 αποτελεί την αυτοματοποιημένη έκδοση της SPME, η οποία μπορεί προσδεδεμένη με ένα χρωματογραφικό σύστημα να χρησιμοποιηθεί για "on line" (υποκεφάλαιο 3.8) προετοιμασία και διαχωρισμό δειγμάτων. Στην HS-SPME η ίνα εκτίθεται στον υπερκείμενο χώρο του αέριου, υγρού ή στερεού δείγματος. Στην DI-SPME η ίνα βυθίζεται απευθείας στο υγρό δείγμα 164. Οι μέθοδοι διαφοροποιούνται ελάχιστα ανάλογα με το αν απαιτείται παραγωγοποίηση, τον τρόπο ανάδευσης και την προσθήκη ή μη πρόσθετων ουσιών. Ο σημαντικότερος παράγοντας στην επιτυχία της SPME είναι η συγγένεια των αναλυτών με τη στατική φάση. Η SPME παρέχει χαμηλά όρια ανίχνευσης και ποσοτικές ανακτήσεις. Ειδικά με τη HS-SPME επιτυγχάνονται εκχυλίσματα εξαιρετικής καθαρότητας, απαλλαγμένα από μη πτητικές

90 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών ανεπιθύμητες προσμίξεις, αφού η ίνα δε βυθίζεται στο δείγμα, οπότε λαμβάνονται μόνο οι υπό εξέταση ουσίες. Λεπτομερείς μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για τη θεωρητική περιγραφή της SPME 182. Η πληρότητα της εκχύλισης εξαρτάται από το συντελεστή κατανομής του αναλύτη προς τη συγκεκριμένη στατική φάση. Ενδεικτικές παράμετροι που εξετάζονται προς βελτιστοποίηση είναι η πολικότητα, η εσωτερική διάμετρος, το μήκος και το πάχος της στατικής φάσης, το ph και η ιοντική ισχύς του δείγματος και η ταχύτητα ροής. Αν αυξηθούν οι διαστάσεις της ίνας θα αυξηθεί η ποσότητα του δείγματος, οι ανεπιθύμητες προσμίξεις, καθώς και η διαπλάτυνση των κορυφών λόγω αργής εκρόφησης. Η τεχνική προετοιμασίας δειγμάτων της SPME σε σωλήνα ("In-tube" SPME) χρησιμοποιεί έναν ανοιχτό τριχοειδή σωλήνα, ο οποίος μπορεί να συνδεθεί σε σειρά (on-line) με GC, HPLC ή LC/MS. Η τεχνική αυτή επιδέχεται αυτοματοποίησης, με την εκχύλιση, εκρόφηση και ένεση στη στήλη να πραγματοποιούνται από έναν αυτόματο δειγματολήπτη, με αποτέλεσμα τη μείωση του συνολικού χρόνου ανάλυσης. Οι οργανικές ενώσεις εκχυλίζονται από υδατικά δείγματα, στο καλυμμένο με στατική φάση εσωτερικό του τριχοειδούς, το οποίο στη συνέχεια εκπλένεται και από εκεί εκροφώνται με ποσότητα κινητής φάσης ή διαλύτη εκρόφησης. Οι ουσίες αμέσως εισάγονται στη στήλη προς ανάλυση. Η βασική διαφορά μεταξύ της κλασικής SPME και της "In-tube" είναι ότι στην πρώτη οι αναλύτες προσροφώνται στην εξωτερική επιφάνεια της ίνας από αναδευόμενο διάλυμα, ενώ στην "In-tube" στην εσωτερική επιφάνεια τριχοειδούς από ρέον διάλυμα δείγματος 121. Στην "In-tube" SPME απαιτείται διήθηση του δείγματος πριν την εκχύλιση για την αποφυγή εμφράξεων. Οι ανεπιθύμητες ουσίες που προσροφώνται στην ίνα μπορούν να απομακρυνθούν με έκπλυσή της πριν την εισαγωγή στο θάλαμο εκρόφησης. Οι ίνες πρέπει να χειρίζονται με προσοχή γιατί είναι εύθραυστες και η στατική στιβάδα αποκολλάται εύκολα κατά την εισαγωγή και ανάδευση του δείγματος. Ακόμα μια σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο τεχνικών είναι ότι με τη SPME οι αναλύτες εκροφώνται κατά τη διάρκεια της ένεσης, καθώς η κινητή φάση περνά γύρω από την ίνα, ενώ με την "In-tube" SPME οι αναλύτες εκροφώνται, είτε με ροή κινητής φάσης, είτε με διαλύτη εκρόφησης σε δεύτερο φιαλίδιο και μετά εισάγονται στην αναλυτική στήλη. Με χρήση της SPME απουσιάζει η κορυφή του διαλύτη εκχύλισης από τα χρωματογραφήματα, αλλά παρατηρείται διαπλάτυνση των κορυφών λόγω αργής

91 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών εκρόφησης των αναλυτών από την ίνα, ενώ με την "In-tube" η διαπλάτυνση των κορυφών είναι πολύ μικρότερη αφού οι αναλύτες εκροφώνται πλήρως πριν την εισαγωγή στη στήλη. Σχήμα 3.12: Σχηματική παράσταση των τεχνικών SPME με: (Α) κλασική (fiber) και (Β) με σωλήνα (In tube) Παρά τα πλεονεκτήματα που αναφέρθηκαν για την SPME αξίζει να αναφερθεί 82 ότι η τεχνική αυτή δεν έχει χρησιμοποιηθεί για εκχύλιση δειγμάτων ρουτίνας λόγω σοβαρών μειονεκτημάτων για αυτή την εφαρμογή 15, όπως ο περιορισμένος αριθμός των εμπορικά διαθέσιμων ινών και τη δυσκολία αυτοματοποίησης για μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Πρόσθετες ενέργειες καθαρισμού απαιτούνται επίσης για επαναλαμβανόμενες αναλύσεις με την ίδια ίνα. Εφαρμογές της τεχνικής αυτής έχουν αναφερθεί για εκχύλιση μεμονωμένων ουσιών 183 ή ομάδων απαγορευμένων ουσιών σε βιολογικά υγρά 102, Αυτοματοποιημένες τεχνικές εκχύλισης 184 Σκοπός της αυτοματοποίησης της SPE είναι η βελτίωση της ταχύτητας και της αξιοπιστίας των αναλυτικών μεθόδων. Εφαρμόζονται τρεις τύποι ρομποτικών συστημάτων (at-line, on-line, in-line), όπως παρουσιάζονται στο Σχήμα 3.13, για την αυτοματοποίηση της SPE 185. Η "at-line" σύζευξη περιλαμβάνει προετοιμασία δειγμάτων από ρομποτική συσκευή και αυτόματο δειγματολήπτη για την ένεση των δειγμάτων στην αναλυτική στήλη. Δεν υπάρχει άμεση ροή υγρού μεταξύ της μονάδας εκχύλισης και της αναλυτικής μονάδας. Δεν αναλύεται όλη η ποσότητα του εκχυλίσματος, αλλά ένα κλάσμα αυτής. Μειονεκτήματα αποτελούν η συλλογή και η εξάτμιση του εκχυλίσματος. Παράδειγμα

92 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών συστήματος "at-line" αποτελεί η SPE με πλάκες 96 κυψελίδων. Με τα "on-line" συστήματα πραγματοποιείται άμεση εισαγωγή ολόκληρου του εκχυλίσματος στην αναλυτική στήλη. Πρόκειται για δύο συζευγμένες συσκευές, μία για την προετοιμασία των δειγμάτων και μία για την ενόργανη ανάλυσή τους. Τα δείγματα μπορούν να εκχυλίζονται και να αναλύονται το ένα μετά το άλλο, ή κατά τη διάρκεια της ανάλυσης του ενός να εκχυλίζεται το άλλο. Η δεύτερη περίπτωση εμφανίζει μεγαλύτερη αποδοτικότητα. Ένα εμφανές πλεονέκτημα των "on-line" συστημάτων είναι ότι κάποια πιθανά λάθη κατά τη διαδικασία εκχύλισης αποφεύγονται, αυξάνοντας έτσι την επαναληψιμότητα και ακρίβεια. Στα "in-line" συστήματα η παρασκευαστική διαδικασία είναι πλήρως ενσωματωμένη στην αναλυτική συσκευή, πρόκειται δηλαδή για ένα ενιαίο όργανο. Σχήμα 3.13: Σχηματική παρουσίαση των ολοκληρωμένων μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων με την τεχνική διαχωρισμού και ανίχνευσης 185 Η πιο κοινή "on-line" σύζευξη της SPE είναι με LC, αφού χρησιμοποιούνται παρόμοιοι διαλύτες και δεν απαιτούνται περαιτέρω τροποποιήσεις. Η "on-line" σύζευξη με GC συνεπάγεται ένεση μεγάλων όγκων διαλύτη στην αναλυτική στήλη, απαιτώντας

93 ΚΕΦ. 3 Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών περαιτέρω τροποποιήσεις στο σύστημα εισαγωγής δείγματος. Τα συστήματα εισαγωγής δείγματος είναι: 1) "on-column", 2) βρόχου και 3) θερμοκρασιακά προγραμματιζόμενου εξατμιστή (programmed temperature vaporizer, PTV). Τα "on-line" συστήματα παρουσιάζουν κάποια πλεονεκτήματα έναντι των "at-line". Ο "on-line" μηχανισμός ουσιαστικά αποτελεί τροποποίηση του κλασικού δειγματολήπτη, οπότε μπορεί εύκολα και φθηνά να εφαρμοσθεί. Ο προγραμματισμός των αντλιών και βαλβίδων καθορίζεται εύκολα μέσω κατάλληλου λογισμικού. Επιπλέον βελτιώνεται σημαντικά η ευαισθησία της μεθόδου, αφού όλο το εκχύλισμα οδηγείται στην αναλυτική στήλη. Το βασικό μειονέκτημα του "on-line" μηχανισμού είναι ο περιορισμένος χρόνος ζωής των φυσιγγίων SPE. Στα αυτόματα συστήματα προετοιμασίας δειγμάτων προκύπτουν προβλήματα που δεν αντιμετωπίζονται στον off line διαχωρισμό. Για παράδειγμα, η τοποθέτηση των φυσιγγίων πρέπει να είναι ακριβής, να υπάρχει επαρκής ποσότητα διαλυτών και να μη δημιουργούνται φυσαλίδες στα υγρά του συστήματος

94

95 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Κεφάλαιο 4 Τεχνική GC/TOFMS

96 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4.ΤΕΧΝΙΚΗ ΑΕΡΙΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑΣ- ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑΣ ΜΑΖΩΝ ΧΡΟΝΟΥ ΠΤΗΣΗΣ ΙΟΝΤΩΝ 4.1 Εισαγωγή Η αυξημένη ευαισθησία και η υψηλή εξειδίκευση της φασματομετρίας μαζών ως αναλυτικής τεχνικής, εξηγούν τη σημαντική θέση που κατέχει στις αναλυτικές τεχνικές για την ταυτοποίηση ουσιών. Σε συνδυασμό με την αεριοχρωματογραφία ή με την υγροχρωματογραφία προκύπτουν οι ονομαζόμενες "συνδυασμένες τεχνικές GC/MS ή LC/MS" που τυγχάνουν ευρείας εφαρμογής σε διάφορους τομείς, όπου υπάρχει η ανάγκη ταυτόχρονης ανίχνευσης ενός μεγάλου αριθμού ουσιών, όπως είναι η τοξικολογία, ο περιβαλλοντικός έλεγχος και ο έλεγχος ντόπινγκ. Οι αυξανόμενες απαιτήσεις για την ταυτόχρονη ανίχνευση ουσιών σε λειτουργία πλήρους σάρωσης, καθώς και με εξαιρετική ακρίβεια προσδιορισμού μαζών (accurate mass) οδήγησε στην ανάπτυξη της τεχνικής GC/TOFMS 186,187. Η τεχνική αυτή η οποία επιτρέπει τον προσδιορισμό της δομής άγνωστων ουσιών με βάση τις πληροφορίες που παρέχει για τα ακριβή μοριακά βάρη αυτών, θεωρείται μια από τις καλύτερες τεχνικές για την ανάλυση δειγμάτων ρουτίνας. Τα κύρια πλεονεκτήματα που εμφανίζει είναι η υψηλή διαχωριστική ικανότητα (~7000 Full Width Half Maximum, FWHM), το μεγάλο εύρος μαζών και η δυνατότητα λήψης μεγάλου αριθμού φασμάτων σε μικρό χρονικό διάστημα. 4.2 Οργανολογία στη φασματομετρία μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Τα κυριότερα τμήματα μιας χρωματογραφικής διάταξης 188 φασματομέτρου μαζών είναι τα παρακάτω: 1) Σύστημα εισαγωγής του δείγματος, 2) Πηγή ιόντων, 3) Αναλυτής μαζών, 4) Ανιχνευτής, 5) Διάταξη ψηφιοποίησης

97 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Σύστημα εισαγωγής δείγματος Σκοπός του συστήματος εισαγωγής του δείγματος είναι η προετοιμασία του δείγματος για την εισαγωγή του στο χώρο ιοντισμού (πηγή ιόντων), κάτω από συνθήκες σταθερής ροής και σε αέρια κατάσταση. Στην περίπτωση δειγμάτων ενώσεων με περιoρισμένη πτητικότητα ή στερεών, η εξαέρωσή τους διευκολύνεται με θέρμανση σε συνθήκες υψηλού κενού. Με κατάλληλο στόμιο εισαγωγής, το αέριο δείγμα εισάγεται σε ενδιάμεσο χώρο με μικρότερη πίεση (τυπικά 10-5 Torr), χώρο απ όπου, με σταθερή παροχή εισάγεται στο χώρο ιοντισμού, όπου επικρατεί ακόμη χαμηλότερη πίεση (τυπικά Torr), ώστε να αποφεύγονται οι συγκρούσεις μεταξύ των ιόντων Πηγή Ιόντων Η πηγή ιόντων (ion source) είναι ο χώρος όπου επιτυγχάνεται η παραγωγή των χαρακτηριστικών, για την υπό προσδιορισμό ουσία, ιόντων με μονομοριακές (πρόσκρουση ηλεκτρονίων, ιοντισμός με πεδίο) ή διμοριακές (χημικός ιοντισμός) τεχνικές. Η πηγή που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή είναι η πηγή ιοντισμού με πρόσκρουση ηλεκτρονίων (electron impact ή EI sourse). Το ρεύμα των μορίων της ένωσης Μ, που εισάγεται στην πηγή, βομβαρδίζεται με δέσμη ηλεκτρονίων μεγάλης κινητικής ενέργειας, στην περιοχή ev, συνήθως 70 ev. Κατά την πορεία τους τα ηλεκτρόνια συγκρούονται με μερικά από τα μόρια της ένωσης Μ οπότε παράγονται θετικά μοριακά ιόντα (κατιοντικές ρίζες). Όλα τα παραγόμενα ιόντα αρχικά έχουν τυχαίες κατευθύνσεις, το ισχυρό όμως ηλεκτρικό πεδίο προκαλεί σύγκλιση των ιόντων σε μια λεπτή ταινιωτή δέσμη με ελάχιστη απόκλιση, κατάλληλη για να υποστεί ανάλυση στον αναλυτή μαζών Αναλυτής Μαζών Η βασική λειτουργία του αναλυτή μαζών σε ένα φασματόμετρο μαζών είναι να διαχωρίσει τα ιόντα, που παράγονται στην πηγή ιόντων, ανάλογα με τις διαφορετικές τιμές των λόγων m/z. Ο διαχωρισμός είναι απαραίτητος έτσι, ώστε το μετρούμενο ιοντικό ρεύμα στον ανιχνευτή ιόντων, που ακολουθεί τον αναλυτή μαζών, να αντιστοιχεί σε ιόντα με συγκεκριμένο λόγο m/z

98 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Από τον τύπο του αναλυτή μαζών εξαρτάται η διαχωριστική ικανότητα (resolution) του οργάνου, που είναι το σπουδαιότερο χαρακτηριστικό ποιότητας ενός φασματομέτρου μαζών. Η διαχωριστική (ή διακριτική) ικανότητα (R) ορίζεται από το λόγο R= m/δm (4.1) όπου m και m+δm αντιστοιχούν σε λόγους m/z με κορυφές ικανοποιητικά διαχωρισμένες. Κατά συνθήκη, ικανοποιητικός διαχωρισμός θεωρείται ότι επιτυγχάνεται, όταν οι περίπου ισοϋψείς κορυφές επικαλύπτονται σε ύψος, που δεν υπερβαίνει το 10% του ύψους των κορυφών. Για παράδειγμα, R= 1000 σε μάζα 100,0 σημαίνει ότι το φασματόμετρο μπορεί να διαχωρίσει τη μάζα 100 από τη μάζα 100,1 (Δm = 0,1). Τα φασματόμετρα μαζών διακρίνονται σε φασματόμετρα χαμηλής και υψηλής διαχωριστικής ικανότητας. Στα πρώτα, που έχουν διαχωριστική ικανότητα από 100 έως 1000, τα διάφορα ιόντα διακρίνονται με βάση την ονομαστική μάζα (nominal mass), που αντιστοιχεί στην πλησιέστερη ακέραιη τιμή προς το μοριακό τους βάρος. Με τα φασματόμετρα υψηλής διαχωριστικής ικανότητας (R= ) μπορούν να διαχωριστούν ιόντα με ίδια ονομαστική μάζα, αλλά με διαφορετικές τιμές ακριβούς μάζας (exact mass), που διαφέρουν στο τρίτο ή και στο τέταρτο δεκαδικό ψηφίο. Η τεχνική GC/TOFMS ανήκει στις τεχνικές υψηλής διαχωριστικής ικανότητας με τιμή R (όπου R=t/2Δt, όπου t ο χρόνος πτήσης του ιόντος και Δt το πλάτος στο μέσον του μεγίστου της κορυφής του ιόντος στον άξονα του χρόνου) περίπου Η κύρια διαφορά μεταξύ διαφόρων φασματομέτρων μαζών έγκειται στους αναλυτές, που χρησιμοποιούν για το διαχωρισμό των ιόντων. Ο αναλυτής που χρησιμοποιείται στην τεχνική GC/TOFMS είναι αναλυτής "χρόνου πτήσεως" (time-of-flight analyzer). Οι αναλυτές "χρόνου πτήσεως" βασίζονται στο ότι όταν ιόντα με διαφορετικές μάζες επιταχύνονται και αποκτούν την ίδια κινητική ενέργεια, κάθε ιόν αποκτά μια χαρακτηριστική ταχύτητα, η οποία είναι αντιστρόφως ανάλογη της τετραγωνικής ρίζας του λόγου μάζα προς φορτίο (m/z). Η παραγωγή των ιόντων στην πηγή ιόντων δεν είναι συνεχής, αλλά γίνεται με βραχείς παλμούς. Τα ιόντα επιταχύνονται με το δυναμικό V και διακρίνονται μεταξύ τους με βάση το διαφορετικό χρόνο πτήσεως, που απαιτείται για να διανύσουν σωλήνα συγκεκριμένου μήκους και να φτάσουν στον ανιχνευτή. Οι

99 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων χρόνοι πτήσης κατόπιν χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των λόγων m/z των αντίστοιχων ιόντων. Έτσι, λοιπόν 191 όταν εφαρμοστεί σταθερό δυναμικό V σε ένα ιόν φορτίου ez, το ιόν αυτό θα αποκτήσει κινητική ενέργεια E που δίνεται από τη σχέση: E = Vez (4-2) και θα κινηθεί παράλληλα προς το εφαρμοζόμενο πεδίο με ταχύτητα u, η οποία εξαρτάται από τη μάζα του ιόντος, m, και το φορτίο του (όπου e είναι το φορτίο ενός ηλεκτρονίου), σύμφωνα με τη σχέση: 1 mu 2 η οποία μπορεί να γραφεί με τη μορφή Vez = 2 (4-3) 2eVz m = (4-4) 2 u Όπως φαίνεται από τη σχέση (4-4), για δεδομένη κινητική ενέργεια, τα ιόντα που έχουν μικρή μάζα θα έχουν μεγαλύτερη ταχύτητα από τα ιόντα που έχουν μεγαλύτερη μάζα. Στο TOFMS, τα ιόντα που εξέρχονται από την πηγή επιταχύνονται με γνωστή κινητική ενέργεια και αναγκάζονται με την περιοδική εφαρμογή παλμών να εισέλθουν σε θάλαμο πτήσης γνωστού μήκους L στον οποίο υπάρχει ισχυρό κενό χωρίς την επίδραση πεδίου. Η χρονική στιγμή της εφαρμογής του παλμού ορίζεται ως t=0. Κατά τη διάρκεια της πτήσης τους, τα ιόντα διαχωρίζονται κατά μήκος του άξονα κίνησης με βάση την τιμή του λόγου m/z. Στο τέλος του θαλάμου πτήσης τα ιόντα προσκρούουν σε ένα ανιχνευτή και καταγράφονται οι αντίστοιχοι χρόνοι πτήσης. Έτσι, αν ο χρόνος πτήσης δίνεται από τη σχέση: t = L / u (4-5) τότε για γνωστές τιμές εφαρμοζόμενου δυναμικού επιτάχυνσης και μήκους διαδρομής πτήσης, υπολογίζεται ο λόγος m/z, ο οποίος είναι ανάλογος του τετραγώνου του χρόνου πτήσης του αντίστοιχου ιόντος: m t = 2 Ve (4-6) 2 ( ) z L Κατά αυτό τον τρόπο, η εφαρμογή του παλμού δημιουργεί ένα μικρό σύνολο από ιόντα (δέσμη ιόντων), το οποίο κατά τη διάρκεια της πτήσης διαχωρίζεται σε μικρότερες δέσμες ιόντων ανάλογα με τις επιμέρους ταχύτητες των ιόντων έτσι, ώστε η άφιξή τους στον ανιχνευτή να μπορεί να καταγραφεί με τη μορφή φάσματος μαζών

100 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Έτσι λοιπόν τα ιόντα με μεγαλύτερη μάζα φτάνουν αργότερα στον ανιχνευτή σε σχέση με τα ιόντα μικρότερης μάζας Ανιχνευτής Ιόντων Ο ανιχνευτής ιόντων παράγει στην έξοδό του ηλεκτρικό σήμα (συνήθως ηλεκτρικό ρεύμα), ανάλογο του αριθμού ιόντων και του φορτίου τους, που δέχεται στην είσοδό του στη χρονική μονάδα. Οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενοι ανιχνευτές είναι οι ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστές (electron multiplier) και οι ανιχνευτές πλακών πολλαπλής διέλευσης 190,195 (multi-channel plate detectors, MCP). Ο ανιχνευτής που χρησιμοποιήθηκε στην τεχνική GC/TOFMS είναι ο MCP. Ο ανιχνευτής αυτός αποτελείται από λεπτή πλάκα την οποία διαπερνά πλήθος μικροσκοπικών σωλήνων (microchannels), όπως φαίνεται στο Σχήμα 4.1. Σχήμα 4.1: Ανιχνευτής MCP Όταν ένα ιόν με επαρκή ενέργεια προσκρούσει στο MCP ελευθερώνεται ένας παλμός ηλεκτρονίων στην άνοδο. Κάθε μικροσωλήνας του MCP λειτουργεί ως ένας ηλεκτρονιοπολλαπλασιαστής έτσι, ώστε για κάθε εισερχόμενο ιόν να αντιστοιχούν περίπου 10 εξερχόμενα ηλεκτρόνια, τα οποία επιταχύνονται και προσκρούουν σε ταλαντωτή που με τη σειρά του εκπέμπει

101 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων φωτόνια. Το ηλεκτρικό σήμα που παράγεται με τη βοήθεια κατάλληλου φωτοπολλαπλασιαστή είναι ανάλογο του αριθμού των φωτονίων. Για πολύ μεγάλη τιμή m/z η πιθανότητα δημιουργίας δευτερογενών ηλεκτρονίων μειώνεται, καθώς εξαρτάται από την ταχύτητα του εισερχόμενου ιόντος και όχι από την κινητική του ενέργεια. Έτσι, αυτός ο τύπος ανιχνευτών παρουσιάζει προβλήματα σε υψηλές τιμές m/z Διάταξη ψηφιοποίησης Όπως ήδη αναφέρθηκε μια από τις προδιαγραφές των φασματομέτρων χρόνου πτήσης στην οποία δίνεται έμφαση είναι ο αριθμός φασμάτων που καταγράφονται ανά δευτερόλεπτο. Αν υποτεθεί μέγιστος χρόνος πτήσης 50 μs, τότε ο ρυθμός σάρωσης είναι 20 khz, που σημαίνει ότι φάσματα λαμβάνονται κάθε δευτερόλεπτο. Στην πραγματικότητα, ένα σύνολο από πρακτικούς και θεμελιώδεις περιορισμούς μειώνουν σημαντικά τον αριθμό "χρήσιμων" φασμάτων που καταγράφονται στα 100 φάσματα ανά δευτερόλεπτο, μέγεθος που εξακολουθεί να είναι σημαντικά υψηλότερο σε σχέση με τα φασματόμετρα σάρωσης. Η τρέχουσα διαθέσιμη τεχνολογία ηλεκτρονικών υπολογιστών έχει τη δυνατότητα επεξεργασίας φασμάτων 190,195 που λαμβάνονται σε αυτό το ρυθμό, αλλά οι μέθοδοι ψηφιοποίησης παλμού που είναι διαθέσιμες δεν καλύπτουν πλήρως τις ανάγκες των σημερινών αναλυτών TOFMS. Η διάταξη ψηφιοποίησης που χρησιμοποιήθηκε είναι ο μετατροπέας χρόνου σε ψηφιακό σήμα (time to digital converter, TDC). Τα συστήματα αυτά ανιχνεύουν χρονικά όλους τους παλμούς (start και stop events) και αποθηκεύουν τους χρόνους αυτών των συμβάντων ή το χρονικό διάστημα που μεσολαβεί μεταξύ τους. Κάθε παλμός επιτάχυνσης καταλήγει σε ένα φάσμα από χρόνους άφιξης ιόντων και αυτά τα μεμονωμένα φάσματα αθροίζονται στη μνήμη ηλεκτρονικού υπολογιστή, ο οποίος κατασκευάζει ένα ιστόγραμμα που αποτελείται από αρκετές εκατοντάδες παλμούς ιόντων σε συνεχόμενα μεμονωμένα χρονικά διαστήματα. Τα TDCs είναι εφοδιασμένα με διατάξεις που δίνουν το έναυσμα έναρξης της καταγραφής, μόνο όταν η ένταση του εισερχόμενου σήματος είναι τουλάχιστον ίση με μια προκαθορισμένη τιμή. Η τεχνική αυτή λειτουργεί ικανοποιητικά όταν υπάρχει μικρή πιθανότητα να συμπέσει χρονικά η άφιξη δύο ή περισσότερων ιόντων. Όταν όμως αυτό συμβεί, καταγράφεται μόνο ένα "stop event" (καθώς το δεύτερο εισερχόμενο

102 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων σήμα δεν καταγράφεται αν το πρώτο σήμα δεν πέσει κάτω από το προκαθορισμένο όριο νεκρός χρόνος (dead time), οπότε σημειώνονται απώλειες καταγραφών και μετατοπίσεις κορυφών προς χαμηλότερες μάζες, όπως εξηγείται παρακάτω. Για το λόγο αυτό, οι συγκεκριμένες διατάξεις δεν είναι κατάλληλες για υψηλούς ρυθμούς άφιξης ιόντων. Παρόλα αυτά παρουσιάζουν βασικά πλεονεκτήματα: δεν καταγράφονται μηδενικά δεδομένα, υπάρχει πολύ μικρός θόρυβος υποβάθρου, οι συσκευές που χρησιμοποιούνται είναι σχετικά απλές και δίνουν καλή διαχωριστικότητα κορυφών χρονικά όταν συνδυαστούν με τις κατάλληλες διατάξεις. 4.3 Διάταξη του GC/TOFMS-Premier Η διάταξη 190 του GC/TOFMS που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία απεικονίζεται στο Σχήμα 4.2 Σχήμα 4.2: Απεικόνιση GC/TOFMS με ορθογώνια επιτάχυνση και ανακλαστικό κάτοπτρο Το χρησιμοποιούμενο όργανο είναι ένα υψηλής απόδοσης φασματόμετρο μαζών ορθογώνιας επιτάχυνσης (με ανακλαστικό κάτοπτρο). Για την ανίχνευση πτητικών ουσιών το όργανο συνδέεται με αεριοχρωματογράφο

103 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Το δείγμα εισάγεται στην εσωτερική πηγή όπου παράγονται τα ιόντα. Στη συνέχεια η δέσμη των ιόντων που προέρχεται από την πηγή αρχικά αφήνεται να γεμίσει ένα χώρο του επιταχυντή ιόντων στον οποίο δεν υπάρχει καμία επίδραση πεδίου (5-10% σε αναλογία του θαλάμου πτήσης). Όταν ο χώρος αυτός γεμίσει, εφαρμόζεται ένας ταχύς ( ns) παλμός δυναμικού μεταξύ των ηλεκτροδίων του επιταχυντή δημιουργώντας έτσι αναπαραγώγιμο ηλεκτρικό πεδίο. Υπό την επίδραση του πεδίου αυτού, όλα τα ιόντα που βρίσκονται εκείνη τη χρονική στιγμή στο συγκεκριμένο χώρο του επιταχυντή ωθούνται μέσω σχισμής εντός δεύτερου χώρου. Στο δεύτερο χώρο, τα ιόντα υφίστανται ταυτόχρονα την ίδια επιτάχυνση, με φορά κάθετη προς την αρχική τους κατεύθυνση και εισέρχονται στο χώρο πτήσης. Μόλις επιταχυνθεί το πρώτο πακέτο ιόντων τα ηλεκτρόδια ηρεμούν ώστε να ξαναγεμίσει ο χώρος επιτάχυνσης με νέο τμήμα της δέσμης ιόντων. Η δέσμη ιόντων, ο επιταχυντής και ο ανιχνευτής αποτελούν μια ορθογώνια διάταξη 190,192,196. Το ηλεκτροστατικό πεδίο είναι έτσι σχεδιασμένο ώστε η δύναμη που εφαρμόζεται να είναι αυστηρά κάθετη στον άξονα της δέσμης ιόντων. Καθώς τα ιόντα της δέσμης κινούνται αρχικά σχεδόν παράλληλα μεταξύ τους, έχουν μηδενική μέση ταχύτητα και ελάχιστη διασπορά ταχυτήτων στον άξονα κατά τον οποίο εφαρμόζεται η επιτάχυνση. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η βέλτιστη εστίαση των ιόντων στον άξονα του θαλάμου πτήσης. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο χρόνος ηρεμίας των ηλεκτροδίων (fill-up mode) πρέπει να είναι επαρκής ώστε να επιτραπεί στα ιόντα με m/z ίσο με το άνω όριο του εύρους μαζών να φτάσουν στο χώρο πριν την επόμενη εφαρμογή του παλμού (push-out mode). Μέσα στον αναλυτή μαζών τα ιόντα ανακλώνται μέσω του ανακλαστικού κατόπτρου 190,192,196 (reflectron ion mirror) στον ανιχνευτή MCP. Η διάταξη του ανακλαστικού κατόπτρου, που αποτελείται ουσιαστικά από ένα ηλεκτροστατικό κάτοπτρο, δημιουργεί ένα ή περισσότερα πεδία επιβράδυνσης που αντιτίθενται στο πεδίο επιτάχυνσης. Τα ιόντα αναδύονται από το ανακλαστικό κάτοπτρο με ανεστραμμένες ταχύτητες. Καθώς ο χρόνος που απαιτείται για να ταξιδέψει ένα ιόν διαμέσου του κατόπτρου είναι αντιστρόφως ανάλογος της τετραγωνικής ρίζας της ενέργειας πτήσης του, τα ιόντα με τη μεγαλύτερη ενέργεια (ταχύτερα) εισδύουν σε μεγαλύτερο βάθος στο κάτοπτρο και συνεπώς απαιτούν περισσότερο χρόνο για την ανάκλασή τους, επιτρέποντας τη χρονική σύμπτωσή τους με τα βραδύτερα ιόντα ίδιου

104 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων m/z. Έτσι, με την κατάλληλη ρύθμιση του επιβραδυντικού πεδίου, γίνεται απόσβεση των αρχικών διασπορών ταχύτητας και διάταξης στο χώρο, ώστε ιόντα με ίδιο m/z να φτάνουν στον ανιχνευτή την ίδια χρονική στιγμή. Ένα επιπλέον πλεονέκτημα του ανακλαστικού κατόπτρου είναι η αύξηση (σχεδόν διπλασιασμός) της διαδρομής πτήσης χωρίς αύξηση του μεγέθους του οργάνου. Η αύξηση της διαδρομής πτήσης αυξάνει τον παράγοντα t στο λόγο R=t/2Δt διατηρώντας παράλληλα μικρό το Δt με τη βοήθεια του κατόπτρου, με συνέπεια τη σημαντική βελτίωση της διαχωριστικής ικανότητας του οργάνου. Τέλος, όπως ήδη αναφέρθηκε, οι αφίξεις των ιόντων στον ανιχνευτή καταγράφονται χρησιμοποιώντας το μετατροπέα χρόνου σε ψηφιακό σήμα (TDC). Σε συνέχεια της άφιξης και καταγραφής ενός ιόντος από το μετατροπέα TDC, μεσολαβεί ένα ελάχιστο χρονικό διάστημα πριν την επόμενη άφιξη ιόντος. Το διάστημα αυτό καλείται νεκρός χρόνος του TDC και είναι της τάξεως των 5 ns. Στην περίπτωση που περισσότερα από ένα ιόντα καταφθάσουν στον ίδιο χρόνο καταγράφεται μόνο το ένα ιόν. Όταν το ηλεκτρόδιο ώθησης λειτουργεί σε συχνότητα 25kHz ένα πλήρες φάσμα καταγράφεται κάθε 40 μs. Ένα από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά οποιουδήποτε φασματομέτρου μαζών που πρέπει να αναφερθεί είναι το δυναμικό εύρος, το οποίο συνήθως ορίζεται ως το εύρος, είτε αριθμού ιόντων, είτε συγκέντρωσης δείγματος στο οποίο λαμβάνεται γραμμική απόκριση από τον ανιχνευτή. Το δυναμικό εύρος του TDC περιορίζεται σημαντικά από το "νεκρό χρόνο" 190,195. Σε μεγάλα ρεύματα ιόντων ένα μέρος από τις αφίξεις τους δεν καταγράφεται και κατά συνέπεια παρατηρείται μετατόπιση προς χαμηλότερες μάζες (Σχήμα 4.3) και μικρότερα μετρούμενα εμβαδά στις αντίστοιχες κορυφές

105 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Σχήμα 4.3: Φαινόμενο κορεσμού ανιχνευτή στο φασματόμετρο μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Στο Σχήμα ,198 παρουσιάζεται η μετάβαση από μη κορεσμένο σήμα (Α, Β) σε κορεσμένα (C, D, E) χρησιμοποιώντας την απεικόνιση κορυφών σε πραγματικό χρόνο σε κατάσταση συνεχούς φάσματος. Οι καταγεγραμμένες εντάσεις των κορεσμένων ιόντων φαίνεται να τείνουν σε σταθερή τιμή, ενώ είναι σημαντικό να αναγνωριστεί η εκδήλωση του κορεσμού με την αλλαγή του σχήματος και της θέσης της κορυφής. Ωστόσο, το λογισμικό ενσωματώνει ψηφιακή διόρθωση του νεκρού χρόνου (Digital Dead Time Correction DDTC), η οποία αντισταθμίζει το φαινόμενο αυτό, επιτρέποντας την επίτευξη μεγάλης ακρίβειας μετρήσεις μαζών και ποσοτικοποίηση σε μεγάλο εύρος ρευμάτων ιόντων. Πρόσφατα η τεχνολογία της βελτίωσης του δυναμικού εύρους 190,199,200 (dynamic range enhancement, DRE) εισήχθη στο χώρο του TOF-MS, η οποία επιτρέπει την επέκταση του δυναμικού εύρους λειτουργίας του οργάνου κατά μια τάξη μεγέθους, μεγιστοποιώντας την πληροφορία που λαμβάνεται από μία και μοναδική ανάλυση, για ακριβή μέτρηση μάζας, αλλά και για ποσοτικές μελέτες. Η DRE επιδέχεται προγραμματισμό, δίνοντας τη δυνατότητα επιλογής μεταξύ λειτουργίας χαμηλής και υψηλής απόδοσης του φασματομέτρου μαζών. Η λειτουργία βελτίωσης δυναμικού εύρους (Dynamic Range Enhancement DRE) αυξάνει το εύρος γραμμικής περιοχής του οργάνου. Επιτρέπει την ανάλυση πυκνών δειγμάτων που παράγουν υψηλά σήματα

106 ΚΕΦ. 4 Τεχνική Αεριοχρωματογραφίας- Φασματομετρίας Μαζών χρόνου πτήσης ιόντων Η λειτουργία αυτή επιτυγχάνεται μέσω ειδικών φακών που εστιάζουν και καθοδηγούν τη δέσμη ιόντων στην διεύθυνση z. Το όργανο λαμβάνει δεδομένα χρησιμοποιώντας δύο λειτουργίες: μία υπό κανονικές συνθήκες (υψηλή ένταση) και μία με την ακτίνα ελαφρώς μη εστιασμένη (μειωμένη ένταση). Στις περιπτώσεις όπου παρατηρείται κορεσμός στον ανιχνευτή στη σάρωση υψηλής έντασης, η σάρωση μειωμένης έντασης δεν είναι κορεσμένη και επιτρέπει την ακριβή μέτρηση μαζών των κορυφών. Έτσι για παράδειγμα, χρόνος σάρωσης 0,24 s αποτελείται από 2 φάσματα/s σε κατάσταση χαμηλής ευαισθησίας και 2 σαρώσεις/s σε κατάσταση υψηλής ευαισθησίας. Η λογική εφαρμογής του DRE είναι η εξής: Οι μεγάλες κορυφές του χρωματογραφήματος υψηλής έντασης είναι κορεσμένες (και κατά συνέπεια η ακρίβεια μαζών είναι μικρή). Ωστόσο, τα δεδομένα είναι αποδεκτά στην περίπτωση κορυφών μειωμένης έντασης. Το λογισμικό ελέγχει κάθε φάσμα υψηλής έντασης για επισημάνσεις σε κορυφές. Αν καμία κορυφή δεν έχει επισημανθεί (λόγω κορεσμού), τότε χρησιμοποιεί τα δεδομένα υψηλής έντασης και απορρίπτει εκείνα χαμηλής έντασης. Στην αντίθετη περίπτωση, αναζητά στα δεδομένα χαμηλής έντασης που καταγράφονται πριν και μετά την καταγραφή υψηλής έντασης και βρίσκει τις πληροφορίες που αφορούν τις κορεσμένες κορυφές. Υπολογίζει αυτόματα το μέσο όρο των μαζών και εντάσεων, πολλαπλασιάζει με τον κατάλληλο συντελεστή και προσαρμόζει τις τιμές στο υπάρχον φάσμα για να δημιουργήσει μια καλύτερη απεικόνιση των "προβληματικών" κορυφών με ακριβείς μετρήσεις μαζών

107 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

108

109 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Κεφάλαιο Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών

110 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ 5.1 Εισαγωγή Βασική απαίτηση για τα εργαστήρια ελέγχου φαρμακοδιέγερσης αποτελεί η ικανότητα ανίχνευσης, ενός πολύ μεγάλου αριθμού απαγορευμένων ουσιών όπως αυτές καθορίζονται στη λίστα του WADA 11, στο MRPL. Οι ουσίες αυτές, οι οποίες ανήκουν σε διαφορετικές κατηγορίες και έχουν διαφορετικές ιδιότητες που σχετίζονται με την πολικότητα, την πτητικότητα και το μοριακό τους βάρος ανιχνεύονται κυρίως με τη χρήση των τεχνικών GC/MS και LC/MS. Παρά την αυξανόμενη εφαρμογή της τεχνικής LC/MS στην ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών, τα πλεονεκτήματα της τεχνικής GC/MS εξακολουθούν να είναι σημαντικά κυρίως για την εφαρμογή της σε μεθόδους σάρωσης. Βάσεις δεδομένων που περιλαμβάνουν φάσματα μαζών των εξεταζομένων με GC/MS, παραγωγοποιημένων ουσιών είναι σήμερα διαθέσιμες σε ένα μεγάλο αριθμό, διευκολύνοντας με αυτό τον τρόπο την ταυτοποίησή τους. Όπως ήδη αναφέρθηκε (υποκεφάλαιο 2.1) η ανάλυση των ουσιών με GC/MS περιλαμβάνει το στάδιο της παραγωγοποίησης με σκοπό μεταξύ των άλλων τη βελτίωση της χρωματογραφικής συμπεριφοράς. Διάφορες μέθοδοι παραγωγοποίησης, έχουν προταθεί στη βιβλιογραφία για τις περισσότερες ομάδες των απαγορευμένων ουσιών. Μέχρι πρότινος οι μέθοδοι σάρωσης για την ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών περιελάμβαναν τη χρήση διαφορετικών παρασκευαστικών και αναλυτικών μεθοδολογιών. Παρά την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου υδρόλυσης για το σύνολο των εξεταζόμενων ουσιών 201, βασικό μειονέκτημα εξακολουθεί να παραμένει η εφαρμογή κοινής πορείας παραγωγοποίησης. Η ανίχνευση των διεγερτικών και ναρκωτικών ουσιών επιτυγχάνεται με το σχηματισμό παραγώγων TMS-TFA, των διουρητικών με το σχηματισμό μεθυλο-παραγώγων, ενώ αντίστοιχα των αναβολικών στεροειδών με το σχηματισμό TMS- και ενολ-tms παραγώγων. Στα πλαίσια της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου σάρωσης, των απαγορευμένων ουσιών, αναπτύχθηκε ενιαία μέθοδος παραγωγοποίησης η οποία επιτρέπει την ανίχνευση ενός μεγάλου αριθμού μελετούμενων ουσιών στο MRPL. Η μελέτη του σταδίου παραγωγοποίησης περιλαμβάνει την εφαρμογή ενός διπλού

111 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών σταδίου, με το σχηματισμό TMS-παραγώγων. Βελτιστοποίηση της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης πριν την εφαρμογής της στο σύνολο των εξεταζομένων ουσιών, πραγματοποιήθηκε με τη μελέτη διαφόρων παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοσή της (υποκεφάλαιο 2.3). 5.2 Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Λεπτομερής περιγραφή των υλικών αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν έχει ήδη αναφερθεί 5. Περιληπτικά τα υλικά αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των δειγμάτων ελέγχου είναι: α) Για τα διεγερτικά-ναρκωτικά, των εταιρειών Sigma-Aldrich (Γερμανία), Lipomed (Ελβετία), LCG Standards (Γερμανία) και Acros Organics (Βέλγιο), β) Για τα διουρητικά των εταιρειών Sigma-Aldrich και European Pharmacopeia (Γαλλία), γ) Για τα αναβολικά στεροειδή των εταιρειών Sigma, LGC, και Steraloids. Τα πολυσυστατικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής (χρησιμοποιούνται οι συμβολισμοί του Εργαστηρίου Doping για την αποφυγή συγχύσεως με τις χρησιμοποιούμενες μεθοδολογίες): Ι) ένα δείγμα ποιοτικού ελέγχου (STDC) που περιλαμβάνει 12 αντιπροσωπευτικές ουσίες (με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες) από τις κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών, για τα πειραματικά πρωτόκολλα που περιγράφονται στα εδάφια Η σύσταση του πολυσυστατικού STDC, καθώς και οι μελετούμενες συγκεντρώσεις συνοψίζονται στον Πίνακα 5.1. Πίνακας 5.1: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου STDC Ουσία C STDC (mg/l) C ούρων (μg/l) 1 Testosterone 25, Androsterone 25, β-OH methandienone 25, Fluoxymesterone tetrol mt2 25, OH-stanozolol 25, Aminogluthethimide 25, Amiloride 25, Atenolol 25, Benzoyl ecgonine 50,0 1,0x Amphetamine 50,0 1,0x Ethacrynic acid 50,0 1,0x Ephedrine 150 3,0x

112 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Οι μελετούμενες συγκεντρώσεις του πολυσυστατικού STDC είναι μεγαλύτερες του MRPL, όπως αυτό καθορίζεται από το WADA (υποκεφάλαιο 1.6). ΙΙ) 5 δείγματα ελέγχου (CMIX, 471, 847, CALWADA, CALD) για τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στο εδάφιο Οι ουσίες που περιέχονται σε κάθε δείγμα ελέγχου και η συγκέντρωσή τους σε αυτό παρουσιάζονται στους παρακάτω πίνακες. H συγκέντρωση των μελετούμενων ουσιών στα δείγματα ελέγχου είναι ίση με το MRPL (υποκεφάλαιο 1.6): Πίνακας 5.2: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CMIX C cmix C cmix ΟΥΣΙΑ ΟΥΣΙΑ (mg/l) (mg/l) Boldenone PC 5,0 17α-methyl-5α-androstane-3α,17β-diol 5,0 (Methyltestosterone MT) Methenolone PC 5,0 6β-OH-4-Cl-dehydromethyltestosterone (Oral 5,0 Turinabol MT) Furazabol PC 5,0 16β-OH-Furazabol (Furazabol MT) 5,0 16β-OH-Stanozolol 5,0 Calusterone 5,0 Bambuterol 5,0 7β,17α-dimethyl-5β-androstan-3α,17β-diol (Calusterone MT) 2α-methyl-5α-androstane-3αol-17-one 5,0 13β-17α-diethyl-3α,17β-dihydroxy-5α-gonane (Drostanolone MT) (Norbolethone MT) 17-epimethandienone (Methandienone MT) 5,0 13β-17α-diethyl-3α,17β-dihydroxy-5β-gonane (Norbolethone MT) Epioxandrolone 5,0 Formoterol 5,0 7α,17α-dimethyl-5β-androstan- 3α,17β-diol (Bolasterone MT) 17-ethyl-5α-estran-3α,17β-diol (Norethandrolone MT) 1α-methylen-5α-androstan-3αol-17-one (Methenolone MT) 1α-methyl-5α-androstan-3α-ol- 17-one (Mesterolone MT) 4-chloro-4-androstene-3α-ol- 17-one (Clostebol MT) 5,0 Tetrahydrogestrinone 5,0 5,0 Acebutolol 25 5,0 Alprenolol 25 5,0 Atenolol 25 5,0 Bisoprolol 25 Gestrinone 5,0 Bunolol 25 Bolasterone pc 5,0 Betaxolol 25 Zeranol 5,0 Carteolol norandrosterone 5,0 Carvedilol 25 (Nandrolone MT) 19-noretiocholanolone 5,0 Celiprolol 25 (Nandrolone MT) Salbutamol 5,0 Esmolol 25 4-OH-Testosterone 5,0 Labetalol 25 5,0 5,0 5,

113 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.2 (συνέχεια) 17α-methyl-5β-androstane- 5,0 Levobunolol 25 3α,17β-diol (Methyltestosterone MT) Epimetendiol (Methandienone 5,0 Metipranolol 25 MT) Formoterol 5,0 Metoprolol 25 Formestane 5,0 Nadolol nor-17,17-dimethylfluoxymesterone 5,0 Oxprenolol 25 (Fluoxymesterone MT) 9α-F-17α-methyl-androst-4-5,0 Penbutolol 25 ene-3α,6β,11β,17β-tetrol (Fluoxymesterone MT) 3'-OH-Stanozolol (Stanozolol 5,0 Pindolol 25 MT) 2-OH-methyl-17α-methylandrostan-6,11α,17β-triol 5,0 Propranolol 25 (OH- Formebolone) 6-α-OH-androsten(4)dione 5,0 Sotalol 25 6-β-OH-Methandienone 5,0 Timolol 25 Mibolerone 5,0 Pemoline ethyl-5b-estran-3α,17β-diol (Norethandrolone MT) 5,0 Amiloride 13 Salmeterol 5,0 Clopamide 13 Aminoglutethimide 5,0 TriaMTerene 13 Oxandrolone 5,0 Buprenorphine 10 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one (Boldenone MT) 17α-ethyl-5β-estrane-3α,17βdiol (Norethandrolone MT) 5,0 Benzoyl egconine 25 5,0 Probenecid 13 Oxymesterone 5,0 Codeine 25 Fenoterol 5,0 Oxycodone 10 Ethisterone (Danazol MT) 5,0 Hydromorphone 10 Terbutaline 5,0 Amiphenazole 25 Clenbuterol 5,0 MT: metabolite PC: parent compound

114 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.3: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου 471 ΟΥΣΙΑ C 471 (mg/l) Androsterone 63 Etiocholanolone 63 5α-Αndrostene diol 2,5 5β-Αndrostene diol 4,5 Testosterone 4,5 Epitestosterone 0,8 d3-testosterone 2,2 d3-epitestosterone 0,4 DHT 0,5 DHEA 3,1 Salbutamol 25 THC-COOH (11-nor-Δ 9 -tetrahydrocannabinol) 0,4 18-Nor-17,17, dimethyl-fluoxymesterone 2,5 16β-Hydroxy-Furazabol 2,5 Furazabol 2,5 Πίνακας 5.4: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου 847 ΟΥΣΙΑ C 847 (μg/l) 19 Norandrosterone 1x Noretiocholanolone 50 17α-methyl-5α-androstan-3α,17β diol 50 17α-methyl-5β-androstan-3α,17β diol 50 Clenbuterol 50 4β-Hydroxystanozolol 1x10 2 3'- Hydroxystanozolol 1x10 2 Epimethendiol Nor-17,17 Dimethyl-5β-Androst-1,13 Dien-3α-ol 1x10 2 Buprenorphine 5x10 2 Πίνακας 5.5: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALWADA ΟΥΣΙΑ C calwada (mg/l) ΟΥΣΙΑ Morphine 1x10 2 F enproporex 50 Methadone 20 Heptaminol 50 Pethidine 20 Methamphetamine 50 Pentazocine 20 Normorphine 50 Ethamivan 50 Adrafinil 50 Etilefrine 50 Hydromorphone 20 C calwada (mg/l)

115 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.5 (συνέχεια) Terbutaline 50 Mephentermine 50 Fenoterol 50 MDA 50 (methylenedioxyamphetamine) Sydnocarb 50 Oxycodone 20 Benzoylegconine 50 pentylenetrazol (pentetrazol) 50 Amiphenazole 50 phendimetrazine 50 Modafinil 50 Prolintane 50 Pholedrine (P-hydroxy methylamphetamine) 50 Selegiline 50 Amphepramone 50 Strychnine 20 Amphetamine 50 Etafedrine 20 Benzphetamine 50 Caffeine 1x10 2 Benzylamphetamine 50 Carphedon 50 Cocaine 50 EDDP 20 Cropropamide 50 p-hydroxy-amphetamine 50 crotetamide Ecgonine methylester 50 phenylephrine 50 Ephedrine 50 dihydrocodeine 20 Ethylamphetamine 50 Norcodeine 20 Methylephedrine 50 MDMA 50 (methylenedioxymethylamphetamine) Nor ephedrine 50 Pipradol 20 Nor-pseudoephedrine 50 Amphetaminl 50 (cathine) Pseudoephedrine 50 Furfenorex 87 Phentermine 50 Ritalinic acid 50 Anastrozole 50 Fentanyl 50 Dextromoramide 20 Bupropion 20 Mefenorex 50 Famprofazone 50 Methoxyphenamine 50 Alfentanyl 50 Methylphenidate 50 Buflomedil 20 Nikethamide 50 Adrenaline (epinephrine) 50 6-acetyl morphine 20 synephrine 50 Aminoglutethimide 50 octopamine 50 Clomiphene 50 Phenmetrazine 50 Fenethylline 50 Meclofenoxate 50 Fenfluramine 50 6-hydroxy bromantan

116 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.6: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALD ΟΥΣΙΑ C cald (mg/l) Acetazolamide 25 Bendroflumethiazide 25 Bumetanide 25 Canrenoic potasium 25 Chlortalidone 25 Ethacrynic acid 25 Furosemide 25 Hydrochlorothiazide 25 Indapamide 25 Althiazide 25 Chlorothiazide 25 Clopamide 25 Cyclothiazide 25 Dichlorophenamide 25 Hydroflumethiazide 25 Methylchlothiazide 25 Polythiazide 25 Trichloromethiazide 25 Xipamide Αντιδραστήρια Δισόξινο φωσφορικό κάλιο, KH 2 PO 4 (Merck, 99%) Άνυδρο θειϊκό νάτριο, Na 2 SO 4 (Panreac, 99%) Όξινο φωσφορικό κάλιο, K 2 HPO 4 (Merck, 99,5%) Ανθρακικό κάλιο, K 2 CO 3 (Merck, 99%) Διαιθυλαιθέρας, C 4 H 10 O (LABSCAN, 99,5%) Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 I/DTE 1000:2:4 (v/w/w) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 10 ml Ν-μεθυλο-Ν-τριμεθυλο σιλυλο-τριφθορο ακεταμιδίου (MSTFA, Machery-Nagel 100%), 20 mg ιωδιούχου αμμωνίου (NH 4 I, Merck 99,5 %) και 40 mg διθειοερυθριτόλης (DTE, Sigma, 99 %). Φυλάσσεται σε κλειστό, σκουρόχρωμο υάλινο περιέκτη. Αντιδραστήριο EtSH, Merck Αντιδραστήριο PrSH, Merck Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/1/2 (v/w/v) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 5 mg NH 4 I και 10 μl PrSH (reagent grade, Merck). Φυλάσσεται σε κλειστό, σκουρόχρωμο υάλινο περιέκτη. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/2/3 (v/w/v)

117 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 10 mg NH 4 I και 15 μl PrSH Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/2/5 (v/w/v) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 10 mg NH 4 I και 25 μl PrSH. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/4/6 (v/w/v ) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 20 mg NH 4 I και 30 μl PrSH. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/4/10 (v/w/v ) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 20 mg NH 4 I και 40 μl PrSH. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/5/2 (v/w/v ) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 25 mg NH 4 I και 10 μl PrSH. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/NH 4 Ι/PrSH 1000/6/9 (v/w/v ) Παρασκευάζεται με ανάμιξη 5 ml MSTFA, 30 mg NH 4 I και 45 μl PrSH. Αντιδραστήριο παραγωγοποίησης MBTFA Αντιδραστήριο παραγωγοποίησης MSTFA Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA -1% TMCS Παρασκευάζεται με ανάμιξη 4,95 ml MSTFA και 50 μl TMCS. Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA -3% TMCS Παρασκευάζεται με ανάμιξη 4,85 ml MSTFA και 150 μl TMCS Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA -6% TMCS Παρασκευάζεται με ανάμιξη 4,7 ml MSTFA και 300 μl TMCS Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Υψηλοί εσμυρισμένοι σωλήνες όγκου 15 ml Εσμυρισμένοι σωλήνες με κωνική βάση Εσμυρισμένα πώματα Υάλινες πιπέττες Pasteur Ογκομετρικές φιάλες όγκου 1, 2, 5,10, 25 ml Μεταλλική σπάτουλα τύπου Roth (Βιοδιαγνωστική). Πλαστικά ρύγχη αυτόματων πιπεττών ph-μετρικός χάρτης εύρους 0-6, 7,5-14 Πλαστικοί σωλήνες μιας χρήσης, χωρητικότητας 5 ml Φιαλίδια αυτόματου εισαγωγέα 1,5 ml τύπου Crimp Neck ND-11, διαφανή Micro insert, χωρητικότητας 0,1 ml, διαφανή με κωνικό πυθμένα, 12 mm

118 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πώματα τύπου "Aluminium cap clear lacquered-11 mm Septum Natural rubber, transparent", πάχους 1,0 mm Ψαλίδι ανοίγματος και κλεισίματος φιαλιδίων αυτόματου εισαγωγέα Εργαστηριακές Συσκευές Οριζόντιοι ανακινητήρες Αναδευτήρας περιδίνησης (vortex) Αναλυτικός ζυγός Αναλυτικός ζυγός τύπου GR 200, AND (τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων και μεγίστου φορτίου 60 g) χρησιμοποιήθηκε για την ζύγιση ουσιών, για την παρασκευή πρότυπων διαλυμάτων. Φαρμακευτικός ζυγός Για την ισοβάρυνση υψηλών υάλινων σωλήνων με εσμύρισμα, χρησιμοποιήθηκε φαρμακευτικός ζυγός τύπου CASBEE, MW Μεταλλόλουτρα θερμοκρασίας 60 και 80 0 C Τα μεταλλόλουτρα τύπου TBK27, ΞΕΝΟΝ Ο.Ε με θερμαντική πλάκα που φέρει οπές κατάλληλες για την υποδοχή σωλήνων, χρησιμοποιούνται για την εξάτμιση της οργανικής φάσης και παραγωγοποίηση με διακόπτη έναρξης και διακοπής της λειτουργίας, με κομβίο ρύθμισης της θερμοκρασίας, καθώς και δυνατότητα παρακολούθησης της καθορισμένης και πραγματικής τιμής της θερμοκρασίας. Θάλαμος μικροκυμάτων Συσκευή εξάτμισης Φυγόκεντρος Αυτόματες πιπέττες τύπου Finnpipette-Labsystems μl, μl, 1-5 ml. Κλίβανος θερμοκρασίας 50 και C Αναλυτικός εξοπλισμός Αεριοχρωματογράφος με αναλυτή φασματόμετρο μαζών χαμηλής διαχωριστικής ικανότητας GC HP6890/5973, με αυτόματο δειγματολήπτη ΗP7683 και λογισμικό MSD Chemstation G2613A έκδοση D Τριχοειδής στήλη HP Ultra1, 17 m (μήκος) x 0,20 mm (εσωτερική διάμετρος) x 0,11 μm (πάχος στρώματος επικάλυψης) (GC/MSD, ULTRA1-11)

119 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Αεριοχρωματογράφος με αναλυτή φασματόμετρο μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας (HRMS) HP 6890/AUTOSPEC - ULTIMAE MICROMASS με αυτόματο δειγματολήπτη HP και λογισμικό MassLynx V4.SP1. Τριχοειδής στήλη HP Ultra1, 12 m x 0,20 mm i.d. x 0,33 μm (ULTRA1-33). 5.3 Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης Ι) Για τα πειραματικά πρωτόκολλα που πραγματοποιήθηκαν στις σειρές πραγματοποιήθηκαν οι εξής αναλύσεις: Ανάλυση του δείγματος ελέγχου STDC (Πίνακας 5.1) με GC/MS μέθοδο (stnadi) παρακολούθησης όλων των ιόντων (full scan) για τις ουσίες 9-12 και με μέθοδο (ster2sc) παρακολούθησης όλων των ιόντων (full scan) για τις ουσίες 1-8. Οι μέθοδοι stnadi και ster2sc παρουσιάζονται στους Πίνακες 5.7 και 5.8, αντίστοιχα. Στη συνέχεια του συγκεκριμένου κεφαλαίου χάρην συντομίας η ομάδα των ουσιών 1-8 θα αναφέρεται ως αναβολικά και η ομάδα των ουσιών 9-12 ως διεγερτικά-ναρκωτικά. Πίνακας 5.7: Αναλυτικές παράμετροι full scan GC/MS μεθόδου ανάλυσης διεγερτικών ναρκωτικών ουσιών (stnadi) Αναλυτική στήλη HP Ultra 1 17m x 0,200 mm x 0,11μm Όγκος εισαγωγής δείγματος 1 μl Κινητή φάση Ήλιον (He), ροή 1,2 ml min -1 Split 1: 15 Θερμοκρασία εισαγωγής δείγματος C Θερμοκρασιακό πρόγραμμα C για 3 min, 30 0 C/min μέχρι C για 7 min Εύρος μαζών (mass range) m/z

120 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.8: Αναλυτικές παράμετροι full scan GC/MS μεθόδου ανάλυσης αναβολικών ουσιών (ster2sc) Αναλυτική στήλη HP Ultra 1 17m x 0,200 mm x 0,11μm Όγκος εισαγωγής δείγματος 2 μl Κινητή φάση Ήλιον (He), ροή 1,1 ml min -1 Split 1: 15 Θερμοκρασία εισαγωγής δείγματος Θερμοκρασιακό πρόγραμμα C C για 0 min, 3 0 C/min μέχρι C για 0 min, 30 0 C/min μέχρι C (τελική θερμοκρασία) για 3,15 min. Εύρος μαζών (mass range) m/z Τα διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων αναλυτών παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.9 Πίνακας 5.9: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων με GC/MS, ουσιών του STDC Ουσία Αναλύτης Ιόν 1 Ιόν 2 Ιόν 3 1 Testosterone bis-tms Androsterone bis -TMS β-OH methandienone tris-tms Fluoxymesterone tetrol mt2 tetra-tms OH-stanozolol tris-tms Aminogluthethimide bis -TMS Amiloride tetra-tms Atenolol tris-tms Benzoyl ecgonine O-TMS Amphetamine an1 N-TMS Amphetamine an2 bis -TMS Ethacrynic acid O-TMS Ephedrine an1 O-TMS Ephedrine an2 bis -TMS ΙI) Για τα πειραματικά πρωτόκολλα που εξετάστηκαν στη σειρά πραγματοποιήθηκαν οι εξής αναλύσεις: Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, BLANK με full scan GC/MS μέθοδο (stnadi) για τα διεγερτικά-ναρκωτικά. Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALMIX, 471, BLANK με SIM GC/MS μέθοδο (ster2) για τα αναβολικά στεροειδή. Οι μέθοδοι ster2 και ster2sc έχουν κοινό χρωματογραφικό πρόγραμμα (Πίνακας 5.8) και διαφέρουν στο ότι η πρώτη είναι SIM μέθοδος. Δεκατέσσερις διαφορετικές ομάδες ιόντων περιλαμβάνονται στη ster2 μέθοδο για το σύνολο των εξεταζόμενων ουσιών

121 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALMIX, 847, BLANK με SIR GC/HRMS μέθοδο (aasteroids) για τα αναβολικά στεροειδή. Η μέθοδος aasteroids παρουσιάζεται στον Πίνακα Εννέα διαφορετικές ομάδες ιόντων περιλαμβάνονται στη μέθοδο για το σύνολο των εξεταζομένων ουσιών. Πίνακας 5.10: Αναλυτικές παράμετροι SIR HRMS μεθόδου ανάλυσης αναβολικών ουσιών (aasteroids) Αναλυτική στήλη HP Ultra 1 12m x 0,200 mm x 0,33μm Όγκος εισαγωγής δείγματος 1 μl Κινητή φάση Ήλιον (He), ροή 1,1 ml min -1 Split 1: 15 Θερμοκρασία εισαγωγής δείγματος Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Μέθοδος παρακολούθησης επιλεγμένων ιόντων (selective ion recording-sir) C C για 0,5 min, 12,5 0 C/min μέχρι C για 2,5 min. 9 ομάδες ιόντων Στα Σχήματα 5.1 και 5.2 συνοψίζονται οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την προετοιμασία και την ανάλυση των αντίστοιχων δειγμάτων ελέγχου για τις σειρές Φάση Ι-II (Σειρές ) STDC+ISTD εξάτμιση παράγωγα Αναβολικά Διεγερτικά-Ναρκωτικά Full scan GC/MS analysis (ster2sc) Full scan GC/MS analysis (stnadi) Σχήμα 5.1: Προετοιμασία του δείγματος ελέγχου STDC για ανάλυση απαγορευμένων ουσιών στις σειρές και

122 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Φάση ΙΙΙ (Σειρά 5.5.4) ούρα+istd υδρόλυση εκχύλιση ph ~ 9-10 Αναβολικά DE Διεγερτικά-Ναρκωτικά DE 2-propanol εξάτμιση εξάτμιση Παράγωγα Παράγωγα (ενιαία μέθοδος) (ενιαία μέθοδος) SIM GC/MS + Full scan HRMS analysis GC/MS analysis (ster2 & aasteroids) (stnadi) Σχήμα 5.2: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, CMIX, CALD, 847, 471, BLANK για ανάλυση απαγορευμένων ουσιών της σειράς Πειραματικός σχεδιασμός Η πειραματική διαδικασία διαιρέθηκε σε τρεις σειρές πειραμάτων (φάσεις) ως εξής: 1. Προκαταρκτικά πειράματα (Φάση I, εδάφιο 5.5.2) 2. Μελέτη των παραμέτρων που επιδρούν στην απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης (Φάση II, εδάφιο 5.5.3) 3. Εφαρμογή της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης στο σύνολο των εξεταζομένων ουσιών, σε δείγματα ούρων (Φάση III, εδάφιο 5.5.4). Στη φάση Ι σχεδιάστηκε η πραγματοποίηση των προκαταρκτικών πειραμάτων με στόχο το σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων για τις εξεταζόμενες ουσίες, μέσω διαφορετικών αντιδραστηρίων ή με συνδυασμό αυτών, σε αντιδράσεις παραγωγοποίησης ενός και δύο σταδίων

123 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν βιβλιογραφικά δεδομένα που παρουσιάστηκαν στο Κεφάλαιο 2 και αφορούν αντιδραστήρια παραγωγοποίησης που έχουν χρησιμοποιηθεί για το σχηματισμό σιλυλο-παραγώγων στον έλεγχο ντόπινγκ. Συγκεκριμένα και όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.3 δοκιμάστηκαν για το σκοπό αυτό τα εξής αντιδραστήρια: Το αντιδραστήριο MSTFA To αντιδραστήριο MSTFA/NH 4 I/x, όπου x τα αναγωγικά μέσα DTE, EtSH, PrSH που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών (βλ. εδάφιο 2.2.2). Ακολούθως πραγματοποιήθηκε η εκτέλεση πειραμάτων με τις παραπάνω συνθήκες. Η λήψη μη ικανοποιητικών αποτελεσμάτων για τμήμα των εξεταζομένων ουσιών οδήγησε σε εφαρμογή αντίδρασης παραγωγοποίησης δύο σταδίων, η οποία έχει εφαρμοστεί με επιτυχία σε μόρια που φέρουν πολλές δραστικές ομάδες όπως ήδη αναφέρθηκε στο Κεφάλαιο 2, μετά από εκτενή βιβλιογραφική αναζήτηση. Επόμενο βήμα του πειραματικού σχεδιασμού ήταν η αξιολόγηση στη φάση II των παραμέτρων που μπορεί να επηρεάσουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης με σκοπό τη βελτιστοποίηση αυτής. Παράμετροι όπως η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, ο χρόνος και η θερμοκρασία επώασης, η εφαρμογή συμβατικής μεθόδου θέρμανσης ή εναλλακτικών μεθόδων όπως η ακτινοβόληση με μικροκύματα, καθώς και η προσθήκη βελτιωτικών μέσων όπως καταλύτη και διαλύτη είναι δυνατό να επηρεάσουν την απόδοση της αντίδρασης, όπως αναφέρθηκε στο εδάφιο 2.3. Για την επιλογή της βέλτιστης πορείας παραγωγοποίησης εφαρμόστηκε μέθοδος σταδιακής αλλαγής ενός παράγοντα 202 και με επανάληψη του κύκλου για την αντιμετώπιση αλληλεπιδράσεων. Με τη μέθοδο αυτή διατηρούνται σταθερές όλες οι παράμετροι εκτός από μία, η τιμή της οποίας μεταβάλλεται. Μετά από συγκεκριμένο αριθμό πειραμάτων επιλέγεται η βέλτιστη τιμή της. Στη συνέχεια η τιμή αυτή της παραμέτρου διατηρείται σταθερή (βέλτιστη), ενώ μεταβάλλεται η τιμή της επόμενης παραμέτρου και ακολουθείται η ίδια διαδικασία. Το κριτήριο με τα οποίο επιλέγονται σε κάθε βήμα οι βέλτιστες συνθήκες είναι η μέγιστη απόδοση για το σύνολο των ουσιών. Η απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης για κάθε ουσία υπολογίζεται με βάση το συντελεστή RRF (Relative response factor), ο οποίος ορίζεται

124 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών ως ο λόγος του εμβαδού (area) του μελετούμενου αναλύτη προς το εμβαδό του εσωτερικού προτύπου. Τέλος σχεδιάστηκε η εφαρμογή στη φάση III, της βέλτιστης πορείας όπως αυτή προέκυψε από τη φάση II, στο σύνολο των απαγορευμένων ουσιών. Συγκεκριμένα σε αυτή τη φάση, δείγματα ούρων αθλητών εμβολιάστηκαν με τις υπό προσδιορισμό ουσίες σε συγκέντρωση ίση με το MRPL. Ακολούθησε ανάλυση αυτών, όπως περιγράφηκε στο υποκεφάλαιο 5.3 κατόπιν παραγωγοποίησης με την ενιαία μέθοδο. Ο πειραματικός σχεδιασμός για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απεικονίζεται στο Σχήμα

125 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Παραγωγοποίηση ενός σταδίου TMS παράγωγα Φάση Ι Αναβολικά Στεροειδή (MSTFA/ΝΗ 4 Ι/X) Διεγερτικά Ναρκωτικά MSTFA όπου Χ DTE EtSH PrSH Πειράματα Παραγωγοποίηση δύο σταδίων ΟΧΙ Αποδεκτά αποτελέσματα ΝΑΙ Αποδεκτά αποτελέσματα ΝΑΙ Βελτιστοποίηση πορείας παραγωγοποίησης Φάση ΙΙ ΟΧΙ Νέος σχεδιασμός παραγωγοποίησης Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης Χρόνος επώασης Προσθήκη καταλύτη, διαλύτη Θερμοκρασία επώασης, ακτινοβόληση Αξιολόγηση αποτελεσμάτων Επιλογή βέλτιστων συνθηκών παραγωγοποίησης Εφαρμογή στο σύνολο των ουσιών σε δείγματα ούρων Φάση ΙΙΙ Σχήμα 5.3: Διάγραμμα ροής (πειραματικός σχεδιασμός) του πειραματικού πρωτοκόλλου για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών

126 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών 5.5 Πειραματικά πρωτόκολλα παραγωγοποίησης Προετοιμασία πειραμάτων Ι. Εσωτερικά πρότυπα Ως εσωτερικά πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν οι ουσίες codeine και imipramine. Η ουσία codeine παραγωγοποιείται προς σχηματισμό του αναλύτη codeine-otms, ενώ η ουσία imipramine αναλύεται απαραγωγοποίητη. Με την ουσία codeine, η οποία εκλούεται στο μέσον των χρόνων ανάσχεσης των μελετούμενων ουσιών, πραγματοποιείται έλεγχος της πορείας παραγωγοποίησης, ενώ με την ουσία imipramine έλεγχος διαφόρων χρωματογραφικών συνθηκών, όπως κατάσταση της στήλης κα. Στη φάση III που πραγματοποιείται εφαρμογή της ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης, σε δείγματα ούρων χρησιμοποιείται ως εσωτερικό πρότυπο και η ουσία methyltestosterone για τον έλεγχο των αναβολικών ουσιών. ΙΙ. Υδρόλυση -Εκχύλιση Η παρασκευαστική διαδικασία που εφαρμόστηκε για την ανάλυση των δειγμάτων της φάσεως III, προ του σταδίου παραγωγοποίησης, έχει ήδη αναφερθεί 5. Περιληπτικά για την εκχύλιση των αναβολικών στεροειδών 5 ml δείγματος ελέγχου υδρολύονται μετά την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου (methyltestosterone). Ακολουθεί εκχύλιση σε βασικό περιβάλλον (ph:9-10) με διαλύτη διαιθυλαιθέρα και προσθήκη θεϊκού νατρίου στο δείγμα. Κατόπιν ανακίνησης των δειγμάτων, ακολουθεί φυγοκέντρηση και διαίρεση της οργανικής στιβάδας σε δυο κλάσματα (ένα για την ανάλυση GC/MS και ένα για την ανάλυση HRMS κατόπιν παραγωγοποίησης). Για την εκχύλιση των διεγερτικών ναρκωτικών και διουρητικών ουσιών 2,5 ml δείγματος ελέγχου υδρολύονται μετά την προσθήκη του εσωτερικού προτύπου (codeine). Ακολουθεί εκχύλιση σε βασικό περιβάλλον (ph:9-10) με διαλύτη διαιθυλαιθέρα-ισοπροπανόλη (5/1) και προσθήκη θεϊκού νατρίου στο δείγμα. Κατόπιν ανακίνησης των δειγμάτων, ακολουθεί φυγοκέντρηση και μεταφορά της οργανικής στιβάδας σε κωνικούς σωλήνες. ΙΙΙ. Έλεγχος επαρκούς παραγωγοποίησης Ο έλεγχος προσδιορισμού επαρκούς παραγωγοποίησης πραγματοποιείται με προσδιορισμό του λόγου εμβαδών R A, όπου R A = Androsterone-OTMS/ Androsterone bis-tms 20. Αν ο λόγος είναι υψηλός, τότε η αντίδραση παραγωγοποίησης δεν θεωρείται επιτυχής αφού πρακτικά δεν ολοκληρώνεται (βλ. εδάφιο 2.2.2)

127 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών IV. Προσδιορισμός RRF (Relative response factor) Για όλες τις μελετούμενες παραμέτρους της φάσης II και για κάθε εξεταζόμενη ουσία προσδιορίζεται ο λόγος RRF που ορίζεται ως ο λόγος του εμβαδού (area) του μελετούμενου αναλύτη προς το εμβαδό του εσωτερικού προτύπου. Στην πραγματικότητα, οι τιμές που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό του RRF, αντιστοιχούν στο μέσο όρο των έξι μετρήσεων, τόσο για την επιφάνεια του αναλύτη, όσο και του εσωτερικού προτύπου Προκαταρκτικά πειράματα -Παραγωγοποίηση σε ένα και δύο στάδια Στο στάδιο αυτό εφαρμόστηκαν πορείες παραγωγοποίησης ενός και δύο σταδίων, με στόχο το σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων για την πλειοψηφία των μελετούμενων ουσιών. Ως κύριο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης χρησιμοποιήθηκε το MSTFA. Καθώς η παραγωγοποίηση των αναβολικών στεροειδών απαιτεί το σχηματισμό των TMS-enol αιθέρων, η παραγωγοποίηση ενός σταδίου εφαρμόστηκε ως εξής: 100 μl MSTFA/NH 4 I/DTE 1000/2/4 (v/w/w) προστέθηκαν στο στερεό υπόλειμμα του δείγματος ελέγχου STDC και ακολούθησε επώαση στους 80 0 C για 30 min. Εκτός από το DTE δύο ακόμη αντιδραστήρια δοκιμάστηκαν ως αναγωγικά μέσα αντικαθιστώντας το DTE: το EtSH και το PrSH. Τα αντιδραστήρια αυτά, όπως ήδη αναφέρθηκε στο Κεφάλαιο 2 έχουν χρησιμοποιηθεί στην αντίδραση παραγωγοποίησης των αναβολικών στεροειδών. Καθώς η εφαρμογή του παραπάνω αντιδραστηρίου οδήγησε σε μη ικανοποιητικά αποτελέσματα για τις ουσίες που φέρουν στο μόριό τους "ασταθείς" (labile) ομάδες, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση της ουσίας ephedrine, κρίθηκε απαραίτητη η εφαρμογή αντίδρασης παραγωγοποίησης δυο σταδίων ως εξής: 1ο στάδιο: 50 μl MSTFA, και επώαση στους 80 C για 20 min, 2ο στάδιο: 50 μl MSTFA/NH 4 I/PrSH 1000/2/5 (v/w/v), επώαση στους 80 C, για 20 min. (Η αναλογία για το μίγμα παραγωγοποίησης μεταβλήθηκε σε σχέση με το προηγούμενο αντιδραστήριο λόγω ύπαρξης δυο ομάδων SH στη DTE, έναντι μιας στην PrSH)

128 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Η αντίδραση παραγωγοποίησης δυο σταδίων έχει αναφερθεί (βλ.εδάφιο 2.2.2) για μόρια που φέρουν πολλές δραστικές ομάδες Μελέτη παραμέτρων που επηρεάζουν την αντίδραση παραγωγοποίησης Διάφορες παράμετροι που εφαρμόζονται κατά τη διάρκεια της παραγωγοποίησης μπορούν να επηρεάσουν την απόδοσή της, όπως ήδη αναφέρθηκε και στο υποκεφάλαιο 2.3 μετά από εκτενή βιβλιογραφική αναζήτηση. Η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, ο χρόνος επώασης, η θερμοκρασία επώασης, η επιτάχυνση της αντίδρασης με εναλλακτικά μέσα, όπως η ακτινοβόληση με μικροκύματα έναντι της συμβατικής μεθόδου θέρμανσης, καθώς και η προσθήκη "βελτιωτικών μέσων", όπως η προσθήκη καταλύτη και διαλύτη μελετήθηκαν και αξιολογήθηκαν στο στάδιο αυτό. Οι παράμετροι που μελετήθηκαν παρουσιάζονται στον Πίνακα 5.11, ενώ οι εφαρμοζόμενες τιμές για κάθε μελετούμενη παράμετρο στον Πίνακα Για τη βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης χρησιμοποιήθηκε μέθοδος σταδιακής αλλαγής ενός παράγοντα. Οι τιμές για κάθε εξεταζόμενη παράμετρο παρουσιάζονται στον Πίνακα Όπως έχει αναφερθεί, η βέλτιστη τιμή για κάθε παράμετρο διατηρείται σταθερή και χρησιμοποιείται ως σημείο έναρξης για τη μελέτη της επόμενης παραμέτρου, έως ότου ολοκληρωθεί η μελέτη όλων των παραμέτρων του Πίνακα Μετά τη ολοκλήρωση του πρώτου κύκλου βελτιστοποίησης, με τη μελέτη των παραμέτρων A-D, ακολούθησε ένας δεύτερος κύκλος με την επαναξιολόγηση της παραμέτρου Α για την αντιμετώπιση τυχόν αλληλεπιδράσεων, ακολουθώντας την ίδια λογική προσέγγισης. Πρέπει να σημειωθεί ότι κάθε μελετούμενη παράμετρος ελέγχθηκε και αξιολογήθηκε σταδιακά, με την εφαρμογή διαφόρων επιπέδων τα οποία αναφέρονται ως X i, όπου X είναι η μελετούμενη παράμετρος και i η αντίστοιχη τιμή της. Αναλυτικά για τη μελέτη της παραμέτρου Α εξετάστηκαν 7 διαφορετικά επίπεδα με μεταβολή των αναλογιών για τα αντιδραστήρια NH 4 I και PrSH, του εφαρμοζόμενου αντιδραστηρίου MSTFA/NH 4 I/PrSH στο δεύτερο στάδιο της παραγωγοποίησης. Τα επίπεδα που επιλέχθηκαν περιλαμβάνουν την εφαρμογή "πυκνότερου" και "αραιότερου" αντιδραστηρίου σε σχέση με αυτό που έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά για την παραγωγοποίηση των αναβολικών στεροειδών

129 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εφαρμογή 7 διαφορετικών επιπέδων πραγματοποιήθηκε και για τη μελέτη του χρόνου επώασης με συμβατική μέθοδο θέρμανσης. Τα εφαρμοζόμενα επίπεδα περιλαμβάνουν αλλαγές στο πρώτο και στο δεύτερο στάδιο της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Για την προσθήκη βελτιωτικών μέσων στο πρώτο στάδιο μελετήθηκαν 7 διαφορετικά επίπεδα. Στην πραγματικότητα το 1 ο επίπεδο πραγματοποιείται χωρίς την προσθήκη βελτιωτικών μέσων και συγκρίνεται με τα επίπεδα 2-4 μετά την προσθήκη καταλύτη και τα επίπεδα 5-7 μετά την προσθήκη διαλύτη. Για τη μελέτη της θερμοκρασίας επώασης με συμβατική μέθοδο θέρμανσης μελετήθηκαν 7 διαφορετικά επίπεδα με μεταβολές, τόσο στο πρώτο, όσο και στο δεύτερο στάδιο της αντίδρασης παραγωγοποίησης, ενώ η μελέτη της επιτάχυνσης της αντίδρασης παραγωγοποίησης με εφαρμογή ακτινοβόλησης, με μικροκύματα, περιλαμβάνει την εφαρμογή 3 επιπέδων. Όλες οι μελετούμενες παράμετροι, καθώς και τα επίπεδα αυτών που εξετάστηκαν παρουσιάζονται ως γραμμές στον Πίνακα Για παράδειγμα οι εφαρμοζόμενες συνθήκες παραγωγοποίησης για τη μελέτη της παραμέτρου Α είναι: 1 ο στάδιο : 50 μl MSTFA, και επώαση στους 80 C για 20 min, 2ο στάδιο: 50 μl Ai (όπου i λαμβάνει τιμές από 1 εως 7 στον Πίνακα 5.11) επώαση στους 80 C, για 20 min (Πίνακας 5.12). Για την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης με εναλλακτικά μέσα, όπως η ακτινοβόληση, χρησιμοποιήθηκε ένας κλασικός θάλαμος μικροκυμάτων. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες τοποθετήθηκαν σε κατάλληλα ποτήρια ζέσεως, τα οποία συμπληρώθηκαν με απιονισμένο ύδωρ και τοποθετήθηκαν στον θάλαμο, ο οποίος λειτούργησε με εφαρμοζόμενη ισχύ 900 watt

130 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.11: Πειραματικός σχεδιασμός για τη βελτιστοποίηση της ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών με τη μελέτη των παραμέτρων (A-D) Παράμετρος Ai : Παράμετρος Bi : Παράμετρος Ci: Παράμετρος Di: Επανεκτίμηση της παραμέτρουa (Ai r ) : Συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης MSTFA:NH 4 I:PrSH (v:w:v) Χρόνος επώασης 1 ο στάδιο/2 ο στάδιο Προσθήκη βελτιωτικών μέσων στο 1 ο στάδιο % προσθήκη καταλύτη, προσθήκη διαλύτη (ACN) Θέρμανση με συμβατικά μέσα και εναλλακτικά με ακτινοβόληση (MW) 1 ο στάδιο-/2 ο στάδιο (θερμοκρασία επώασης) και 1 ο στάδιο-/2 ο στάδιο (ακτινοβόληση με MW) Συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης MSTFA:NH 4 I: PrSH (v:w:v) :1:2 20/20 Επίπεδα των μελετούμενων παραμέτρων ΔΠ 60/ :1: :2:3 30/20 1% TMCS 80/ :2: :2:5 45/20 3% TMCS 100/ :2: :4:6 20/10 5% TMCS 80/ :4: :4:10 20/30 10 μl ACN 80/ :4: :5:2 10/20 25 μl ACN 60/ :5: :6:9 10/10 50 μl ACN 100/ :6:9 8 NA NA NA MW 20/20 NA 9 NA NA NA MW 10/10 NA 10 NA NA NA MW 5/5 NA MW: ακτινοβόληση με μικροκύματα, ΔΠ: δεν προστέθηκαν βελτιωτικά μέσα, NA: δεν εφαρμόζεται

131 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.12: Εξεταζόμενες τιμές των παραμέτρων A-D για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών όπως σχεδιάστηκε και εφαρμόστηκε στην παρούσα διατριβή Μελετούμενη παράμετρος A B C D A r A A i A βέλτιστη A βέλτιστη A βέλτιστη A r i Τιμή της μελετούμενης παραμέτρου B 20/20 min B i B βέλτιστη B βέλτιστη B βέλτιστη C Δεν προστέθηκε Δεν προστέθηκε C i D 80/80 C 80/80 C 80/80 C C βέλτιστη C βέλτιστη D i D βέλτιστη A βέλτιστη - D βέλτιστη : Η τιμή κάθε εξεταζόμενης παραμέτρου με τη μέγιστη απόδοση για τις εξεταζόμενες ουσίες A i, B i, C i, D i, A i r : επίπεδα των μελετούμενων παραμέτρων (με τιμές i από 1-10)

132 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εφαρμογή στο σύνολο των ουσιών Δείγματα ελέγχου ούρων τα οποία περιλαμβάνουν αναλύτες από διάφορες κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών (διεγερτικά, ναρκωτικά, αναβολικά και διουρητικά) εκχυλίστηκαν (βλ εδάφιο ΙΙ) και παραγωγοποιήθηκαν σύμφωνα με την πορεία παραγωγοποίησης που προέκυψε στη φάση II: 1 ο Στάδιο : 50 μl of MSTFA και 25 μl ACN προστέθηκαν στο στερεό υπόλειμμα. Τα δείγματα επωάζονται στους 80 C για 10 min. 2 ο Στάδιο 50 μl από το αντιδραστήριο A 2 (βλ. Πίνακα 5.11) προστέθηκαν στο δοκιμαστικό σωλήνα του σταδίου 1. Τα δείγματα επωάζονται στους 80 C για 10 min. 5.6 Αποτελέσματα Συζήτηση Εισαγωγή Στο πλαίσιο της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης έγιναν δοκιμές σχηματισμού τριμεθυλο-σιλυλο-παραγώγων, επειδή η σιλανοποίηση αποτελεί την εφαρμοζόμενη πορεία παραγωγοποίησης για την πλειοψηφία των εξεταζόμενων ουσιών που ανιχνεύονται στο εργαστήριο ελέγχου ντόπινγκ. Το πλέον ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο στον έλεγχο ντόπινγκ είναι το MSTFA που οδηγεί στο σχηματισμό TMS παραγώγων. Το MSTFA έχει χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με το MBTFA για την παραγωγοποίηση των διεγερτικών και ναρκωτικών ουσιών προς σχηματισμό -OTMS και -NTFA παραγώγων. Παρόλα αυτά, ο σχηματισμός των TFA παραγώγων σε μεθόδους σάρωσης οδηγεί σε μείωση του χρόνου ζωής της στήλης, λόγω αποσύνθεσης της στατικής φάσης. Αυτό με τη σειρά του οδηγεί σε κακή χρωματογραφική συμπεριφορά και ελαττωμένη ευαισθησία, γεγονός που με τη σειρά του δεν επιτρέπει την περαιτέρω ανάλυση, με την ίδια χρωματογραφική στήλη, των απαραγωγοποίητων ουσιών. Για αυτούς τους λόγους κατά τη μελέτη του σταδίου παραγωγοποίησης τέθηκε ως στόχος η ανάπτυξη κοινής πορείας με την εφαρμογή σιλυλο-παραγώγων αυξάνοντας με αυτό τον τρόπο την παραγωγικότητα της ανάλυσης αφού αποφεύγεται η συχνή αντικατάσταση της χρωματογραφικής στήλης ακόμη και μετά την παράλληλη ανάλυση παραγωγοποιημένων και απαραγωγοποίητων αναλυτών

133 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Προκαταρκτικά πειράματα -Παραγωγοποίηση σε ένα και δύο στάδια Για το σχηματισμό των τριμεθυλοσιλυλο-παραγώγων, οι αρχικές δοκιμές που πραγματοποιήθηκαν αφορούν τη χρήση αντιδραστηρίων που έχουν ήδη χρησιμοποιηθεί σε μεθόδους σάρωσης, είτε για την παραγωγοποίηση των: α) διεγερτικών και ναρκωτικών ουσιών, είτε β) των αναβολικών στεροειδών ουσιών. Καθώς η παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών προϋποθέτει την εφαρμογή του κατάλληλου αντιδραστηρίου για το σχηματισμό των O-TMS και TMS ενολ-αιθέρων, καθίσταται σαφές ότι το αντιδραστήριο MSTFA, με το οποίο έχει επιτευχθεί επιτυχώς παραγωγοποίηση όλων των διεγερτικών και ναρκωτικών ουσιών 57, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης. Αντίθετα, επιλέχθηκε για τη μελέτη του σταδίου αυτού, παραγωγοποίηση των μελετούμενων ουσιών με το αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται ευρέως για την παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών. Όπως ήδη αναφέρθηκε στο εδάφιο 5.5.2, στο σημείο αυτό εξετάστηκαν τρία αντιδραστήρια παραγωγοποίησης τα οποία διαφέρουν στο χρησιμοποιούμενο αναγωγικό μέσο. Παρόλο που τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από την εφαρμογή των τριών διαφορετικών αναγωγικών μέσων είναι παρόμοια, όσον αφορά την λαμβανόμενη ευαισθησία, το PrSH επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη στην αντίδραση παραγωγοποίησης των δυο σταδίων προκειμένου: α) να αποφευχθεί η παρεμπόδιση στη χρωματογραφία, καθώς και η ανάγκη συχνής αντικατάστασης της χρωματογραφικής στήλης (περίπτωση του DTE) και β) η πολύ έντονη και ερεθιστική οσμή (περίπτωση του EtSH). Με το αντιδραστήριο αυτό παρότι επιτυγχάνεται παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών όπως αναμενόταν, δεν ελήφθησαν ικανοποιητικά αποτελέσματα για τμήμα των εξεταζομένων ουσιών, όπως για παράδειγμα η ephedrine. Παραγωγοποίηση της ουσίας ephedrine με το αντιδραστήριο MSTFA/NH 4 I/PrSH 1000/2/5 (v/w/v) οδήγησε στο σχηματισμό του mono-tms παραγώγου ως κύριου προϊόντος, το οποίο παρουσίασε παράλληλα κακή χρωματογραφική συμπεριφορά (Σχήμα 5.4A-1). Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να αναφερθεί ότι αντίδραση της ephedrine με το MSTFA ως αντιδραστήριο παραγωγοποίησης οδηγεί στο ίδιο προϊόν, το οποίο όμως παρουσιάζει άριστη χρωματογραφική συμπεριφορά (Σχήμα 5.4B). Ο δεύτερος αναλύτης για την ουσία ephedrine, το παράγωγο ephedrine bis-tms ανιχνεύεται σε

134 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών μικρότερο ποσοστό (5.4.C-1) και με καλή χρωματογραφική συμπεριφορά ανεξάρτητα από την εφαρμοζόμενη πορεία παραγωγοποίησης (Σχήμα 5.4 C). Εκτός από την ephedrine αξίζει να σημειωθούν και τα αποτελέσματα για την ουσία cortisol μετά την εφαρμογή της πορείας παραγωγοποίησης του ενός σταδίου. Παραγωγοποίηση αυτής, με το ίδιο αντιδραστήριο έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό δύο προϊόντων 203 : ενός δευτερεύοντος το οποίο αντιστοιχεί στο penta-tms παράγωγο και ενός κύριου που αντιστοιχεί στο tetra-tms (το οποίο προκύπτει με απομάκρυνση της ομάδας TMS-OH από το penta-tms παράγωγο) ενισχύοντας έτσι τη θεωρία για την απομάκρυνση ασταθών ομάδων, όπως οι υδροξυλομάδες με το εφαρμοζόμενο αντιδραστήριο (Σχήμα 5.5 Α). Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε μια προσπάθεια εφαρμογής μιας νέας πορείας παραγωγοποίησης, η οποία: α) θα είναι λιγότερο "δραστική" 204 για τις "ευαίσθητες" υδροξυλομάδες", προκειμένου να αποφευχθούν τα προβλήματα που ήδη αναφέρθηκαν και β) θα είναι ικανή να παραγωγοποιεί παρεμποδισμένες υδροξυλομάδες, με καλή χρωματογραφική συμπεριφορά. Για αυτό το σκοπό πραγματοποιήθηκε εφαρμογή παραγωγοποίησης σε δυο στάδια ως εξής: α) εφαρμογή του πρώτου σταδίου με σκοπό την προστασία των ευαίσθητων υδροξυλομάδων με ένα λιγότερο δραστικό αντιδραστήριο, όπως το MSTFA και β) εφαρμογή του δεύτερου πιο δραστικού αντιδραστηρίου MSTFA/NH 4 I/PrSH, για την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Αξίζει να σημειωθεί ότι χρήση του MSTFA στο πρώτο στάδιο είναι συμβατή με το αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται στο δεύτερο στάδιο

135 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 5.4: (A) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης σε: ένα στάδιο (1), δύο στάδια (2) και μετά τη βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης (3) (B) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης με MSTFA (C) ιοντικό χρωματογράφημα για την ephedrine bis-tms, κατόπιν παραγωγοποίησης σε ένα στάδιο (1), δύο στάδια (2) και μετά την βελτιστοποίηση της πορείας παραγωγοποίησης (3)

136 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εφαρμογή της πορείας παραγωγοποίησης δυο σταδίων οδήγησε σε βελτίωση των αποτελεσμάτων για την ουσία ephedrine (Σχήμα 5.4, 2A και 2C), τόσο στη χρωματογραφική συμπεριφορά, όσο και στην ευαισθησία του σχηματιζόμενου παραγώγου. Με την αντίδραση αυτή επιτυγχάνεται επίσης η παραγωγοποίηση των αναβολικών ουσιών, ενώ στην περίπτωση της ουσίας cortisol, το penta-tms παράγωγο είναι το κύριο (και σχεδόν το αποκλειστικό) προϊόν της αντίδρασης των δυο σταδίων, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 5.5B. Σχηματική απεικόνιση των παραγόμενων tetra και penta TMS παραγώγων για την ουσία cortisol παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.6. Σχήμα 5.5: (A) ιοντικό χρωματογράφημα για την ουσια cortisol, κατόπιν παραγωγοποίησης: A) σε ένα στάδιο και (B)σε δύο στάδια. Κορυφή 1: cortisol tetra-tms, κορυφή 2: cortisol pentatms

137 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών O TMS O OH HO TMS O O TMS OH MSTFA/NH 4 I/PrSH (1) O MSTFA/NH 4 I/PrSH MSTFA TMS O Cortisol + O TMS TMS O O TMS O TMS TMS O Σχήμα 5.6: Παραγωγοποίηση της ουσίας cortisol με αντίδραση ενός και δυο σταδίων. Σχηματισμός των cortisol tetra-tms (1) και penta-tms (2) (2) Μελέτη παραμέτρων που επηρεάζουν την απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης Στο στάδιο αυτό πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση των παραμέτρων που επιδρούν στην απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης με σκοπό την επιλογή των βέλτιστων συνθηκών και εφαρμογή αυτών στην ενιαία μέθοδο παραγωγοποίησης. Η επιλογή της καταλληλότερης τιμής για κάθε μελετούμενη παράμετρο, έγινε με βάση τη μέγιστη απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης (σιλανοποίησης) για την πλειοψηφία των μελετούμενων ουσιών. Η απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης υπολογίζεται μέσω του RRF (relative rensponse factor) ο οποίος προσδιορίζεται για κάθε ουσία και για κάθε μελετούμενη παράμετρο, ως ο λόγος του εμβαδού του προσδιοριζόμενου αναλύτη προς το εμβαδό του εσωτερικού προτύπου (codeine). Για όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν και αφορούν τη μελέτη των διαφόρων παραμέτρων η τιμή που αξιολογείται είναι ο μέσος όρος έξι τιμών μετρήσεων αφού κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και αναλύθηκε εις διπλούν. Για κάθε μελετούμενη παράμετρο εξετάζεται η επίδρασή της στην ομάδα των "αναβολικών" και "διεγερτικών" ουσιών, ενώ παράλληλα αξιολογείται και η επίδραση αυτών στο σύνολο των ουσιών μέσω του αθροίσματος των RRF το οποίο αποτελεί ποσοτική έκφραση της απόδοσης της μεθόδου προς βελτιστοποίηση. Σύμφωνα με τον Πίνακα 5.11 εξετάστηκαν οι εξής παράμετροι:

138 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (παράμετρος A) μελετήθηκε αρχικά τροποποιώντας την ποσότητα του NH 4 I και του αναγωγικού μέσου PrSH για το αντιδραστήριο Ai, στο 2 ο στάδιο της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης. Όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 5.7 Α, το αντιδραστήριο παραγωγοποίησης Α 1 έχει ως αποτέλεσμα αυξημένη ευαισθησία για τους μελετούμενους αναλύτες. Από τη μελέτη της ουσίας ephedrine προκύπτει ότι με το συγκεκριμένο αντιδραστήριο ο λόγος του αναλύτη ephedrine bis-tms (κύριος) προς τον αναλύτη ephedrine mono-tms είναι περίπου 2. Στα ίδια συμπεράσματα καταλήγουμε για την ουσία amphetamine με τον αναλύτη amphetamine mono-tms να αποτελεί τον κύριο αναλύτη με το συγκεκριμένο αντιδραστήριο. Για τις ουσίες benzoylecgonine και ethacrynic acid, τα αντιδραστήρια Α 1- Α 7 φαίνεται να οδηγούν σε παρόμοια αποτελέσματα όσον αναφορά την ευαισθησία των μελετούμενων παραγώγων. Ανάλυση των αναβολικών με τα ίδια αντιδραστήρια (Σχήμα 5.8 Α) οδηγεί σε παρόμοια αποτελέσματα για το αντιδραστήριο Α 1. Αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης παραγωγοποίησης παρατηρείται για σχεδόν όλες τις μελετούμενες ουσίες με εξαίρεση την ουσία testosterone. Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων με το άθροισμα των RRF (Σχήμα 5.9 Α) οδηγεί σε συμπέρασμα παρόμοιο με αυτά που έχουν ήδη αναφερθεί, την επιλογή δηλαδή του αντιδραστηρίου Α 1 ως βέλτιστου για την παράμετρο Α. Τα αποτελέσματα που προκύπτουν για τα διεγερτικά με τροποποίηση του χρόνου επώασης (παράμετρος Β), και στα δύο στάδια της προτεινόμενης πορείας παραγωγοποίησης παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.7Β. Διακύμανση στην απόδοση της αντίδρασης παρατηρείται για την ουσία amphetamine mono-tms, η οποία εμφανίζει αύξηση του RRF (με αντίστοιχη μείωση για το bis-tms παράγωγο) με μείωση του χρόνου παραγωγοποίησης. Μελέτη του Σχήματος 5.8 Β οδηγεί σε παρόμοια συμπεράσματα για τα αναβολικά με εξαίρεση την ουσία methandienone mt για την παρατηρείται μείωση αυτού. Αντίθετα, αύξηση του RRF προκύπτει για την ουσία aminoglutethimide. Μείωση του χρόνου παραγωγοποίησης σε συνολικά 20 λεπτά για το 1 ο και το 2 ο στάδιο προκύπτει και από τη μελέτη του Σχήματος 5.9Β (με τιμή 7,7 για το επίπεδο Β7 έναντι του 7,3 για το επίπεδο 2). Η μείωση αυτή στο χρόνο επώασης είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς συνεπάγεται εξοικονόμηση χρόνου, μια παράμετρος ιδιαίτερα σημαντική για μεθόδους

139 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 5.7: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για τα διεγερτικά-ναρκωτικά: (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW και (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r)

140 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 5.8: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για τα αναβολικά στεροειδή: (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW και (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r)

141 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών σάρωσης. Ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης σε 20 λεπτά συνολικά, είναι το αποτέλεσμα του σταδίου αυτού. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν δοκιμές που περιλαμβάνουν την προσθήκη βελτιωτικών μέσων, όπως είναι η προσθήκη καταλύτη και διαλύτη. Τόσο ο καταλύτης (TMCS), όσο και ο διαλύτης (ACN) έχουν αναφερθεί για την ευεργετική τους δράση αυξάνοντας την ταχύτητα της αντίδρασης παραγωγοποίησης και ενισχύοντας την ολοκλήρωση αυτής. Το TMCS έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως κυρίως σε συνδυασμό με το MSTFA και το BSTFA για την παραγωγοποίηση διαφόρων απαγορευμένων ουσιών, ενώ η ευεργετική δράση του ACN έχει αναφερθεί σε διάφορες εφαρμογές. Όπως προκύπτει γραφικά από τη μελέτη του Σχήματος 5.7 C και 5.8 C προσθήκη του TMCS δεν προκαλεί καμία αξιοσημείωτη μεταβολή στα μέχρι τώρα αποτελέσματα για το σύνολο των εξεταζόμενων ουσιών. Συνεπώς το άθροισμα των RRF (Σχήμα 5.9 C) υπολογίζεται ίσο (επίπεδα C 2-4 ) ή και μικρότερο από το αρχικό επίπεδο C 1, στο οποίο δεν έχει πραγματοποιηθεί προσθήκη βελτιωτικών μέσων

142 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών

143 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 5.9: Μελέτη των παραμέτρων Ai- Air για το σύνολο των μελετούμενων ουσιών (sum RRF): (A) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης, (B) χρόνος επώασης, (C) προσθήκη καταλύτη και διαλύτη, (D) θερμοκρασία επώασης/ ακτινοβόληση με MW, (E) Συγκέντρωση αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης (r), (RRF(A) το RRF των αναβολικών, RRF(Δ-Ν) το RRF των διεγερτικών ναρκωτικών) Από τη μελέτη των ίδιων σχημάτων προκύπτει ότι προσθήκη του ACN οδηγεί σε αύξηση του λόγου ephedrine bis-tms (κύριο) / ephedrine mono-tms, καθώς και σε αύξηση του λόγου amphetamine mono-tms/ amphetamine bis-tms. Επιπλέον στα αναβολικά η προσθήκη του ACN οδηγεί σε αύξηση του RRF για την ουσία aminoglutethimide και μείωση για την ουσία methandienone met. Στο Σχήμα 5.9 C παρουσιάζονται τα αποτελέσματα μετά την προσθήκη ACN σε σχέση με το αρχικό αντιδραστήριο, οπότε η προσθήκη 25 μl (επίπεδο C6) επιλέγεται ως βέλτιστη. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε επώαση σε διαφορετικές θερμοκρασίες με συμβατική μέθοδο θέρμανσης, αλλά και με την εφαρμογή εναλλακτικών μέσων, όπως ακτινοβόληση με μικροκύματα σύμφωνα με τον Πίνακα Από τη μελέτη των Σχημάτων 5.7 D και 5.8 D προκύπτουν μικρές διαφορές στους RRF με εξαίρεση το επίπεδο 4 που παρουσιάζει τη χαμηλότερη τιμή σε σχέση με τα υπόλοιπα (Σχήμα 5.9 D). Εφαρμογή ακτινοβόλησης με MW οδήγησε σε αύξηση του λόγου ephedrine bis- TMS /ephedrine mono-tms, ενώ αξιολόγηση των συνολικών αποτελεσμάτων (Σχήμα 5.9 D) οδηγεί σε αποτελέσματα ανάλογα με αυτά της συμβατικής μεθόδου θέρμανσης. Τα πειράματα με εφαρμογή MW εμφανίζουν το μειονέκτημα της κακής επαναληψιμότητας και συνεπώς της μεγάλης διακύμανσης, για τους μελετούμενους

144 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών αναλύτες που οφείλεται πιθανώς σε ανεξέλεγκτη εξάτμιση των πτητικών κυρίως ουσιών (amphetamine, ephedrine), η οποία πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια της ακτινοβόλησης καθώς και στην ύπαρξη υγρασίας στο χώρο που πραγματοποιείται η αντίδραση. Έτσι η πορεία αυτή απορρίπτεται και συνεπώς παραγωγοποίηση με συμβατική θέρμανση (στους 80 0 C, τόσο στο 1 ο, όσο και στο 2 ο στάδιο) επιλέχθηκε στο στάδιο αυτό. Κατόπιν συμπλήρωσης του 1 ου κύκλου των πειραμάτων με τη μελέτη των παραμέτρων A-D πραγματοποιήθηκε επανέλεγχος της παραμέτρου A. Παραγωγοποίηση με το αντιδραστήριο Α5 οδηγεί σε αύξηση του RRF για τις ουσίες ephedrine bis-tms και atenolol και σε μείωση για τις ουσίες aminoglutethimide και το fluoxymesterone met, όπως προκύπτει από τα Σχήματα Ε. Μελέτη του Σχήματος 5.9Ε αποδεικνύει τη μικρή διακύμανση στο σύνολο των αποτελεσμάτων για τα επίπεδα Α 1r, Α 2r, Α 5r με το επίπεδο Α 2r να παρουσιάζει (ελαφρώς) τη μεγαλύτερη απόδοση. Καθώς η απόδοση της αντίδρασης παραγωγοποίησης δεν παρουσίασε μεγάλες διαφορές από τον προηγούμενο κύκλο, τα πειράματα της φάσης II θεωρείται ότι ολοκληρώθηκαν με τη μελέτη της παραμέτρου Α ιr. Από τη μελέτη των Σχημάτων σημειώνεται ότι το εύρος των RRF κυμαίνεται μεταξύ των τιμών 0,04 έως 2,33 εκτός της περίπτωσης της εφεδρίνης για την οποία χρησιμοποιήθηκε συντελεστής κανονικοποίησης. Συνοψίζοντας καταλήγουμε: Συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης: το αντιδραστήριο Α2 με συγκέντρωση MSTFA/NH 4 I/PrSH 1000/2/3 (v/w/v) παρουσιάζει τη μεγαλύτερη απόδοση για το σύνολο των εξεταζόμενων ουσιών. Η συγκέντρωση αυτή είναι παρόμοια με τη συγκέντρωση του αντιδραστηρίου που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την παραγωγοποίηση των αναβολικών στεροειδών. Χρόνος επώασης: επιμήκυνση του χρόνου παραγωγοποίησης δεν οδήγησε σε αύξηση των RRF. Οι διακυμάνσεις που παρατηρήθηκαν, στις εφαρμοζόμενες δοκιμές δεν είναι σημαντικές, ενώ όπως αποδεικνύεται μείωση του χρόνου παραγωγοποίησης σε είκοσι λεπτά συνολικά, επιτρέπει την ολοκλήρωση της αντίδρασης παραγωγοποίησης. Προσθήκη βελτιωτικών μέσων: η προσθήκη καταλυτών έχει αναφερθεί ότι επιταχύνει την αντίδραση παραγωγοποίησης. Από τη συγκεκριμένη μελέτη δεν προέκυψε τροποποίηση των αποτελεσμάτων μετά την προσθήκη του καταλύτη. Προσθήκη επίσης διαφόρων διαλυτών, όπως το ACN έχει αναφερθεί, με στόχο τη βελτίωση των

145 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών τιμών RRF, πιθανόν λόγω της ικανότητας αυτών να επιταχύνουν την αντίδραση παραγωγοποίησης 73. Προσθήκη 25 μl στο 1 ο στάδιο οδήγησε σε αύξηση των RRF. Θερμοκρασία επώασης: Κατά τη θέρμανση με συμβατική μέθοδο τα αποτελέσματα που ελήφθησαν δεν παρουσιάζουν μεγάλες διακυμάνσεις για όλες τις δοκιμές. Θέρμανση με MW παρουσίασε κακή επαναληψιμότητα και μεγάλες διακυμάνσεις, παρά το γεγονός ότι εμφάνισε συγκρίσιμες τιμές RRF με τη συμβατική θέρμανση ακόμη και μετά την εφαρμογή της για πολύ σύντομο χρονικό διάστημα (επίπεδο D10). Κατά συνέπεια η βελτιστοποιημένη πορεία παραγωγοποίησης η οποία συνδυάζει τη μέγιστη απόδοση για τις μελετούμενες ουσίες, όπως αυτό προέκυψε από τη μελέτη ων παραμέτρων A-D συνοψίζεται στο Σχήμα Σχήμα 5.10: Ενιαία μέθοδος παραγωγοποίησης δυο σταδίων για το σχηματισμό τριμεθυλοσιλυλο παραγώγων Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που παρουσιάστηκαν στο εδάφιο αυτό, η βελτιστοποιημένη μέθοδος παραγωγοποίησης επιτρέπει την εφαρμογή ενιαίας παραγωγοποίησης σε ομάδες ουσιών για τις οποίες μέχρι πρότινος απαιτούνταν η εφαρμογή δυο διαφορετικών πορειών παραγωγοποίησης σε διαδικασίες σάρωσης. Το αποτέλεσμα αυτό με τη σειρά του εμφανίζεται ιδιαίτερα σημαντικό μιας και οδηγεί: Σε αξιοσημείωτη μείωση κόστους για τα χρησιμοποιούμενα αντιδραστήρια Εξοικονόμηση χρόνου, που είναι ιδιαίτερα σημαντική σε μεθόδους σάρωσης απαγορευμένων ουσιών Μείωση των αναγκών του απασχολούμενου προσωπικού των εργαστηρίων Εφαρμογή στο σύνολο των ουσιών Οι αναλύτες που ανιχνεύθηκαν μετά την εφαρμογή της βελτιστοποιημένης πορείας παραγωγοποίησης (Σχήμα 5.10) στο MRPL με λόγο S/N>3 205 παρουσιάζονται στους Πίνακες 5.13 και Η ενιαία αυτή πορεία παραγωγοποίησης των δυο σταδίων

146 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών επιτρέπει την ανίχνευση 190 ουσιών (η μελέτη της ανάκτησης των οποίων μελετήθηκε στο Κεφάλαιο 6) συμπεριλαμβανομένων των ενδογενών και συνθετικών αναβολικών στεροειδών, διεγερτικών, ναρκωτικών, β2 αγωνιστών και β-ανταγωνιστών, καθώς και τριών διουρητικών ουσιών. Παραγωγοποίηση με την ενιαία μέθοδο παραγωγοποίησης οδήγησε σε προστασία των "ασταθών ομάδων", όπως για παράδειγμα στην περίπτωσης της ουσίας cortisol, με αποτέλεσμα το σχηματισμό του per-tms παραγώγου και τη βελτίωση της χρωματογραφικής συμπεριφοράς. Το ACN, όπως προέκυψε και κατά τη διάρκεια της βελτιστοποίησης εμφάνισε θετική επίδραση στην παραγωγοποίηση των διεγερτικών ναρκωτικών αυξάνοντας το ποσοστό των per-tms παραγώγων για διάφορες ουσίες όπως για παράδειγμα η ephedrine, ενώ όπως παρουσιάστηκε δεν επηρεάζει την αντίδραση των αναβολικών στεροειδών. Θετική επίσης εμφανίστηκε η δράση του ACN σε ουσίες που φέρουν στο μόριο δευτεροταγές άτομο αζώτου, όπως οι benzylamphetamine, ethylamphetamine, mefenorex κα, στις οποίες όπως προέκυψε από τη μελέτη των αντίστοιχων χρωματογραφημάτων, διευκολύνεται ο σχηματισμός του N-TMS παραγώγου παρουσία αυτού. Παραγωγοποίηση του μεγαλύτερου μέρους των διουρητικών ουσιών, καθώς και της ουσίας sydnocarb στο MRPL δεν επιτεύχθηκε με τη βελτιστοποιημένη πορεία παραγωγοποίησης. Πίνακας 5.13: Αναλύτες, σχηματιζόμενα παράγωγα και διαγνωστικά ιόντα που ανιχνεύονται με παραγωγοποίηση δύο σταδίων σε δείγματα ούρων αθλητών και full scan GC/MS ανάλυση : Αναλύτης Παράγωγο Διαγνωστικά ιόντα (m/z) GC/MS Ανάλυση 6-acetyl-morphine TMS 399, 340, hydroxy bromantan TMS 91, 393, 184 Adrafinil artefact NA 167, 152 Alfentanyl NA 289, 268, 222 Adrenaline tris-tms 355, 44, 294 Aminoglutethimide tris-tms 291, 276, 433 Amphepramone an1 (M) NA 100, 77,

147 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.13 (συνέχεια) Amphepramone an2 enol TMS 277, 233, 248 Amphetamine TMS 116, 192, 91 Amphetaminil NA 132, 105, 91 Benzoylecgonine TMS 82, 240, 361 Benzphetamine NA 91, 148, 238 Benzylamphetamine an1 NA 134, 91, 210 Benzylamphetamine an2(m) TMS 206, 282, 91 Buflomedil enol TMS 84, 295, 379 Bupropion NA 100, 224, 139 Caffeine NA 194, 109, 82 Carphedon enol TMS 272, 104, 257 Cocaine NA 82, 182, 303 Cropropamide NA 100, 168, 69 Crotethamide NA 86, 154, 69 Dextromoramide NA 100, 265, 128 Dihydrocodeine TMS 373, 315, 358 Ecgonine methylester TMS 82, 96, 271 EDDP NA 277, 262, 220 Ephedrine an1(m) bis -TMS 130, 179, 294 Ephedrine an2 TMS 58, 179, 222 Etafedrine TMS 86, 250, 176 Ethamivan TMS 223, 294, 193 Ethylamphetamine TMS 144, 220, 91 Etilefrine an1 bis-tms 58, 268, 310 Etilefrine an2(m) tris-tms 130, 147, 382 Etilefrine C,N Methylene bis-tms 280, 265,

148 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.13 (συνέχεια) Famprofazone NA 286, 229, 214 Fencamfamine an1 NA 98, 215, 186 Fencamfamine an2 TMS 170, 287, 258 Fenethylline an1 NA 250, 207, 91 Fenethylline an2 TMS 322, 220, 398 Fenfluramine TMS 144, 288, 159 Fenproporex TMS 169, 126, 245 Fentanyl NA 245, 189, 202 Furfenorex NA 81, 138, 91 Heptaminol bis-tms 116, 274, 131 MDA TMS 116, 135, 236 MDMA an1 NA 58, 135, 193 MDMA an2 (M) TMS 130, 250, 264 Meclofenoxate NA 200, 141, 111 Mefenorex an1 NA 120, 91, 196 Mefenorex an2 (M) TMS 192, 91, 220 Mephentermine an1 (M) NA 72, 148, 91 Mephentermine an2 TMS 144, 220, 91 Methadone enol TMS 72, 296, 85 Methamphetamine TMS 130, 206, 91 Methoxyphenamine TMS 130, 91, 236 Methylephedrine TMS 72, 163, 236 Methylphenidate TMS 156, 290, 59 Modafinil artifact (M) bis-tms 167, 219, 152 Modafinil-H2O enol-tms 327, 167, 258 Morphine bis -TMS 429, 236,

149 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.13 (συνέχεια) Nikethamide NA 106, 177, 78 Norcodeine TMS 357, 329, 342 Nor-ephedrine bis-tms 116, 280, 179 Norfenfluramine TMS 116, 260, 159 Normorphine an1(m) bis TMS 222, 415, 400 Normorphine an2 tris-tms 487, 308, 472 Norpseudoephedrine bis TMS 116, 280, 179 Octopamine tetra TMS 267, 174, 426 Oxycodone bis-tms 459, 444, 297 Pentazocine TMS 289, 244, 342 Pentylenetetrazol NA 82, 55, 109 Pethidine NA 247, 218, 232 Phendimetrazine NA 85, 57, 191 Phenmetrazine an1 NA 71, 177, 117 Phenmetrazine an2 TMS 100, 115, 143 Phentermine TMS 130, 114, 91 Phenylephrine an1 bis-tms 267, 44, 296 Phenylephrine an2 (M) tris-tms 116, 147, 368 Phenylephrine bis-tms 280, 265, 308 Tetrahydroisoquinoline Pholedrine an1 (M) bis-tms 130, 294, 179 Pholedrine an2 TMS 58, 179, 236 p-hydroxy-amphetamine an1 (M) bis-tms 116, 280, 179 p-hydroxy-amphetamine an2 tris-tms 188, 352, 179 Pipradol TMS 84, 255, 165 Prolintane NA 126, 174,

150 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.13 (συνέχεια) Pseudoephedrine an1 (M) bis-tms 130, 294, 179 Pseudoephedrine an2 TMS 58, 179, 222 Ritalinic TMS 156, 230, 192 Selegiline NA 96, 91, 172 Strychnine NA 334, 319, 305 Synephrine an1 bis-tms 267, 193, 296 Synephrine an2 (M) tris-tms 116, 267, 368 Bumetanide bis-tms 508, 493, 465 Furosemide bis-tms 474, 459, 355 Ethacrynic acid bis-tms 243, 319, 339 M: main (κύριος) αναλύτης, an: analyte, NA: not applied (ανιχνεύεται το απαραγωγοποίητο προϊόν) Πίνακας 5.14: Αναλύτες, σχηματιζόμενα παράγωγα και διαγνωστικά ιόντα που ανιχνεύονται με παραγωγοποίηση δύο σταδίων σε δείγματα ούρων αθλητών και HRMS ανάλυση (συνεχίζεται): Αναλύτης Παράγωγο Διαγνωστικά ιόντα (m/z) GC/MS Ανάλυση Διαγνωστικά ιόντα (m/z) HRMS Ανάλυση Ομάδα ιόντων (function) 11β-hydroxyetiocholanolone bis-tms 432 NA 11β-hydroxyandrosterone bis-tms 432 NA 16β-hydroxystanozolol tetra-tms NA , (8) 18-methyl-19-norandrosterone bis-tms 405, 315, (2) 18-methyl-19-noretiocholanolone bis-tms 405, 315, 434 NA 1-Testosterone bis-tms 194, 432, 417 NA 3'-Hydroxystanozolol tris-tms NA , (7) 4- Hydroxytestosterone tris-tms 520, 505, 430 NA 4β-hydroxystanozolol tris-tms NA , (7) 5α-Androstandiol bis-tms 241, 421, 129 NA 5β-Androstandiol bis-tms 241, 421, 129 NA

151 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.14 (συνέχεια) 7-me-Nandrolone bis-tms 434, 419, 329 NA Acebutolol tetra-tms 144, 437, 609 NA Alprenolol bis-tms 144, 378, 101 NA Amiloride tetra-tms 388, 390, 403 NA Aminoglutethimide tris-tms 291, 276, 433 NA Amiphenazole tris-tms 407, 187, 392 NA Anastrozole NA 209, 293, 266 NA Androstendione bis-tms 430, 415, 325 NA Androstendione mt1 tris-tms 518, 503, 445 NA Androsterone bis-tms 434, 419 NA Atenolol- an1 bis-tms 72, 294, 395 NA Atenolol- an2 tris-tms 144, 295, 467 NA Bambuterol TMS 86, 439, 282 NA Betaxolol bis-tms 144, 264, 436 NA Bisoprolol bis-tms 144, 101, 282 NA Bolasterone mt1 bis-tms 143, 284, , (4) Boldenone bis-tms 206, 430, 415 NA Boldenone mt1 bis-tms 194, 417, , (2) Boldenone mt2 bis-tms 275, 417, 432 NA Bromantan mt TMS 393, 395, 91 NA Buprenorphine an1 bis-tms NA , (9) Buprenorphine an2 TMS NA (8) Calusterone bis-tms NA , (5) Cannabis mt1 bis-tms 371, 473, 488 NA Carteolol- an1 bis-tms 235, 86, 421 NA Carteolol-an2 TMS 86, 349, 364 NA

152 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.14 (συνέχεια) Carvedilol- an1 TMS 183, 180, 463 NA Carvedilol- an2 bis-tms 252, 254, 413 NA Celiprolol TMS 86, 200, 435 NA Clenbuterol bis-tms NA , (1) Clomiphene mt1 TMS 86, 100, , (7) Clostebol mt1 bis-tms 451, 466, , (4) Clostebol mt2 bis-tms 453, 455, 468 NA Cocaine mt TMS 82, 240, , (1) Codeine TMS 371, 356, 343 NA Cyclofenyl mt1 tris-tms 422, 343, , (5) Danazol mt1 bis-tms 456, 301, (5) Danazol mt2 tris-tms 455, 558, 543 NA DHEA bis-tms 432, 417, 327 NA DHEA Cyclo mt bis-tms 432, 417, 377 NA DHT bis-tms 434, 419, 405 NA Drostanolone mt1 bis-tms NA , (3) Epitestosterone bis-tms 432, 417 NA Esmolol bis-tms 144, 252, 424 NA Etiocholanolone bis-otms 434, 419 NA Fenoterol penta-tms 308, 356, (5) Fenoterol adduct tetra-tms 424, 335, 308 NA Fluoxymesterone mt1 bis-tms NA , (3) Fluoxymesterone mt2 tetra-tms NA , (5) Formebolone mt1 tris-tms 534, 389, , (5) Formebolone mt2 penta-tms 707, 619, (7) Formestane tris-tms 518, 503, 430 NA

153 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.14 (συνέχεια) Furazabol TMS 143, 387, (5) Furazabol mt1 bis-tms 490, 218, (7) Hydromorfone bis-tms 429, 414, 234 NA Labetalol-an1 tetra-tms 234, 455, 130 NA Labetalol-an2 tris-tms 234, 455, 130 NA Letrozol mt TMS 291, 217, 190 NA Levobunolol bis-tms 234, 86, 435 NA Mesterolone mt1 bis-tms NA , (3) Methandienone LTmt bis-tms NA , (3) Methandienone mt1 bis-tms NA , (2) Methandienone mt4 TMS NA , (1) Methenolone bis-tms 195, 208, 446 NA Methenolone mt1 bis-tms 431, 446, , (3) Methyltestosterone bis-tms 446, (5) Methyltestosterone mt1 bis-tms NA , (3) Methyltestosterone mt2 bis-tms NA , (3) Metipranolol-an1 OTMS 72, 152, 265 NA Metipranolol-an2 bis-tms 144, 266, 224 NA Metoprolol bis-tms 144, 224, 101 NA Mibolerone bis-tms 301, 431, 446 NA Nadolol tris-tms 86, 147, 510 NA Nandrolone mt1 bis-tms NA , (2) Nandrolone mt2 bis-tms NA , (2) Norbolethone mt1 bis-tms 157, 435, 345 NA Norbolethone mt2 bis-tms NA (5), (5) Norethandrolone mt1 bis-tms 157, 144, , (4)

154 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.14 (συνέχεια) Norethandrolone mt2 bis-tms 157, 144, 421 NA Norethisterone mt1 bis-tms 431, 446, 169 NA Oral turinabol mt1 bis-tms 143, 315, 317 NA Oral turinabol mt2 tris-tms 582, 584, 218 NA Oral turinabol m3 tetra-tms NA , (6) Oxandrolone bis-tms NA , (5) Oxandrolone mt1 bis-tms NA , (4) Oxprenolol bis-tms 144, 86, 101 NA Oxycodone bis-tms 459, 444, 297 NA Oxymesterone tris-tms NA , (6) Oxymetholone mt1 tris-tms 143, 462, 282 NA Oxymetholone mt2 tris-tms 143, 460, 550 NA Oxymetholone mt3 tetra-tms NA , (6) Pemoline tris-tms 392, 178, 377 NA Probenecid TMS 328, 193, 257 NA Propranolol bis-tms 144, 216, 388 NA Prostanozol mt tris-tms NA (6), (6) Reproterol mt tris-tms NA (9), (9) RSR13 bis-tms 326, 485, 470 NA Salbutamol tris-tms 86, 369, (1) Salmeterol tris-tms NA (9) Salmeterol mt penta-tms NA (9) Sotalol tris-tms 144, 250, 473 NA Stenbolone bis-tms 208, 193, 446 NA Tamoxifen mt TMS 72, 58, , (6) Terbutaline tris-tms 86, 356, 426 NA

155 ΚΕΦ. 5 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 5.14 (συνέχεια) Testosterone bis-tms 432, 417 NA Timolol TMS 86, 373, 186 NA Trenbolone mt1 bis-tms 307, 412, , (3) Triamterene tris-tms 454, 469, 366 NA Zeranol tris-tms 433, 307, , (5) Zipaterol bis-tms NA (1), (1) mt: metabolite, an: analyte, NA: not applied Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως για παράδειγμα στην ουσία amphepramone παρατηρήθηκε "αντιστροφή" των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν σε πρότυπα διαλύματα και στα αποτελέσματα που προέκυψαν σε δείγματα ούρων. Έτσι, ενώ ο αναλύτης enol-tms αποτελεί το κύριο προϊόν, έναντι της απαραγωγοποίητης ουσίας όπως αυτό προσδιορίστηκε σε πρότυπα διαλύματα, στα ούρα εμφανίζεται ως κύριο προϊόν η απαραγωγοποίητη ουσία. Τέτοιες αποκλίσεις οφείλονται πιθανόν σε παρεμπόδιση από το υπόβαθρο του δείγματος. Η ταυτόχρονη παρουσία δυο αναλυτών για αρκετές από τις μελετούμενες ουσίες, με τον ένα από αυτούς να εμφανίζεται ως κύριος με το υψηλότερο σήμα, παρατηρείται σε αρκετές ουσίες όπως προκύπτει από τη μελέτη των Πινάκων Εισαγωγή των δύο αναλυτών στη μακροεντολή (macro) με σκοπό την ταυτόχρονη παρακολούθησή τους μπορεί να θεωρηθεί ως ένα επιπλέον μέτρο ασφαλέστερης ανίχνευσης αυτών σε μεθόδους σάρωσης 206. Πρέπει τέλος να αναφερθεί ότι παρόλο που η μέθοδος στηρίζεται σε βελτιστοποιημένο πρωτόκολλο παραγωγοποίησης, η αποτελεσματικότητα της προτεινόμενης πορείας, επιβεβαιώνεται σε όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα με την ταυτόχρονη παρακολούθηση του λόγου R A, γεγονός που ενισχύει την εγκυρότητα της προτεινόμενης μεθόδου για την ευρεία χρήση της

156

157 ΚΕΦ. 6 - Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Κεφάλαιο Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών

158 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΕΝΙΑΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΣΕ ΟΥΡΑ ΑΘΛΗΤΩΝ 6.1 Εισαγωγή Όπως ήδη αναφέρθηκε βασικός στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου σαρώσεως που περιλαμβάνει κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης για το σύνολο των απαγορευμένων ουσιών. Στα πλαίσια ανάπτυξης κοινής παρασκευαστικής πορείας πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης των απαγορευμένων ουσιών. Η κοινή πορεία εκχύλισης που μελετάται πρέπει να έχει ευρεία εφαρμογή, να εκχυλίζει ένα μεγάλο αριθμό απαγορευμένων ουσιών και να απομακρύνει ικανοποιητικά τις ανεπιθύμητες προσμίξεις της μήτρας, ώστε να μην παρεμποδίζεται η ανίχνευσή τους. Το έκλουσμα που θα προκύψει από την κοινή αυτή πορεία εκχύλισης θα αναλύεται απευθείας στο LC/MS με απλή ανασύσταση και κατόπιν παραγωγοποίησης στο GC/MS. Αξίζει να αναφερθεί ότι μέχρι πρότινος για την ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών απαιτούνταν τέσσερις διαφορετικές παρασκευαστικές διαδικασίες για τις ανάγκες των αντίστοιχων μεθόδων σάρωσης των απαγορευμένων ουσιών (υποκεφάλαιο 1.5). Με βάση τις απαιτήσεις που αναφέρθηκαν πραγματοποιήθηκε ο πειραματικός σχεδιασμός της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου εκχύλισης. Για την εκχύλιση των εξεταζομένων ουσιών χρησιμοποιήθηκε ένας μεγάλος αριθμός προσροφητικών υλικών με διαφορετικές ιδιότητες. Υγρό υγρό εκχύλιση των παραπάνω ουσιών πραγματοποιήθηκε σε μικρότερη έκταση. Οι ουσίες που εξετάστηκαν ανήκουν στις τάξεις των: διεγερτικών, ναρκωτικών, αναβολικών στεροειδών, β-αναστολέων, β2- αγωνιστών, διουρητικών και κορτικοστεροειδών. 6.2 Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Τα υλικά αναφοράς που χρησιμοποιήθηκαν έχουν ήδη αναφερθεί στο εδάφιο

159 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Τα πολυσυστατικά διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν, καθώς και οι μελετούμενες συγκεντρώσεις είναι τα εξής: Ι) Δυο δείγματα ποιοτικού ελέγχου που περιλαμβάνουν 15 (CALA) και 9 (CALB) αντιπροσωπευτικές ουσίες (με διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες) από τις κατηγορίες απαγορευμένων ουσιών, για τα πειραματικά πρωτόκολλα που περιγράφονται στα εδάφια Το CALA περιέχει ουσίες που ανήκουν στις τάξεις των αναβολικών στεροειδών (1-13 στον Πίνακα 6.1) και κορτικοστεροειδών (14-15 στον Πίνακα 6.1), ενώ το CALB ουσίες που κατατάσσονται ως διεγερτικά, ναρκωτικά (1-7 στον Πίνακα 6.2) και διουρητικά (8-9 στον Πίνακα 6.2). Η σύσταση των πολυσυστατικών διαλυμάτων CALA και CALB, καθώς και οι μελετούμενες συγκεντρώσεις συνοψίζονται στους Πίνακες 6.1 και 6.2. Πίνακας 6.1: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALA Ουσία C CALA (mg/l) C ούρων (μg/l) C αναλυόμενη (μg/l) 1 Testosterone 2,50 50,0 35,0 2 Formestane 2,50 50,0 35,0 3 6β-OH methandienone 2,50 50,0 35,0 4 Boldenone mt1 2,50 50,0 35,0 5 Fluoxymesterone tetrol mt2 2,50 50,0 35,0 6 Furazabol pc 2,50 50,0 35,0 7 Oxandrolone 2,50 50,0 35, OH-stanozolol 2,50 50,0 35,0 9 3-OH-stanozolol 1,00 20,0 14,0 10 Fenoterol 3,00 60,0 42,0 11 Aminogluthethimide 10, Amiloride 25, Atenolol 50,0 1,0x Triamcinolone acetonide 5, ,0 15 Prednisone 5, ,0 Πίνακας 6.2: Ουσίες που περιέχονται στο διάλυμα ποιοτικού ελέγχου CALΒ Ουσία C CALA (mg/l) C ούρων (mg/l) C αναλυόμενη (mg/l) 1 Amphetamine 25,0 0,75 0,53 2 Pholedrine 25,0 0,75 0,53 3 Ephedrine 150 4,50 3,15 4 Heptaminol 25,0 0,75 0,53 5 Benzoyl ecgonine 25,0 0,75 0,53 6 Methylphenidate 50,0 1,50 1,05 7 Morphine 25,0 0,75 0,53 8 Furosemide 25,0 0,75 0,23 9 Ethacrynic acid 25,0 0,75 0,

160 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Οι μελετούμενες συγκεντρώσεις για τις σειρές είναι μεγαλύτερες ή ίσες του MRPL, όπως αυτό καθορίζεται από το WADA (υποκεφάλαιο 1.6). ΙΙ) 5 δείγματα ελέγχου (CMIX, 471, 847, CALWADA, CALD) για τα πρωτόκολλα που περιγράφονται στο εδάφιο Η σύσταση των δειγμάτων αυτών έχει ήδη αναφερθεί (5.2.1 ΙΙ). Οι μελετούμενες συγκεντρώσεις για τη σειρά είναι ίση με το MRPL, όπως αυτό καθορίζεται από το WADA (υποκεφάλαιο 1.6). Όλα τα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν περιλαμβάνουν μοίρασμα της οργανικής στοιβάδας σε δύο τμήματα, ένα για την ανάλυση των αναβολικών και διεγερτικών ναρκωτικών μετά από παραγωγοποίηση με GC/MS και ένα δεύτερο για την ανάλυση των κορτικοστεροειδών και διουρητικών μετά από απλή ανασύσταση με LC/MS Αντιδραστήρια Άνυδρο θειϊκό νάτριο, Na 2 SO 4, καθαρότητας 99,0 % w/w, Panreac Στερεό ρυθμιστικό μίγμα όξινου ανθρακικού νατρίου/ανθρακικού νατρίου, ΝaHCO 3 ( 99,7 % w/w) / Na 2 CO 3 ( 99,8 % w/w) 10/1, Panreac MSTFA, Ν-μεθυλο-Ν-τριμεθυλοσιλυλοτριφθοροακεταμίδιο, C 6 H 12 ONF 3 Si, καθαρότητας 98,0 %, Pierce MBTFA, N-μεθυλο-δισ(τριφθοροακεταμίδιο), C 5 H 3 O 2 NF 6, Macherey Nagel Ενζυμικό διάλυμα β-γλυκουρονιδάσης/αρυλοσουλφατάσης από Helix Pomatia, units/ml, Sigma-Aldrich Οξικός αιθυλεστέρας, καθαρότητας 99,8 %, Labscan Διαιθυλαιθέρας [(C 2 H 5 ) 2 O], καθαρότητας 99,5 %, Labscan Τert-βουτυλομεθυλαιθέρας, (CH 3 ) 3 COCH 3, καθαρότητας 99,8 % v/v, p.a., Labscan Ακετόνη, καθαρότητας 99.5 %, Labscan Χλωροφόρμιο, CHCl 3, καθαρότητας 99,5 % v/v, p.a., Labscan Διχλωρομεθάνιο, CH 2 Cl 2, καθαρότητας 99,8 % v/v, p.a., Labscan n-εξάνιο, καθαρότητας 95,0 % v/v, p.a., Labscan Ιωδομεθάνιο, CH 3 I, καθαρότητας 99,5 %, Ανθρακικό κάλιο K 2 CO 3, καθαρότητας 99,0 %, Merck Πρότυπο διάλυμα μεθυλοτεστοστερόνης, 5 μg/ml

161 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρότυπο διάλυμα κωδεΐνης, 100 μg/ml, C 18 H 21 O 3 N, Sigma-Aldrich Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/ΝΗ 4 Ι/DTE 1000/2/4 (v/w/w) Μίγμα ακετονιτριλίου/δισαπεσταγμένου ύδατος με περιεκτικότητα οξικού οξέος 0,1 % v/v Δισαπεσταγμένο ύδωρ Ισοπροπανόλη, καθαρότητας 99,9 % v/v, p.a., Merck Ακετονιτρίλιο, καθαρότητας 99,9 % v/v, p.a., Labscan Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/ΝΗ 4 Ι/ PrSH 1000/2/3 (v/w/v) Μίγμα παραγωγοποίησης MSTFA/ΝΗ 4 Ι/ PrSH 1000/4/7 (v/w/v) CH 3 COOH καθαρότητας 99,7 %, p.a., Panreac Τριαιθυλαμίνη, καθαρότητας 99,0 %, p.a., Sigma-Aldrich ΝΗ 3, καθαρότητας 25,0 %, p.a., Merck Οξικό αμμώνιο, CH 3 COONH 4, καθαρότητας 98,0 %, p.a., Sigma-Aldrich Οξικό νάτριο, CH 3 COONa, καθαρότητας 98,0 %, p.a., Sigma-Aldrich KH 2 PO 4, καθαρότητας 98,0 100,5 %, p.a., Panreac Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Oasis HLB (500 mg/6 ml), Waters Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Oasis MCX (500 mg/6 ml), Waters Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Oasis MAX (500 mg/6 ml), Waters Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Bond Elut C18-EC (500 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Bond Elut C8-EC (500 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Bond Elut Certify (500 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Bond Elut Certify II (500 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Bond Elut LMS (500 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Focus (50 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Abselut Nexus (200 mg/6 ml), Varian Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute C8-EC (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute C8-ΝΕ (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute C18-EC (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute C18-ΝΕ (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute 101 (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute HCX (300 mg/6 ml), Biotage

162 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute HCX-3 (300 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Isolute C2-EC (500 mg/6 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Multimode (500 mg/3 ml), Biotage Φυσίγγια εκχύλισης στερεάς φάσης Lichrolut EN (500 mg/6 ml), Merck Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Γυάλινοι σωλήνες Βιδωτά, πλαστικά πώματα για τους υάλινους σωλήνες Φιαλίδια Crimp Neck ND-11, διαφανή, χωρητικότητας 1,5 ml Καπάκια Αluminum Cap Clear lacquered-11 mm, septum natural rubber/tef, πάχους 1,0 mm Μικροενθέματα χωρητικότητας 0,1 ml, διαφανή με κωνικό πυθμένα Γυάλινες πιπέττες Pasteur Μεταλλικές σπάτουλες ΑΝ24, ΑΝ25, ΑΝ26 Αυτόματες πιπέττες 5-40 μl, μl, μl, 1-5 ml και επαναληπτική πιπέττα Πλαστικά ρύγχη για όλες τις πιπέττες Ψαλίδι κλεισίματος φιαλιδίων αυτόματου εισαγωγέα Ογκομετρικές φιάλες βαθμονομημένες για την παρασκευή και φύλαξη των διαλυμάτων Ογκομετρικοί κύλινδροι Σωλήνες RIA Πώματα για τους σωλήνες RIA phμετρικός χάρτης 4-7 και 7,5-14 Εσμυρισμένα υάλινα πώματα Γυάλινοι κωνικοί σωλήνες με εσμύρισμα Γυάλινοι βιδωτοί κωνικοί σωλήνες Εργαστηριακές Συσκευές Αυτόματος αναδευτήρας vortex Οριζόντιοι ανακινητήρες Φυγόκεντρος Hermle Διανεμητές υγρών μέγιστου όγκου 10 ml

163 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Ρεύμα Ν 2 Ζυγοί Ξηραντήρας με Ρ 2 Ο 5 υπό κενό Μεταλλόλουτρο Κλίβανος Φούρνος μικροκυμάτων Συσκευή κενού για τα φυσίγγια SPE Αναλυτικός εξοπλισμός Αεριοχρωματογράφος με αναλυτή φασματόμετρο μαζών χαμηλής διαχωριστικής ικανότητας GC HP6890/5973, με αυτόματο δειγματολήπτη ΗP7683 και λογισμικό MSD Chemstation G2613A έκδοση D Τριχοειδής στήλη HP Ultra1, 17 m x 0,20 mm i.d. x 0,11 μm (GC/MSD, ULTRA1-11). Αεριοχρωματογράφος με αναλυτή φασματόμετρο μαζών υψηλής διαχωριστικής ικανότητας HP 6890/AUTOSPEC - ULTIMAE MICROMASS με αυτόματο δειγματολήπτη HP και λογισμικό MassLynx V4.SP1. Τριχοειδής στήλη HP Ultra1, 12 m x 0,20 mm i.d. x 0,33 μm (ULTRA1-33). Υγροχρωματογράφος με αναλυτή φασματόμετρο μαζών παγίδας ιόντων 1100 Series LC/MSD, δειγματολήπτη HP και λογισμικό Agilent Chemstation for LC συζευγμένο με λογισμικό MSD Trap Control. Στήλη υγροχρωματογραφίας Zorbax Rx-C8, 2,1 mm x 150 mm i.d., μέγεθος πόρων 5 μm (Agilent Technologies: ) (ZORBAX1-1). 6.3 Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης Ι) Για τα πειραματικά πρωτόκολλα που πραγματοποιήθηκαν στις σειρές πραγματοποιήθηκαν οι εξής αναλύσεις (Σχήμα 6.1): Ανάλυση του δείγματος ελέγχου CALB με full scan GC/MS μέθοδο για τα διεγερτικά-ναρκωτικά και του CALA με SIM μέθοδο για τα αναβολικά, κατόπιν παραγωγοποίησης. Aνάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALA και CALB με LC/MS-Ion trap για τα κορτικοστεροειδή και τα διουρητικά αντίστοιχα με μέθοδο παρακολούθησης επιλεγμένων ιόντων

164 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Προσθήκη CALA, CALB σε Ούρα εκχύλιση SPE LLE SPE+LLE εξάτμιση ανάλυση LC/MS GC/MS CALA CALB CALA CALB SIM, LC/MS κορτικοστεροειδή SIM, LC/MS διουρητικά SIM, GC/MS αναβολικά Full scan, GC/MS Διεγερτικά-ναρκωτικά Σχήμα 6.1: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALA, CALB για ανάλυση στις σειρές Τα διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων αναλυτών παρουσιάζονται στους Πίνακες 6.3 και 6.4 Πίνακας 6.3: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων ουσιών με LC/MS Ουσία Ιόν 1 Ιόν 2 Ιόν 3 Methyltestosterone Triamcinolone acetonide Prednisone Furosemide Ethacrynic acid

165 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.4: Διαγνωστικά ιόντα των εξεταζόμενων ουσιών με GC/MS Ουσία Ιόν 1 Ιόν 2 Ιόν 3 Codeine 371 Methyltestosterone Amphetamine N-TMS Pholedrine bis-tms Pholedrine O-TMS Ephedrine bis-tms Ephedrine O-TMS Heptaminol bis-tms Benzoyl ecgonine O-TMS Methylphenidate N-TMS Morphine bis-tms Codeine Methyltestosterone Formestane β-OH methandienone Boldenone met Fluoxymesterone tetrol mt2 tetra-tms Furazabol pc Oxandrolone bis-tms OH-stanozolol tris-tms OH-stanozolol tris-tms Fenoterol penta-tms Fenoterol-enz analyte Fenoterol tetra-tms Aminogluthethimide tetra-tms Amiloride tetra-tms Atenolol bis-tms Atenolol tris-tms Androsterone bis-tms Androsterone O-TMS 347 ΙΙ) Για τα πειραματικά πρωτόκολλα που εξετάστηκαν στη σειρά πραγματοποιήθηκαν οι εξής αναλύσεις (Σχήμα 6.2): Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, BLANK με full scan GC/MS μέθοδο για τα διεγερτικά-ναρκωτικά (stnadi), κατόπιν παραγωγοποίησης Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALMIX, 471, BLANK με SIM GC/MS μέθοδο για τα αναβολικά στεροειδή (ster2), κατόπιν παραγωγοποίησης Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALMIX, 847, BLANK με SIR GC/HRMS μέθοδο για τα αναβολικά στεροειδή (aasteroids), κατόπιν παραγωγοποίησης

166 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Ανάλυση των δειγμάτων ελέγχου CALMIX, 471, BLANK με LC/MS-Ion trap με μέθοδο (cortico) παρακολούθησης επιλεγμένων ιόντων για τα κορτικοστεροειδή και δυο διουρητικές ουσίες (ethacrynic acid, furosemide) με απλή ανασύσταση. Δείγματα ελέγχου (CALWADA, CMIX, 471, 847, BLANK) Εκχύλιση με προτεινόμενα πρωτόκολλα εξάτμιση ανάλυση ΕΜΠ Full scan, GC/MS Διεγερτικά-ναρκωτικά SIM, GC/MS αναβολικά SIM, HRMS αναβολικά SIM, LC/MS κορτικοστεροειδή, διουρητικά CALWADA blank CMIX, 471 blank CMIX, 847 blank CMIX blank ΕΜΠ: Ενιαία μέθοδος παραγωγοποίησης Σχήμα 6.2: Προετοιμασία των δειγμάτων ελέγχου CALWADA, CMIX, 471, 847, BLANK για ανάλυση στη σειρά Όλες οι χρωματογραφικές μέθοδοι ανάλυσης συμπεριλαμβανομένων των διαγνωστικών ιόντων των εξεταζομένων αναλυτών για το σύνολο των απαγορευμένων ουσιών έχουν αναφερθεί Πειραματικός σχεδιασμός Η πειραματική διαδικασία η οποία παρουσιάζεται συνοπτικά στο Σχήμα 6.3 διαιρείται σε τέσσερις σειρές πειραμάτων ως εξής: 1. Προκαταρκτικά πειράματα-εκχύλιση σε μη υδρολυμένα ούρα, 2. Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE, 3. Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με LLE και συνδυασμό SPE και LLE, 4. Εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων στο σύνολο των υπό μελέτη ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών και συγκέντρωση ίση με το MRPL

167 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Σχήμα 6.3: Διάγραμμα ροής του πειραματικού πρωτοκόλλου για την ανάπτυξη ενιαίας πορείας εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών

168 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Επιπλέον η 1 η σειρά πειραμάτων διαιρείται στα εξής στάδια: Ι) Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών με LLE ή SPE Στη φάση αυτή επιλέχθηκαν τα σημαντικότερα πρωτόκολλα από τη βιβλιογραφία, τα οποία έχουν χρησιμοποιηθεί για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών, όπως αυτά προέκυψαν και παρουσιάστηκαν στο Κεφάλαιο 3 μετά από εκτενή βιβλογραφική αναζήτηση. Αρχικά, στο στάδιο αυτό, εφαρμόστηκαν μέθοδοι SPE και LLE χωρίς το στάδιο της υδρόλυσης. Η εφαρμογή των διαφόρων πειραματικών πρωτοκόλλων οδήγησε σε μη ικανοποιητικά αποτελέσματα (αδυναμία προσδιορισμού) για ένα τμήμα των μελετούμενων ουσιών λόγω έντονης παρουσίας υποβάθρου. ΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με το προσροφητικό υλικό OASIS HLB Στο στάδιο αυτό σχεδιάστηκε ο συνδυασμός της SPE με τη LLE. Η εφαρμογή αυτή έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά για την εκχύλιση αναβολικών στεροειδών (βλ εδάφιο 3.5.2) με το προσροφητικό υλικό OASIS HLB και το διαλύτη TBME με ικανοποιητικά αποτελέσματα. Εφαρμογή του συγκεκριμένου πειραματικού πρωτοκόλλου (με κατάλληλες τροποποιήσεις) οδήγησε σε βελτίωση των λαμβανομένων αποτελεσμάτων, πιθανόν λόγω μείωσης των παρεμποδίσεων από τη μήτρα του δείγματος (matrix). ΙΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με διάφορα προσροφητικά υλικά Λόγω βελτίωσης των αποτελεσμάτων στο στάδιο ΙΙ σχεδιάστηκε η επανεξέταση πρωτοκόλλων SPE σε συνδυασμό της με τη LLE. Τα προσροφητικά υλικά που εξετάστηκαν έχουν ήδη αναφερθεί στο στάδιο I. IV) Πρόσθετα πειράματα για την προβληματική ανίχνευση των ουσιών της φάσης Ι Στο στάδιο αυτό σχεδιάστηκε και πραγματοποιήθηκε έλεγχος των παραμέτρων που προκαλούν ατελή παραγωγοποίηση των ουσιών στη φάση Ι. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκε: α) έκλουση των ουσιών με διαφορετικούς διαλύτες στο στάδιο της SPE και β) εφαρμογή δραστικότερων συνθηκών παραγωγοποίησης

169 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Στην 2 η σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE και προσδιορίστηκε η σειρά της υδρόλυσης. Στην 3 η σειρά πειραμάτων υδρολυμένα ούρα εκχυλίστηκαν με 3 πορείες LLE, καθώς και με διαφορετικές πορείες SPE σε συνδυασμό με LLE σύμφωνα με τα πειραματικά πρωτόκολλα που εμφάνισαν τα καλύτερα αποτελέσματα στην 1 η σειρά πειραμάτων. Τέλος στην 4 η σειρά εφαρμόστηκαν οι βέλτιστες πορείες εκχύλισης της σειράς 3 στο σύνολο των ουσιών και σε συγκέντρωση ίση με το MRPL. Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφερθεί ότι ο πειραματικός σχεδιασμός που πραγματοποιήθηκε ολοκληρώνεται με τις 4 σειρές πειραμάτων που παρουσιάστηκαν, με τα αποτελέσματα της προηγούμενης σειράς να επηρεάζουν τον πειραματικό σχεδιασμό της επόμενης. Tο κριτήριο επιλογής των διαφόρων πρωτοκόλλων που εξετάστηκαν είναι ο μέσος όρος των ανακτήσεων των μελετούμενων ουσιών, η διασπορά των ανακτήσεων για τις μελετούμενες ουσίες ανά πρωτόκολλο, όσο και η εικόνα του λαμβανόμενου χρωματογραφήματος, ώστε να είναι όσο το δυνατό περισσότερο απαλλαγμένο από το matrix

170 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών 6.5 Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης Προετοιμασία πειραμάτων Ι. Προσροφητικά υλικά Τα προσροφητικά υλικά για το σύνολο των πειραμάτων παρουσιάζονται στους Πίνακες 6.5 (silica) και 6.6 (πολυμερή). Πίνακας 6.5: Εξεταζόμενα προσροφητικά υλικά στηριζόμενα σε silica Α/Α Προσροφητικό Σύσταση Ιδιότητα 1 Isolute C18 NE Silica-C18 + -OH -Si-C 18 H 37 υδρόφοβο με - SiΟΗ 2 Isolute C18 EC Silica-C18 -Si-C 18 H 37 υδρόφοβο 3 Isolute C8 EC Silica-C8 -Si-C 8 H 17 υδρόφοβο 4 Isolute C8 NE Silica-C8 + -OH -Si-C 8 H 17 υδρόφοβο με - SiOH 5 Isolute C2 EC Silica-C2 -Si-CH 2 -CH 3 υδρόφοβο 6 Isolute HCX 80 % C % C3- SO 3 H -SiCH 2 CH 2 CH 2 SO 3 - μικτού τύπου 7 Bond Elut Certify 80 % C % benzeneso 3 H Si (H 2 C) 3 SO 3 - μικτού τύπου 8 Isolute HCX-3 80 % C % C3-SO 3 H -SiCH 2 CH 2 CH 2 SO 3 - μικτού τύπου 9 Bond Elut Certify II 80 % C % C 3 N(CH 3 ) 3 + -Si(CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3 μικτού τύπου 10 Multimode C18,SAX,SCX μικτού τύπου

171 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.6: Εξεταζόμενα προσροφητικά υλικά στηριζόμενα σε πολυμερές Α/Α Προσροφητικό Σύσταση Ιδιότητα 1 Oasis HLB PVP-DVB * CH CH 2 CH CH 2 * υδρόφιλο - υδρόφοβο N O m n 2 Isolute ENV+ PS-DVB-OH hypercrosslinked CH CH 2 * CH CH 2 m CH CH 2 * n υδρόφοβο με -ΟΗ 3 Isolute 101 PS-DVB hypercrosslinked OH CH CH 2 * CH CH 2 m CH CH 2 * n υδρόφοβο 4 Bond Elut LMS PS-DVB hypercrosslinked CH CH 2 * CH CH 2 CH CH 2 * m n υδρόφοβο 5 LiChrolut EN PS-DVB hypercrosslinked CH CH 2 * CH CH 2 m CH CH 2 * n υδρόφοβο CH CH 2 6 Abs Elut Nexus PMA-DVB CH 3 υδρόφιλο - υδρόφοβο * C CH 2 CH CH 2 * m n COOCH 3 7 Focus PS-DVB τροποποιημένο CH CH 2 * CH CH 2 m CH CH 2 * n υδρόφιλο - υδρόφοβο R CH CH 2 8 Oasis MCX PVP-DVB-SO 3 H μικτού τύπου * CH CH 2 m N O CH CH 2 * n HO 3 S 9 Oasis MAX PVP-DVB-NR 3 + * CH CH 2 m N O CH CH 2 CH CH 2 * n μικτού τύπου +R 3 N CH CH

172 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών ΙΙ. Βιολογικά δείγματα Ως βιολογικό υλικό για την πραγματοποίηση των πειραμάτων της φάσης III χρησιμοποιήθηκαν ούρα ανδρών και γυναικών τα οποία παρασκευάστηκαν με ανάμειξη ούρων αρνητικών για απαγορευμένες ουσίες, όπως προέκυψε από τις διαδικασίες σάρωσης. Κατόπιν μεταγγίστηκαν σε σωλήνες RIA των 2,5 ml οι οποίοι πωματίστηκαν και αποθηκεύθηκαν στην κατάψυξη. Το μίγμα αυτό στο εξής θα αναφέρεται ως λευκό (blank). ΙΙΙ. Εσωτερικά πρότυπα Ως εσωτερικά πρότυπα χρησιμοποιήθηκαν η codeine και η methyltestosterone, ουσίες που προστίθενται στην αρχή της ανάλυσης και στην οργανική στιβάδα μετά την εκχύλιση, αντίστοιχα. Η codeine που προστίθεται από την αρχή στα ούρα έχει σκοπό την κατάδειξη προβλημάτων σε όλη την παρασκευαστική διαδικασία (πιθανή εξάτμιση του διαλύτη εκχύλισης ή και απωλειών κατά την εκχύλιση). Η methyltestosterone προστίθεται πριν το στάδιο της τελικής εξάτμισης ώστε να μην παρουσιάζει απώλειες λόγω της εκχύλισης και το σήμα της να χρησιμοποιηθεί στον υπολογισμό της ανάκτησης των υπό εξέταση ουσιών. ΙV. Υδρόλυση των δειγμάτων Για την υδρόλυση επιλέγεται η χρήση ενζυμικού διαλύματος β-γλυκουρονιδάσης / αρυλoσουλφατάσης από Helix Pomatia 201, σε ph 4,5 5,5, στους (50 ± 2) C για 2,5 h ή στους (37 ± 2) C για τη διάρκεια της νύχτας με το οποίο επιτυγχάνεται αποσύζευξη των εστέρων του θειϊκού και του γλυκουρονικού οξέος. Παρασκευαστικά η υδρόλυση πραγματοποιείται ως εξής: σε 5,0 ml ούρων προστίθενται 1,0 ml ρυθμιστικού διαλύματος οξικών, 1,0 Μ, ph 5,2 και 50 μl ενζυμικού διαλύματος από Helix Pomatia. Οι σωλήνες πωματίζονται και θερμαίνονται στους (50 ± 2) C για 2,5 h ή στους (37 ± 2) C για τη διάρκεια της νύχτας. V. Προετοιμασία για χρωματογραφική ανάλυση Τα δείγματα που αναλύονται με GC/MS ή GC/HRMS παραγωγοποιούνται πριν τη χρωματογραφική σύμφωνα με τη βελτιστοποιημένη πορεία που αναφέρεται στο εδάφιο Για τα δείγματα που αναλύονται με LC/MS πραγματοποιήθηκε ανασύσταση σε μίγμα CH 3 CN / δισαπεσταγμένο ύδωρ (50/50) με περιεκτικότητα σε CH 3 COOH 0,1 % v/v

173 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών VI. Έλεγχος επαρκούς παραγωγοποίησης Βλ εδάφιο 5.5.1, III. VΙΙ. Υπολογισμός ανακτήσεων Η εκατοστιαία ανάκτηση των υπό εξέταση ουσιών υπολογίζεται με βάση τον τύπο: όπου: (Area sub)extr: το εμβαδόν της κορυφής του αναλύτη, σε δείγματα blank, στα οποία τα δείγματα ελέγχου προστίθενται στην αρχή της παρασκευαστικής διαδικασίας, (Area istd) nonextr: το εμβαδόν της κορυφής του εσωτερικού προτύπου, που προστίθεται σε όλα τα δείγματα πριν το στάδιο της τελικής εξάτμισης, (Area sub) nonextr: το εμβαδόν της κορυφής του αναλύτη, σε δείγματα blank, στα οποία τα δείγματα ελέγχου προστίθενται πριν το στάδιο της τελικής εξάτμισης. Όλα τα εξεταζόμενα πρωτόκολλα παρατίθενται στο Παραρτήμα 3, ενώ τμήμα των αποτελεσμάτων ανάκτησης των επιμέρους πρωτοκόλλων παρατίθενται στο Παράρτημα Προκαταρκτικά πειράματα-εκχύλιση σε μη υδρολυμένα ούρα Στο εδάφιο αυτό περιγράφονται τα προκαταρκτικά πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε ούρα αθλητών χωρίς να περιλαμβάνεται το στάδιο της υδρόλυσης. Η σειρά αυτή των προκαταρκτικών δοκιμών διαιρείται σε 4 στάδια ως εξής: Ι) Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών με LLE ή SPE Στο στάδιο αυτό πραγματοποιήθηκε εκχύλιση των απαγορευμένων ουσιών με την εφαρμογή πρωτοκόλλων βασιζόμενων, σε εκχύλιση στερεάς φάσης ή υγρό-υγρό εκχύλιση. Για την εκχύλιση στερεάς φάσης χρησιμοποιήθηκαν προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε silica ή πολυμερή, με διαφορετικές ιδιότητες (πολικά, μη πολικά, μικτού τύπου) ή του ιδίου προσροφητικού υλικού από διαφορετική εταιρεία, όπως αυτά προέκυψαν μετά από εκτενή βιβλιογραφική αναζήτηση (βλ. Κεφ. 3)

174 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 1-LLE με οξικό αιθυλεστέρα Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 100 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 9,5 με μίγμα στερεών NaHCO 3 / Na 2 CO 3 10/1 Εκχύλιση με 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα, 2 g άνυδρου Na 2 SO 4 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: ικανοποιητικά καθαρό υπόβαθρο, με αδυναμία ανίχνευσης για τα Aminoglutethimide και 16-ΟΗ-Stanozolol (ακόμα και στα δείγματα που προστέθηκαν οι ουσίες μετά την εκχύλιση, οπότε έχουμε έντονη παρεμπόδιση από τη μήτρα) και μεγαλύτερη από 100 % ανάκτηση για τα Oxandrolone και Fluoxymesterone tetrol met2 Διεγερτικά: έντονη παρεμπόδιση μήτρας στα 2 πρώτα λεπτά και μεγαλύτερη από 100 % ανάκτηση για την Ephedrine, την Amphetamine και το Methylphenidate Πρωτόκολλο 2 - Isolute C18 - EC Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min * Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 και 5,0 ml εξανίου Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση *Ο χρόνος ξήρανσης που εφαρμόστηκε θεωρείται ικανοποιητικός, λόγω ταχείας ξήρανσης με την εφαρμογή κενού. Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: ικανοποιητικά καθαρό υπόβαθρο, με αδυναμία ανίχνευσης των Aminoglutethimide, 16-OH-stanozolol, Oxandrolone (ακόμα και στα δείγματα που προστέθηκαν οι ουσίες μετά την εκχύλιση, οπότε έχουμε έντονη παρεμπόδιση από τη μήτρα) Διεγερτικά: γενικά ικανοποιητικά αποτελέσματα, με ανάκτηση μεγαλύτερη από 100 % για τα Benzoyl ecgonine και Prednisone

175 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 3 - Isolute C18 ΝΕ Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,5 6,8 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 Μ, ph 6 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 Μ, ph 6 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 3,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 Μ, ph 6 Έκλουση 4,0 ml μεθανόλης/ch 3 COOH 98/2 και 4,0 ml μεθανόλης/τριαιθυλαμίνης 98/2 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 5,6 ml (GC/MS) και 2,4 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης πολλών από τις προσδιοριζόμενες ουσίες ή ανακτήσεις >100 λόγω παρεμπόδισης από τη μήτρα Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο Πρωτόκολλο 4- Isolute C18 EC Εφαρμόστηκε η ίδια πορεία με το πρωτόκολλο 3. Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης των formestane, aminoglutethimide, 16-OH-stanozolol, ενώ για τις ουσίες boldenone metabolite, oxandrolone η ανάκτηση υπολογίστηκε >100 Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο Πρωτόκολλο 5- Bond Elut C18 EC Εφαρμόστηκε η ίδια πορεία με το πρωτόκολλο 3. Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης των furazabol, formestane, 16-OH-stanozolol, ενώ για τις ουσίες atenolol, 3-OH stanozolol η ανάκτηση υπολογίστηκε >100 Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, ανάκτηση >100 για τις ουσίες methylphenidate και prednisone

176 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 6- Bond Elut Certify Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 5,7 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 4,0 ml μεθανόλης, 4,0 ml Η 2 Ο και 4,0 ml ρυθμ. διαλλύματος φωσφορικών 0,1 Μ, ph 5,2 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,1 Μ, ph 5,2 και 2,0 ml CH 3 COOH 1 M Έκλουση 4,0 ml CΗCl 3 /ακετόνης 3/1 Έκπλυση φυσιγγίου Α) 4,0 ml μεθανόλης ή Β) 4,0 ml Η 2 Ο Έκλουση 4,0 ml μεθανόλης/ch 2 Cl 2 7/3, 3 % σε τριαιθυλαμίνη Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 5,6 ml (GC/MS) και 2,4 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: A πορεία: Αναβολικά: αδυναμία ανίχνευσης των Aminoglutethimide, Amiloride, 3-OHstanozolol και 16-OH-stanozolol. Ικανοποιητική ανίχνευση των υπόλοιπων αναλυτών Διεγερτικά: Μεγαλύτερη από 100 % υπολογίζεται η ανάκτηση των Benzoyl ecgonine και Methylphenidate. Ικανοποιητική ανίχνευση των υπόλοιπων αναλυτών Ανάλογα αποτελέσματα από την πορεία Β με μικρότερες ανακτήσεις των πιο πολικών ουσιών Πρωτόκολλο 7- Isolute HCX Εφαρμόστηκε η ίδια πορεία με το πρωτόκολλο 6. Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν : Αναβολικά: αδυναμία ανίχνευσης των formestane, Aminoglutethimide, Amiloride και 16-OH-stanozolol. Μεγαλύτερη του 100 % προκύπτει η ανάκτηση των Boldenone met και 6-β-OH-methandienone. Διεγερτικά: Ικανοποιητική ανίχνευση των περισσότερων αναλυτών με εξαίρεση την πολύ χαμηλή ανάκτηση του Heptaminol Ανάλογα και τα αποτελέσματα της πορείας Β

177 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 8- Isolute 101 Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,5 6,8 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,025 Μ, ph 6 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,025 Μ, ph 6 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml Η 2 Ο Έκλουση 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/ισοπροπανόλης 3/1 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, με μεγαλύτερη από 100 % προκύπτει η ανάκτηση των Furazabol, Amiloride, 3-OH-stanozolol, Oxandrolone και Fluoxymesterone tetrol met2 Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, με μεγαλύτερη από 100 % ανάκτηση υπολογίζεται για τα Benzoyl ecgonine, Pholedrine, Amphetamine και Methylphenidate Πρωτόκολλο 9 Bond Elut LMS Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,0 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 Μ, ph 6 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 3,0 ml μεθανόλης και 3,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 4,0 ml μεθανόλης Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 2,8 ml (GC/MS) και 1,2 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, με αδυναμία ανίχνευσης των Formestane, Aminoglutethimide, Atenolol, 3-OH-stanozolol, Oxandrolone και 16-OH-stanozolol Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, με ανάκτηση >100 % υπολογίζεται η ανάκτηση για τις περισσότερες από τις προσδιοριζόμενες ουσίες

178 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 10 Isolute 101 Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 5,5 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,1 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml Η 2 Ο Έκλουση 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/ισοπροπανόλης 3/1 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 5,6 ml (GC/MS) και 2,4 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των λαμβανομένων χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: αδυναμία ανίχνευσης των Formestane, Aminoglutethimide, 3-OHstanozolol, 16-OH-stanozolol, Oxandrolone και Fluoxymesterone tetrol met2. Επιπλέον οι ανακτήσεις των υπόλοιπων αναλυτών υπολογίζονται πάνω από 100 %, λαμβάνονται δηλαδή μη ικανοποιητικά αποτελέσματα Διεγερτικά: ανιχνεύονται ικανοποιητικά όλοι οι αναλύτες Πρωτόκολλο 11 Isolute ENV+ Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,5 6,8 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,025 Μ, ph 6 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,025 Μ, ph 6 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml Η 2 Ο Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης/τριαιθυλαμίνης 98/2 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν : Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, δεν υπολογίζονται οι ανακτήσεις. Ισχυρή μετατόπιση των χρόνων ανάσχεσης Διεγερτικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο με μεγαλύτερη από 100 % υπολογίζεται η ανάκτηση της pholedrine

179 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 12 Oasis HLB Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,0 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 Μ, ph 6 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 3,0 ml μεθανόλης και 3,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 4,0 ml μεθανόλης Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 2,8 ml (GC/MS) και 1,2 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: πολύ "βρώμικο" υπόβαθρο, με αδυναμία ανίχνευσης των Fenoterol Aminoglutethimide, 3-OH-stanozolol, Oxandrolone και 16-OH-stanozolol. Μεγαλύτερη από 100 % προκύπτει η ανάκτηση του Fluoxymesterone tetrol met2. Ισχυρή μετατόπιση των χρόνων ανάσχεσης Διεγερτικά: "βρώμικο" υπόβαθρο Πρωτόκολλο 13 Oasis MCX Εφαρμόστηκε η ίδια πορεία με το πρωτόκολλο 6. Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν γενικά μη ικανοποιητικά αποτελέσματα για το σύνολο των ουσιών και δεν υπολογίζονται οι ανακτήσεις. Οι συνθήκες για την εφαρμογή των πρωτοκόλλων περιγράφονται στο Παράρτημα 3. Ακολουθήθηκε πορεία πολλαπλών σταδίων με τη χρήση διαφορετικών φυσιγγίων σε σειρά. Από τη μελέτη των χρωματογραφημάτων δεν προέκυψαν ικανοποιητικά αποτελέσματα, τόσο λόγω "βρώμικου" υποβάθρου, όσο και λόγω χαμηλών ανακτήσεων των προσδιοριζομένων ουσιών. ΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με το προσροφητικό υλικό OASIS HLB Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται προσπάθεια βελτίωσης των αποτελεσμάτων που προέκυψαν από τα πειραματικά πρωτόκολλα του σταδίου Ι. Ο συνδυασμός SPE και LLE που έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των αναβολικών στεροειδών με το προσροφητικό υλικό OASIS HLB ελέγχεται στο στάδιο αυτό

180 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 17 Oasis HLB + LLE Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml H 2 O Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml H 2 O Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Παραλαβή με 1,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών, ph 7,0 Ρύθμιση ph 9,5 με ρυθμ. διάλυμα ανθρακικών Εκχύλιση με 5,0 ml ΜΤΒΕ Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: εξαιρετικά καθαρό υπόβαθρο, με πολύ χαμηλή ανάκτηση για τα Amiloride και Atenolol. Ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: εξαιρετικά καθαρό υπόβαθρο, με πολύ χαμηλή ανάκτηση για τα Benzoyl ecgonine και Heptaminol. Ανίχνευση όλων των αναλυτών Ακολούθησε βελτιστοποίηση του σταδίου έκπλυσης, όπως περιγράφεται στα πρωτόκολλα 18_1 (α c), καθώς και επιλογή διαλύτη στο στάδιο της LLE σύμφωνα με το πρωτόκολλο 18_2 (a-d). Στα πρωτόκολλα αυτά προστέθηκε Na 2 SO 4 ως παράγοντας εξαλάτωσης στο στάδιο της LLE. Πρωτόκολλο 18_1(a c) Oasis HLB + LLE Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml H 2 O Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου a)4,0 ml H 2 O b) 4,0 ml H 2 O/ μεθανόλης : 95/5 c)4,0 ml H 2 O/ μεθανόλης : 70/30 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Παραλαβή με 1,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών, ph 7,0 Ρύθμιση ph 9,5 με ρυθμ. διάλυμα ανθρακικών Εκχύλιση με 5,0 ml ΜΤΒΕ Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση

181 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Ως καταλληλότερος διαλύτης έκλουσης επιλέχθηκε το μίγμα Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 μετά την εφαρμογή του πρωτοκόλλου Πρωτόκολλο 18_2(a-d) Oasis HLB + LLE Προσθήκη διαλυμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml H 2 O Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml H 2 O/ μεθανόλης : 95/5 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Παραλαβή με 1,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών, ph 7,0 Ρύθμιση ph 9,5 με ρυθμ. διάλυμα ανθρακικών Εκχύλιση με 5,0 ml ΜΤΒΕ (a), DE/2-Propanol :5/1(b), EA (c), DE/EA/CH 2 Cl 2 :4/3/3,5 (d) Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Όπου DE diethylether (διαιθυλαιθέρας), EA ethylacetate (οξικός αιθυλεστέρας). Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν: Αναβολικά: o Πορεία a: πολύ καθαρό υπόβαθρο με ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών o Πορεία b: καθαρό υπόβαθρο, με αδυναμία ανίχνευσης των Formestane, Aminoglutethimide, Amiloride, 3-OH-stanozolol και 16-OH-stanozolol. Πολύ μεγαλύτερη από 100 % υπολογίζεται η ανάκτηση του 6β-ΟΗ-methandienone o Πορεία c: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα για το σύνολο των ουσιών. Δεν υπολογίζονται οι ανακτήσεις o Πορεία d: πολύ καθαρό υπόβαθρο, με ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: o Πορεία a: πολύ καθαρό υπόβαθρο με ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών o Πορεία b: καθαρό υπόβαθρο, με αρκετά χαμηλές ανακτήσεις για τα Amphetamine και Heptaminol o Πορεία c: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα για το σύνολο των ουσιών. Δεν υπολογίζονται οι ανακτήσεις o Πορεία d: πολύ καθαρό υπόβαθρο, με ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών

182 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Στο επόμενο στάδιο πραγματοποιήθηκε επανάληψη πρωτοκόλλων από το εδάφιο Ι και δοκιμή κάποιων νέων σε συνδυασμό με την LLE, αφού όπως προέκυψε στο στάδιο αυτό οδηγεί σε σημαντική μείωση του matrix και βελτίωση των αποτελεσμάτων. ΙΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με διάφορα προσροφητικά υλικά Στο στάδιο αυτό δοκιμάζονται διάφορα προσροφητικά υλικά συμπεριλαμβανομένων αυτών που δοκιμάστηκαν στο στάδιο Ι, σε συνδυασμό με LLE και με διαλύτη εκχύλισης τον DE/EA/CH2Cl2 :4/3/3.5 που προέκυψε από το στάδιο II. Πρωτόκολλο 19 Isolute C18 - EC + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 και 2,0 ml εξανίου Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Παραλαβή με 2,5 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών, ph 7,0 Ρύθμιση ph 9,5 με μίγμα στερεών NaHCO 3 / Na 2 CO 3 10/1 Εκχύλιση με 5,0 ml διαιθυλαιθέρα/οξικού αιθυλεστέρα/ch 2 Cl 2 4/3/3,5, 2 g άνυδρου Na 2 SO 4 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει : Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 20 -Isolute C18 NE + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,8 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 Μ, ph 6,0 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 Μ, ph 6,0 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 3,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 Μ, ph 6,0 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης/τριαιθυλαμίνης 95/5 Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει :

183 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο αλλά με αδυναμία ανίχνευσης των 6β-ΟΗmethandienone, Formestane, Aminoglutethimide, 3-OH-stanozolol και 16-OHstanozolol. Πολύ χαμηλή ανάκτηση για τα Fenoterol και Testosterone Διεγερτικά: καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 21 - Isolute LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,025 Μ, ph 6,0 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,025 Μ, ph 6,0 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/ισοπροπανόλης 3/1 Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ανίχνευση όλων των αναλυτών με χαμηλή ανάκτηση για την amphetamine Πρωτόκολλο 22 - Isolute ENV+ + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,025 Μ, ph 6,0 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,025 Μ, ph 6,0 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/ισοπροπανόλης 3/1- τριααιθυλαμίνης :95-5 Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών, εκτός των Fenoterol και Amiloride Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών

184 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 23 - Bond Elut LMS + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,1 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 Μ, ph 5,5 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 4,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 24 Oasis HLB + LLE Επαναλαμβάνεται το πρωτόκολλο 23. Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 25 Isolute HCX + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,0 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 2,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 και 2,0 ml CH 3 COOH 1 M Έκλουση 4,0 ml CHCl 3 /ακετόνης 3/1 και 4,0 ml μεθανόλης/ CH 2 Cl 2 7/3,10 % σε τριαιθυλαμίνη Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο, με πολύ μεγαλύτερη του 100 % ανάκτηση για το 6β-ΟΗ-methandienone (δε λαμβάνεται υπόψη στα αποτελέσματα) και ικανοποιητικά αποτελέσματα για τις υπόλοιπες ουσίες Διεγερτικά: καθαρό υπόβαθρο, με χαμηλή ανάκτηση να υπολογίζεται για το Heptaminol και ικανοποιητική ανίχνευση των υπόλοιπων αναλυτών

185 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 26- Isolute C8 - EC + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 4,8-5,5 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 2,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 και 1,0 ml εξανίου Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν γενικά ικανοποιητικά αποτελέσματα για το σύνολο των ουσιών. Πρωτόκολλο 27- Nexus + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,1 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,05 M ph 6,1 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 2,0 ml μεθανόλης, 2,0 ml Η 2 Ο και 3,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 M, ph 6,1 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 1,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 M, ph 6,1 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτει: Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης του Aminoglutethimide και ικανοποιητικά αποτελέσματα για τους υπόλοιπους αναλύτες Διεγερτικά: ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 28: Isolute C8-NE + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,8 με ρυθμ. διάλυμα οξικών 0,05 M ph 6,0 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 M ph 6,0 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 2,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 0,05 M, ph 6,0 και 1,0 ml εξανίου Έκλουση 4,0 ml μεθανόλης/ch 3 COOH 98/2 και 4,0 ml μεθανόλης/τριαιθυλαμίνης 95/5 Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης του Fenoterol και ικανοποιητικά αποτελέσματα για τους υπόλοιπους αναλύτες

186 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Διεγερτικά: ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Πρωτόκολλο 29 Focus + LLE Ίδια πορεία με το πρωτόκολλο 27 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης του Amiloride και ικανοποιητικά αποτελέσματα για τους υπόλοιπους αναλύτες Διεγερτικά: ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών, με χαμηλές ανακτήσεις για τα Amphetamine και Heptaminol Πρωτόκολλο 30 Bond Elut Certify + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,0 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 2,0 ml ρυθμ. διαλύματος φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 και 2,0 ml CH 3 COOH 1 M Έκλουση 4,0 ml CHCl 3 /ακετόνης 3/1 και 4,0 ml μεθανόλης/ CH 2 Cl 2 7/3,10 % σε τριαιθυλαμίνη Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης των Fenoterol και Amiloride. Ικανοποιητικά είναι τα αποτελέσματα για τους υπόλοιπους αναλύτες Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο, γενικά ικανοποιητικά αποτελέσματα Πρωτόκολλο 31 Oasis MCX + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ρύθμιση ph 6,0 με ρυθμ. διάλυμα φωσφορικών 0,05 Μ, ph 6,1 Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 2,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 και 4,0 ml HCl 0,1 M Έκλουση 4,0 ml CHCl 3 /ακετόνης 3/1 και 4,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/τριαιθυλαμίνης 9/1 Εξάτμιση όλων Συνέχεια με LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Αναβολικά: καθαρό υπόβαθρο με αδυναμία ανίχνευσης των Fenoterol, Amiloride, Atenolol, 3-OH-Stanozolol και 16-ΟΗ-stanozolol Διεγερτικά: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα με αδυναμία ανίχνευσης των Benzoyl ecgonine, Heptaminol και Pholedrine

187 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών IV) Πρόσθετα πειράματα για την προβληματική ανίχνευση των ουσιών της φάσης Ι (βλ εδάφιο Ι) H εκχύλιση με SPE (εδάφιο Ι), οδηγεί σε ατελή παραγωγοποίηση όπως αυτό προσδιορίστηκε από το λόγο R A. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ανεξάρτητο από το χρησιμοποιούμενο προσροφητικό υλικό καθώς και από την απόδοση της εκχύλισης των επιμέρους αναλυτών. Στα πλαίσια βελτίωσης αυτών των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε: (α) έκλουση των μελετούμενων ουσιών με διαφορετικούς διαλύτες με στόχο τη μείωση του υποβάθρου καθώς και (β) προσπάθεια παραγωγοποίησης με πιο δραστικές συνθήκες. Αρχικά, σύμφωνα με το πρωτόκολλο 32, 4 διαλύτες διαφορετικής πολικότητας χρησιμοποιούνται για την έκλουση των ουσιών του δείγματος ελέγχου CALA με το προσροφητικό υλικό C18, οι οποίοι στη συνέχεια αναλύονται με GC/MS κατόπιν παραγωγοποίησης με τις συνθήκες παραγωγοποίησης των αναβολικών στεροειδών σε διαδικασίες σάρωσης (100 μl MSTFA/NH 4 I/DTE 1000/2/4 (v/w/w) και επώαση στους 80 C για 30 min). Πρωτόκολλο 32 (a-d) Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 5,0 ml ρυθμ. διαλύματος οξικών 1,0 Μ, ph 5,2 και 5,0 ml εξανίου Έκλουση Α) 5,0 ml μεθανόλης, Β) 5,0 ml διαιθυλαιθέρα, Γ) 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/εξανίου 4/6 ή Δ) 5,0 ml οξικού αιθυλεστέρα/διαιθυλαιθέρα 1/1 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα αναβολικά : Α: ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών, αλλά με παρεμπόδιση από τη μήτρα Β: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα με αδυναμία ανίχνευσης αρκετών ουσιών Γ: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα με αδυναμία ανίχνευσης αρκετών ουσιών. Πολύ μεγαλύτερη του 1000 % υπολογίζεται η ανάκτηση των Formestane και 6β-OHmethandienone (οι τιμές τους δε λαμβάνονται υπόψη στα αποτελέσματα) Δ: μη ικανοποιητικά αποτελέσματα με αδυναμία ανίχνευσης αρκετών ουσιών

188 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Επιλέγεται η μεθανόλη ως καταλληλότερος διαλύτης για την έκλουση των εξεταζόμενων ουσιών. Στο επόμενο πρωτόκολλο ελέγχεται η αποτελεσματικότητα των συνθηκών παραγωγοποίησης. Πραγματοποιείται εκχύλιση με Α:C18 (εδάφιο Ι) και B:C18+LLE (εδάφιο ΙΙ) και ανάλυση με GC/MS κατόπιν παραγωγοποίησης με τις εξής συνθήκες: 1: 25 μl CH 3 CN + 50 μl MSTFA, θέρμανση στους 80 C, για 10 min. Παραμονή 3 min στον απαγωγό για να κρυώσουν. Προσθήκη 50 μl MSTFA/NH 4 I/PrSH 1000/2/3 (v/w/v), θέρμανση στους 80 C, για 10 min 2: 25 μl CH 3 CN + 50 μl MSTFA, θέρμανση στους 80 C, για 30 min. Παραμονή 3 min στον απαγωγό για να κρυώσουν. Προσθήκη 50 μl MSTFA/NH 4 I/ PrSH 1000/2/3 (v/w/v), θέρμανση στους 80 C, για 30 min 3: 25 μl CH 3 CN + 50 μl MSTFA, θέρμανση στους 80 C, για 30 min. Παραμονή 3 min στον απαγωγό για να κρυώσουν. Προσθήκη 50 μl MSTFA/NH 4 I/ PrSH 1000/4/7 (v/w/v), θέρμανση στους 80 C, για 30 min 4: 100 μl MSTFA/NH 4 I/DTE 1000/2/4 (v/w/w), θέρμανση στους 80 C για 30 min Πρωτόκολλο 33 (Αi-Bi, με i=1-4) Πρωτόκολλο 33 A: Εκχύλιση με - Isolute C18 EC. Τα δείγματα εκχυλίζονται σύμφωνα με πρωτόκολλο 2 Πρωτόκολλο 33 Β: Εκχύλιση με - Isolute C18 EC και LLE Τα δείγματα εκχυλίζονται με συνδυασμό SPE και LLE σύμφωνα με πρωτόκολλο Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE Η αρχική εφαρμογή της ακολουθεί τη σειρά SPE Υδρόλυση LLE (α) Η πορεία αυτή εφαρμόστηκε στο προσροφητικό υλικό OASIS HLB. Στη συνέχεια λόγω μη ικανοποιητικών αποτελεσμάτων της πορείας α πραγματοποιήθηκε εφαρμογή των πρωτοκόλλων 32α και 32β τα οποία διαφοροποιούνται μόνο στη σειρά της υδρόλυσης η οποία μπορεί να εφαρμοστεί ως εξής Υδρόλυση SPE LLE (β)

189 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πρωτόκολλο 34α OASIS HLB -Υδρόλυση + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 3,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Υδρόλυση βλ. εδάφιο IV Εξάτμιση όλων LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο, χαμηλή ανάκτηση για το amiloride και ικανοποιητική ανίχνευση των υπόλοιπων αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο, με χαμηλή ανάκτηση για το Heptaminol και ικανοποιητική ανίχνευση των υπόλοιπων αναλυτών Πρωτόκολλο 34β- Υδρόλυση-OASIS HLB + LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Υδρόλυση βλ. εδάφιο IV Ενεργοποίηση φυσιγγίου 5,0 ml μεθανόλης και 5,0 ml Η 2 Ο Διαβίβαση ούρων Ξήρανση 3 min Έκπλυση φυσιγγίου 3,0 ml Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5 Έκλουση 5,0 ml μεθανόλης Εξάτμιση όλων LLE όπως στο πρωτόκολλο 19 Από την εξέταση των χρωματογραφημάτων προκύπτουν για τα: Αναβολικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Διεγερτικά: πολύ καθαρό υπόβαθρο, καλές ανακτήσεις και ικανοποιητική ανίχνευση όλων των αναλυτών Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με LLE και συνδυασμό SPE και LLE Στη σειρά αυτή αυτό δοκιμάζονται σε υδρολυμένα ούρα τα πρωτόκολλα που παρουσίασαν τα καλύτερα αποτελέσματα στο εδάφιο III. Τα πρωτόκολλα αυτά περιγράφονται συνοπτικά στον Πίνακα 6.7. Λεπτομερής περιγραφή των πρωτοκόλλων αυτών έχει πραγματοποιηθεί σε προηγούμενα εδάφια καθώς και στο Παράρτημα 3 με μόνη διαφοροποίηση το στάδιο της υδρόλυσης

190 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας. 6.7: Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης στερεάς φάσης σε υδρολυμένα ούρα Πρωτόκολλο Προσροφητικό υλικό Υδρόλυση SPE+ LLE 35 Isolute C18 - EC 36 Isolute Oasis HLB 38 Bond Elut LMS 39 Isolute C18 - EC 40 Isolute HCX 41 Isolute C8 - NE 42 Nexus Από τη μελέτη των παραπάνω πρωτοκόλλων προκύπτει ότι οι πορείες με συνδυασμό SPE και LLE οδηγούν σε καθαρισμό του υποβάθρου και βελτίωση των αποτελεσμάτων παρά τις χαμηλότερες λαμβανόμενες ανακτήσεις. Πραγματοποιήθηκε επίσης εφαρμογή 3 πρωτοκόλλων που περιλαμβάνουν υδρόλυση και ακολούθως LLE, με τρεις διαφορετικούς διαλύτες (πρωτόκολλα 43 a-c) ως εξής: Πρωτόκολλο (43a c) :Υδρόλυση - LLE Προσθήκη δειγμάτων ελέγχου 100 μl CALA, 150 μl CALB Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl codeine Υδρόλυση βλ. εδάφιο IV Ρύθμιση ph 9,5 με μίγμα στερεών NaHCO 3 / Na 2 CO 3 10/1 Εκχύλιση με 5,0 ml a)διαιθυλαιθέρα/ισοπροπανόλη 5/1, b) DE/EA/CH 2 Cl 2 :4/3/3,5, c) MTBE 2 g άνυδρου Na 2 SO 4 Προσθήκη εσωτερικού προτύπου 100 μl methyltestosterone Μοίρασμα οργανικής στιβάδας σε 3,5 ml (GC/MS) και 1,5 ml (LC/MS) Εξάτμιση όλων Ανασύσταση και παραγωγοποίηση Και στα τρία εφαρμοζόμενα πρωτόκολλα η εφαρμογή της LLE μετά την υδρόλυση παρουσίασε χαμηλές ανακτήσεις για τις ουσίες amiloride, heptaminol, benzoylecgonine Εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων στο σύνολο των υπό μελέτη ουσιών σε δείγματα ούρων αθλητών και συγκέντρωση ίση με το MRPL. Στην τελική σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκε εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων, όπως αυτά προέκυψαν από το στάδιο 6.5.4, σε συγκέντρωση ίση με το MRPL σύμφωνα με τον Πίνακα

191 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Για κάθε εξεταζόμενο πρωτόκολλο παρασκευάστηκαν 8 δείγματα ελέγχου (βλ υποκεφάλαιο 6.3ΙΙ). Πίνακας. 6.8: Πειραματικά πρωτόκολλα εκχύλισης, για το σύνολο των ουσιών Πρωτόκολλο Εφαρμοζόμενη πορεία 44 Isolute C18 EC + LLE 45 Isolute 101+ LLE 46 Oasis HLB+ LLE 47 Bond Elut LMS+ LLE 48 Isolute C18 EC + LLE 49 Isolute C8 NE + LLE 50 LLE1: DE/EA/CH2Cl2 4/3/3,5 51 LLE2: DE/2-propanol: 5/1 52 LLE3: DE Όπου LLE: Εκχύλιση με DE/EA/CH2Cl2: 4/3/3.5, εκτός των τελευταίων πρωτοκόλλων όπου ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης αναγράφεται στον Πίνακα 6.8. Τα πρωτόκολλα περιγράφονται λεπτομερώς στο Παράρτημα Αποτελέσματα Συζήτηση Εισαγωγή Για την αξιολόγηση όλων των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν ελήφθησαν υπόψη: Η συνολική εικόνα του ολικού χρωματογραφήματος, για την τυχόν παρουσία πολύ μεγάλων παρεμποδιζουσών κορυφών Η ικανοποιητική παραγωγοποίηση (εδάφιο VI). Σε περιπτώσεις μη ικανοποιητικής παραγωγοποίησης ανεξαρτήτως των αποτελεσμάτων της ανάκτησης, η προτεινόμενη πορεία θεωρείται ανεπιτυχής Η % ανάκτηση των προσδιοριζόμενων ουσιών

192 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Η υπολογιζόμενη ανάκτηση σε αρκετά πειραματικά πρωτόκολλα εμφανίστηκε χαμηλή λόγω: o παρουσίας πτητικών ενώσεων, όπως τα εξεταζόμενα διεγερτικά ή άλλες ενώσεις μικρού μοριακού βάρους o Λόγω απωλειών στο στάδιο της εξάτμισης o Παρουσίας υδρόφιλων αναλυτών, όπως τα Amiloride και Fenoterol και συνεπώς απωλειών στο στάδιο της έκπλυσης o Μη ικανοποιητικής πρόσδεσης στο στάδιο φόρτωσης του δείγματος ή ανεπαρκούς απομάκρυνσης στο στάδιο της έκλουσης. Ακόμη και σε περιπτώσεις που η % ανάκτηση είναι χαμηλή η πορεία δεν απορρίπτεται αν οι ουσίες ανιχνεύονται στο MRPL. Η υπολογιζόμενη ανάκτηση σε αρκετά πειραματικά πρωτόκολλα εμφανίστηκε >100% λόγω: Συνέκλουσης παρεμποδιζουσών ουσιών Μη αναπαραγώγιμης επιφάνειας των φυσιγγίων Προβληματικής εξάτμισης των δειγμάτων Προκαταρκτικά πειράματα-εκχύλιση σε μη υδρολυμένα ούρα Ι) Εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών με LLE ή SPE Ως παράμετρος των υπολογιζόμενων ανακτήσεων, ανά πρωτόκολλο, χρησιμοποήθηκε ο μέσος όρος των ανακτήσεων των ουσιών των δειγμάτων ελέγχου CALA και CALB. Σημειώνεται ότι μας ενδιαφέρει η ανίχνευση όλων των ουσιών εξίσου. Στο πρώτο πειραματικό πρωτόκολλο εφαρμόζεται υγρό-υγρό εκχύλιση με τη χρήση ενός πολικού διαλύτη. Το υπόβαθρο είναι αρκετά καθαρό με αδυναμία ανίχνευσης 2 αναβολικών (Aminoglutethimide και 16-OH-stanozolol) και ανακτήσεις μεγαλύτερες από 100 % για τους αναλύτες Oxandrolone, Fluoxymesterone tetrol met2 και Methylphenidate. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε εκχύλιση στερεάς φάσης με προσροφητικά υλικά προτεινόμενα από τη βιβλιογραφία, όπως παρουσιάστηκε στο Κεφάλαιο 3 μετά από εκτενή βιβλιογραφική αναζήτηση, για την εκχύλιση μεγάλου αριθμού απαγορευμένων

193 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών ουσιών. Τα εξεταζόμενα προσροφητικά υλικά κατηγοριοποιήθηκαν σε προσροφητικά βασιζόμενα σε silica και σε προσροφητικά βασιζόμενα σε πολυμερές. Υδρόφοβα προσροφητικά υλικά διαφορετικών εταιρειών αλλά με τις ίδιες ιδιότητες (πχ C18) εξετάστηκαν. Τα προσροφητικά C18 διαφορετικών εταιρειών οδήγησαν σε παρόμοια αποτελέσματα τα οποία πιθανότατα σχετίστηκαν κυρίως από το εφαρμοζόμενο πρωτόκολλο. Εφαρμογή του πρωτοκόλλου 2 οδήγησε σε πιο ικανοποιητική ανίχνευση των ουσιών σε σχέση με τα υπόλοιπα, κυρίως λόγω καθαρότερου υποβάθρου. Προσροφητικά υλικά με υψηλότερο ποσοστό ελεύθερων υδροξυλομάδων λόγω μη κάλυψης των άκρων (Πρωτόκολλο 3) οδήγησαν σε μειωμένη ανίχνευση των μελετούμενων ουσιών λόγω έντονου υποβάθρου. Προσροφητικά υλικά μικτής φάσης βελτίωσαν την ανάκτηση των βασικών ουσιών όπως αναμενόταν, λόγω των πολλαπλών αλληλεπιδράσεων, παράλληλα όμως οδήγησαν σε αύξηση του matrix λόγω της συνένωσης των επιμέρους κλασμάτων. Μειονέκτημα των προσροφητικών υλικών βασιζόμενων σε silica που εξετάστηκαν αποτέλεσε η απουσία επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων. Προσροφητικά υλικά βασιζόμενα σε πολυμερή με υδρόφοβα χαρακτηριστικά, ή με συνδυασμό υδρόφιλων-υδρόφοβων χαρακτηριστικών ομάδων, καθώς και μικτού τύπου κατιοανταλλάκτες που περιγράφηκαν στα πρωτόκολλα 8-13 εμφάνισαν υψηλότερες ανακτήσεις και πιο επαναλήψιμα αποτελέσματα για κάποιες από τις προσδιοριζόμενες ουσίες, πιθανώς λόγω της μη αντιστρεπτής πρόσδεσης αυτών στην επιφάνεια του προσροφητικού. Όπως αποδείχθηκε από τα αποτελέσματα της εκχύλισης, κανένα από τα πρωτόκολλα που εφαρμόστηκαν δεν ήταν εφικτό να χρησιμοποιηθεί για την εφαρμογή ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών. Σε όλα τα πρωτόκολλα αναφέρθηκαν προβλήματα ανίχνευσης τμήματος των εξεταζόμενων ουσιών ή προβληματικές ανακτήσεις που αρκετές φορές ξεπερνούν το 100%, πιθανόν λόγω έντονης παρουσίας υποβάθρου. Παράλληλα η έντονη παρουσία ενώσεων της μήτρας είχε σαν αποτέλεσμα ατελή παραγωγοποίηση των μελετούμενων ουσιών, όπως προσδιορίστηκε με το λόγο R A

194 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Τα εφαρμοζόμενα πρωτόκολλα δεν εμφάνισαν αξιοποιήσιμα ερευνητικά αποτελέσματα κατά συνέπεια δεν κρίθηκε απαραίτητη η γραφική αναπαράσταση των δεδομένων. ΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με το προσροφητικό υλικό OASIS HLB Ο συνδυασμός SPE και LLE (πρωτόκολλο 17) οδήγησε σε σημαντική βελτίωση των λαμβανομένων αποτελεσμάτων για το σύνολο των ουσιών. Από τη μελέτη των χρωματογραφημάτων προέκυψε σημαντική μείωση του σήματος του υποβάθρου που με τη σειρά της είχε σαν αποτέλεσμα την ανίχνευση όλων των μελετούμενων ουσιών του σταδίου αυτού. Σύγκριση των πρωτοκόλλων 17 και 12 απέδειξαν την ευεργετική δράση της LLE. Στο πρωτόκολλο 12 (βλ εδάφιο Ι.), όπως έχει αναφερθεί ήταν αδύνατη η ανίχνευση κάποιων ουσιών λόγω του έντονου υπόβαθρου, ενώ παράλληλα η συνέκλουση παρεμποδιζουσών ουσιών είχε σαν αποτέλεσμα ανακτήσεις μεγαλύτερες του 100%. Εφαρμογή του πρωτοκόλλου 17 επέτρεψε την ανίχνευση όλων των ουσιών ακόμη και σε περιπτώσεις με εξαιρετικά χαμηλή ανάκτηση (amiloride, atenolol κ.α) λόγω της μείωσης του υποβάθρου και της αύξησης του λόγου S/N. Η εξαιρετικά χαμηλή ανάκτηση των πολικών κυρίως ουσιών οφειλόταν ενδεχομένως στην απώλεια αυτών κατά το στάδιο της έκπλυσης με Η 2 Ο καθώς και στην απουσία παράγοντα εξαλάτωσης (Na 2 SO 4 ) κατά την υγρό-υγρό εκχύλιση. Στο στάδιο βελτιστοποίησης πραγματοποιήθηκε επανάληψη του πρωτοκόλλου 17 αλλά με την εφαρμογή τριών διαφορετικών διαλυτών έκπλυσης με σκοπό την επιλογή του καταλληλότερου διαλύτη που θα οδηγούσε σε μικρότερες απώλειες των εξεταζόμενων ουσιών, αλλά και σε καθαρότερο υπόβαθρο. Τα χρωματογραφήματα συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα διαλύματα ελέγχου που είχαν υποστεί μόνο την πορεία εξάτμιση-παράγωγα. Ως καταλληλότερος διαλύτης έκλουσης με βάση τα παραπάνω επιλέχθηκε το μίγμα Η 2 Ο/μεθανόλης 95/5. Στις δοκιμές που ακολούθησαν πραγματοποιήθηκε επιλογή του διαλύτη εκχύλισης στην LLE. Στα πειράματα αυτά προστέθηκε Na 2 SO 4 και όπως αποδεικνύεται από σύγκριση των πρωτοκόλλων 17 και 18_2a που διαφέρουν μόνο στην προσθήκη του Na 2 SO 4 στο

195 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών στάδιο της LLE, η % ανάκτηση ορισμένων από τις προσδιοριζόμενες ουσίες βελτιώνεται σημαντικά (Παράρτημα 4). Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν με τη χρήση των τεσσάρων διαφορετικών διαλυτών για το στάδιο της LLE, οι διαλύτες (b) και (c) δεν εκχυλίζαν το σύνολο των ουσιών (b), ή συνέκλουαν μεγάλο αριθμό παρεμποδιζουσών ουσιών (c) οπότε δεν ελήφθησαν υπόψη στην τελική επιλογή. Για τους διαλύτες (a) και (d) προέκυψαν τα εξής αποτελέσματα : Σ %Rec CALB CALA Πρωτόκολλο 18Α Πρωτόκολλο 18D Σχήμα 6.4: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Σ % Rec των πρωτοκόλλων 18a και 18d Σύμφωνα με το Σχήμα 6.4 για τα μελετούμενα πρωτόκολλα 18a, 18d προέκυψε ότι αποτελέσματα για το δείγμα ελέγχου CALA είναι ισοδύναμα ενώ ελήφθησαν λίγο καλύτερα αποτελέσματα με τον διαλύτη d για το δείγμα ελέγχου CALB. Όπως προέκυψε από το Σχήμα 6.5 τα δυο πρωτόκολλα παρουσίασαν παρόμοια αποτελέσματα για το μέσο όρο των ανακτήσεων με το 18d να είναι ελάχιστα υψηλότερο. Από τη μελέτη του Σχήματος 6.6 παρατηρούμε ότι οι ανακτήσεις για όλες τις εξεταζόμενες ουσίες εμφάνισαν μικρότερη διακύμανση με το διαλύτη D. Για όλους αυτούς τους λόγους επιλέχθηκε ο διαλύτης D: DE/EA/CH 2 Cl 2 : 4/3/3,5 ως διαλύτης εκχύλισης της LLE για τα επόμενα πειράματα

196 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Average (%Rec) Πρωτόκολλο 18Α Πρωτόκολλο 18D Σχήμα 6.5: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average (% Rec) των πρωτοκόλλων 18a και 18d %CV (%Rec) Πρωτόκολλο 18Α Πρωτόκολλο 18D Σχήμα 6.6: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων %CV (%Rec) ανάλυσης των πρωτοκόλλων 18a και 18d ΙΙΙ) Συνδυασμός SPE και LLE με διάφορα προσροφητικά υλικά Τα πειραματικά πρωτόκολλα που παρουσιάστηκαν στο εδάφιο III, περιελάμβαναν την εκχύλιση των υπό μελέτη ουσιών με προσροφητικά υλικά από όλες τις κατηγορίες σύμφωνα με την αρχική ταξινόμηση και συνδυασμό αυτών με LLE, με το διαλύτη που προέκυψε ως βέλτιστος (βλ εδάφιο II). Προσροφητικά υλικά τύπου silica με υδρόφοβες ιδιότητες (πρωτόκολλα 19, 20, 26, 28) ή μικτού τύπου (πρωτόκολλο 25, 30) καθώς και πολυμερή με υδρόφοβες ιδιότητες (πρωτόκολλα 21, 23) ή συνδυασμό υδρόφοβων υδρόφιλων (πρωτόκολλα 22, 24, 27, 29) χρησιμοποιήθηκαν για τις δοκιμές εκχύλισης αυτής της σειράς πειραμάτων

197 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών AVERAGE (%Rec) Π19 Π20 Π21 Π22 Π23 Π24 Π25 Π26 Π27 Π28 Π29 Π30 Π31 Σχήμα 6.7: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average (% Rec) των πρωτοκόλλων της φάσης ΙΙΙ Όπως προέκυψε από το Σχήμα 6.7 τα πρωτόκολλα 27, 24, 19 παρουσίασαν την υψηλότερη μέση ανάκτηση με τα πρωτόκολλα 21, 28, 23, 25 να δίνουν παρόμοια αποτελέσματα. Με εξαίρεση τα πρωτόκολλα 20 και 31 που παρουσίασαν τις χαμηλότερες ανακτήσεις, τα υπόλοιπα προσροφητικά υλικά δεν παρουσίασαν μεγάλες διαφορές, με τη μέση ανάκτηση να κυμαίνεται από 42-63%. Επιπλέον με το πρωτόκολλο 20 δεν ανιχνεύθηκαν όλες οι προσδιοριζόμενες ουσίες του δείγματος ελέγχου CALA, γεγονός που δικαιολογεί την χαμηλή μέση ανάκτηση. Μελέτη του Σχήματος 6.8 οδήγησε σε παρόμοια συμπεράσματα, με τα πρωτόκολλα 20 και 31 να παρουσιάζουν πάρα πολύ υψηλή διακύμανση στις ανακτήσεις των μελετούμενων ουσιών. Καθώς βασική απαίτηση στις προτεινόμενες πορείες για τη σάρωση απαγορευμένων ουσιών είναι η εκχύλιση ενός μεγάλου αριθμού των μελετούμενων ουσιών, ήταν ιδιαίτερα σημαντικό οι αποκλίσεις, οι οποίες σε ένα βαθμό δικαιολογούνται από τα διαφορετικά χαρακτηριστικά των μελετούμενων ουσιών να μην είναι πολύ μεγάλες. Βάσει αυτής της σημαντικής απαίτησης τα πρωτόκολλα 20 και 31 δεν θα εξεταστούν σε επόμενο στάδιο, δηλαδή σε υδρολυμένα ούρα. Τα πρωτόκολα 30, 29 και 22 εμφάνισαν την αμέσως μεγαλύτερη διακύμανση των αποτελεσμάτων

198 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Μελέτη των χρωματογραφημάτων και αξιολόγηση των λαμβανομένων αποτελεσμάτων των πειραματικών πρωτοκόλλων της σειράς III συγκρινομένης με την σειρά I αποδεικνύει την ευεργετική συνεισφορά του σταδίου της LLE ως μέσου βελτιστοποίησης της εφαρμοζόμενης πορείας εκχύλισης. Η μείωση του σήματος υποβάθρου, η περαιτέρω απομάκρυνση παρεμποδιζουσών ουσιών είχαν σαν αποτέλεσμα τη βελτίωση του λόγου S/N και την αποτελεσματικότερη ανίχνευση των ουσιών. Η % ανάκτηση των προσδιοριζομένων ουσιών σε αρκετές περιπτώσεις κυμαινόταν σε χαμηλά επίπεδα, όμως λόγω της βελτίωσης του λόγου S/N η ανίχνευση των μελετούμενων ουσιών πραγματοποιήθηκε επιτυχώς. 120 Π Π20 80 CV (% Rec) Π19 Π21 Π22 Π23 Π24 Π25 Π26 Π27 Π28 Π29 Π Π19 Π20 Π21 Π22 Π23 Π24 Π25 Π26 Π27 Π28 Π29 Π30 Π31 Σχήμα 6.8: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων %CV (%Rec) ανάλυσης των πρωτοκόλλων φάσης ΙΙΙ Πρόσθετα προσροφητικά υλικά από αυτά που ήδη αναφέρθηκαν χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την σειρά πειραμάτων τα οποία όμως δεν παρουσιάζονται αφού τα αποτελέσματα που προέκυψαν είναι λιγότερο ικανοποιητικά, αφενός λόγω πιο "βρώμικου" υποβάθρου και αφετέρου λόγω αδυναμίας προσδιορισμού τμήματος των υπό μελέτη ουσιών. Σε αυτά τα προσροφητικά υλικά συγκαταλέγονται τα Isolute C2, τα Multimode, τα Isolute HCX-3 και τα Lichrolut EN

199 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών IV) Πρόσθετα πειράματα για την προβληματική ανίχνευση των ουσιών της φάσης Ι (βλ εδάφιο Ι) Εφαρμογή του πρωτοκόλλου 32 με τη χρήση των τεσσάρων διαλυτών έκλουσης, διαφορετικής πολικότητας απέδειξε ότι σε όλες τις περιπτώσεις η συνεισφορά από τη μήτρα ανεξάρτητα από το χρησιμοποιούμενο διαλύτη έκλουσης, με την εφαρμογή της SPE ήταν πολύ έντονη. Η έκλουση με MeOH είχε σαν αποτέλεσμα ικανοποιητικές ανακτήσεις και ανίχνευση όλων των ουσιών σε σχέση με τους υπόλοιπους τρεις διαλύτες για αυτό και επιλέχθηκε ως διαλύτης έκλουσης. Για αυτές τις συνθήκες προσδιορίστηκε ο λόγος R A όπου και στις τέσσερις περιπτώσεις κυμαινόταν σε πολύ υψηλά επίπεδα από 20 έως 50%. Στο επόμενο στάδιο εφαρμόστηκαν 2 διαφορετικές πορείες εκχύλισης με το προσροφητικό υλικό Isolute C18. Σε κάθε μια από πορείες πραγματοποιήθηκε παραγωγοποίηση των μελετούμενων ουσιών με 4 διαφορετικές συνθήκες όπως περιγράφηκε στο εδάφιο IV. Σε όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκε έλεγχος επαρκούς παραγωγοποίησης. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στον Πίνακα 6.9. Πίνακας 6.9: Αποτελέσματα παραγωγοποίησης με έλεγχο του λόγου R A Πρωτόκολλο % R A 33A A A A B B B B Εφαρμογή μόνο SPE (πρωτόκολλο 33Α) για την εκχύλιση απαγορευμένων ουσιών δεν ενδείκνυται αφού η συνεισφορά από το υπόβαθρο είναι τόσο έντονη με αποτέλεσμα την ατελή παραγωγοποίηση ανεξάρτητα από τις εφαρμοζόμενες συνθήκες (ακόμη και με το ευρέως χρησιμοποιούμενο αντιδραστήριο των αναβολικών στεροειδών). Ανάλογα συμπεράσματα προέκυψαν από την παρατήρηση του ιοντικού χρωματογραφήματος για το δείγμα ελέγχου CALA κατόπιν παραγωγοποίησης (Σχήμα 6.9). Όπως φαίνεται από

200 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών το χρωματογράφημα, ο λόγος R A είναι πάρα πολύ υψηλός οπότε και η αντίδραση παραγωγοποίησης δεν ολοκληρώνεται. Σχήμα 6.9: Ιοντικό χρωματογράφημα του δείγματος ελέγχου CALA μετα από SPE εκχύλιση και παραγωγοποίηση Αξίζει να σημειωθεί ότι πραγματοποιήθηκαν πρόσθετες δοκιμές που αφορούν το στάδιο παραγωγοποίησης συμπεριλαμβανομένων πιο δραστικών συνθηκών όπως αύξηση του χρόνου επώασης, επώαση με θάλαμο μικροκυμάτων κ.α χωρίς όμως τροποποίηση των αναφερθέντων αποτελεσμάτων. Εφαρμογή της πορείας 33Β οδήγησε σε ικανοποιητικά αποτελέσματα για όλες τις εφαρμοζόμενες συνθήκες με μικρές διαφοροποιήσεις, γεγονός που αποδεικνύει ότι η ατελής παραγωγοποίηση είναι αποτέλεσμα ανεπαρκούς απομάκρυνσης παρεμποδιζουσών ουσιών από τη μήτρα. Το ίδιο συμπέρασμα προέκυψε από την εξέταση του ιοντικού χρωματογραφήματος του δείγματος ελέγχου CALA για την πορεία αυτή (Σχήμα 6.10)

201 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Από τη μελέτη του Πίνακα 6.7 προέκυψε ότι για όλες τις εφαρμοζόμενες συνθήκες παραγωγοποίησης τα αποτελέσματα είναι ανάλογα οπότε και δεν απαιτείται διαφοροποίηση των συνθηκών παραγωγοποίησης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η πορεία Α που περιλαμβάνει πειραματικά πρωτόκολλα μόνο με SPE εμφάνισε τις υψηλότερες ανακτήσεις για το σύνολο των μελετούμενων ουσιών αν και υπήρχαν περιπτώσεις όπως π.χ η ουσία 6β-OH methandienone η οποία δεν ανιχνευθηκε λόγω παρουσίας matrix. Τα αποτελέσματα του σταδίου αυτού συμβαδίζουν με τα αποτελέσματα του σταδίου I και III. Συνοψίζοντας καταλήγουμε ότι η πορεία εκχύλισης με την εφαρμογή μόνο SPE δεν ήταν δυνατό να εφαρμοστεί σε υδρολυμένα ούρα λόγω: Ατελούς παραγωγοποίησης Αδυναμίας προσδιορισμού τμήματος μελετούμενων ουσιών Σχήμα 6.10: Ιοντικό χρωματογράφημα του δείγματος ελέγχου CALA μετα από συνδυασμό SPE και LLE εκχύλισης και παραγωγοποίηση

202 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με το προσροφητικό OASIS HLB σε συνδυασμό με LLE Μελέτη των αποτελεσμάτων των εξεταζόμενων προσροφητικών ουσιών με την πορεία a όπου η SPE προηγήθηκε του σταδίου υδρόλυσης οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερες ανακτήσεις συγκρινομένου με τα αντίστοιχo πρωτόκολλo που δεν περιελάμβανε το στάδιο της υδρόλυσης (π.χ πρωτόκολλο 24 με 28 α). Για αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκε έλεγχος της "σειράς" της υδρόλυσης με την πορεία a (βλ εδάφιο 6.5.3) και την πορεία β όπου η SPE έπεται της εκχύλισης. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο Σχήμα 6.11 από όπου αποδεικνύεται ότι η SPE μετά το στάδιο της υδρόλυσης οδήγησε σε υψηλότερες ανακτήσεις Average (%Rec) a 34b Σχήμα 6.11: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average(% Rec) των πρωτοκόλλων 34a και 34b

203 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εκχύλιση υδρολυμένων ούρων με LLE και συνδυασμό SPE και LLE AVERAGE ( %REC) ) Π35 Π36 Π37 Π38 Π39 Π40 Π41 Π42 Π43A Π43B Π43C Σχήμα 6.12: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων Average(% Rec) των πρωτοκόλλων Από το Σχήμα 6.12 παρατηρείται ότι όλα τα εφαρμοζόμενα πρωτόκολλα παρουσίασαν παρόμοια αποτελέσματα όσον αφορά τη μέση ανάκτηση, με το πρωτόκολλο 42 να έχει τη μικρότερη μέση ανάκτηση. Στο Σχήμα 6.13 παρατηρούμε επίσης ότι το πρωτόκολλο 40 παρουσίασε τη μεγαλύτερη διακύμανση στις μέσες ανακτήσεις των μελετούμενων ουσιών. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα τα πρωτόκολλα αυτά δεν εξετάστηκαν στο τελικό στάδιο. Παρόλο που τα μελετούμενα πρωτόκολλα με την LLE παρουσίασαν ικανοποιητικές ανακτήσεις, αξίζει να σημειωθεί ότι και εδώ η διακύμανση των ανακτήσεων για το σύνολο των ουσιών είναι υψηλή

204 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών %CV (% Rec) Π35 Π36 Π37 Π38 Π39 Π40 Π41 Π42 Π43A Π43B Π43C Σχήμα 6.13: Συγκριτικό διάγραμμα των αποτελεσμάτων%cv(% Rec) των πρωτοκόλλων Εφαρμογή των βέλτιστων πρωτοκόλλων στο σύνολο των υπό μελέτη ουσιών Τα αποτελέσματα για τα πειραματικά πρωτόκολλα που εφαρμόστηκαν συνοψίστηκαν στους Πίνακες όπου και παρουσιάστηκαν τα αποτελέσματα ξεχωριστά για κάθε δείγμα ελέγχου ανάλογα με την εφαρμοζόμενη αναλυτική μέθοδο (βλ. εδάφιο ΙΙ)

205 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.10: Αποτελέσματα εκχύλισης των δειγμάτων ελέγχου CMIX, 471, CALD με LC/MS Ion trap ανάλυση Ουσία Πειραματικά Πρωτόκολλα Formoterol 2 Triamcinolone 3 16a-hydroxyprednisolone 4 Prednisolone 5 Fludrocortisone 6 Prednisone 7 Methylprednisolone 8 Dexamethasone 9 Betamethasone 10 Flumethasone 11 Beclomethasone 12 Flunisolide 13 Fluocortolone 14 Triamcinolone acetonide 15 Trenbolone 16 Desonide 17 Gestrinone 18 Budesonide 19 THG 20 Formebolone ΜΤ 21 Finasteride ΜΤ 22 Boldione 23 Ethacrynic acid 24 Furosemide MT: metabolite

206 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.11: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CMIX με HRMS ανάλυση (συνεχίζεται) Ουσία Πειραματικά Πρωτόκολλα 1 Nor androstosterone, nor etiocholanolone Methyldiols 3 16-OH-stanozolol 4 3 κ 4-OH-stanozolol 5 Epimetendiol 6 Clenbuterol 7 Salbutamol 8 Benzoylecgonine 9 boldenone mt 10 Drostanolone /mesterolone ΜΤ 11 Methenolone ΜΤ 12 Clostebol ΜΤ 13 Fluoxymesterone ΜΤ 1 14 Fluoxymesterone ΜΤ 2 15 Ζeranol 16 Bolasterone /calusterone 17 Norethandrolone

207 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.11 (συνέχεια) 18 Oxymesterone 19 Furazabol ΜΤ 20 Furazabol pc 21 Calusterone /bolasterone ΜΤ 22 Salmeterol 23 Fenoterol 24 Oxandrolone 25 Epioxandrolone 26 Ethisterone 27 Buprenorphine bis-tms 28 Buprenorphine mono-tms 29 1 Methyltestosterone MT: metabolite

208 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.12: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου 847 με HRMS ανάλυση Ουσία Πειραματικά Πρωτόκολλα Nor Nor androstosterone, androstosterone, nor nor etiocholanolone etiocholanolone Methyldiols 2 Methyldiols 3 3 κ 4 OH-stanozolol 3 3 κ 4 OH-stanozolol 4 Epimetendiol 4 Epimetendiol 5 18normetenol 5 18normetenol 6 Clenbuterol 7 6 Buprenorphine Clenbuterol bis-tms 7 Buprenorphine bis-tms 8 Buprenorphine mono-tms 8 Buprenorphine mono-tms

209 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.13: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CMIX με GC/MS ανάλυση (συνεχίζεται) Ουσία Πειραματικά Πρωτόκολλα Terbutaline 2 Bambuterol 3 Salbutamol 4 Fenoterol 5 Boldenone 6 Boldenone MT testosterone 8 1-androstendione 9 1-Testosterone met 10 Methenolone 11 Methenolone mt/norethisterone mt 12 Norethandrolone MT 1 13 Norethandrolone MT 2 14 Clostebol MT 1 15 Mibolerone 16 Ethisterone 17 Furazabol MT 18 Oral turinabolol MT a -norbolethone 20 5β-nor bolethone 21 Zeranol 22 4-OH testosterone 23 6a-OH Androstendione 24 Formestane

210 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.13 (συνέχεια) 25 Aminoglutethimide 26 Anastrozole 27 letrozol met 28 Amiloride 29 Triamterene 30 Hydromorphone 31 Oxymorphone 32 Oxycodone 33 Pemoline 34 Amiphenazole 35 Bromantane MT 36 Acebutolol 37 Betaxolol 38 Bisoprolol an1 39 Bisoprolol an2 40 Carteolol1 41 Carteolol 2 42 Celiprolol 43 Esmolol 44 Labetalol 45 Levobunolol 46 Metipranolol2 47 Metipranolol3 48 Metoprolol 49 Nadolol 50 Oxprenolol

211 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.13 (συνέχεια) 51 Pindolol 52 Propranolol 53 Sotalol 54 Timolol MT: metabolite, an: analyte Πίνακας 6.14: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου 471 με GC/MS ανάλυση Ουσία Πειραματικά Πρωτόκολλα T/E ratio ~4 ~4 ~4 ~4 ~4 ~4 ~4 ~4 ~4 2 Androsterone, etiocholanolone bis- TMS 3 Androsterone, etiocholanolone O- TMS 4 DHEA 5 Salbutamol 6 Epitrenbolone 7 Furazabol 8 THCCOOH

212 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.15: Αποτελέσματα εκχύλισης του δείγματος ελέγχου CALWADA με GC/MS ανάλυση (συνεχίζεται) Oυσία Πρωτόκολλο Morphine 2 Methadone 3 Pentazocine 4 Ethamivan 5 Etilefrine 6 Terbutaline 7 Fenoterol 8 Benzoylecgonine 9 Modafinil 10 Pholedrine 11 Amphetamine 12 Benzphetamine 13 Benzylamphetamine 14 Cocaine 15 Cropromamide 16 Crotethamide 17 Ecgonine Me ester 18 Ephedrine, psephedrine 19 Ethylamphetamine 20 Methylephedrine 21 Norephedrine, norpseudoephedrine 22 Phentermine

213 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.15 (συνέχεια) 23 Fencamfamine 24 Morphine 25 6-acetymorphine 26 Aminoglutethimide 27 Anastrozole 28 Clomiphene 29 Dextromoramide 30 Fenethylline 31 Fenfluramine 32 Fenproporex 33 Heptaminol 34 Mefenorex 35 Methoxyphenamine 36 Methylamphetamine 37 Methylphenidate 38 Nikethamide 39 Normorphine 40 Adrafinil 1 41 Adrafinil II 42 Hydromorphone 43 Mephentermine 44 MDA 45 Oxycodone 46 Phenyltetrazol 47 Phendimetrazine 48 Prolintane 49 Strychnine

214 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Πίνακας 6.15 (συνέχεια) 50 Etafedrine 51 Caffeine 52 Carphedon 53 Phenilephrine 54 Dihydrocodeine 55 Norcodeine 56 MDMA 57 Pipradol 58 Norfenfluramine 59 Furfenorex 60 Ritalinic acid 61 Fentanyl 62 Famprofazone 63 Alfentanyl 64 Octopamine 65 Phenmetrazine 66 6-OH-bromantan η ουσία δεν ανιχνεύθηκε διαφορετική αναλογία, δυσκολία προσδιορισμού (λόγω χαμηλού σήματος ή έλλειψης εκλεκτικότητας- specificity)

215 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Από τον Πίνακα 6.10 προέκυψε ότι όλες οι εξεταζόμενες ουσίες ανιχνεύθηκαν στο MRPL με τα εξεταζόμενα πρωτόκολλα εκτός από το 49 με το οποίο δεν προσδιορίστηκαν οι ουσίες fludrocortisone, prednisone και methylprednisolone. Η ουσία finasteride met δεν ανιχνεύθηκε με τα πρωτόκολλα 50 και 52, γεγονός όμως που δεν αποτελεί πια πρόβλημα μια και η ουσία αυτή έχει αφαιρεθεί από τη λίστα του WADA. Στον Πίνακα 6.11 παρατηρείται η αδυναμία ανίχνευσης των ουσιών oxandrolone και epioxandrolone σε όλα τα εφαρμοζόμενα πρωτόκολλα. Στην πραγματικότητα αυτό που αποδείχθηκε μετά από ανάλυση λευκού δείγματος το οποίο εμβολιάστηκε με τις ουσίες oxandrolone και epioxandrolone και αναλύθηκε με GC/MS κατόπιν παραγωγοποίησης με full scan μέθοδο, ήταν ο σχηματισμός διαφορετικού αναλύτη, από αυτόν που έχει αναφερθεί σε μεθόδους σάρωσης, με τα συγκεκριμένα παράγωγα λόγω σxηματισμού πρόσθετου προϊόντος (adduct), με το PrSH 207. Επιπλέον ο προσδιορισμός της ουσίας zeranol επιτεύχθηκε σε όλα τα πρωτόκολλα, με αναλογία όμως διαφορετική από ότι στη χρησιμοποιούμενη έως τώρα μέθοδο σάρωσης. Παρόλα αυτά ο προσδιορισμός της δεν αποτέλεσε πρόβλημα μιας και δεν ανιχνεύθηκε στα λευκά δείγματα, παρά μόνο στα δείγματα ελέγχου. Με το πρωτόκολλο 51 δεν ανιχνεύθηκαν οι ουσίες salmeterol και fenoterol. Χωρίς ιδιαίτερες δυσκολίες πραγματοποιήθηκε και ανίχνευση των ουσιών του δείγματος ελέγου 847 (Πίνακας 6.12) με εξαίρεση την ανίχνευση του Epimetendiol (methandienone metabolite) λόγω του χαμηλού σήματος αυτού. Η δυσκολία αυτή αντιμετωπίζεται με την ανίχνευση άλλων μεταβολιτών του methandienone που ανιχνεύθηκαν ικανοποιητικά με τα προτεινόμενα πρωτόκολλα. Από τη μελέτη του Πίνακα 6.13 παρατηρήθηκε δυσκολία ανίχνευσης της ουσίας boldenone σε όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα. Παρόλα αυτά ανιχνεύθηκε ικανοποιητικά ο μεταβολίτης αυτού όπως παρουσιάστηκε στον Πίνακα Τα ίδια αποτελέσματα προέκυψαν για την ουσία furazabol MT η οποία όμως ανιχνεύθηκε ικανοποιητικά με GC/HRMS. Επιτυχώς ανιχνεύθηκε και η μητρική ουσία όπως παρουσιάζεται στον Πίνακα Αδυναμία ανίχνευσης παρουσιάστηκε επίσης για τις ουσίες 5α-norbolethone και aminoglutethimide

216 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών Εφαρμογή του πρωτοκόλλου 51 οδήγησε σε αδυναμία ανίχνευσης του epitrenbolone σύμφωνα με τον Πίνακα Από τη μελέτη του ιδίου πίνακα προέκυψε ότι ο λόγος T/E προσδιορίστηκε, στο δείγμα ελέγχου 471 με όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα, πολύ κοντά στην πραγματική τιμή (T/E=4). Οι προσδιοριζόμενες επίσης τιμές για το λόγο R A υπολογίστηκαν για όλα τα πρωτόκολλα μικρότερες του 1%. Αξίζει να σημειωθεί ότι σε εκχύλιση δείγματος που πραγματοποιήθηκε μόνο με SPE και προσροφητικό υλικό το C18 ο λόγος T/E προσδιορίστηκε περίπου με τιμή T/E~1,5 ενώ ο λόγος R A ίσος με 25%, αποτελέσματα σύμφωνα με αυτά που έχουν ήδη αναφερθεί σε προηγούμενα εδάφια λόγω της ανεπαρκούς παραγωγοποίησης. Από τη μελέτη του Πίνακα 6.15 προέκυψε ότι με τις πορείες 47 και 51 δεν ανιχνεύθηκαν οι ουσίες Ecgonine Me-ester, ethylamphetamine, methylamphetamine, phenilephrine και methadone, pentazocine αντίστοιχα. Επιπλέον με το πρωτόκολλο 51 παρατηρήθηκε πολύ έντονη συνεισφορά από το matrix κυρίως για τα πρώτα 2 min με αποτέλεσμα να δυσχαιρένεται ή να μην πραγματοποιείται η ανίχνευση αναλυτών που εκλούονται στην αρχή του χρωματογραφήματος, όπως οι methylamphetamine, nor fenfluramine. Η ανίχνευση των ουσιών αυτών επιτυγχάνεται με τους αντίστοιχους παραγωποιημένους αναλύτες που εμφανίζονται αργότερα στο χρωματογράφημα και δεν παρεμποδίζονται από την παρουσία του υποβάθρου. Συνοψίζοντας, από τη μελέτη των Πινάκων προέκυψε ότι οι προτεινόμενες πορείες 44-46, 48, 50, 52 μπορούν να εφαρμοστούν ως μέθοδοι εκχύλισης σε μεθόδους σαρώσεως για την ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών. Οι ανακτήσεις των προσδιοριζομένων ουσιών όπως επίσης και η απομάκρυνση των ενώσεως της μήτρας εμφάνισαν διαφορές από πρωτόκολλο σε πρωτόκολλο όπως αναμενόταν, λόγω διαφορετικών ιδιοτήτων των προσροφητικών υλικών. Είναι ιδιαίτερα σημαντικό να επισημανθεί ότι με τις παραπάνω προτεινόμενες μεθόδους κατέστη δυνατή η ανίχνευση των απαγορευμένων ουσιών, σε δείγματα ούρων και σε συγκέντρωση ίση με το MRPL. Με τα πρωτόκολλα που περιελάμβαναν συνδυασμό SPE-LLE είναι δυνατή η μείωση του υποβάθρου και αποτελεσματικότερη ανίχνευση των "προβληματικών" ουσιών, παράλληλα όμως σε κάποιες περιπτώσεις εμφανίστηκαν μειωμένες ανακτήσεις εξαιτίας του διπλού εφαρμοζόμενου σταδίου. Το γεγονός αυτό

217 ΚΕΦ. 6 Ανάπτυξη ενιαίας μεθόδου εκχύλισης απαγορευμένων ουσιών σε ούρα αθλητών είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τη μελέτη ουσιών που ανιχνεύονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις όπως τα αναβολικά στεροειδή, ενώ φαίνεται να ευνοεί την ανίχνευση των διεγερτικών-ναρκωτικών που ανιχνεύονται στα ούρα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις. Επιπλέον η εφαρμογή LLE έναντι του συνδυασμού LLE-SPE για το σύνολο των εξεταζομένων ουσιών οδηγεί σε εξοικονόμηση χρόνου που είναι ιδιαίτερα σημαντική σε μεθόδους σάρωσης. Από τις εφαρμοζόμενες LLE οι δυο προτεινόμενες είναι με α) χρήση του μίγματος DE/EA/CH2Cl2 4/3/3,5 και β) με DE. Ο πιο πολικός διαλύτης α οδηγεί σε υψηλότερες ανακτήσεις σε σχέση με τον β κυρίως για τις πολικές εξεταζόμενες ουσίες, ενώ παράλληλα έχει σαν αποτέλεσμα μεγαλύτερη επίδραση από το υπόστρωμα παρεμποδίζοντας την ανίχνευση ουσιών που εκλούονται στην αρχή του χρωματογραφήματος. Εκχύλιση των εξεταζομένων ουσιών με LLE και διαλύτη διαιθυλαιθέρα, ο οποίος έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την εκχύλιση των αναβολικών στεροειδών 30, προέκυψε ως αποτέλεσμα της μελέτης του σταδίου αυτού

218

219 ΚΕΦ. 7 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS Κεφάλαιο Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS

220 ΚΕΦ. 7 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΠΑΓΟΡΕΥΜΕΝΩΝ ΟΥΣΙΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ GC/TOFMS 7.1 Εισαγωγή Στα πλαίσια της ανάπτυξης ενιαίας μεθόδου σαρώσεως πραγματοποιήθηκε ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική της αεριοχρωματογραφίας-φασματομετρίας μαζών χρόνου πτήσης ιόντων (GC/TOFMS). Μετά την επιλογή/βελτιστοποίηση των παραμέτρων του φασματομέτρου μαζών αναλύθηκαν πρότυπα διαλύματα ελέγχου τα οποία περιλαμβάνουν ένα μεγάλο αριθμό απαγορευμένων ουσιών, με σκοπό την εύρεση των χρόνων ανάσχεσης, καθώς και των κύριων διαγνωστικών ιόντων των μελετούμενων ουσιών. Για ουσίες που δεν είναι διαθέσιμες σε πρότυπα διαλύματα αναλύθηκαν "μεταβολικά δείγματα" με στόχο την ταυτοποίηση αυτών. Με κατάλληλο σχεδιαστικό πρόγραμμα απεικονίστηκαν οι μελετούμενοι αναλύτες και σχεδιάστηκαν οι πιθανές θραύσεις για την εύρεση τουλάχιστον τριών διαγνωστικών ιόντων ανά ουσία. Κατόπιν προσαρμόστηκαν μακροεντολές (macro) στο λογισμικό του οργάνου με σκοπό την αυτοματοποίηση της επεξεργασίας των αποτελεσμάτων. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν 2 "macro" εκτύπωσης, ένα για την ομάδα των διεγερτικών-ναρκωτικών ουσιών και ένα για την ομάδα των αναβολικών ουσιών. Για την ομάδα των διεγερτικών ναρκωτικών ουσιών δημιουργήθηκε βιβλιοθήκη φασμάτων τριμεθυλοσιλυλο παραγώγων κατόπιν εφαρμογής της ενιαίας μεθόδου παραγωγοποίησης που περιγράφηκε λεπτομερώς στο Κεφάλαιο 5. Η βιβλιοθήκη αυτή περιλαμβάνει όλες τις μελετούμενες ουσίες, το φάσμα μαζών, όπως αυτό προέκυψε μετά την ανάλυση με GC/TOFMS, καθώς και τα κύρια διαγνωστικά ιόντα ανά ουσία. Στη συνέχεια δείγματα ούρων αθλητών εμβολιασμένα με τις απαγορευμένες ουσίες σε συγκέντρωση ίση με το MRPL αναλύθηκαν με την ενιαία μέθοδο σάρωσης, η οποία περιλαμβάνει κοινή παρασκευαστική πορεία και ενιαίο στάδιο αναλυτικής μέτρησης. Η κοινή παρασκευαστική πορεία αποτελείται από κοινό στάδιο υδρόλυσης, εκχύλισης και παραγωγοποίησης, όπως αυτά προέκυψαν στα Κεφάλαια 5 και 6. Τα δείγματα αναλύθηκαν με GC/TOFMS με κοινή χρωματογραφική μέθοδο για το σύνολο των ουσιών

221 ΚΕΦ. 7 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS 7.2 Διαλύματα, αντιδραστήρια, εξοπλισμός Διαλύματα υλικά αναφοράς-πολυσυστατικά διαλύματα Βλ υποκεφάλαιο Αντιδραστήρια Βλ εδάφιο Γυάλινα σκεύη και αναλώσιμα Βλ εδάφιο Εργαστηριακές Συσκευές Βλ εδάφιο Αναλυτικός εξοπλισμός Αεριοχρωματογράφος GC HP6890, με αυτόματο δειγματολήπτη ΗP7683 και αναλυτή φασματόμετρο μαζών χρόνου πτήσης ιόντων της Waters Micromass με λογισμικό Masslynx v4.0. Το συγκεκριμένο φασματόμετρο μαζών ανιχνεύει μάζες με τη μέθοδο της πλήρους σάρωσης ιόντων (full scan) στην περιοχή amu με τη μέθοδο ιοντισμού δέσμης ηλεκτρονίων (EI) και ικανότητα διαχωρισμού 7000 (FWHM). Τριχοειδής στήλη HP Ultra1, 17 m x 0,20 mm i.d. x 0,11 μm (ULTRA1-11). 7.3 Αναλυτικές παράμετροι-χρωματογραφική μέθοδος ανάλυσης Η ανάλυση, τόσο των πρότυπων διαλυμάτων, όσο και των δειγμάτων ούρων πραγματοποιήθηκε με την αναλυτική μέθοδο της οποίας τα χαρακτηριστικά συνοψίζονται στον Πίνακα

222 ΚΕΦ. 7 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS Πίνακας 7.1: Αναλυτικές παράμετροι ενιαίας GC/TOFMS μεθόδου ανάλυσης απαγορευμένων ουσιών Αναλυτική στήλη HP Ultra 1 17m x 0,200 mm x 0,11μm Όγκος εισαγωγής δείγματος 1 μl Κινητή φάση Ήλιον (He), ροή 0,9 ml min -1 Split 1: 15 Θερμοκρασία εισαγωγής δείγματος Θερμοκρασιακό πρόγραμμα Συνολικός χρόνος ανάλυσης C 70 0 C για 0 min, 90 0 C/min μέχρι C παραμονή για 5 min, 30 0 C/min μέχρι C για 0 min, 3 0 C/min μέχρι C για 0 min και 40 0 C/min μέχρι C παραμονή για 8 min. 35,3 min Εύρος μαζών (mass range) m/z Χρόνος σάρωσης 0,24 Χρόνος μεταξύ δυο σαρώσεων 0,01 Τεχνική ιονισμού δέσμης ηλεκτρονίων Χρόνος έναρξης λήψης φασματομετρικών δεδομένων (solvent delay) 70 ev 2 min 7.4 Πειραματικό πρωτόκολλο ανάλυσης ουσιών με GC/TOFMS Προετοιμασία πειραμάτων Ι. Βιολογικά δείγματα Ως βιολογικό υλικό για την πραγματοποίηση των πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν ούρα εθελοντών, αρνητικά για απαγορευμένες ουσίες όπως προέκυψε μετά την ανάλυση αυτών με τις διαδικασίες σάρωσης. Tα δείγματα αυτά αναφέρονται ως "blank" (λευκά). II. Επιλογή/βελτιστοποίηση των παραμέτρων του φασματομέτρου μαζών Η προετοιμασία του οργάνου για την ανάλυση των δειγμάτων περιλαμβάνει: α) βελτιστοποίηση των διαφόρων παραμέτρων (tuning) με σκοπό το βέλτιστο διαχωρισμό (resolution) και τη μέγιστη ευαισθησία, και β) έλεγχο της ακρίβειας μέτρησης των μαζών (calibration). Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιείται με βάση την ουσία heptacosa σύμφωνα με τις προδιαγραφές του οργάνου 190 και τις υποδείξεις προσωπικού της Waters, καθημερινά πριν την έναρξη της ανάλυσης

223 ΚΕΦ. 7 Ανίχνευση απαγορευμένων ουσιών με την τεχνική GC/TOFMS Κατά τη διάρκεια της βελτιστοποίησης η πρότυπη ουσία heptacosa εισάγεται απευθείας στην πηγή ιοντισμού με κατάλληλη σύριγγα και κατόπιν οι παράμετροι του φασματόμετρου μαζών χρόνου πτήσης ρυθμίζονται έτσι, ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη ευαισθησία για τη μάζα 219 ( ) της ουσίας heptacosa. Συγχρόνως οι μάζες 18 και 28 που αντιστοιχούν στην υγρασία και τον αέρα, πρέπει να διατηρηθούν σε όσο το δυνατό χαμηλότερα επίπεδα (Σχήμα 7.1). Σχήμα 7.1: Παράθυρο tuning και παρακολούθηση των μαζών 28 και 219 Ρυθμίζονται επίσης οι παράμετροι του φασματομέτρου ώστε το ληφθέν φάσμα για την ουσία heptacosa να είναι ανάλογο του φάσματος αναφοράς (Σχήμα 7.2). Σχήμα 7.2: Πρότυπο φάσμα αναφοράς της ουσίας heptacosa