Μεταπτυχιακή Εργασία. «Μακρολίδια και ριβόσωμα: φυσικά εμπόδια ή αλλοστερικοί τροποποιητές;» Πλέσσα Ελένη Χημικός

Transcript

1 ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ» Μεταπτυχιακή Εργασία «Μακρολίδια και ριβόσωμα: φυσικά εμπόδια ή αλλοστερικοί τροποποιητές;» Πλέσσα Ελένη Χημικός Πάτρα, 2017

2 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Γεώργιος Ντίνος Αναπληρωτής Καθηγητής τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών (επιβλέπων) Δημήτριος Καλπαξής Καθηγητής τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωνσταντίνος Σταθόπουλος Καθηγητής τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο τμήμα Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στο εργαστήριο βιολογικής χημείας, υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή κ. Γεωργίου Ντίνου. Πρώτα απ όλα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Ντίνο για την άψογη συνεργασία που είχαμε σε όλη τη διάρκεια της διπλωματικής μου αλλά και για την καθοδήγηση και βοήθειά του. Κατά την διάρκεια της συνεργασίας μας, έμαθα πολλά πράγματα για την επιστήμη, τα οποία θα με συντροφεύουν καθ όλη τη διάρκεια της ακαδημαϊκής μου πορείας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους καθηγητές κ. Καλπαξή και κ. Σταθόπουλο για την συμμετοχή τους στην τριμελή επιτροπή και για τις συμβουλές και γνώσεις που μου προσέφεραν, καθώς επίσης και τους υπόλοιπους καθηγητές του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας για την αρμονική συνεργασία και τις χρήσιμες συμβουλές που μου έδωσαν. Επιπλέον, ένα μεγάλο ευχαριστώ στον Dr. Polikanov για την συνεισφορά του στην παρούσα εργασία, με την διαξαγωγή των κρυσταλλογραφικών μελετών και την επιμέλεια των νέων κρυσταλλογραφικών εικόνων που παρουσιάζονται. Ευχαριστώ επίσης, τα μέλη του εργαστηρίου του κ. Ντίνου και όλους τους προπτυχιακούς, μεταπτυχιακούς φοιτητές και υποψήφιους διδάκτορες του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας, για το άριστο κλίμα συνεργασίας καθ όλη τη διάρκεια που βρέθηκα εκεί. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα, τους μεταπτυχιακούς φοιτητές Παναγιώτα Γιανοπούλου και Γιάννη Βλαχογιάννη και την υποψήφια διδάκτορα Γεωργία Κουρνούτου για την συνεργασία και την φιλία τους και τους εύχομαι καλή συνέχεια στην ακαδημαϊκή τους πορεία. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καλούς μου φίλους για την στήριξή τους σε όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Τέλος, τις θερμότερες ευχαριστίες μου στην οικογένειά μου, που είναι πάντοτε δίπλα μου σε όλα μου τα βήματα. 3

4 Περιεχόμενα Περίληψη... 6 Abstract... 7 Εισαγωγή Δομή προκαρυωτικού Ριβοσώματος S Υπομονάδα S Υπομονάδα Λειτουργικές περιοχές ριβοσώματος Κέντρο αποκωδικοποίησης Κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης Τούνελ εξόδου Πρωτεϊνοσύνθεση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Έναρξη Επιμήκυνση Τερματισμός Ανακύκλωση Αντιβιοτικά Αντιβιοτικά που δρουν στο ριβόσωμα Αναστολείς της Α-θέσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Μακρολίδια Συναγωνισμός Χλωραμφενικόλης και Ερυθρομυκίνης Σκοπός της διπλωματικής εργασίας Υλικά Μέθοδοι Απομόνωση ριβοσωμάτων Καλλιέργειες κυττάρων Escherichia coli, στελέχους Κ

5 4.1.2 Παρασκευή κλάσματος S Παραλαβή κλάσματος S Παραλαβή κλάσματος FWR Παραλαβή πλυμένων ριβοσωμάτων Παρασκευή Ac[ 3 Η]Phe- trna E. coli Παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna Απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna Ακετυλίωση του [ 3 Η]Phe- trna Συναγωνιστική πρόσδεση ραδιενεργών αντιβιοτικών στο ριβόσωμα παρουσία μη ραδιενεργών Σχηματισμός εναρκτήριου συμπλόκου Αντίδραση πουρομυκίνης Αποτελέσματα Συναγωνισμός πρόσδεσης στο ριβόσωμα παρουσία ραδιενεργού προσδέτη Συναγωνιστικός έλεγχος με την αντίδραση πουρομυκίνης Συναγωνισμός Ερυθρομυκίνης με Χλωραμφενικόλη Συναγωνισμός χλωραμφενικόλης με μακρολίδια που δε φέρουν το σάκχαρο της κλαδινόζης Μελέτη του συναγωνισμού της ερυθρομυκίνης με αναστολείς της Α-θέσης Συναγωνισμός ερυθρομυκίνης με λινεζολίδη Κρυσταλλογραφικά δεδομένα Συζήτηση Βιβλιογραφία

6 Περίληψη Η λεπτομερής μελέτη του τούνελ εξόδου των πεπτιδικών αλυσίδων στο ριβόσωμα, έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην συσσώρευση πολλών δεδομένων, τα οποία δίνουν μια σαφή εικόνα της λειτουργικής σπουδαιότητας της περιοχής αυτής του ριβοσώματος. Οι μελέτες αυτές, έχουν συμβάλει καθοριστικά στη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης των μακρολιδίων, μιας μεγάλης κατηγορίας αντιβιοτικών με ευρεία θεραπευτική εφαρμογή, τα οποία προσδένονται στην είσοδο του τούνελ. Παρόλο που σήμερα, με τη βοήθεια και της κρυσταλλογραφίας, γνωρίζουμε επακριβώς τη θέση πρόσδεσης των περισσότερων μακρολιδίων αλλά και την αλληλεπιδρασή τους με άλλα αντιβιοτικά του κέντρου της πεπτιδυλοτρασφεράσης, υπάρχει αδυναμία εξήγησης ή κατανόησης της αλληλεπίδρασης ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης. Το ένα αντιβιοτικό παρεμποδίζει την πρόσδεση του άλλου κι ενώ οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις της ερυθρομυκίνης εκτοπίζουν την προσδεδεμένη στα ριβοσώματα χλωραμφενικόλη με σαφή συναγωνιστικό τρόπο, η χλωραμφενικόλη δεν είναι σε θέση να εκτοπίσει την δεσμευμένη ερυθρομυκίνη, ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις. Τα διαθέσιμα μέχρι σήμερα κρυσταλλογραφικά δεδομένα υψηλής ανάλυσης από τα ριβοσωματικά σύμπλοκα με τα αντιβιοτικά, υποστηρίζουν την ευρέως αποδεκτή άποψη ότι υπάρχουν δυο ανεξάρτητες θέσεις δέσμευσης, η μία στην θέση Α του κέντρου πεπτιδυλοτρανσφεράσης για τη χλωραμφενικόλη, και η άλλη κοντά στην είσοδο του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος, για την ερυθρομυκίνη. Σύμφωνα με τα παραπάνω δεδομένα, δεν υπάρχει αλληλεπικαλυπτόμενη περιοχή στις θέσεις δέσμευσης, επομένως δεν υπάρχει τρόπος να εξηγηθεί η αδυναμία ταυτόχρονης πρόσδεσης και των δυο αντιβιοτικών. Σε αυτή την εργασία, με βάση λειτουργικές μελέτες και νέα κρυσταλλογραφικά δεδομένα, προσπαθήσαμε να ρίξουμε φως στην παραπάνω αλληλεπίδραση ερυθρομυκίνης/χλωραμφαινικόλης. Σύμφωνα με τα νέα δεδομένα της κρυσταλλογραφικής ανάλυσης και σε αντίθεση με τα προηγούμενα, υπάρχει στερεοχημική παρεμπόδιση μεταξύ των δύο δεσμευμένων αντιβιοτικών, που εξηγεί γιατί δεν μπορούν να βρίσκονται ταυτόχρονα προσδεδεμένα στο ίδιο ριβόσωμα. Επιπλέον, οι λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι η διαθέσιμη συγκέντρωση της ελεύθερης χλωραμφενικόλης, όταν η ερυθρομυκίνη είναι ήδη προσδεδεμένη στο ριβόσωμα, μειώνεται δραματικά, λόγω παρεμπόδισης της διέλευσης του τούνελ εξόδου από την ερυθρομυκίνη. Συνεπώς, η ερυθρομυκίνη εκτός από αλλοστερικός τροποποιητής, δρα και ως φυσικό εμπόδιο της ελεύθερης διέλευσης του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος. 6

7 Abstract The detailed studies of the nascent peptide exit tunnel of the ribosome in recent years, have led to the accumulation of many data, that give a clear picture of the functional significance of this ribosomal area. These studies have greatly contributed to investigating the mechanism of macrolides action, a large class of broad spectrum therapeutic antibiotics, which bind to the entrance of the tunnel. Although today, thanks to crystallographic data, not only we know the precise binding site of most macrolides, but also their interaction with other antibiotics at the peptidyltransferase center, there is an inability to explain or understand the interaction between erythromycin and chloramphenicol. One antibiotic inhibits the binding of the other and while increasing concentrations of erythromycin displace chloramphenicol bound on the ribosomes in a clear competitive manner, chloramphenicol is unable to displace bound erythromycin, even at high concentrations. The up-to-date crystallographic data of high resolution, from ribosomal complexes with antibiotics, support the widely accepted view that there are two independent binding sites; one at the A-site of peptidyl transferase for chloramphenicol and the other near the entrance of the exi tunnel, for erythromycin. According to the aforementioned data, there is no overlapping area at the binding sites of these antibiotics, therefore we are unable to explain why they cannot be bound simultaneously on the same ribosome. In this work, based on functional studies and new crystallographic data, we tried to shed light on the above case of erythromycin / chloramphenicol competition. According to the new data of crystallographic analysis and unlike the previous ones, there is a steric hindrance between the two bound antibiotics, which explains why they cannot be simultaneously bound to the same ribosome. In addition, functional studies reveal that the available concentration of free chloramphenicol, when erythromycin is already bound to the ribosome, is dramatically reduced due to obstruction of the exit tunnel passage. Consequently, erythromycin, apart from an allosteric modifier, also acts as a natural obstacle of the ribosomal exit tunnel. 7

8 Εισαγωγή 8

9 1. Δομή προκαρυωτικού Ριβοσώματος Η πρωτεϊνοσύνθεση είναι μια πολύπλοκη και εξαιρετικά σημαντική διαδικασία που εκτελείται από όλους τους ζωντανούς οργανισμούς. Η διαδικασία αυτή γίνεται στο ριβόσωμα, το οποίο είναι ένα υποκυτταρικό ριβονουκλεοπρωτεϊνικό οργανίδιο, που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά από τον George Palade το 1950 σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Palade 1950). Τα ριβοσώματα αποτελούνται από ριβονουκλεϊκό οξύ rrna και πρωτεΐνες. Το rrna παίζει τον κύριο καταλυτικό του ρόλο και αποτελεί τα 2/3 της συνολικής μάζας, ενώ οι πρωτεΐνες διατηρούν την τρισδιάστατη δομή του. Η δομή του ριβοσώματος είναι εξαιρετικά συντηρημένη σε ότι αφορά τα βασικά χαρακτηριστικά του, ωστόσο υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ του ευκαρυωτικού και προκαρυωτικού ριβοσώματος (Melnikov et al., 2012). Το προκαρυωτικό ριβόσωμα λόγω του συντελεστή καθίζησης του μετά από φυγοκέντρηση χαρακτηρίζεται ως 70S και αποτελείται από μια μικρή 30S και μια μεγάλη 50S υπομονάδα με μοριακό βάρος 800,000 και 1,500,000 Da αντίστοιχα. Η 30S υπομονάδα αποτελείται από 22 διαφορετικές πρωτεΐνες και μια αλληλουχία ριβοσωμικού RNA, το 16S, που περιέχει περίπου 1600 νουκλεοτίδια. Η υπομονάδα 50S αποτελείται από περίπου 33 διαφορετικές πρωτεΐνες, μια 23S αλληλουχία rrna με περίπου 2900 νουκλεοτίδια, και μια αλληλουχία 5S rrna με περίπου 120 νουκλεοτίδια (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Το ριβόσωμα έχει τρεις θέσεις σύνδεσης για το trna, την Α (αμινοακυλο) θέση, την Ρ (πεπτιδυλο) θέση και την θέση Ε (έξοδος), που σχηματίζονται στην επιφάνεια σύνδεσης των δυο υπομονάδων (Εικόνα 1). Στην Α θέση προσδένεται το αμινοακυλο-trna που φέρει το συμπληρωματικό αντικωδικόνιο για το κωδικόνιο του mrna που παρουσιάζεται στην θέση αυτή. Το πεπτίδυλο-trna στη θέση P, βρίσκεται μετά τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού και την μετατόπιση και στην θέση Ε βρίσκεται το απακυλιωμένο trna το οποίο απομακρύνεται από το ριβόσωμα με σκοπό να επαναακυλιωθεί για ένα νέο κύκλο συμμετοχής του. Το mrna συνδέεται γύρω από τον αυχένα της υπομονάδας 30S, μέσω της οποίας μπορεί να κινείται σταδιακά, ένα κωδικόνιο τη κάθε φορά, κατά την επιμήκυνση του νεοσυντιθέμενου πεπτιδίου (Ramakrishnan, 2002; Yonath, 2009). 9

10 Εικόνα 1:Το ριβόσωμα 70S με το mrna (μαύρο) και τις θέσεις πρόσδεσης του trna, Α (μωβ) P (πράσινο) και Ε (κίτρινο) (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) S Υπομονάδα Η μεγάλη υπομονάδα, 50S, περιλαμβάνει την πεπτιδυλοτρανσφεράση (PTC) -το ενεργό κέντρο του ριβοσώματος που καταλύει τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού- το κέντρο υδρόλυσης του GTP και θέσεις πρόσδεσης για παράγοντες που βοηθούν στην έναρξη, την επιμήκυνση και τις φάσεις τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Απαρτίζεται από δύο μόρια rrna τα 23S και 5S και από 33 πρωτεΐνες. Η δομή της είναι ημισφαιρική με διάμετρο περίπου 250 Å και παρουσιάζει μία συμπαγή, κεντρική δομή, το σώμα, με 3 προεξοχές (Εικόνα 2). Η κεντρική προεξοχή αποτελείται από το 5S rrna, μέρος του 23S rrna και τις πρωτεΐνες L5, L18, L25 και L33, η αριστερή προεξοχή αποτελείται από rrna και την πρωτεΐνη L1, ενώ η δεξιά προεξοχή αποτελείται από τις πρωτεΐνες L7/L12 (Ban, 2000; Schmeing and Ramakrishnan, 2009). 10

11 Εικόνα 2: Δομή της ριβοσωματικής υπομονάδας 50S του προκαρυωτικού ριβοσώματος με τις 3 προεξοχές αριστερή, κεντρική, δεξιά (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) S Υπομονάδα H μικρή ριβοσωματική υπομονάδα αποτελείται από το 16S rrna και 22 πρωτεΐνες. Σύμφωνα με κρυσταλλογραφικές μελέτες η μικρή υπομονάδα μοιάζει με σώμα που έχει κεφάλι, λαιμό και σώμα. Το σώμα έχει έναν ώμο, μια πλατφόρμα και ένα πόδι με ένα δάκτυλο (ή αλλιώς σπυρούνι), ενώ το κεφάλι έχει μια μύτη με μια επιπλέον προεξοχή, το ράμφος (Εικόνα 3). Τρεις μακριές έλικες (διαμήκεις) οι H44, H7 και H16 / H17 βρίσκονται παράλληλα στον μακρύ άξονα της υπομονάδας που εφάπτεται με την υπομονάδα 50S. Η κεφαλή συνδέεται με το σώμα μέσω μίας έλικας RNA, την H28, ενώ το άνω μέρος του ώμου (H16 / H18) και το κάτω μέρος της μύτης (H33 / H34) σχηματίζουν μια μη ομοιοπολική σύνδεση σώματοςκεφαλής. Η δομή αυτή περιβάλλει την είσοδο σχηματίζοντας ένα καμπύλο δίαυλο, που είναι ο αγωγός για την αλυσίδα mrna (Schluenzen et al 2000). Οι πρωτεΐνες της 30S υπομονάδας έχουν κυρίως συνδετικό ρόλο σε αντίθεση με το rrna που βρίσκεται σε όλες τις λειτουργικές περιοχές. Εκτός από το μονοπάτι πρόσδεσης του mrna, η μικρή υπομονάδα περιέχει και το κέντρο αποκωδικοποίησης καθώς και τα περισσότερα από τα στοιχεία που ελέγχουν την πιστότητα της μετάφρασης. Το κέντρο αποκωδικοποίησης που βρίσκεται στο πάνω μέρος του σώματος και στο κάτω μέρος του κεφαλιού, οργανώνει τη μετακίνηση των mrna και trna και ελέγχει την πιστότητα στις αλληλεπιδράσεις κωδικόνιου-αντικωδικονίου (Green and Noller, 1997). 11

12 Εικόνα 3: Απεικόνιση της 30S ριβοσωματικής υπομονάδας με τα επιμέρους δομικά της στοιχεία head: κεφαλή, beak: ράμφος, body: σώμα, spur: σπιρούνι, DC: κέντρο αποκωδικοποίησης. (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). 1.3 Λειτουργικές περιοχές ριβοσώματος Κέντρο αποκωδικοποίησης Ο συνδυασμός βάσεων μεταξύ του κωδικονίου του mrna και αντικωδικονίου του trna είναι το πιο σημαντικό βήμα για την επιλογή του σωστού trna που θα μεταφέρει το κατάλληλο αμινοξύ στην νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η επιλογή trna ξεκινάει από τον παράγοντα επιμήκυνσης Tu, ο οποίος μεταφέρει trna στην θέση Α και υδρολύει GTP κατά την δημιουργία αλληλεπιδράσεων κωδικονίου αντικωδικονίου στο κέντρο αποκωδικοποίησης. Στο κέντρο αυτό, το ριβόσωμα επανεξετάζει το trna και το απορρίπτει αν δεν ταιριάζει με το κωδικόνιο του mrna στη θέση Α (Ramakrishnan 2002, Demeshkina et al. 2012). Το κέντρο αποκωδικοποίησης βρίσκεται μεταξύ του άνω τμήματος του σώματος και του κάτω τμήματος της κεφαλής της 30S υπομονάδας (Εικόνα 3). Αποτελείται κυρίως από RNA και συγκεκριμένα από τις έλικες h44, h18 και h34. Η πρόσδεση του mrna και του συγγενικού trna στη θέση Α επάγει τον προσανατολισμό των βάσεων Α1492 και Α1493 εξωτερικά της έλικας 44 καθώς και αλλαγή στην διαμόρφωση της βάσης G530 από συν- σε αντι-. Στις νέες τους διαμορφώσεις, οι βάσεις Α1493 και Α1492 αλληλεπιδρούν με το πρώτο και το δεύτερο ζεύγος βάσης, αντίστοιχα, της έλικας κωδικονίου-αντικωδικού, ενώ η βάση G530 της έλικας 18 αλληλεπιδρά τόσο με τη δεύτερη θέση του αντικωδικονίου όσο και την τρίτη θέση του κωδικονίου. Με τον τρόπο αυτό, το ριβόσωμα είναι σε θέση να διακρίνει λάθη 12

13 στις αντιστοιχίσεις μεταξύ των δύο πρώτων ζευγών βάσεων της έλικας κωδικονίουαντικωδικονίου, ενώ το περιβάλλον της τρίτης θέσης (wobble) είναι κατάλληλο για την υποδοχή ζευγών βάσεων με μη κανονική γεωμετρία (Ogle et al., 2001) Κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης Το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος, που είναι υπεύθυνο για τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, βρίσκεται στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα, κάτω από την κεντρική προεξοχή και δημιουργείται με τη συμμετοχή πέντε ελίκων της περιοχής V του 23S rrna, των ελίκων 69 και 70 της περιοχής IV, και ενός μικρού τμήματος της περιοχής ΙΙ (Yusupov et al., 2001). Tο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC) καταλύει τις δύο κύριες χημικές αντιδράσεις στη σύνθεση των πρωτεϊνών: το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού και την απελευθέρωση του πεπτιδίου. Με τη διευκρίνιση των ατομικών δομών της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας, επιβεβαιώθηκε ότι το ριβόσωμα είναι ριβοένζυμο, καθώς το ενεργό του κέντρο αποτελείται αποκλειστικά από 23S RNA (Schulze and Nierhaus, 1982; Nissen, et al., 2000; Polacek and Mankin 2005; Moore and Steitz, 2005). Έχει βρεθεί ότι στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης δεν βρίσκονται πρωτεΐνες. Οι προεκτάσεις όμως των ριβοσωμικών πρωτεϊνών L2, L3, L4 και L15, L16 και L27, πλησιάζουν εγγύτατα και είναι απαραίτητες για την διαμόρφωση του (Ban 2000; Maguire et al 2005; Nissen et al., 2000; Selmer et al., 2006), γεγονός που είχε δημιουργήσει την πεποίθηση για άμεση ή έμμεση εμπλοκή των πρωτεϊνών στην καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος (Nissen et al., 2000; Selmer et al., 2006). 13

14 Εικόνα 4: Το ενεργό κέντρο της πεπτιδύλοτρανσφεράσης Α) με το rrna και τις πρωτεΐνες που προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο Β) χωρίς το rrna (Nissen et al., 2000) Τούνελ εξόδου Οι νεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται από το ριβόσωμα στο κυτταρόπλασμα μέσω του τούνελ εξόδου (Frank et al., 1995a). To τούνελ διασχίζει την υπομονάδα 50S από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης που βρίσκεται στο κέντρο της κεντρικής προεξοχής μέχρι τη βάση της υπομονάδας στην κυτταροπλασματική πλευρά της, δημιουργώντας ένα πόρο με μήκος περίπου 100 Å και πλάτος 10 έως 20 Å (Ban et al., 2000; Wilson et al., 2002). Το τοίχωμά του αποτελείται από νουκλεοτίδια των περιοχών I -V του 23S rrna και από προεκτεινόμενες ουρές των πρωτεϊνών L4, L22 και L23. Σε απόσταση περίπου 30 Å από το κέντρο πεπτιδυλτρανσφεράσης, υπάρχει έντονη στένωση του τούνελ, αφού στο σημείο αυτό, ένας βρόχος της πρωτεΐνης L22 πλησιάζει τον εκτεταμένο βρόγχο της L4 (Εικόνα 5). Στο άκρο του, το τούνελ εξόδου του ριβοσώματος διευρύνεται και το σημείο εκείνο αποτελείται από RNA κι ένα δακτύλιο τεσσάρων συντηρημένων ριβοσωμικών πρωτεϊνών τις L22, L23, L24 και L29. (Malhotra et al., 1998; Ban, 2000; Nissen et al., 2000; Schluenzen et al., 2000; Kosolapov et al., 2009). Σε ορισμένες πρώιμες δομικές περιγραφές του ριβοσώματος με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, το τούνελ φαίνεται να διακλαδίζεται καθώς πλησιάζει στην έξοδο, οδηγώντας τους ερευνητές στο συμπέρασμα ότι τα νεοσυντιθέμενα πεπτίδια μπορεί να βγαίνουν από το ριβόσωμα από εναλλακτικές διαδρομές (Frank et al., 1995a; Malhotra et al., 1998; Gabashvili et al., 2001), ερμηνεία που αναθεωρήθηκε από μεταγενέστερες μελέτες (Ban et al, 2000; Yusupov et al., 2001; Moore, 2002; Voss et al., 2006). 14

15 Εικόνα 5: To τούνελ του ριβοσώματος των βακτηρίων. Απεικονίζεται μια εγκάρσια τομή της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας όπου φαίνονται τα συστατικά του τούνελ. Πεπτιδυλο-tRNA (πορτοκαλί), RNA (γκρι) και ριβοσωματικές πρωτεΐνες (μπλε), εκτός από τις πρωτεΐνες L4 (κόκκινο), L22 (μπλε), L23 (κίτρινο), L29 (μωβ) και L24 (πράσινο) και L32 (σκούρο πράσινο) (Wilson and Beckman, 2011). Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι το τούνελ εξόδου δεν είναι απλά ένας αγωγός που οδηγεί στην έξοδο της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας, αλλά παίζει έναν πιο ενεργό ρόλο στα πρώιμα γεγονότα αναδίπλωσης των πρωτεϊνών καθώς και στη ρύθμιση της μετάφρασης (Kramer et al., 2009; Wilson and Beckmann, 2011; Ito and Chiba, 2013). H σύγκριση των δομών μεγάλων υπομονάδων από διάφορα βακτήρια και αρχαία δείχνουν ότι υπάρχει μόνο πολύ περιορισμένη ευκαμψία διαμόρφωσης εντός του ριβοσωματικού τούνελ και δεν παρέχουν στοιχεία για διαρθρωτικές αναδιατάξεις μεγάλης κλίμακας, ώστε να επιτραπεί τριτοταγής αναδίπλωση του πολυπεπτιδίου εντός του τούνελ (Seidelt et al, 2009; Becker et al, 2009; Matheisl et al., 2015). Η διέλευση συγκεκριμένων πολυπεπτιδικών αλυσίδων διαμέσου του τούνελ εξόδου, μπορεί να οδηγήσει σε πρόωρη παύση της μετάφρασης (stalling), ένα γεγονός που χρησιμοποιείται από το κύτταρο για να ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση (Εικόνα 6) (Ito et al, 2010). Σε ορισμένες περιπτώσεις, η πρόωρη παύση απαιτεί την παρουσία ενός επιπλέον μορίου τελεστή, όπως ένα αντιβιοτικό. Ένα τέτοιο παράδειγμα βρίσκεται στο βακτηριακό οπερόνιο ermc, όπου παρουσία του μακρολιδίου ερυθρομυκίνης προάγεται η πρώιμη παύση κατά τη διάρκεια της μετάφρασης του πεπτιδίου οδηγού, ermcl (Ramu et al., 2009; Wilson et al., 2016). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι παρουσία ερυθρομυκίνης, η μετάφραση του πεπτιδίου οδηγού ermcl σταματά πρόωρα στο ένατο κωδικόνιο (Ile9), με το πεπτιδύλο trna Ile να βρίσκεται στην θέση Ρ (Ramu et al., 2009; Vazquez-Laslop et al., 2008). Οι μεταλλάξεις που καταργούν την παύση της μετάφρασης βρίσκονται στην αλληλουχία 6FVI9 του ErmCL, ενώ η παύση πραγματοποιείται ανεξάρτητα από την ταυτότητα του δέκατου 15

16 αμινοξέος στην θέση A της πεπτιδυλοτρανσφερασης. Επιπροσθέτως, μετάλλαξη των 23S rrna νουκλεοτιδίων Α2062 ή Α2503 του ριβοσωματικού τούνελ εξόδου καθώς και απουσία του σακχάρου κλαδινόζης της ερυθρομυκίνης που βρίσκεται προσδεδμένη στο τούνελ, καταργεί την παύση της μετάφρασης (Ramu et al., 2011). Τα δεδομένα αυτά, αποκαλύπτουν ένα περίπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ του πεπτιδίου ErmCL, του σακχάρου της κλαδινόζης της ερυθρομυκίνης και των συστατικών της ριβοσωματικής σήραγγας, που μεταδίδουν ένα σήμα πίσω στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, για να αποτραπεί ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των αμινοξέων Ile9 (Ρ-θέση) και Ser10 (Α-θέση) (Εικόνα 6) (Wilson, 2011b). Εικόνα 6. Α) Απουσία ερυθρομυκίνης δεν γίνεται πρόωρη λήξη της πρωτεϊνοσύνθεσης και δεν μεταφράζεται το πεπτίδιο οδηγός ermc. Παρουσία ερυθρομυκίνης, γίνεται πρόωρη λήξη της μετάφρασης του οδηγού πεπτιδίου ErmCL, γεγονός που αλλάζει τη διαμόρφωση του mrna και εκθέτει τη θέση δέσμευσης ριβοσώματος (RBS) στα γονίδια που βρίσκονται μετά από αυτό, επιτρέποντας την έκφρασή του. Β) Σχηματική απεικόνιση του ριβοσώματος που παρουσία ερυθρομυκίνης έχει σταματήσει πρόωρα τη μετάφραση του πεπτιδίου ErmCL, με το ErmCL-tRNA Ile στη θέση Ρ (κίτρινο) και το δέκατο κωδικόνιο που κωδικοποιεί σερίνη Ser-tRNA Ser να βρίσκεται στην Α-θέση. Η αλληλεπίδραση μεταξύ της ερυθρομυκίνης (μπλε), του πεπτιδίου ErmCL και του ριβόσωματος μεταδίδει ένα σήμα (βέλος) προς τα πίσω για να αδρανοποιήσει το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC) (Wilson, 2011b). 1.4 Πρωτεϊνοσύνθεση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Η διαδικασία της μετάφρασης, τόσο στους ευκαρυωτικούς όσο και στους προκαρυωτικούς οργανισμούς, περιλαμβάνει ένα πολύπλοκο δίκτυο μορίων (Ramakrishnan, 2002). Πέραν του βασικού μηχανισμού που παρέχεται από τις ριβοσωματικές υπομονάδες, απαραίτητα μόρια είναι το mrna, οι διάφοροι μεταφραστικοί παράγοντες καθώς και τα αμινοάκυλο-trnas. Για την μελέτη της μετάφρασης έχουν εφαρμοστεί ολοένα και πιο εξελιγμένα βιοχημικά και γενετικά εργαλεία, ενώ η κινητική της προ-σταθερής (presteady 16

17 state) κατάστασης έχει επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση των βημάτων της (Rodnina et al., 1997). Η πρωτεϊνική σύνθεση θα μπορούσε να διακριθεί σε τρία στάδια: την έναρξη, την επιμήκυνση και τον τερματισμό/ ανακύκλωση (Εικόνα 7). Σε κάθε ένα από αυτά τα στάδια συμμετέχει συγκεκριμένη ομάδα μεταφραστικών παραγόντων οι οποίοι ρυθμίζουν τη διαδικασία (Wilson and Nierhaus, 2007). In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι τρεις εναρκτήριοι παράγοντες (IF1, IF2 και IF3), τρεις παράγοντες επιμήκυνσης (EF-G, EF-Tu και EF-Ts) και τρεις από τους τέσσερις παράγοντες τερματισμού (RF1 ή RF2, RF3 και RRF) είναι απαραίτητοι και επαρκείς για την πρωτεϊνική σύνθεση (Shimizu et al, 2001). Εικόνα 7: Στάδια της μετάφρασης στα βακτήρια (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) Έναρξη Στα βακτήρια, η σύνθεση της πρωτεΐνης, σύμφωνα με τις οδηγίες της αλληλουχίας του mrna, αρχίζει όταν το mrna συνδέεται με την ριβοσωματική 30S υπομονάδα, όπου η αλληλουχία οδηγός Shine Dalgarno (SD) έρχεται σε επαφή με την αλληλουχία anti-sd του 16S rrna της 30S υπομονάδας. Το γεγονός αυτό ακολουθείται από δέσμευση του εναρκτήριου trna, φορτωμένου με φορμυλιωμένη μεθειόνη, στη θέση Ρ σε ένα στάδιο αντίδρασης που επιταχύνεται πολύ από τους τρεις παράγοντες έναρξης IF1, IF2 και IF3, 17

18 οδηγώντας στο σχηματισμό του 30S εναρκτηρίου συμπλόκου (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Ο IF3 (initiation factor 3) είναι αυτός που διεκπεραιώνει τη σωστή πρόσδεση του mrna στην 30S ριβοσωματική υπομονάδα διακρίνοντας το σωστό κωδικόνιο έναρξης επάνω στο mrna, (Hussain et al., 2016) και διεγείρει την αλληλεπίδραση κωδικονίουαντικωδικονίου στην Ρ θέση (Myasnikov et al., 2009). Ο IF2 εμφανίζει δράση GTΡάσης και συμβάλλει στην πρόσδεση του εναρκτήριου trna, καθώς και στην σύζευξη της 50S υπομονάδας με το 30S εναρκτήριο σύμπλοκο. Η πρόσδεση του IF3 στην 30S υπομονάδα παρεμποδίζει τη δράση του IF2, γεγονός που συμβάλει στην ορθότητα και στη επίσπευση της έναρξης της μετάφρασης (Macdougall and Gonzalez, 2015). Ο IF1 προσδένεται στην Α θέση της 30S υπομονάδας και κατέχει ενεργοποιητικό ρόλο για τους παράγοντες IF2 και IF3, ενώ επιπλέον σταθεροποιεί την πρόσδεση του IF2 στο προεναρκτήριο 30S σύμπλοκο (Pavlov et al., 2008). Tο εναρκτήριο trna (trna-fmet) διαφοροποιείται από τα μόρια αμινοάκυλο-trna που συμμετέχουν στην επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας καθώς φέρει μία φορμυλιωμένη μεθειονίνη (fmet) και άλλες δομικές παραλλαγές. Το εναρκτήριο trna εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης με την Ρ θέση, στην οποία, αφού προσδεθεί, υφίσταται αλλαγές στη διαμόρφωση, απαραίτητες για τον σχηματισμό του 70S εναρκτήριου συμπλόκου (Mangroo et al., 1995). Το 70S εναρκτήριο σύμπλοκο προκύπτει μετά την πρόσδεση και της 50S υπομονάδας στο 30S εναρκτήριο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό πυροδοτεί την υδρόλυση ενός GTP από τον IF2 και την αποχώρηση όλων των παραγόντων έναρξης από το ριβόσωμα (Gualerzi and Pon, 2015). Επομένως, η Α θέση του ριβοσώματος βρίσκεται πλέον κενή και μπορεί να δεχτεί ένα αμινοάκυλο-trna, ώστε να ξεκινήσει η φάση της επιμήκυνσης. Η δέσμευση του συμπλόκου 30S-IF3 στο mrna, τον IF1, τον IF2 και το εναρκτήριο trna οδηγούν στο σύμπλοκο έναρξης 30S (30S-IC). Ο IF2 προωθεί την ένωση των δυο υπομονάδων για να σχηματίσει το σύμπλοκο έναρξης 70S (70S-IC), γεγονός που συνοδεύεται από την απελευθέρωση του IF3. Με την υδρόλυση GTP και την απελευθέρωση φωσφορικών από τον IF2 το trna-fmet μετακινείται στο κέντρο πεπτιδυλοντρασφεράσης, προετοιμάζοντας το ριβόσωμα για την επιμήκυνση (Grigoriadou et al., 2007). 18

19 1.4.2 Επιμήκυνση Ο κύκλος επιμήκυνσης αποτελείται από στάδια διαδοχικής προσθήκης αμινοξέων στην πολυπεπτιδική αλυσίδα. Στην αρχή του κάθε κύκλου, το ριβόσωμα έχει προσδεδεμένο στην θέση Ρ το πεπτιδυλο-trna με μια πολυπεπτιδική αλυσίδα και κενή τη θέση Α, αλλά κατειλημένη την Ε-θέση με το αποακυλιωμένο trna. Κατά τη διάρκεια της αποκωδικοποίησης, το επόμενο αμινοξύ παραδίδεται ως ένα τριμερές σύμπλοκο που αποτελείται από τον παράγοντα επιμήκυνσης Tu (EF-Tu), GTP και αμινοακυλο-trna. Η αποκωδικοποίηση ακολουθείται από το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, με αποτέλεσμα την επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας κατά ένα αμινοξύ. Η καταλυόμενη από EF-G μετατόπιση μετακινεί τα trnas και mrna σε σχέση με το ριβόσωμα (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Η αποκωδικοποίηση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως, εξασφαλίζει ότι το σωστό αμινοακυλο-trna, όπως υποδεικνύεται από το κωδικόνιο mrna, επιλέγεται στην θέση Α. Η δέσμευση του κατάλληλου τριμερούς συμπλόκου (aa-trna EF-Tu GTP) στη θέση Α του ριβοσώματος, αφού προηγηθεί η αναγνώριση, έχει ως αποτέλεσμα την υδρόλυση GTP από τον παράγοντα EF-Tu, την αποσύνδεση του παράγοντα από το ριβόσωμα και την μετακίνηση του αμινοακυλο άκρου (CCA) του trna της θέσης Α στο PTC, γεγονός που ονομάζεται διευθέτηση (Demeshkina et al., 2012). Κατά τη διαδικασία αυτή πραγματοποιείται ισχυρή δέσμευση του συμπλόκου στην Α θέση με ταυτόχρονη ενεργοποίηση του κέντρου GTPάσης, το οποίο επιδρά στο σύμπλοκο EF-Tu GTP (Rodnina et al., 2005). Η ενεργοποίηση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την υδρόλυση του GTP του συμπλόκου προς EF-Tu GDP και Pi (Voorhees et al., 2011). Με τον τρόπο αυτό, το αμινοακυλo άκρο CCA του aa-trna μπορεί να οδηγηθεί προς το PTC της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας με σκοπό το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού με το πεπτιδυλο-trna της Ρ θέσης (Schuette et al., 2009). Το κεντρικό γεγονός στη σύνθεση πρωτεϊνών είναι η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού, στην οποία η α-αμινομάδα του αμινοακυλο-trna προκαλεί πυρηνόφιλη προσβολή του εστερικού άνθρακα του πεπτιδυλο-trna για να σχηματίσει ένα νέο πεπτιδικό δεσμό. Με το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, η νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα μετατοπίζεται από το trna της Ρ θέσης σε αυτό της Α θέσης, επιμηκυμένη κατά ένα αμινοξύ ενώ παράλληλα το trna της Ρ θέσης αποακυλιώνεται (Εικόνα 8) (Pech and Nierhaus, 2008). 19

20 Εικόνα 8: Πυρηνόφιλη προσβολή του εστερικού δεσμού του νεοσυντιθέμενου πεπτιδίου της Ρ θέσης από το αμινοξύ του αα-trna στης Α θέσης, προκαλώντας μετατόπιση της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας από την Ρ στην Α θέση (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Στο επόμενο στάδιο, της μετατόπισης, το πεπτίδυλο-trna που βρίσκεται στη θέση Α μεταπίπτει από την κλασσική Α/Α στην Α/Ρ υβριδική διαμόρφωση, όπου ο άκρο του αντικωδικωνίου εντοπίζεται στην Α θέση της μικρής υπομονάδας, ενώ το άκρο δέκτης του αμινοξέος στην Ρ θέση της μεγάλης υπομονάδας (Zhou et al., 2014). Ταυτόχρονα, το αποακυλιωμένο-trna ενώ βρισκόταν στην Ρ/Ρ διαμόρφωση, μεταπίπτει και αυτό σε μία υβριδική διαμόρφωση, Ρ/Ε, με το άκρο του αντικωδικωνίου να αλληλεπιδρά με την Ρ θέση στη μικρή υπομονάδα και το άκρο που ήταν προσδεδεμένο το αμινοξύ να βρίσκεται στην Ε θέση της μεγάλης υπομονάδας (Agirrezabala and Frank, 2009). Οι μετατοπίσεις αυτές συνοδεύονται από μία στερεοδομική αλλαγή του ριβοσώματος, η οποία αφορά κυρίως περιστροφή μεταξύ των δύο υπομονάδων. Η 30S υπομονάδα περιστρέφεται σε σχέση με την 50S κατά ~8 ο (Guo and Noller, 2012). Στην συνέχεια, μία αντίστροφη περιστροφή της κεφαλής της μικρής υπομονάδας, ακολουθούμενη από αντίστροφη περιστροφή του σώματος της μικρής υπομονάδας, επαναφέρει το ριβόσωμα στη σωστή δομή του (Ratje et al., 2010). Η μετατόπιση του αποακυλιωμένου trna στην Ε θέση έχει ως αποτέλεσμα την έξοδο του από το ριβόσωμα. Στη φάση επιμήκυνσης, τα αμινοακυλο-trna εισέρχονται στη θέση Α σε σύμπλεγμα με τον παράγοντα επιμήκυνσης Tu (EF-Tu, μια GTPase) με μία προς τα εμπρός μετακίνηση του mrna στο πλαίσιο ανάγνωσής του, έτσι ώστε η θέση Α να γίνεται προσβάσιμη στο επόμενο κωδικόνιο προς ανάγνωση από ένα νέο αμινοακυλο-trna (Frank et al., 2007). Η επιμήκυνση επαναλαμβάνεται μέχρι να βρεθεί στη θέση Α μία τριπλέτα νουκλεοτιδίων που να αντιστοιχεί σε κωδικόνιο λήξης και να σημάνει τον τερματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης. 20

21 1.4.3 Τερματισμός Όταν στην Α θέση του ριβοσώματος βρεθεί ένα από τα κωδικόνια τερματισμού UGA, UAG και UAA η μετάφραση τερματίζεται καθώς δεν αντιστοιχούν σε κάποιο αμινοξύ. Τα κωδικόνια τερματισμού διαβάζονται αποκλειστικά από παράγοντες απελευθέρωσης τάξης-1 (release factors 1) RF1, που αναγνωρίζουν τα κωδικόνια UAA, UAG και ταξης- 2 RF2, που αναγνωρίζουν τα κωδικόνια UAA, UGA (Scolnick, et al., 1968; Dunkle and Cate, 2010). Οι παράγοντες αυτοί προκαλούν υδρόλυση του εστερικού δεσμού μεταξύ της ολοκληρωμένης πρωτεϊνικής αλυσίδας με το trna που συνδέεται με την Ρ θέση, οδηγώντας σε γρήγορη απελευθέρωση. Μετά την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το ριβόσωμα, ο παράγοντας απελευθέρωσης τάξης 3, RF3, που είναι μια GTPase, προσδένεται στο ριβόσωμα και προκαλεί την απελευθέρωση των RF1 και RF2, αλλά και του ιδίου. Οι παράγοντες απελευθέρωσης έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν και σε ένα σύστημα ελέγχου της πεπτιδυλοτρασφεράσης, οδηγώντας σε πρόωρο τερματισμό της πρωτεϊνοσύνθεσης σε περίπτωση λανθασμένης αναγνώρισης του κωδικονίου που θα οδηγούσε σε ενσωμάτωση λανθασμένου αμινοξέος (Petropoulos et al., 2014; Zaher and Green, 2009) Ανακύκλωση Μετά την απομάκρυνση της πεπτιδικής αλυσίδας και την υδρόλυση του GTP από τον RF3, ο παράγοντας διαχωρίζεται από το ριβόσωμα, αφήνοντας το mrna κι ένα αποακυλιωμένο trna στη θέση Ρ. Το ριβόσωμα πρέπει να ανακυκλωθεί στις υπομονάδες του για ένα νέο γύρο πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η διαδικασία αυτή εξοικονομεί πολλή ενέργεια στο κύτταρο, καθώς η σύνθεση και συναρμολόγηση του ριβοσώματος είναι μια ενεργοβόρος διαδικασία (Hirashima and Kaji, 1973). Στα βακτήρια, μια πρωτεΐνη που ονομάζεται παράγοντας ανακύκλωσης ριβοσωμάτων (RRF) σε συνεργασία με τους παράγοντες EF-G και IF3 διεξάγουν τη διαδικασία της ανακύκλωσης. Για τον μηχανισμό δράσης των παραγόντων αυτών έχουν προταθεί δυο μοντέλα. Α) Ο EF-G προκαλεί μία μετατόπιση του ριβοσώματος, εισάγοντας έτσι τον RRF στην Ρ θέση και απομακρύνοντας το απακυλιωμένο trna με αποτέλεσμα να προκαλείται μία αυθόρμητη αποδέσμευση των δύο υπομονάδων, ενώ ο IF-3 προσδένεται άμεσα με την 30S υπομονάδα, αποτρέποντας έτσι την επανασύνδεση τους (Macdougall and Gonzalez, 2015). Β) Η δράση του 21

22 EF-G και του RRF προκαλούν την απομάκρυνση της 50S υπομονάδας ενώ ο IF-3 προκαλεί απομάκρυνση του απακυλιωμένου trna της Ρ θέσης και του mrna (Prabhakar et al., 2017). 1.5 Αντιβιοτικά Τα αντιβιοτικά, που ονομάζονται επίσης και αντιβακτηριακά, είναι ένας τύπος αντιμικροβιακού φαρμάκου που χρησιμοποιείται στη θεραπεία και πρόληψη βακτηριακών λοιμώξεων και μπορούν είτε να σκοτώσουν είτε να εμποδίσουν την ανάπτυξη βακτηριδίων. Τα αντιβιοτικά, ανάλογα με τη δομή τους, στοχεύουν διαφορετικές ζωτικές διεργασίες του βακτηριακού κυττάρου (Lewis, 2013). Ανάλογα με τον στόχο δράσης τους, διακρίνονται σε πέντε κατηγορίες: α) αντιβιοτικά που παρεμποδίζουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος (όπως κεφαλοσπορίνες, πενικιλίνες, βανκομυκίνη, β-λακτάμες), β) που παρεμποδίζουν ή αναστέλλουν τη σύνθεση νουκλεϊκών οξέων στοχεύοντας τη DNA γυράση και τοποϊσομεράση (όπως φθοροκινολόνες, ριφαμπικίνες) γ) αντιβιοτικά που στοχεύουν τον μεταβολισμό του φολικού οξέως (π.χ. τριμεθοπρίμη, σουλφοναμίδες), δ) που παρεμποδίζουν ή αναστέλλουν την πρωτεϊνική σύνθεση (π.χ. τετρακυκλίνες, οξαζολιδινόνες, μακρολίδια, αμινογλυκοσίδες) και ε) αντιβιοτικά που αλλοιώνουν τη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης (π.χ. πολυμυξίνη Β, αμφοτερικίνη Β) (Εικόνα 9). Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της δράσης των αντιβιοτικών είναι ότι οι παραπάνω κυτταρικοί στόχοι διαφοροποιούνται σημαντικά στα ευκαρυωτικά κύτταρα, επιτρέποντας έτσι την χορήγηση τους σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς χωρίς την εμφάνιση σοβαρών τοξικών παρενεργειών (Wright, 2010). 22

23 Εικόνα 9: Οι στόχοι των αντιβιοτικών (αριστερά) και οι μηχανισμοί μικροβιακής ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (δεξιά), με ορισμένα αντιπροσωπευτικά αντιβιοτικά για κάθε κατηγορία (Wright, 2010). Η άνοδος και η εξάπλωση της αντίστασης στα αντιβιοτικά αποτελεί μια μοναδική πρόκληση τόσο για την επιστήμη όσο και για την ιατρική. Σήμερα, η κρίση αυτή συνοδεύεται και από την εξάπλωση οργανισμών ανθεκτικών σε πολλαπλά φάρμακα (Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Klebsiella spp., Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa και Enterobacter spp.) (Boucher et al., 2009). Στην περίπτωση μερικών Gram-αρνητικών βακτηρίων, όπως το A. baumannii, υπάρχουν στελέχη που είναι ανθεκτικά σε όλα τα διαθέσιμα ως σήμερα αντιβιοτικά (Higgins et al., 2009). Τα αντιβιοτικά καταργούν ή υπονομεύουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες και οι μηχανισμοί αντίστασης των βακτηρίων αξιοποιούν κάθε μηχανισμό με τον οποίο μπορεί να γίνει η εξουδετέρωση του φαρμάκου. Οι κύριοι τύποι αντίστασης στα αντιβιοτικά είναι: α) ταχύτατη απέκκριση του αντιβιοτικού μέσω ειδικών αντλιών στο κυτταρικό τοίχωμα, β) παράκαμψη του στόχου του αντιβιοτικού, γ) τροποποίηση του ενδοκυτταρικού στόχου του αντιβιοτικού και δ) απενεργοποίηση του αντιβιοτικού μέσω ενζυμικών αντιδράσεων (Εικόνα 9) (Wright, 2010). Η μεθοδολογία ανάπτυξης των πρώτων αντιβιοτικών στηρίχτηκε στην πλατφόρμα ανακάλυψης του Selman Waksman το 1940, ο οποίος πήρε στρεπτομύκητες από το έδαφος, που υποβλήθηκαν σε διαλογή για αντιμικροβιακή δράση έναντι ευαίσθητου μικροοργανισμού δοκιμής, ανιχνεύοντας ζώνες αναστολής της ανάπτυξης σε πλάκα επικάλυψης (Fischbach and 23

24 Walsh, 2009). Με τον τρόπο αυτό οι φαρμακευτικές εταιρίες ανέπτυξαν τις πρώτες τάξεις αντιβιοτικών για τα επόμενα 20 χρόνια. Στη συνέχεια όμως, η χρήση αυτής της πλατφόρμας σταμάτησε να δίνει νέες ενώσεις με αντιβακτηριαδιακή δράση, ενώ παράλληλα άρχισε να αναπτύσσεται ανθεκτικότητα στις υπάρχουσες, με αποτέλεσμα να υπάρχει ανάγκη για νέες ενώσεις. Για το λόγο αυτό, ξεκίνησε η εργαστηριακή τροποποίηση των ήδη υπαρχόντων αντιβιοτικών κι έτσι προέκυψαν, ύστερα από τροποποίηση των μητρικών μορίων, τα αντιβιοτικά δεύτερης γενιάς. Περαιτέρω τροποποιήσεις των μορίων αυτών οδήγησαν στην δημιουργία των αντιβιοτικών τρίτης έως και τέταρτης γενιάς, (Εικόνα 10) παρέχοντας μία προσωρινή λύση στο πρόβλημα της ανθεκτικότητας (Arenz and Wilson, 2016). Τα τελευταία χρόνια ωστόσο, έχουν γίνει προσπάθειες για de novo σύνθεση νέων αντιβιοτικών (Nicolaou et al., 2009; Seiple et al., 2016). Εικόνα 10: Η συνθετική χημεία χρησιμοποιείται ευρέως για τη δημιουργία νέων γενεών κατηγοριών αντιβιοτικών. Τα μητρικά μόρια έχουν μαύρο χρώμα, οι χημικές τροποποιήσεις έχουν κόκκινο χρώμα. Το μητρικό μόριο της κινολόνης είναι συνθετικό, ενώ τα άλλα είναι φυσικά προϊόντα (Fischbach and Walsh, 2009) Αντιβιοτικά που δρουν στο ριβόσωμα Δεκαετίες βιοχημικών και μικροβιολογικών μελετών και πιο πρόσφατες δομικές μελέτες, έχουν αποκαλύψει ότι μια μεγάλη ποικιλία αντιβιοτικών αναστέλλουν συγκεκριμένα την πρωτεϊνική σύνθεση, καθώς οι ουσιαστικές διαφορές που έχουν παρατηρηθεί στα στάδια 24

25 της πρωτεϊνοσύνθεσης μεταξύ των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων προσφέρουν τη δυνατότητα επιλεκτικής αναστολής της (Wilson, 2009; Sohmen et al., 2009). Η πλειονότητα των γνωστών αντιβιοτικών-αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης, στοχεύει στην επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας: oι αμινογλυκοσίδες, η χλωραμφενικόλη, τo φουσιδικό οξύ, οι λινκοσαμίδες, τα μακρολίδια, οξαζολιδινόνες οι στρεπτογραμίνες και οι τετρακυκλίνες είναι οι οικογένειες των αντιβιοτικών που ανήκουν σε αυτή την κατηγορία. Υπάρχουν όμως και ενώσεις που στοχεύουν ειδικά τη φάση της έναρξης, είναι ωστόσο περιορισμένες όσον αφορά την κλινική τους εφαρμογή λόγω προβλημάτων εξειδίκευσης των φαρμάκων (edeine και pactamycin), τοξικότητας (everminicin) και διαλυτότητας (θειοπεπτίδια και θερμορουβίνη). Επίσης πολλά αντιβιοτικά παρεμποδίζουν τον τερματισμό και την ανακύκλωση της μετάφρασης, αλλά αυτές οι ενώσεις συνήθως έχουν πιο έντονο αποτέλεσμα κατά τη φάση της επιμήκυνσης επειδή όλες τους αναστέλλουν την υδρόλυση του GTP. Εντούτοις, το φουσιδικό οξύ και η βλαστισιδίνη S αποτελούν εξαιρέσεις επειδή αναστέλλουν την ανακύκλωση και τον τερματισμό, αντίστοιχα, σε ουσιαστικά χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτές που απαιτούνται για την αναστολή της επιμήκυνσης (Wilson, 2014). Εικόνα 11: Στόχοι των αντιβιοτικών κατά τη διάρκεια της σύνθεσης βακτηριακών πρωτεϊνών. Απεικονίζονται τα αντιβιοτικά που δρουν σε κάθε στάδιο της μετάφρασης (Wilson, 2014) Αναστολείς της Α-θέσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Υπάρχουν αρκετά αντιβιοτικά που προσδένονται στην Α-θέση της πεπτιδυλοτρανφεράσης και είτε παρεμποδίζουν την πρόσδεση του αα-trna ή την σωστή του διαμόρφωση. Ορισμένα από αυτά τα αντιβιοτικά τα οποία θα μελετηθούν και στη συνέχεια 25

26 είναι η χλωραμφενικόλη, η κλινδαμυκίνη, η σπαρσομυκίνη, η υγρομυκίνη Α, το Α201Α και η λινεζολίδη. Χλωραμφενικόλη Η χλωραμφενικόλη (CAM) είναι ένα αντιβιοτικό ευρέως φάσματος, που απομονώθηκε για πρώτη φορά από καλλιέργειες Streptomyces venequelae το 1947, αλλά τώρα παράγεται συνθετικά. Έχει σχετικά απλή δομή (Εικόνα 12) και ήταν το πρώτο αντιβιοτικό ευρέως φάσματος που ανακαλύφθηκε με βακτηριοστατική δράση. Διαχέεται διαμέσου του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος και δεσμεύεται αναστρέψιμα στη 50S ριβοσωματική υπομονάδα των βακτηρίων. H χλωραμφενικόλη, συμπεριφέρεται ως βραδείας δέσμευσης αναστολέας του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, εμποδίζοντας τη διευθέτηση του 3 - CCA άκρου του aa-trna στην Α-θέση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Xaplanteri et al., 2003). Η πρόσδεση της, παρεμβαίνει στη δραστικότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, εμποδίζοντας έτσι τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, άρα και τη μεταφορά αμινοξέων στις επιμηκυνόμενες πεπτιδικές αλυσίδες. Ως αποτέλεσμα, η βακτηριακή πρωτεϊνική σύνθεση παρεμποδίζεται και εππηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Hansen et al., 2003). Είναι δραστική έναντι Gram θετικών και αρνητικών βακτηρίων, τόσο αερόβιων όσο και αναερόβιων, καθώς και ενάντια σε σπειροχαίτες, ρικέτσιες, χλαμύδια και μυκοπλάσματα (Čivljak et al., 2014). H θέση δέσμευσης της χλωραμφενικόλης στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης είναι στην θέση Α. Στις πρώτες κρυσταλλογραφικές μελέτες που είχαν γίνει (Schlunzen et al., 2001), είχε προταθεί μια λανθασμένη διαμόρφωση για τη θέση πρόσδεσης της χλωραμφενικόλης η οποία επικρατούσε στη βιβλιογραφία μέχρι το 2010, όπου με νέα κρυσταλλογραφικά δεδομένα προτάθηκε το σωστό μοντέλο για τη διαμόρφωση της χλωραμφενικόλης στο ριβόσωμα (Dunkle et al., 2010) (Εικόνα 12). Σύμφωνα με τα τελευταία δεδομένα, ο δακτύλιος φαινυλίου της CAM δεσμεύεται μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων στη βάση C2452 του Α- trna, παρεμποδίζοντας την πρόσδεση των aa-trnas κι επηρεάζοντας ταυτόχρονα την πρόσδεση και στην Ρ θέση (Wilson, 2011). Αυτή η θέση δέσμευσης έρχεται σε συμφωνία και με την παρατήρηση ότι η CAM εμποδίζει την αντίδραση της πουρομυκίνης καθώς και τη δέσμευση μικρών θραυσμάτων trna στην θέση Α του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Celma et al., 1971). 26

27 Β C Chloramphenicol Α P-site trna A-site trna Εικόνα 12: Δομή και διαμόρφωση του μορίου της χλωραμφενικόλης στο ριβόσωμα. Α) Χημική δομή του μορίου. Β) Λανθασμένη διαμόρφωση του μορίου της χλωραμφενικόλης (πορτοκαλί χρώμα) στο βακτηριακό ριβόσωμα όπως περιγράφηκε από Schlunzen et al., 2001, που δείχνει το μόριο της χλωραμφενικόλης να προσδένεται μακριά από τη θέση πρόσδεσης των μακρολιδίων (γαλάζιο χρώμα). C) Σωστή διαμόρφωση του μορίου της χλωραμφενικόλης. Ο δακτύλιος φαινυλίου της χλωραμφενικόλης (κίτρινο) δεσμεύεται μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων στη βάση C2452 του Α-tRNA (πράσινο) (Polikanov, unpublished data). Προηγούμενες δομικές μελέτες εντόπισαν μία θέση δέσμευσης για τη χλωραμφενικόλη στην υπομονάδα 50S του D. radiodurans και μια δεύτερη διακριτή θέση, η οποία τοποθετείται κοντά στο τούνελ εξόδου του ριβοσώματος, κοντά στη θέση πρόσδεσης της ερυθρομυκίνης, στην υπομονάδα 50S του H. marismortui (Schlunzen et al., 2001; Hansen et al., 2003) (Εικόνα 13). Οι διαφορετικές θέσεις πρόσδεσης της χλωραμφενικόλης πιθανώς οφείλονται στο γεγονός ότι ο άγριος τύπος του στελέχους H. marismortui είναι ανθεκτικός στην χλωραμφενικόλη, λόγω της χαμηλής συγγένειας του φαρμάκου για την πρωτεύουσα θέση δέσμευσης (Mankin and Garrett, 1991). Αυτή η εγγενής ανθεκτικότητα των αρχαίων στη χλωραμφενικόλη πιθανότατα οφείλεται σε διαφορές αλληλουχίας του rrna μεταξύ των αρχαίων και των βακτηρίων, που εντοπίζονται στο νουκλεοτίδιο C2055 της έλικας Η73 και U2609 και C2610 γειτονικά της έλικας Η73 του rrna (Εικόνα 12) (Dunkle et al., 2010). Μία ανάλογη, θέση πρόσδεσης έχει προταθεί και για το βακτήριο E. coli, γεγονός το οποίο οδηγεί στην υπόθεση της ύπαρξης μίας δεύτερης θέσης πρόσδεσης της χλωραμφενικόλης στο βακτηριακό ριβόσωμα, με μικρότερη όμως συγγένεια (Lessard and Pestka, 1972; Long and Porse, 2003). Τελευταία όμως κρυσταλλογραφικά δεδομένα έχουν απορρίψει την θεωρία αυτή για το βακτήριo Ε. coli (Dunkle et al., 2010) και Τ. thermophilus (Bulkley et al., 2010). 27

28 Εικόνα 13: Οι δυο θέσεις πρόσδεσης που είχαν βρεθεί για το μόριο της χλωραμφενικόλης στο ριβόσωμα του H. marismortui (Hansen et al., 2003). Κλινδαμυκίνη Η κλινδαμυκίνη (Εικόνα 14) είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο, της κατηγορίας των λινκοσαμιδών, που χρησιμοποιούνται κλινικά για τη θεραπεία των θετικών κατά gram βακτηριακών λοιμώξεων. Δομικά μοντέλα της κλινδαμυκίνης σε ριβοσώματα H. marismortui και D. radiodurans τοποθετούν το σάκχαρο γαλακτόζης στη θέση Α του κέντρου της πεπτιδυλοτρανφεράσης με τρόπο που να εμποδίζει την λειτουργική διαμορφωση του aa-trna, ενώ παράλληλα ο δακτύλιος της γαλακτόζης έχει αλληλεπικάλυψη με τη θέση δέσμευσης του σακχάρου της δεσοσαμίνης των μακρολιδίων και κετολιδίων (Dunkle et al., 2010). Σπαρσομυκίνη H σπαρσομυκίνη (Εικόνα 14) είναι ένα νουκλεοτιδικό παράγωγο της ουρακίλης, που παράγεται από Streptomyces sparsogenes, και είναι ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης σε βακτήρια, αρχαία και ευκαρυώτες. Το μόριο της σπαρσομυκίνης έχει μελετηθεί σε ριβοσώματα Deinococcus radiodurans και Haloarcula marismortui κι έχει βρεθεί ότι η διμόρφωση του μορίου στο χώρο διαφέρει μεταξύ των διαφορετικών αυτών στελεχών (Wilson, 2011). Η ουρά που διαθέτει το μόριο της σπαρσομυκίνης έχει αλληλεπικάλυψη με το αμινοάκυλο άκρο ενός aa-trna που προσδένεται στην Α-θέση των ριβοσωμάτων Haloarcula marismortui επομένως εμποδίζει την πρόσδεση του (Monro et al., 1979). Αντίθετα σε ριβοσώματα Deinococcus radiodurans έχει βρεθεί ότι η σπαρσομυκίνη προσδένεται στην Ρ-θέση (Bashan et al., 2003). 28

29 Υγρομυκίνη Α H υγρομυκίνη Α (Εικόνα 14) ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά τη δεκαετία του 1950 ως δευτερογενής μεταβολίτης που παράγεται από τον Streptomyces hygroscopicus. Οι βιοσυνθετικές μελέτες αποκάλυψαν ότι αποτελείται από τρεις ανεξάρτητα συντιθέμενες υπομονάδες και διαπιστώθηκε πως έχει δραστικότητα ευρέος φάσματος έναντι των θετικών κατά Gram και σε μικρότερο βαθμό, των Gram-αρνητικών βακτηριδίων (Mann et al., 1953). Οι βιοχημικές μελέτες δείχνουν ότι το αντιβιοτικό αυτό δεν παρεμβαίνει στην αρχική πρόσδεση του τριμερούς συμπλόκου aa-trna EF-Tu GTP, αλλά δεν επιτρέπει την λειτουργική διαμόρφωση στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανφεράσης (PTC) στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα του E. coli (Polikanov et al., 2015). A201A Το A201A (Εικόνα 14) είναι ένα αμινοακυλο-νουκλεοτιδικό αντιβιοτικό που απομονώθηκε για πρώτη φορά από το στέλεχος Streptomyces capreolus NRRL 3817 (Kirst et al., 1985) και πιο πρόσφατα από τον θαλάσσιο ακτινομύκητα Marinactinospora thermotolerans SCSIO (Zhu et al., 2012). Αποτελείται από πέντε επιμέρους υπομονάδες και είναι δραστικό έναντι θετικών κατά Gram αερόβιων και αναερόβιων βακτηριδίων και των περισσότερων αρνητικών κατά Gram αναερόβιων μικροοργανισμών. Το Α201Α, όπως και η υγρομυκίνη Α, συνδέεται στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, σε θέση που αλληλεπικαλύπτεται με εκείνη της αμινοακυλιωμένης βάσης Α76 ενός Α-tRNA. Η παρουσία των αντιβιοτικών αυτών, παρεμποδίζει την λειτουργική διαμόρφωση του αα-trna στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανφεράσης (Polikanov et al., 2015). Λινεζολίδη Η λινεζολίδη (εικόνα 14) είναι ένα συνθετικό αντιβιοτικό που ανήκει στην οικογένεια των οξαζολιδινών. Χρησιμοποιείται κλινικά για την καταπολέμηση λοιμώξεων του δέρματος και του αναπνευστικού συστήματος που προκαλούνται από στελέχη στρεπτόκοκκου και σταφυλόκοκκου και στελέχη εντερόκοκκου που είναι ανθεκτικά στην βαγκομυκίνη (Αment et al., 2002). Προσδένεται στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης σε θέση που αποτελείται από καθολικά συντηρημένα νουκλεοτίδια και είναι τοποθετημένη με τέτοιο τρόπο ώστε ο δακτύλιος μορφολίνης να προσανατολίζεται προς την επιφάνεια της υπομονάδας, ενώ η Ν- ακυλο αμινομέθυλο ουρά να είναι προσανατολισμένη προς το τούνελ εξόδου (Wilson et al., 2008). Είναι γνωστό, από τη βιβλιογραφία (Kokkori et al., 2014), ότι η λινεζολίδη δεν 29

30 επηρεάζει τον σχηματισμό του συμπλόκου C ούτε την πρόσδεση της πουρομυκίνης στη θέση Α, σε ριβοσώματα Staphylococus epidermidis. Chloramphenicol Linezolid Clindamycin Sparsomycin Hygromycin A A201A Εικόνα 14: Χημική δομή των αναστολέων της Α-θέσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης που χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα που θα περιγραφούν στη συνέχεια Μακρολίδια Τα μακρολίδια αντιπροσωπεύουν μια μεγάλη οικογένεια αναστολέων πρωτεϊνικής σύνθεσης με υψηλό κλινικό ενδιαφέρον λόγω της δυνατότητας εφαρμογής τους στην ιατρική. Αποτελούνται από μεγάλους λακτονικούς δακτυλίους διαφορετικών μεγεθών (12/14/15/16 μελεις), στους οποίους συνδέονται ένα ή περισσότερα δεοξυσάκχαρα ή αμινοσάκχαρα. Προσδένονται στη βακτηριακή ριβοσωμική υπομονάδα 50S και παρεμβαίνουν στη σύνθεση 30

31 των πρωτεϊνών (Dinos, 2017). Η υψηλή συγγένεια των μακρολιδίων για τα βακτηριακά ριβοσώματα, μαζί με την εξαιρετικά διατηρημένη δομή των ριβοσωμάτων σε όλα σχεδόν τα βακτηριακά είδη, εξηγούν τη χρήση τους ως αντιβιοτικά ευρέως φάσματος. Από την ανακάλυψη του πρώτου μακρολιδίου, δηλαδή της ερυθρομυκίνης το 1950, ξεκίνησαν οι προσπάθειες τροποποίησης της μητρικής ένωσης, οδηγώντας σε ενώσεις με καλύτερη βιοδιαθεσιμότητα, σταθερότητα στο όξινο περιβάλλον του στομάχου και βελτιωμένη φαρμακοκινητική (Nakagawa et al., 1992; Hardy et al., 1992). Αυτές οι προσπάθειες οδήγησαν στη δεύτερη γενιά μακρολιδίων, συμπεριλαμβανομένων πολύ γνωστών μελών όπως η αζιθρομυκίνη, η κλαριθρομυκίνη και η ροξυθρομυκίνη. Στη συνέχεια, προκειμένου να αντιμετωπιστεί η αυξανόμενη αντίσταση στα αντιβιοτικά, αναπτύχθηκε μία τρίτη γενιά μακρολιδίων που εμφανίζουν βελτιωμένη δραστικότητα έναντι πολλών ανθεκτικών στελεχών (Katz and Ashley, 2005). Δυστυχώς, οι βελτιώσεις συνοδεύονταν από σοβαρές παρενέργειες, οδηγώντας σε απογοήτευση κι έτσι πολλοί ερευνητές σταμάτησαν να εργάζονται στην ανάπτυξη νέων μακρολιδίων προτού αντιμετωπισθεί το θέμα της ασφαλούς χορήγησης. Μια τελευταία δημοσίευση (Seiple et al., 2016), προτείνει μια νέα πλατφόρμα εξ ολοκλήρου συνθετικής παραγωγής των μακρολιδίων, συνδυάζοντας απεριόριστες τροποποιήσεις τόσο στο λακτονικό δακτύλιο όσο και στα προσδεδεμένα σάκχαρα ή αμινοσάκχαρα. Τα μακρολίδια είναι δραστικά κυρίως κατά των θετικών κατά Gram βακτηριδίων και ιδιαίτερα κατά των Staphylococcus, Streprococcus και Diplococcus και έχουν περιορισμένη δραστικότητα έναντι Gram-αρνητικών βακτηριδίων, όπως Neisseria gonorroheae, Haemophilus influenza, Bordetella pertussis και Ν. meningitis (Nakayama, 1984). Επιπλέον, είναι εξαιρετικά δραστικά κατά διαφόρων μυκοπλασμάτων (Doucet-Populaire et al., 1998). Όλα τα μακρολίδια δεσμεύονται στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος και καταλαμβάνουν τη θέση τους εντός του τούνελ εξόδου, κοντά στο κέντρο πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η θέση πρόσδεσης των αντιβιοτικών αυτών έχει προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ (Schluenzen et al., 2001; Berisio et al., 2003; Tu et al., 2005; Bulkley et al., 2010; Dunkle et al., 2010). Αν και για μεγάλο διάστημα υπήρχε διαφωνία, όχι τόσο στο προσδιορισμό της θέσης, όσο στο προσανατολισμό του δακτυλίου της λακτόνης, όπως επιβεβαιώθηκε από πρόσφατες μελέτες που χρησιμοποίησαν ριβοσώματα από E. coli (Dunkle et al., 2010) και Τ. thermophilus (Bulkley et al., 2010), ο δακτύλιος μακρολακτόνης όλων των μακρολίδων προσανατολίζεται ομοίως στο τούνελ εξόδου του ριβοσώματος, ανεξάρτητα από τον τύπο του μακρολιδίου ή το μέγεθος του δακτυλίου λακτόνης. Τα μακρολίδια αλληλεπιδρούν με την βάση Α2058 του 23S rrna, 31

32 σχηματίζοντας έναν δεσμό υδρογόνου μεταξύ του υδροξυλίου της δεσοσαμίνης και του αζώτου Ν1 της βάσης Α2058. Επιπροσθέτως, η πρόσδεση των μακρολιδίων σταθεροποιείται μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων του δακτυλίου λακτόνης και των rrna νουκλεοτιδίων 2611 και Ωστόσο, φαίνεται ότι τα μακρολίδια και κετολίδια που φέρουν την πλευρική αλκύλο-άρυλο αλυσίδα έχουν διαφορετική διαμόρφωση ανάμεσα σε διαφορετικά ήδη ριβοσωμάτων και συγκεκριμένα στο D. radiodurans (Berisio et al., 2003), T. thermophilus (Bulkley et al., 2010) και E. coli 70S ribosomes (Dunkle et al., 2010). Για μεγάλο χρονικό διάστημα, τα μακρολίδια θεωρούνταν γενικοί αναστολείς της μετάφρασης παρεμποδίζοντας το τούνελ εξόδου του ριβοσώματος και έτσι αποτρέποντας την πρόοδο της σύνθεσης της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Menninger and Otto, 1982, Tenson et al., 2003, Mankin, 2008). Για την πλειονότητα των πρωτεϊνών, η δέσμευση του αντιβιοτικού στο τούνελ προκαλεί αναστολή της πρωτεϊνοσύνθεσης όταν η πεπτιδική αλυσίδα φτάσει σε μήκος 5-11 αμινοξέων όπου σταματά η επιμήκυνση, οδηγώντας σε αποκόλληση του πεπτιδυλο-trna (drop-off) από το ριβόσωμα (Menninger, 1995; Tenson et al., 2003). Πρόσφατα όμως, ο Mankin και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι μερικές πεπτιδικές αλληλουχίες έχουν την ικανότητα να παρακάμπτουν το αντιβιοτικό εντός του τούνελ εξόδου, οδηγώντας είτε στη σύνθεση μεγάλων πολυπεπτιδίων, που είναι συνδεδεμένα με το ριβοσώμα που έχει προσδεδεμένο το αντιβιοτικό, είτε στη διακοπή της πρωτεϊνοσύνθεσης σε μεταγενέστερη φάση, όταν το μήκος της πολυπεπτιδικής αλυσίδας έχει ήδη προσπεράσει τη θέση δέσμευσης του αντιβιοτικού (Εικόνα 15) (Kannan et al 2012; Gamerdinger and Deuerling, 2012). Τα μακρολίδια, όπως η ερυθρομυκίνη, φαίνεται να επιτρέπουν την παράκαμψη λιγότερων πρωτεϊνών σε σύγκριση με τα κετολίδια, όπως η τελιθρομυκίνη (Kannan et al., 2012; Kannan et al., 2014), πιθανώς επειδή η ερυθρομυκίνη διαφέρει δομικά, αφού έχει προσδεδεμένο το σάκχαρο της κλαδινόζης που προεκτείνεται στο τούνελ εξόδου (Schluenzen et al., 2001, Bulkley et al., 2010, Dunkle et al., 2010). Μετά από χαρτογράφηση του mrna των ριβοσωμάτων που έχουν προσδεδεμένα μακρολίδια κι έχουν σταματήσει την πρωτεϊνοσύνθεση πρόωρα (stalling), εντοπίστηκαν οι mrna αλληλουχίες που επηρεάζονται από αυτά τα αντιβιοτικά. Διαπιστώθηκε ότι δρουν ως εκλεκτικοί αναστολείς, αφού η δέσμευση των μακρολιδίων στο τούνελ του ριβοσώματος, προκαλεί παύση της πρωτεϊνοσύνθεσης μετά από αλληλεπίδραση του αντιβιοτικού με μερικές μοναδικές θέσεις της πεπτιδικής αλυσίδας πλούσιες σε φορτισμένα κατάλοιπα (Davis et al., 2014; Kannan et al., 2014). Το πιο κυρίαρχο μοτίβο για την παύση αυτή είναι η αλληλουχία R/K, X, R/K, όπου τα R και Κ είναι τα αμινοξέα αργινίνη και λυσίνη αντίστοιχα και το Χ αντιπροσωπεύει οποιοδήποτε αμινοξύ. Το ριβόσωμα 32

33 σταματά την πρωτεϊνοσύνθεση όταν το κωδικόνιο που αντιπροσωπεύει το μεσαίο αμινοξύ (Χ) στο παραπάνω μοτίβο εισέρχεται στην θέση Ρ. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι αντί να προκαλούν καθολική διακοπή της πρωτεϊνικής σύνθεσης, τα μακρολίδια και τα κετολίδια επιτρέπουν στην πραγματικότητα τη μετάφραση μόνο ενός μικρού ποσοστού πρωτεϊνών, γεγονός που μπορεί να είναι εξαιρετικά επιβλαβές για το βακτήριο. Ερυθρομυκίνη Η ερυθρομυκίνη (Εικόνα 15) απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1952 από τo βακτήριo Saccharopolyspora erythraea και χρησιμοποοιείται στην κλινική πράξη έναντι μεγάλης γκάμας βακτηριακών λοιμώξεων. Είναι πιο αποτελεσματική έναντι Staphylococcus aureus cocci, στρεπτοκόκκων ομάδας Α, εντεροκόκκων και των πνευμονιοκόκκων (Jelić and Antolović, 2016). Η ερυθρομυκίνη έχει ένα 14-μελή δακτύλιο με τα σάκχαρα κλαδινόζη και δεσοζαμίνη συνδεδεμένα στον C3 και C5, αντίστοιχα. Μέχρι σήμερα υπάρχουν κρυσταλλικές δομές που απεικονίζουν τη θέση δέσμευσης της ερυθρομυκίνης σε τέσσερα διαφορετικά ριβοσωμικά σωματίδια Ε. coli, T. thermophilus, D. radiodurans και H. marismortui. Η σύγκριση των δομών αποκαλύπτει ότι η θέση δέσμευσης της ερυθρομυκίνης είναι πανομοιότυπη στα Ε. coli, T. thermophilus και H. marismortui (Wilson, 2011). Η ερυθρομυκίνη, όπως όλα τα μακρολίδια, δεσμεύεται στην είσοδο του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος και εμποδίζει την επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. ΟΜΤ Tο μακρολίδιο OMT (5-O-mycaminosyltylonolid) (Εικόνα 15), αποτελείται από έναν 16-μελή δακτύλιο, που δε φέρει το σάκχαρο της κλαδινόζης και είναι πρόδρομο μόριο της βιοσύνθεσης της τυλοσίνης. Δεσμεύεται στο τούνελ εξόδου των ριβοσωμάτων Escherichia coli σε μια μερικώς επικαλυπτόμενη θέση με την ερυθρομυκίνη και τυλοσίνη και προσδένεται ισχυρά, ενεργώντας ως αναστολέας βραδείας δέσμευσης (Karahalios et al., 2006). Τελιθρομυκίνη Η εμφάνιση βακτηριακής ανθεκτικότητας στα μακρολίδια οδήγησε στην ανάπτυξη κετολιδίων, όπως η τελιθρομυκίνη (Εικόνα 15), τα οποία είναι ημισυνθετικά παράγωγα των μακρολιδίων, όπου το C3-σάκχαρο της κλαδινόζης αντικαθίσταται με μια κετο-ομάδα. Η τελιθρομυκίνη δεσμεύεται στα νουκλεοτίδια Α2058 και Α2059 της περιοχής V του 23S rrna και η εκτενής αλκυλοάρυλο πλευρική της αλυσίδα εισχωρεί βαθειά μέσα στο τούνελ, αυξάνοντας την ικανότητα πρόσδεσής της στο ριβόσωμα (Xiong et al., 2005). Ο δακτύλιος της 33

34 τελιθρομυκίνης στην 50S υπομονάδα του T. thermophilus (Bulkley et al., 2010), καταλαμβάνει την ίδια θέση με αυτή του H. marismortui (Tu et al., 2005), αλλά διαφέρει σημαντικά με εκείνη που έχει παρατηρηθεί στο D. radiodurans (Berisio et al., 2003). Erythromycin Telithromycin ΟΜΤ Εικόνα 15: Δομή των μακρολιδίων ερυθρομυκίνη, τελιθρομυκίνη και ΟΜΤ και θέση πρόσδεσης των μακρολιδίων στο βακτηριακό ριβόσωμα (Ramu et al., 2009). Εικόνα 16: Τα μακρολίδια είναι εκλεκτικοί αναστολείς. Τα περισσότερα νεοσυντιθέμενα πεπτίδια έχουν κρίσιμες πρωτεϊνικές αλληλουχίες στο Ν άκρο τους (κόκκινος σταυρός) που δεν μπορούν να περάσουν το τμήμα του τούνελ που έχει παρεμποδίσει το μακρολίδιο, με αποτέλεσμα την πρόωρη διακοπή της μετάφρασης. Ωστόσο, μερικές πρωτεΐνες διαθέτουν φυσικοχημικές ή δομικές ιδιότητες στο Ν-άκρο τους (πράσινο βέλος) που επιτρέπουν στο πολυπεπτίδιο να προσπεράσει το αντιβιοτικό (Gamerdinger and Deuerling, 2012). 34

35 1.5.3 Συναγωνισμός Χλωραμφενικόλης και Ερυθρομυκίνης Η μελέτη των αντιβιοτικών που προσδένονται στο ριβόσωμα εκτός από την μεγάλη σημασία που έχει στην ιατρική, έχει αποδειχθεί ότι αποτελεί ένα εξαιρετικό εργαλείο διερεύνησης της δομής και λειτουργίας του ριβοσώματος. Για το λόγο αυτό είναι πολύ σημαντικό να γνωρίζουμε τον μηχανισμό δράσης των αντιβιοτικών αλλά και την αλληλεπίδραση τους με άλλα αντιβιοτικά που προσδένονται στο ριβόσωμα (Wilson, 2009). Μια περίπτωση συναγωνισμού αντιβιοτικών για τον οποίο εδώ και δεκαετίες υπάρχει ασάφεια στη βιβλιογραφία είναι αυτός μεταξύ χλωραμφενικόλης και ερυθρομυκίνης. Το 1966 ο Vazquez έδειξε ότι αυξάνοντας τη συγκέντρωση της ερυθρομυκίνης εκτοπίζεται πλήρως το ραδιενεργό μόριο της χλωραμφενικόλης από το ριβόσωμα (Vazquez, 1966), ενώ λίγα χρόνια αργότερα, η ίδια ομάδα έδειξε ότι υψηλές συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης δεν μπόρεσαν να εκτοπίσουν τη δεσμευμένη ραδιενεργή ερυθρομυκίνη από το ριβόσωμα (Fernandez-Munoz et al., 1971). Έκτοτε, πολυάριθμες εργασίες ασχολήθηκαν με τη δέσμευση των δύο αντιβιοτικών και τα ανασταλτικά τους αποτελέσματα, χωρίς όμως να βρεθεί μια πειστική πρόταση για τον μονομερή ανταγωνισμό τους. Και τα δύο αντιβιοτικά δεσμεύονται παραπλεύρως ή στο λειτουργικό κέντρο της υπομονάδας 50S (Bulkley et al., 2010; Dunkle et al., 2010) και αναστέλλουν τη δραστικότητα της πεπτιδυλτρανσφεράσης με διαφορετικό τρόπo, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Sothiselvam et al., 2016). Η χλωραμφενικόλη καταλαμβάνει την Α-θέση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και η ερυθρομυκίνη, όπως όλα τα μακρολίδια, δεσμεύεται στην είσοδο του τούνελ εξόδου του ριβοσώματος, που τα τελευταία χρόνια έχει προσελκύσει την προσοχή των ερευνητών και η λειτουργικότητά του βρίσκεται υπό εκτεταμένη μελέτη (Wilson et al., 2016 review). Τα αρχικά δεδομένα κρυσταλλικής δομής (Schlünzen et al., 2001), δεν παρουσίασαν αλληλεπικαλυπτόμενη περιοχή για αυτά τα δύο αντιβιοτικά (Eικόνα 12b), καθιστώντας τα δεδομένα ανταγωνισμού ανεξήγητα. Επιπλέον, τα δεδομένα αποτύπωσης μέσω εκκινητή είχαν δείξει ότι και τα δύο αντιβιοτικά τροποποιούν την δραστικότητα του DMS για διάφορες κοινές βάσεις του ριβοσώματος. Ωστόσο, ορισμένες τροποποιήσεις με DMS παρουσιάστηκαν ως ένα δευτερογενές συμβάν που προέρχεται πιθανώς από αλλοστερικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ αντιβιοτικών και ριβοσωμικών υπολειμμάτων (Kostopoulou et al., 2014: Bougas et al., 2017) και πολλές μελέτες, ακόμα και μετά την αποκάλυψη της σωστής διαμόρφωσης των δυο αντιβιοτικών συνέχιζαν να αποτυπώνουν με λανθασμένο τρόπο την μεταξύ τους αλληλεπίδραση. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, όπως θα δούμε και στη συνέχεια, υπάρχει μια στερεοχημική παρεμπόδιση 35

36 μεταξύ αυτών των δύο αντιβιοτικών, εξηγώντας τον λόγο που είναι αδύνατο να υπάρχουν ταυτόχρονα στο ίδιο ριβόσωμα. 36

37 Σκοπός 37

38 2. Σκοπός της διπλωματικής εργασίας Το τούνελ του ριβοσώματος αποτελεί το λειτουργικό του κομμάτι που έχει μελετηθεί λιγότερο συγκριτικά με τα υπόλοιπα, όπως το κέντρο της αποκωδικοποίησης, το κέντρο της GTPase ενεργότητας ή το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Για πολλά χρόνια απασχολούσε την επιστημονική κοινότητα το δυσανάλογα μεγάλο μέγεθος της υπομονάδας σε σχέση με την μικρή, που δεν μπορούσε να εξηγηθεί απλά και μόνο από την παρουσία της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Από την επιβεβαίωση όμως της παρουσίας του στο ριβόσωμα και μετά, οι επιστημονικές εργασίες για το τούνελ έχουν πολλαπλασιαστεί, συμβάλλοντας έτσι στην ανάδειξη της σπουδαιότητας του για τη λειτουργία του ριβοσώματος (Nakatogawa and Ito, 2002; Deutsch 2014; Wilson et al., 2016). Έτσι σήμερα γνωρίζουμε ότι εκτός από διάδρομος εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας στο κυτταρόπλασμα, συμμετέχει στη ρύθμιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης αλλά και στη διαμόρφωση της δευτεροταγούς δομής των νεοσυντιθέμενων πεπτιδικών αλυσίδων (Kramer et al., 2009; Wilson and Beckmann, 2011; Ito and Chiba, 2013). Σε ότι αφορά τη συμμετοχή του στη ρύθμιση, έχει επιβεβαιωθεί η ύπαρξη ενός εσωτερικού δικτύου που συνίσταται από νουκλεοτιδικές βάσεις, αναγνωρίζει την αλληλουχία των αμινοξέων και επικοινωνεί με το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Ramu et al., 2011). Η μεγάλη σπουδαιότητα της λειτουργίας του τούνελ επιβεβαιώνεται και από το γεγονός ότι αποτελεί στόχο αντιβιοτικών, ιδιαίτερα της μεγάλης οικογένειας των μακρολιδίων. Τα τελευταία, εκτός από σπουδαία θεραπευτικά εργαλεία, αποτελούν και ιδανικά μέσα για την μελέτη του τούνελ. Ο μηχανισμός δράσης τους έχει άμεση αλληλοεξάρτηση με την λειτουργία του τούνελ, και κάθε φορά που ανατρέπεται ο μηχανισμός δράσης των μακρολιδίων διαφοροποιείται και η σειρά αξιολόγησης των λειτουργιών του τούνελ (Dinos, 2017). Η περιοχή από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανφερασης μέχρι την είσοδο του τούνελ αποτελεί την κύρια λειτουργική περιοχή του ριβοσώματος γεγονός που επιβεβαιώνεται από το πλήθος των αναστολέων-αντιβιοτικών που προσδένονται σε αυτή την περιοχή (Wilson, 2011). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η θέση του ενός αντιβιοτικού να επικαλύπτεται μερικώς η ολικώς από την θέση του άλλου και να έχουμε πολλές περιπτώσεις συναγωνισμού. Οι περισσότερες από αυτές τις περιπτώσεις συναγωνισμού καθιερώθηκαν από λειτουργικές μελέτες και επιβεβαιώθηκαν στη συνέχεια από κρυσταλλογραφικές μελέτες (Schlunzen et al., 2001; Dunkle et al., 2010; Wilson, 2011). Εξαίρεση όμως στον παραπάνω κατάλογο αποτελεί η περίπτωση της χλωραμφενικόλης και της ερυθρομυκίνης. Ενώ έχει επιβεβαιωθεί πριν από πολλά χρόνια με λειτουργικές μελέτες ο συναγωνισμός των δυο 38

39 αντιβιοτικών (Vasquez, 1966; Lessard and Pestka 1972; Langlois et al., 1977), η κρυσταλλογραφία δεν μπόρεσε μέχρι σήμερα να εξηγήσει την παραπάνω αλληλεπίδραση. Συνεπώς μένει ένα κενό στη βιβλιογραφία πως αυτά τα δυο αντιβιοτικά αλληλοεπιδρούν πάνω στο ριβόσωμα. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τον συναγωνισμό της ερυθρομυκίνης και της χλωραμφενικόλης, με συνδυασμό λειτουργικών και κρυσταλλογραφικών μελετών και είδαμε, για πρώτη φορά, ότι ο συναγωνισμός που παρατηρούμε, οφείλεται σε στερεοχημική παρεμπόδιση της πρόσδεσης του ενός μορίου από το άλλο. Eπιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι η αδυναμία που έχει η χλωραμφενικόλη να αντικαταστήσει την προσδεδεμένη ερυθρομυκίνη οφείλεται στη δυσκολία διέλευσης της πρώτης. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η πρόσδεση της ερυθρομυκίνης λειτουργεί παράλληλα και ως φυσικό εμπόδιο, που δεν επιτρέπει την ελεύθερη διέλευση των μορίων της χλωραμφενικόλης να προσεγγίζουν τη θέση πρόσδεσης της. Το τελευταίο επιβεβαιώθηκε με την χρήση και άλλων μακρολιδίων που διαφέρουν στο σάκχαρο της κλαδινόζης, και έδειξαν καθαρά, ότι το συγκεκριμένο σάκχαρο των μακρολιδίων προβάλλεται στο τούνελ και δρα πράγματι ως φυσικό εμπόδιο. Ταυτόχρονα, η συναγωνιστική μελέτη επεκτάθηκε και σε άλλους αναστολείς της Α-θέσης του ριβοσώματος, επιβεβαιώνοντας την πειραματική μας μέθοδο η οποία σε συμφωνία με τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα της βιβλιογραφίας οριοθετεί τη θέση των μακρολιδίων σε σχέση με το κέντρο της πεπτιδυλοτρανφεράσης. 39

40 Υλικά και Μέθοδοι 40

41 3. Υλικά Αδενοσίνη 5 τριφωσφορική (ATP, adenosinetriphosphate) β-μερκαπτοαιθανόλη Γλυκερόλη Γουανοσίνη 5 τριφωσφορική (GTP, guanosine triphosphate) Εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) Εκχύλισμα κρέατος (peptone from meat) Ερυθρομυκίνη (Ery) Κλινδαμυκίνη Λινεζολίδη Οξικό αμμώνιο (CH3COONH4) Οξικό μαγνήσιο ((CH3COO)2Mg) Οξικό οξύ (CH3COOH) Οξικός αιθυλεστέρας (CH3COOC2H5) Πολυουριδιλικό οξύ (poly-u) Σπαρσομυκίνη Υγρομυκίνη A Υδροχλώριο (HCl) Υδροξείδιο του Καλίου (NaOH) Υδροξείδιο του Νατρίου (KOH) Υγρό σπινθηρισμού (Optifluor) Φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης Χλωραμφαινικόλη Χλωριούχο αμμώνιο (ΝΗ4Cl) Χλωριούχο κάλιο (KCl) Χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl2) Α201Α Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) ΟΜΤ (5-O-mycaminosyltylonolid) Tris hydroxyl-methyl-aminomethane base 41

42 trna Phe specific Ραδιενεργά αντιδραστήρια L-[2,3,4,5,6-3 H]-Φαινυλαλανίνη [ 14 C]-χλωραμφενικόλη [ 14 C]-ερυθρομυκίνη 42

43 4. Μέθοδοι 4.1 Απομόνωση ριβοσωμάτων Καλλιέργειες κυττάρων Escherichia coli, στελέχους Κ12 Τα ριβοσώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα πειράματα που θα περιγραφούν στη συνέχεια απομονώθηκαν από βακτήρια Escherichia coli, το στέλεχος K12. Δείγμα της μητρικής καλλιέργειας εμβολιάζεται σε 10 ml αποστειρωμένου θρεπτικού μέσου LB και τίθεται υπό ανάδευση σε περιστροφικά ανακινούμενο επωαστή (orbital incubator, 120 στροφές/min) σε θερμοκρασία 37 ο C για 16 ώρες. Έπειτα, η καλλιέργεια αραιώνεται στο 1/10 της αρχικής συγκέντρωσης της και η διαδικασία επαναλαμβάνεται έως ότου ο όγκος της καλλιέργειας φτάσει το 1 L. Όταν η οπτική απορρόφηση της τελικής καλλιέργειας φτάσει τη λογαριθμική φάση ανάπτυξης, (Α ), τα κύτταρα συλλέγονται γιατί τα ριβοσώματά τους διαθέτουν τη μέγιστη ενεργότητα. Η συλλογή των κυττάρων πραγματοποιείται με φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall RC-5B και κεφαλή GSA, στις rpm, για 30 min, στους 4 o C. Ακολουθεί έκπλυση των κυττάρων με ψυχρό διάλυμα 0,9Μ KCl και συλλογή τους με φυγοκέντρηση, με τις ίδιες συνθήκες. Τα κύτταρα στη συνέχεια φυλάσσονται στους -20 ο C. Θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani): 10gr/L Bacto peptone, 5 gr/l yeast extract, 10 gr/l NaCl Παρασκευή κλάσματος S30 Τα κύτταρα παραμένουν στο πάγο για 30 min, τοποθετούνται ξανά στους -20 o C για 30 min και στη συνέχεια αφήνονται να αποψυχθούν. Eπαναιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα Α με αναλογία όγκου/βάρους 3 ml/gr κυττάρων και στη συνέχεια ακολουθεί ομογενοποίηση. Η ομογενοποίηση πραγματοποιείται σε συσκευή υπερήχων σε 12 κύκλους των W, διάρκειας 20 sec, με παύση 1 min ανάμεσα σε κάθε κύκλο. Την λύση των κυττάρων ακολουθεί επώαση με DNάση Ι (3 μg/ml) για 20 min στον πάγο. Το διάλυμα που προκύπτει, φυγοκεντρείται στις g για 30 min στους 4 ο C (Sorvall, κεφαλή SS34). Στο ίζημα αυτής της φυγοκέντρησης εντοπίζονται τα κυτταρικά υπολείμματα καθώς και τα κύτταρα τα οποία δεν λύθηκαν, ενώ το υπερκείμενο φυγοκεντρείται σε g για 30 min στους 4 ο C και το υπερκείμενο που παραλαμβάνεται από αυτή την φυγοκέντρηση, αποτελεί το κλάσμα S

44 Διάλυμα Α: 10 mm Tris HCl, ph 7.4, 10 mm (CH3COOH)2Mg, 60 mm KCl, 6 mm β-etsh Παραλαβή κλάσματος S100 Το κλάσμα S-30 φυγοκεντρείται σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο (Beckman, κεφαλή Ti- 75, g, 4 ο C, για 4 h). Το υπερκείμενο (κλάσμα S-100) περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξεά, μεταβολίτες και άλλους, απαραίτητους για την πρωτεϊνοσύνθεση, παράγοντες όπως μεταφραστικούς παράγοντες, συνθετάσες των αα-trnas, trnas. Για την αποφυγή προσμίξεων ριβοσωμικής φύσης, χρησιμοποιούνται μόνο τα άνω 2/3 του υπερκειμένου για την παραλαβή του πρωτεϊνικού κλάσματος S-100, ενώ το ίζημα φυλάσσεται για την παραλαβή των μεταφραστικών παραγόντων και των ριβοσωμάτων. Στο υπερκείμενο προστίθεται στερεό θειϊκό αμμώνιο υπό συνεχή ανάδευση έως ότου το διάλυμα αποκτήσει κορεσμό 80%. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34) στα g για 45min. Στη συνέχεια, το ίζημα αναδιαλύεται στο ¼ του αρχικού όγκου του δείγματος και γίνεται διαπίδυση του διαλύματος σε 1 L ρυθμιστικού διαλύματος Α. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34, g, για 20 min) και το ίζημα απομακρύνεται. Το υπερκείμενο (S-100), ύστερα από προσθήκη γλυκερόλης (τελική συγκέντρωση 5%), χωρίζεται σε μικρά κλάσματα τα οποία φυλάσσονται σε κατάψυξη -80 ο C. Ακολουθεί ανάλυση πρωτεϊνών κατά Bradford για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης του πρωτεϊνικού κλάσματος Παραλαβή κλάσματος FWR Το κλάσμα αυτό περιλαμβάνει μεταφραστικούς παράγοντες απαραίτητους για την πρωτεϊνική σύνθεση (IFs, EFs and RRFs) και περιλαμβάνεται στο ίζημα της υπερφυγοκέντρησης του κλάσματος S-30. Το αρχικό ίζημα των g επαναιωρείται σε 3-5 ml ρυθμιστικού διαλύματος Β υψηλής αλατότητας, αναδεύεται για 10 min και υπερφυγοκεντρείται στα g για 6 h στους 4 ο C (Beckman, κεφαλή Ti 75). Το ίζημα φυλάσσεται για την παραλαβή ριβοσωμάτων ενώ στο υπερκείμενο προστίθεται σταδιακά στερεό θειϊκό αμμώνιο υπό συνεχή ανάδευση έως κορεσμού 80%. Το διάλυμα φυγοκεντρείται (Sorvall, κεφαλή SS34, rpm, 30 min, 4 ο C) και το ίζημα, το οποίο περιέχει τους FWR, επαναιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα Α και υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι 1 L ρυθμιστικού διαλύματος Α. Τέλος, ύστερα από την προσθήκη γλυκερόλης, σε τελική συγκέντρωση 5%, 44

45 χωρίζεται σε μικρά κλάσματα, τα οποία φυλάσσονται σε κατάψυξη -80 ο C. Η συγκέντρωση των παραγόντων υπολογίστηκε με την μέθοδο Bradford. Ρυθμιστικό διάλυμα Β: 10 mm Tris-HCl ph 7.4, 10 mm (AcO)2Mg, 500 mm NH4Cl, 6 mm β-etsh Παραλαβή πλυμένων ριβοσωμάτων Το ίζημα που προκύπτει από την υπερφυγοκέντρηση του κλάσματος S30 ( g) επαναιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα Β overnight, στους 4ºC. Την επόμενη ημέρα, το αιώρημα που περιείχε τα ριβοσώματα αναδεύεται στους 4ºC και κατόπιν φυγοκεντρείται σε υπερφυγόκεντρο Beckman (κεφαλή Ti 75, σε rpm, για 6 ώρες, στους 4ºC). Μετά την φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο διάλυμα απορρίπτεται και το ίζημα των ριβοσωμάτων επαναιωρείται σε ρυθμιστικό διάλυμα Β (όγκου 1,5 ml/σωλήνα) και επωάζεται στους 4ºC overnight. Την επόμενη ημέρα ακολουθεί επαναδιάλυση των ριβοσωμάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα Β και ακολουθεί δεύτερη υπερφυγοκέντρηση σε υπερφυγόκεντρο Beckman, με ίδιες συνθήκες. Το υπερκείμενο διάλυμα της δεύτερης υπερφυγοκέντρησης απορρίπτεται, ενώ το ίζημα επαναιωρείται σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α και επωάζεται overnight στους 4ºC. Την επόμενη ημέρα κατόπιν ανάδευσης, το διάλυμα υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι 4 L ρυθμιστικού διαλύματος Α για 4 ώρες στους 4ºC. Ακολουθεί ήπια φυγοκέντρηση του διαπιδύματος σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall (κεφαλή SS34, σε 2000 rpm, για 10 min). Το υπερκείμενο συλλέγεται και φωτομετρείται στα 260 και τα 280 nm. Βάσει φωτομέτρησης στα 260nm υπολογίζεται η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων, ενώ βάσει του λόγου OD260nm/OD280nm 2 ελέγχεται η καθαρότητά τους. Τέλος, το παρασκεύασμα διατηρείται σε μικρά κλάσματα των μl στην κατάψυξη -80ºC. 4.2 Παρασκευή Ac[ 3 Η]Phe- trna E. coli To Ac[ 3 Η]Phe-tRNA είναι υπόστρωμα της P θέσης στα λειτουργικά πειράματα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης που θα περιγραφούν στη συνέχεια. Η παρασκευή του επιτεύχθηκε με την εστεροποίηση του αμινοξέος φαινυλαλανίνη στο 3 -CCA άκρο του trna Phe και στη συνέχεια ακολούθησε ακετυλίωση Παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna Το πρώτο στάδιο για την παρασκευή του AcPhe- trna περιλαμβάνει την σύνθεση του [ 3 Η]Phe-tRNA. Για την παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna προστίθενται σε δοκιμαστικό σωλήνα 45

46 τα εξής υλικά: 100 mm Tris-HCl ph=7.2, 10 mm (CH3COO)2Mg, 10 mm KCl, 6 mm β - EtSH, 156 A260 units/ml trna crude, 4 A260 units/ml trna Phe. Ακολουθεί επώαση για 20 min στους 37 0 C και στη συνέχεια προστίθενται τα εξής συστατικά: 4 mm ATP, 5 nmol/5 ml [ 3 H]-Phe, 17nmol/5 ml L-Phe, S-100. Η ποσότητα του πρωτεϊνικού κλάσματος S-100 που θα προστεθεί καθορίζεται από πιλοτικά πειράματα σύνθεσης [ 3 H]PhetRNA σε μικρότερο όγκο (30μL). Ακολουθεί δεύτερη επώαση στους 37 ο C για 45 min Απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna Η απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna γίνεται ως εξής: Α) Το παραπάνω μίγμα εκχυλίζεται με την προσθήκη ίσου όγκου 95% w/v διαλύματος φαινόλης και έντονη ανάδευση του εκχυλιζόμενου μίγματος για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Β) Ακολουθεί φυγοκέντρηση του μίγματος στη Sorvall, σε κεφαλή SS34, στις 3000 rpm για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Γ) Φυλάσσεται η υδατική φάση και στη φαινολική φάση προστίθενται 2 ml mq Η2Ο. Δ) Ακολουθεί δεύτερη εκχύλιση της φαινολικής φάσης με φυγοκέντρηση στη Sorvall, σε κεφαλή SS34, στις 3000 rpm για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου. Φυλάσσεται η υδατική φάση και στη φαινολική φάση προστίθενται 2 ml mq Η2Ο. Τέλος γίνεται και τρίτη εκχύλιση της φαινολικής φάσης με τον ίδιο τρόπο και φυλάσσεται η υδατική φάση. Ακολουθούν κατά σειρά τα παρακάτω βήματα: Α) Ανάμιξη των 3 υδατικών φάσεων που έχουν συλλεχθεί. Β) Προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος 25% w/v CH3COOK/CH3COOΗ, ph 5.8 σε ίσο όγκο με το 1/10 του όγκου της ολικής υδατικής φάσης, καθώς και προσθήκη διπλάσιου (προς τον όγκο της ολικής υδατικής φάσης) όγκου 95% αιθανόλης. Το μίγμα αυτό παραμένει για 16 περίπου ώρες σε θερμοκρασία C, ώστε να λάβει χώρα η κατακρήμνιση του [ 3 H]Phe-tRNA. Γ) Φυγοκέντρηση στη Sorvall σε κεφαλή SS34 στις rpm για 10min στους 4 ο C. Το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα πλένεται με 70% αιθανόλη και φυγοκεντρείται ξανά στις ίδιες συνθήκες. Δ) Μετά τη φυγοκέντρηση το υπερκείμενο απομακρύνεται και το ίζημα αναδιαλύεται σε μικρό όγκο ψυχρού mq Η2Ο. 46

47 Ε) Ακολουθείται διαπίδυση σε mq Η2Ο για 4 h στους 4 ο C, με δύο αλλαγές νερού. Με αυτή τη διαδικασία επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της φαινόλης από το μίγμα. Το τελικό μίγμα που αποτελείται από [ 3 Η]Phe-tRNA και μη αμινοακυλιωμένο trna συλλέγεται και προσδιορίζεται τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm, όσο και η ειδική ραδιενέργεια με τη χρήση μετρητή υγρού σπινθηρισμού Ακετυλίωση του [ 3 Η]Phe- trna Η ακετυλίωση του [ 3 H]Phe-tRNA πραγματοποιείται στους 0 ο C με την παρακάτω διαδικασία: Α) Στο [ 3 Η]Phe-tRNA που απομονώθηκε με την προηγούμενη διαδικασία προστίθεται ίση ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος οξικού οξέος/οξικού καλίου ph=5 και 1,16 ml οξικού ανυδρίτη/ 8,1 ml διαλύματος [ 3 Η]Phe- trna. Β) Στη συνέχεια προστίθεται 1/10 του όγκου του δείγματος 20% οξικό κάλιο στους 4 ο C και 2.5 όγκοι ψυχρής 95% αιθανόλης. Γ) Το παρασκεύασμα διατηρείται στους -20 ο C για 16 ώρες, ώστε να κατακρημνισθεί το Ac[ 3 Η]-Phe-tRNA. Δ) Ακολουθεί φυγοκέντρηση στη Sorvall σε κεφαλή SS34 στις rpm για 15 min, στους 4 0 C, συλλογή του ιζήματος και διαλυτοποίησή του σε μικρή ποσότητα mq Η2Ο κι έπειτα το διάλυμα υποβάλλεται σε διαπίδυση σε mq Η2Ο για 4 h στους 4 0 C με δύο αλλαγές νερού. Ε) Στο τελικό παρασκεύασμα προσδιορίζεται τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm όσο και η ειδική ραδιενέργεια. Το δείγμα χωρίζεται σε κλάσματα των 0,5 ml και διατηρείται στους C. 4.3 Συναγωνιστική πρόσδεση ραδιενεργών αντιβιοτικών στο ριβόσωμα παρουσία μη ραδιενεργών Για να διερευνηθεί ο συναγωνισμός μεταξύ ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης, εξετάσθηκε η ικανότητα δέσμευσης ραδιενεργού προσδέτη παρουσία και απουσία μη ραδιενεργού ανταγωνιστή. Ως ραδιενεργός προσδέτης χρησιμοποιήθηκαν [ 14 C]- χλωραμφενικόλη και [ 14 C]-ερυθρομυκίνη και ως ανταγωνιστές τα μόρια της ερυθρομυκίνης και της χλωραμφενικόλης αντίστοιχα. 47

48 Από πειράματα κορεσμού επιλέγουμε τη συγκέντρωση του ραδιενεργού προσδέτη έτσι ώστε να εξασφαλίζουμε επαναληψημότητα και στατιστική ακρίβεια. Αρχικά πραγματοποιείται επώαση των 70S ριβοσωμάτων (τελικής συγκέντρωσης 0,2 μμ) παρουσία του ραδιενεργά σημασμένου αντιβιοτικού (ειδικής ραδιενέργειας 150 dpm/pmol) σε συγκέντρωση 10 μμ, παρουσία ρυθμιστικού διαλύματος Γ. Το μείγμα επωάζεται για 10 min στους 30 ο C και στη συνέχεια ακουλουθει διήθηση. Το αραιωμένο μείγμα διέρχεται από φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης (Milipore, τύπος ΗΑ, διάμετρος 240 mm, μέγεθος πόρου 0,45 μm) με μερική υποβοήθηση κενού και στη συνέχεια πλένεται τρεις φορές με 3 ml ρυθμιστικού διαλύματος Γ, ώστε να απομακρυνθεί πλήρως ο μη προσδεμένος ραδιενεργός προσδέτης. Η απομένουσα ραδιενέργεια στα φίλτρα ποσοτικοποιείται σε μετρητή β ραδιενέργειας με σπινθηριστικό υγρό filter count. Με τον τρόπο αυτό προσδιορίζεται το ποσό της ραδιενέργειας το οποίο δεσμεύεται στη δεδομένη ποσότητα ριβοσωμάτων απουσία και παρουσία ανταγωνιστή. Στην περίπτωση του ανταγωνιστή η αντίδραση διεξάγεται με αυξανομένη συγκέντρωση μη ραδιενεργού προσδέτη (μη ραδιενεργού χλωραμφενικόλης ή ερυθρομυκίνης) ενώ η συγκέντρωση του ραδιενεργού μορίου παραμένει σταθερή. Από την καμπύλη της παραμένουσας προσδεμένης ραδιενέργειας παρουσία του μη ραδιενεργού προσδέτη υπολογίζουμε το IC50, τη συγκέντρωση που απαιτείται για να παραμείνει συνδεδεμένη η μισή ραδιενέργεια του control και στη συνέχεια από τη σχέση των Cheng-Prusoff (Υung-Chi and Prusoff, 1973) υπολογίζουμε την σταθερά δέσμευσης Ki του μη ραδιενεργού προσδέτη. Όπου L, είναι η συγκέντρωση του ραδιενεργού προσδέτη και Κd η σταθερά διάστασής του. Ρυθμιστικό διάλυμα Γ: 20 mm Tris-HCl pη=7.6, 150 mm (CH3COOH)NH4, 10 mm (CH3COOH)2Mg, 6 mm β-etsh. 4.4 Σχηματισμός εναρκτήριου συμπλόκου To εναρκτήριο τριμερές σύμπλοκο C είναι το σύμπλοκο που δημιουργείται από το Αc[ 3 Η]Phe-tRNA, το poly(u) και το ριβόσωμα και σχηματίζεται με την εξής διαδικασία (Drainas and Kalpaxis, 1994): Τα ριβοσώματα πριν χρησιμοποιηθούν επωάζονται για 10 min στους 37 0 C προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Στη συνέχεια αναμειγνύονται σε διάλυμα που περιέχει: 100 mm Tris-HCl ph 7.4, 100 mm CH3COONH4, 6 mm β-etsh, 10 mm (CH3COO)2Mg, 0.5 mm GTP, FWR στην 48

49 άριστη συγκέντρωση, 1.6 mg/ml Poly-U, 13,3 OD/ml Ac[ 3 H]-Phe trna, 32.3 OD/ml ριβοσώματα. Το διάλυμα αυτό επωάζεται στους 25 0 C για 15 min και η αντίδραση διακόπτεται με μεταφορά του διαλύματος σε πάγο. Στη συνέχεια το διάλυμα προσροφάται σε φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης μέσω διήθησης υπό κενό. Το φίλτρο που φέρει το τριμερές σύμπλοκο, ξεπλένεται 3 φορές με 3 ml buffer A κάθε φορά, ώστε να απαλλαγεί το σύμπλοκο C από την περίσσεια του Αc[ 3 Η]Phe-tRNA, η οποία δε συγκρατείται στη μεμβράνη. Στη συνέχεια, γίνεται εμβάπτιση του φίλτρου νιτρικής κυτταρίνης σε σπινθηριστικό υγρό, μέτρηση της ραδιενέργειάς του σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού και ακολουθεί ο υπολογισμός της δέσμευσης του Ac[ 3 H]-Phe-tRNA στο ριβόσωμα. Buffer A: Tris-HCl ph mm, NH4Cl 100 mm, β-etsh 6 mm, (CH3COOH)2Mg 10 mm 4.5 Αντίδραση πουρομυκίνης Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν, η αντίδραση πουρομυκίνης χρησιμοποιείται για την τιτλοδότηση των ριβοσωματικών συμπλόκων, είτε αυτά φέρουν προσδεμένο αντιβιοτικό, είτε όχι. Η πουρομυκίνη είναι ένα αντιβιοτικό που αποτελεί δομικό ανάλογο του 3 CCA άκρου του aa-trna (Εικόνα 17), το οποίο μπορεί να προσδένεται στην Α θέση της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος και αποτελεί ψευδοϋπόστρωμα για την πεπτιδυλοτρανσφεράση. Στην αντίδραση πουρομυκίνης, το AcPhe-tRNA έχει το ρόλο του πεπτίδυλο-trna ενώ η πουρομυκίνη έχει το ρόλο του aa-trna. Η αντίδραση ακολουθεί τα παρακάτω διακριτά στάδια (Synetos and Coutsogeorgopoulos, 1987): Α) Σχηματισμός του εναρκτήριου τριμερούς συμπλόκου C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως (Κεφ. 4.4). Β) Απομόνωση του συμπλόκου C σε φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης με υποβοηθούμενο κενό ώστε να παραμείνει ελεύθερο από μη προσδεμένο ΑcPhe-tRNA. Αυτό επιτυγχάνεται με πλύσεις με buffer A τουλάχιστον 2 φορές επί 3 ml κάθε φορά. Γ) Mεταφορά σε δοχείο που περιέχει 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος με την ακόλουθη σύσταση: Tris-HCl ph mm, NH4Cl 100 mm, β-etsh 6 mm, (CH3COOH)2Mg 10 mm, πουρομυκίνη 1 mm με ή χωρίς αντιβιοτικό. 49

50 Δ) Ακολουθεί επώαση του φίλτρου στο διάλυμα της πουρομυκίνης για τους προεπιλεγμένους χρόνους (σε υδατόλουτρο στους 30 0 C, υπό ανάδευση). Ε) Η αντίδραση τερματίζεται με προσθήκη σε κάθε φιαλίδιο 1 ml ΝaOH 1 Μ. Τα φιαλίδια παραμένουν στους 30 0 C τουλάχιστον 30 min μετά την προσθήκη NaOH ώστε να υδρολυθεί πλήρως η περίσσεια του AcPhe-tRNA που δεν αντέδρασε με την πουρομυκίνη έτσι ώστε να είναι εύκολος ο προσδιορισμός του ποσοστού του προϊόντος ως προς το αρχικό σύμπλοκο. ΣΤ) Το ολικό ποσό της ραδιενέργειας οφείλεται στο προϊόν AcPhe-Puro και στο AcPhetRNA που δεν αντέδρασε. Άρα η ολική ραδιενέργεια που υπολογίζουμε σε όγκο δείγματος 0.8 ml, σε μετρητή β ακτινοβολίας με υγρό σπινθηρισμού optifluor 5 ml, είναι το αρχικό σύμπλοκο. Ζ) Σε ίσο όγκο με το παραπάνω δείγμα που μετρήθηκε η ολική ραδιενέργεια (0,8 ml), εκχυλίζουμε με (2 ml) οξικό αιθυλεστέρα το προϊον (AcPhe-Puro) που ως μη υδρόφιλο μεταφέρεται στην οργανική φάση. Θ) Από την ανώτερη οργανική φάση λαμβάνεται 1,5 ml που μεταφέρεται σε φιαλίδιο που περιέχει 5 ml υγρού σπινθηρισμού optifluor και ακολουθεί μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β ακτινοβολίας. Η τιμή της ραδιενέργειας αντιστοιχεί στο ποσό του προϊόντος AcPhe-Puro. Ο λόγος Ν/N0 x 100 δίνει το ποσοστό μετατροπής του Ac[ 3 H]Phe-tRNA σε προϊόν. Όπου Ν0 είναι η ολική ραδιενέργεια που μετρήθηκε από την υδατική φάση και Ν είναι η ραδιενέργεια που μεταφέρθηκε στην οργανική φάση οξικού αιθυλεστέρα, πάντα από ίσους όγκους μίγματος αντίδρασης. Στο παρακάτω κινητικό σχήμα περιγράφεται η αντίδραση που πραγματοποιείται μεταξύ του ριβοσωματικού συμπλόκου Αc[ 3 Η]Phe-tRNA 70S ριβόσωμα poly(u) και της πουρομυκίνης: Σχήμα 1: Κινητικό σχήμα της αντίδρασης πουρομυκίνης. C είναι το σύμπλοκο Αc[ 3 Η]Phe 70ριβόσωμα poly-u, S είναι η πουρομυκίνη, P είναι το προϊόν (AcPhe-Puro) και C είναι το ριβοσωματικό σύμπλοκο C που δεν έχει προσδεδεμένο AcPhe- trna στη θέση Ρ, με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης. Κ s είναι η θερμοδυναμική σταθερά ή Michaelis Menten και k 3 η καταλυτική σταθερα ή αριθμός μετατροπής. 50

51 Όταν η πουρομυκίνη, προστίθεται σε περίσσεια ως προς το C, η αντίδραση πουρομυκίνης, αν και διμοριακή, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως. Η συγκέντρωση πουρομυκίνης μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και θεωρείται σταθερή. Εικόνα 17: Η ομοιότητα του μορίου της πουρομυκίνης με το aa-trna επιβεβαιώνεται εκτός από τη δομή τους που φαίνεται στην εικόνα και από το γεγονός ότι η πουρομυκίνη λειτουργεί ως ψευδοϋπόστρωμα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, σχηματίζοντας πεπτιδικό δεσμό με την ελεύθερη αμινομάδα της. 51

52 Αποτελέσματα 52

53 5. Αποτελέσματα 5.1 Συναγωνισμός πρόσδεσης στο ριβόσωμα παρουσία ραδιενεργού προσδέτη Για να μελετήσουμε αν τα αντιβιοτικά χλωραμφενικόλη και ερυθρομυκίνη έχουν αμοιβαία αποκλειόμενες θέσεις πρόσδεσης, πραγματοποιήσαμε συναγωνιστικό έλεγχο πρόσδεσης στο ριβόσωμα. Για να διαπιστώσουμε αν το σύστημα συναγωνισμού που χρησιμοποιούμε λειτουργεί σωστά χρησιμοποιήσαμε αρχικά ως ανταγωνιστή μη ραδιοσημασμένη χλωραμφενικόλη. Όπως μπορούμε να δούμε στην Eικόνα 18a, η δεσμευμένη ραδιενέργεια στα 70S ριβοσώματα, απελευθερώνεται σταδιακά με τρόπο που εξαρτάται από τη συγκέντρωση, ακολουθώντας μειούμενη υπερβολή. Από το IC50 (τη συγκέντρωση της μη ραδιενεργού χλωραμφενικόλης που εκτοπίζει το 50% της ραδιενεργού) και τη σχέση Cheng-Prusoff υπολογιζουμε το Ki της χλωραμφενικόλης. Η υπολογιζόμενη τιμή Ki για τη σύνδεση με χλωραμφενικόλη είναι σύμφωνη με τις γνωστές τιμές της βιβλιογραφίας δηλαδή 1.7x10-6 Μ (Lessard and Pestka 1972, Mamos et al., 2013). Στη συνέχεια, εκτός από χλωραμφενικόλη χρησιμοποιήσαμε και ερυθρομυκίνη ως ανταγωνιστή. Η ραδιοσημασμένη χλωραμφενικόλη απελευθερώθηκε και πάλι με παρόμοιο τρόπο, αλλά με μικρότερο IC50 γεγονός που περιμένουμε λόγω της μεγαλύτερης συγγένειας της ερυθρομυκίνης για το ριβόσωμα (Κarahalios et al., 2006). Στη συνέχεια, πραγματοποιήσαμε το αντίστροφο πείραμα (Εικόνα 18b), δηλαδή η ερυθρομυκίνη ήταν ο ραδιενεργός προσδέτης και η χλωραμφενικόλη ο μη ραδιενεργός ανταγωνιστής. Σύμφωνα με την Εικόνα 18b, η ψυχρή ερυθρομυκίνη απελευθερώνει συνολικά την προσδεδεμένη ραδιενεργή με τρόπο που εξαρτάται από τη συγκέντρωση, ενώ η χλωραμφενικόλη δεν έχει καμία επίδραση στην εκτόπιση της δεσμευμένης ραδιενέργειας, ακόμη και σε υψηλές συγκεντρώσεις. 53

54 100 [ 14 C] Chloramphenicol Bound (%) Antibiotic Concentration ( M) Εικόνα 18a: Πρόσδεση της [ 14 C]-χλωραμφενικόλης σε ριβοσώματα E. coli K12 παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης ( ) και ερυθρομυκίνης ( ). Η προσδεμένη ραδιενεργός χλωραμφενικόλη ([ 14 C]-χλωραμφενικόλη) παρουσιάζεται στον άξονα των x ως ποσοστό του control απουσία αντιβιοτικού. Εικόνα 18b: Μεταβολή της προσδεδεμένης ραδιενεργού ερυθρομυκίνης ([ 14 C]-ερυθρομυκίνης) σε ριβοσώματα E. coli παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης ( ) και χλωραμφενικόλης ( ). Η δέσμευση της [ 14 C]-Ερυθρομυκίνης παρουσιάζεται ως ποσοστό του control απουσία και των δύο αντιβιοτικών. 5.2 Συναγωνιστικός έλεγχος με την αντίδραση πουρομυκίνης Ο μονομερής ανταγωνισμός που παρατηρήσαμε με σχέτα ριβοσώματα διερευνήθηκε περαιτέρω σε λειτουργικά ριβοσωμικά σύμπλοκα που σχηματίζουν πεπτιδικό δεσμό. Όταν το σύμπλοκο C εκτίθεται σε πουρομυκίνη, είναι δραστικό δίνοντας προϊόν 100%, αφού όπως είδαμε η πουρομυκίνη αποτελεί ψευδοϋπόστρωμα για την Α-θέση της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η παρουσία αντιβιοτικών όπως η ερυθρομυκίνη, η αζιθρομυκίνη, η 54

55 κλαριθρομυκίνη και το ΟΜΤ δεν έχουν καμία επίπτωση στη παραπάνω αντίδραση, γιατί προσδένονται στο τούνελ μακριά από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Αντίθετα, αντιβιοτικά όπως η χλωραμφενικόλη, η υγρομυκίνη Α, η σπαρσομυκίνη ή η κλινδαμυκίνη που προσδένονται στην Α θέση, αναστέλλουν την αντίδραση πουρομυκίνης, με αποτέλεσμα να υπάρχει μείωση του προϊόντος AcPhe-Puro. Όταν τώρα ένα αντιβιοτικό συναγωνίζεται με την ερυθρομυκίνη και προσδένεται στην Α-θέση, έχουμε το πειραματικό εργαλείο να τιτλοδοτήσουμε την πρόσδεση των συναγωνιστών. Πρόσδεση ερυθρομυκίνης, διατηρεί το σύμπλοκο ενεργό έναντι της πουρομυκίνης ενώ αντίθετα πρόσδεση του συναγωνιστή καθιστά το σύμπλοκο μη ενεργό έναντι της πουρομυκίνης. Επομένως, το σύστημα αυτό είναι ιδανικό για τον προσδιορισμό του συναγωνισμού μεταξύ δυο αντιβιοτικών για δέσμευση στο ριβόσωμα, φυσικά μόνο όταν συνδυάζεται η ερυθρομυκίνη με έναν αναστολέα της Α-θέσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και μόνο όταν ο αναστολέας συναγωνίζεται την ερυθρομυκίνη Συναγωνισμός Ερυθρομυκίνης με Χλωραμφενικόλη Στην εικόνα 19a παρακολουθούμε την αντίδραση πουρομυκίνης του συμπλόκου C σε μείγμα αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (10-200μΜ) και σταθερής ερυθρομυκίνης (0.1μΜ). Το προϊόν AcPhe-Puro απουσία αντιβιοτικών (control) είναι ίσο με το αρχικό ενεργό σύμπλοκο δηλαδη το 100%, γιατί η αντίδραση πουρομυκίνης λαμβάνει χώρα απουσία αντιβιοτικών, και όπως περιγράψαμε νωρίτερα τιτλοδοτεί το σύνολο του ενεργού συμπλόκου. Βλέπουμε ότι παρουσία ερυθρομυκίνης το τιτλοδοτούμενο ενεργό σύμπλοκο παραμένει αναλλοίωτο (μωβ μπάρα), δηλαδή η πρόσδεση της ερυθρομυκίνης διατηρεί το σύμπλοκο ενεργό έναντι της πουρομυκίνης. Στη συνέχεια διαπιστώνουμε ότι η αύξηση της συγκέντρωσης της χλωραμφενικόλης μειώνει το ενεργό σύμπλοκο (γαλάζιες μπάρες), γιατί προσδένεται η χλωραμφενικόλη στη θέση της ερυθρομυκίνης. Έχουμε δηλαδή καθαρά μια εικόνα συναγωνισμού. Όσο αυξάνεται η συγκέντρωση της χλωραμφενικόλης ελαττώνεται το ενεργό σύμπλοκο ή διαφορετικά περισσότερο ριβοσωματικό σύμπλοκο φέρει προσδεμένη χλωραμφενικόλη. Η εικόνα αυτή είναι σε απόλυτη συμφωνία με τις Εικόνες 18a,b όπου φαίνεται ότι τα δυο αντιβιοτικά συναγωνίζονται για κοινή ή αλληλεπικαλυπτομένη θέση. Για να επαναλάβουμε όμως τις συνθήκες του πειράματος της εικόνας 18 που προσπαθούσαμε να εκτοπίσουμε την προσδεμένη ερυθρομυκίνη αυξάνοντας τη συγκέντρωση της χλωραμφενικόλης, προεκθέσαμε το ριβοσωματικό σύμπλοκο C σε διάλυμα ερυθρομυκίνης για 55

56 5 λεπτά και στη συνέχεια προσθέσαμε πουρομυκίνη και αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης. Από τα αποτελέσματα του πειράματος (εικόνα 19a, γκρι μπάρες) βλέπουμε ότι η εικόνα έχει αλλάξει και διαπιστώνουμε ήπια έως μηδενική συναγωνιστική δράση. Για περαιτέρω έλεγχο του συναγωνισμού αυξήσαμε τη συγκέντρωση της ερυθρομυκίνης 10 φορές (1μΜ έναντι 0,1 μμ) και επαναλάβαμε το προηγούμενο πείραμα. Στην εικονα 19b βλέπουμε, ότι ο συναγωνισμός παραμένει, όπως περιμέναμε (γαλάζιες μπάρες), αλλά μετά από προεπώαση του συμπλόκου με ερυθρομυκίνη, η συναγωνιστική εικόνα έχει χαθεί (γκρι μπάρες). Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε απόλυτη συμφωνία με το πείραμα 18b αφού η προσθήκη υψηλών συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης δεν οδήγησαν σε εκτόπιση της ραδιενεργού ερυθρομυκίνης. Συμπερασματικά, μιλάμε για μια μονόπλευρη συναγωνιστική δράση. Chloramphenicol Erythromycin Ac-Phe puromycin (%control) Erythro 20 0 control Ery 0.1µM Ery+CAM 10µM Ery+CAM 20µM Ery+CAM 50µM Ery+CAM 100µM Ery+CAM 200µM Εικόνα 19a: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενης συγκέντρωσης χλωραμφενικόλης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), και παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μωβ) ή παρουσία ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ, 200 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση ερυθρομυκίνης (0.1 μμ) για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (10-200μΜ) με ταυτόχρονη προσθήκη πουρομυκίνης (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα για 1 λεπτό στους 30 ο C. 56

57 120 Ac-Phe Puromycin (% Control) control Ery 1µM Ery+CAM 10µM Ery+CAM 20µM Ery+ CAM 50µM Ery+CAM 100µM Ery+CAM 200µM Εικόνα 19b: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης 1μΜ και αυξανόμενης συγκέντρωσης χλωραμφενικόλης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), και παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 1 μμ (μωβ) ή παρουσία ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ, 200 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση ερυθρομυκίνης (1 μμ) για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (10-200μΜ) με ταυτόχρονη προσθήκη πουρομυκίνης (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα για 1 λεπτό στους 30 ο C. Για να είναι η συναγωνιστική μελέτη των δυο αντιβιοτικών αμφοτερόπλευρη, το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση χλωραμφενικόλης (10μΜ) και αυξανόμενη συγκέντρωση ερυθρομυκίνης ( μμ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 19c (γαλάζιες μπάρες) πάλι παρατηρείται συναγωνισμός μεταξύ ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης. Επίσης, όταν το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα για 5 λεπτά σε χλωραμφενικόλη (10μΜ) και στη συνέχεια προστέθηκαν οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις ερυθρομυκίνης (γκρί μπάρες), το μοτίβο του συναγωνισμού φαίνεται να μην αλλάζει σε αντίθεση με τις Εικόνες 19a και b. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση των αντιβιοτικών με το ριβοσωμικό σύμπλοκο δεν είναι ταχεία και αμοιβαία και εξαρτάται από τις κινητικές πρόσδεσης των αντιβιοτικών. 57

58 Ac-Phe Puromycin (%control) control CAM 10µM Cam+Ery 0.05µM Cam+Ery 0.1µM Cam+Ery 0.5µM Cam+Ery 1µM Cam+Ery 5µM Eικόνα 19c: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης χλωραμφενικόλης 10μΜ και αυξανόμενης συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control) και παρουσία μονο χλωραμφενικόλης 10 μμ (κίτρινο) ή παρουσία χλωραμφενικόλης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης (0,05 μμ, 0,1 μμ, 0,5 μμ, 1 μμ, 5 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση χλωραμφενικόλης (10 μμ) για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις ερυθρομυκίνης (0,05-5 μμ) με ταυτόχρονη προσθήκη πουρομυκίνης (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα για 1 λεπτό στους 30 ο C Συναγωνισμός χλωραμφενικόλης με μακρολίδια που δε φέρουν το σάκχαρο της κλαδινόζης Λαμβάνοντας υπόψη πολλές προηγούμενες και πρόσφατες δημοσιεύσεις που υποστηρίζουν ότι τα μακρολίδια που είναι προσδεδεμένα στην είσοδο του τούνελ εξόδου παρεμποδίζουν μερικώς την διέλευση νεοσυντιθέμενων πεπτιδικών αλυσίδων μέσω του τούνελ εξόδου (Petrone et al., 2008; Po et al., 2017; Wekselman et al., 2017), χρησιμοποιήσαμε επιπλέον μακρολίδια που δε φέρουν το σάκχαρο της κλαδινόζης κι έτσι καταλαμβάνουν μικρότερο όγκο στην ίδια θέση του τούνελ. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιήσαμε το μακρολίδιο OMT (5-O-mycaminosyltylonolid), που αποτελείται από έναν 16-μελή δακτύλιο, και είναι πρόδρομο μόριο της βιοσύνθεσης της τυλοσίνης και την τελιθρομυκίνη ένα 14-μελές κετολίδιο (Εικόνα 20). Και τα δύο αντιβιοτικά φέρουν μόνο ένα αμινοσάκχαρο, την δεσοζαμίνη, 58

59 προσδεμένη στον C5 του δακτυλίου λακτόνης, αφήνοντας ενδεχομένως περισσότερο ελεύθερο χώρο για τη διέλευση στο τούνελ. Erythromycin ΟΜΤ Telithromycin Εικόνα 20: Χημική δομή των μορίων ερυθρομυκίνη, ΟΜΤ και τελιθρομυκίνη. Με πράσινο χρώμα φαίνεται ο διαφορετικός υποκαταστάτης που έχουν προσδεδεμένο τα μόρια στην θέση C3. Η ερυθρομυκίνη έχει το σάκχαρο της κλαδινόζης, το ΟΜΤ μια υδροξυλομάδα ενώ η τελιθρομυκίνη μια καρβονυλομάδα. Συναγωνισμός με ΟΜΤ Tο σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση OMT (0.1 μμ) και προστέθηκε χλωραμφενικόλη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις ( μμ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 21 (γαλάζιες μπάρες) παρατηρείται συναγωνισμός μεταξύ ΟΜΤ και χλωραμφενικόλης. Αυξανομένη συγκέντρωση χλωραμφενικόλης καθιστά το σύμπλοκο ανενεργό, που συνεπάγεται ότι η πρόσδεση της δεν παρεμποδίζεται μη αντιστρεπτά από το ΟΜΤ. Επιπλέον, το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα για 5 λεπτά σε ΟΜΤ (0.1 μμ) και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (γκρί μπάρες), το μοτίβο του συναγωνισμού φαίνεται να μην αλλάζει σε αντίθεση με τις Εικόνες 19a και b που είχε χρησιμοποιηθεί ερυθρομυκίνη. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει μια γρήγορη αντιστρεπτή ισορροπία μεταξύ ΟΜΤ και χλωραμφενικόλης, που προσεγγίζει περισσότερο το κλασσικό μοντέλο του συναγωνισμού. 59

60 Ac-Phe Puromycin (% control) control OMT 0.1µM OMT+Cam 10µM OMT+Cam 20µM OMT+Cam 50µM OMT+Cam 100µM OMT+Cam 200µM Eικόνα 21: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ΟΜΤ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό, απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο ΟΜΤ 0.1 μμ (πράσινη μπάρα) ή παρουσία 0.1 μμ ΟΜΤ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ, 200 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση (0.1 μμ) ΟΜΤ για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (10-200μΜ) και πουρομυκίνη (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα στους 30 ο C για 1 λεπτό. Συναγωνισμός με Τελιθρομυκίνη Η τελιθρομυκίνη είναι ένα μακρολίδιο τρίτης γενιάς, παραγωγό της ερυθρομυκίνης, που αναπτύχθηκε με στόχο να αντιμετωπίσει την ανθεκτικότητα των μικροοργανισμών στα κλασσικά μακρολίδια. Ο λόγος που μελετήθηκε στα συναγωνιστικά μας πειράματα, είναι η απουσία του δακτυλίου κλαδινόζης από τον C3 του μακρολακτονικού δακτυλίου. Tο σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση τελιθρομυκίνης (0.1 μμ) και χλωραμφενικόλη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (1-100 μμ). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 22 (γαλάζιες μπάρες) παρατηρείται συναγωνισμός μεταξύ τελιθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης. Όταν το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα για 5 λεπτά σε τελιθρομυκίνη (0.1 μμ) και στη συνέχεια προστέθηκαν οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (γκρί μπάρες), το μοτίβο του συναγωνισμού φαίνεται να μην αλλάζει, όπως και στην περίπτωση του ΟΜΤ (Εικόνα 21), ενώ έρχεται σε αντίθεση με τις Εικόνες 19a και b που είχε χρησιμοποιηθεί ερυθρομυκίνη. 60

61 Ac-Phe Puromycin (%Control) control Tel 0.1µM Tel+ CAM 1µM Tel+ CAM 2µM Tel+ CAM 5µM Tel+ CAM 10µM Tel+ CAM 20µM Tel+ CAM 50µM Tel+ CAM 100µM Eικόνα 22: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης τελιθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό, απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο τελιθρομυκίνης 0.1 μμ (κόκκινη μπάρα) ή παρουσία τελιθρομυκίνης 0.1 μμ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (1μΜ, 2μΜ, 5μΜ, 10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση (0.1 μμ) τελιθρομυκίνης για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (1-100μΜ) και πουρομυκίνη (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα στους 30 ο C για 1 λεπτό Μελέτη του συναγωνισμού της ερυθρομυκίνης με αναστολείς της Α-θέσης Προκειμένου να επαληθεύσουμε την ορθότητα των συναγωνιστικών μελετών μας, επιλέξαμε αναστολείς της Α-θέσης του ριβοσώματος των οποίων η κρυσταλλική δομή είναι γνωστή κι έτσι μπορούμε να εξηγήσουμε τα αποτελέσματα μας με βάση τα δεδομένα της βιβλιογραφίας Συναγωνισμός ερυθρομυκίνης με κλινδαμυκίνη Η κλινδαμυκίνη είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο, της κατηγορίας των λινκοσαμιδών, που χρησιμοποιούνται κλινικά για τη θεραπεία των θετικών κατά gram βακτηριακών λοιμώξεων. Δομικά μοντέλα της κλινδαμυκίνης τοποθετούν το σάκχαρο της γαλακτόζης στη θέση Α του κέντρου της πεπτιδυλοτρανφεράσης με τρόπο που να εμποδίζει την λειτουργική διαμορφωση του aa-trna, ενώ παράλληλα ο δακτύλιος της γαλακτόζης έχει αλληλεπικάλυψη 61

62 με τη θέση δέσμευσης του σακχάρου της δεσοσαμίνης των μακρολιδίων και κετολιδίων (Dunkle et al., 2010). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση ερυθρομυκίνης (0.1 μμ) και κλινδαμυκίνη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (5-150 μμ). Όπως φαίνεται στην εικόνα 23 (γαλάζιες μπάρες) παρατηρήθηκε συναγωνισμός μεταξύ των δυο αντιβιοτικών. Όταν το σύμπλοκο C εκτέθηκε για 5 λεπτά σε σταθερή συγκέντρωση ερυθρομυκίνης (0,1 μμ) και κλινδαμυκίνη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (γκρι μπάρες), δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά στο ποσοστό του προϊόντος, ακόμη και όταν η συγκέντρωση κλινδαμυκίνης έφθασε τα 150 μμ- εικόνα που παρατηρήθηκε και με τον συναγωνισμό ερυθρομυκίνης με χλωραμφενικόλη. Clindamycin Erythromycin 62

63 Ac-Phe Puromycin (%Control) control Clindamycin 20µM Ery 0.1µM Ery+Clindamycin 5µM Ery+Clindamycin 20µM Ery+Clindamycin 50µM Ery+Clindamycin 100µM Ery+Clindamycin 150µM Εικόνα 23: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων κλινδαμυκίνης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό, απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο κλινδαμυκίνης 20 μμ (πράσινη μπάρα), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μωβ μπάρα) ή παρουσία ερυθρομυκίνης 0.1 μμ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων κλινδαμυκίνης (5 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ, 150 μμ) (γαλάζιες μπάρες). Το σύμπλοκο C εκτέθηκε πρώτα στην ίδια συγκέντρωση (0.1 μμ) ερυθρομυκίνης για 5 λεπτά, και στη συνέχεια προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις κλινδαμυκίνης (5-150μΜ) και πουρομυκίνη (1mM) (γκρι μπάρες). Η αντίδραση πουρομυκίνης έλαβε χώρα στους 30 ο C για 1 λεπτό Συναγωνισμός Σπαρσομυκίνης με Ερυθρομυκίνη H σπαρσομυκίνη είναι ένα νουκλεοτιδικό παράγωγο της ουρακίλης, που παράγεται από Streptomyces sparsogenes, και είναι ισχυρός αναστολέας της δραστικότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης σε βακτήρια, αρχαία και ευκαρυώτες. Η ουρά που διαθέτει το μόριο της σπαρσομυκίνης έχει αλληλεπικάλυψη με το αμινοάκυλο άκρο ενός aa-trna που προσδένεται στην Α θέση επομένως εμποδίζει την πρόσδεση του (Wilson, 2011). Το γεγονός αυτό καθιστά την σπαρσομυκίνη έναν ισχυρό αναστολέα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση σπαρσομυκίνης (5 μμ) και ερυθρομυκίνη σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις (0.5-50μΜ) (Εικόνα 24a). Η εικόνα δείχνει ότι η παρουσία της ερυθρομυκίνης δεν επηρεάζει το σχηματισμό τελικού προϊόντος. Σε άλλο πείραμα μελετήσαμε την αναστολή της σπαρσομυκίνης παρουσία και απουσία σταθερής 63

64 συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης (0.1 μμ). Όπως φαίνεται στο σχήμα 24b (γαλάζιες μπάρες) δεν παρατηρήθηκε συναγωνισμός μεταξύ των δυο αντιβιοτικών. Η παρουσία της ερυθρομυκίνης δεν μεταβάλλει το τελικό προϊόν, εικόνα συμβατή με την απουσία συναγωνισμούαλληλοεπικάλυψης. Η αναστολή που παρατηρείται και στις δυο περιπτώσεις οφείλεται αποκλειστικά στην δράση της σπαρσομυκίνης, γεγονός που δείχνει ότι τα δυο μόρια δεν έχουν αλληλεπικαλυπτόμενες θέσεις πρόσδεσης στο ριβόσωμα ή η πρόσδεση του ενός δεν επηρεάζει την πρόσδεση του άλλου Ac-Phe Puromycin (%Control) Sparsomycin 0 Control Ery 0.1uM SPRS 5uM SPRS+Ery 0.5µM SPRD+Ery 1µM SPRS+Ery 5µM SPRS+Ery 10µM SPRS+Ery 20µM SPRS+Ery 50µM Εικόνα 24a: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης σπαρσομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό, απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο σπαρσομυκίνης 5μΜ (πράσινη μπάρα), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μωβ μπάρα), ή παρουσία 5 μμ σπαρσομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων ερυθρομυκίνης (0.5 μμ, 1 μμ, 5 μμ, 10 μμ, 20 μμ, 50μΜ) (γαλάζιες μπάρες). 64

65 Ac-Phe Puromycin (%Control) Control Ery 0,1 µm Ery+ SPRS 0,1µM Ery+ SPRS 0,5µM Ery+ SPRS 1µM Ery+ SPRS 5µM Ery+ SPRS 10µM Ery+ SPRS 20µM Ery+ SPRS 50µM Ery+ SPRS 100µM Εικόνα 24b: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων σπαρσομυκίνης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνη για 1 λεπτό, απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μωβ μπάρα), ή παρουσία ερυθρομυκίνης 0.1 μμ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων σπαρσομυκίνης (0.1 μμ, 0.5 μμ, 1 μμ, 5 μμ, 10 μμ, 20 μμ, 50μΜ, 100 μμ) (γαλάζιες μπάρες) Συναγωνισμός Ερυθρομυκίνης με Υγρομυκίνη Α H υγρομυκίνη Α ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά τη δεκαετία του 1950 ως δευτερογενής μεταβολίτης που παράγεται από τον Streptomyces hygroscopicus. Οι βιοσυνθετικές μελέτες αποκάλυψαν ότι αποτελείται από τρεις ανεξάρτητα συντιθέμενες υπομονάδες και διαπιστώθηκε πως έχει δραστικότητα ευρέος φάσματος έναντι των θετικών κατά Gram και σε μικρότερο βαθμό, των Gram-αρνητικών βακτηριδίων (Mann et al., 1953). Οι βιοχημικές μελέτες δείχνουν ότι το αντιβιοτικό αυτό δεν παρεμβαίνει στην αρχική πρόσδεση του τριμερούς συμπλόκου aa-trna EF-Tu GTP, αλλά δεν επιτρέπει την λειτουργική διαμόρφωσή του στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανφεράσης (PTC) στη μεγάλη ριβοσωμική υπομονάδα (Polikanov et al., 2015). Αρχικά, το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού υγρομυκίνη Α (γαλάζιες μπάρες), ενώ στη συνέχεια, εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση ερυθρομυκίνης 0,1μΜ και αυξανόμενες συγκεντρώσεις υγρομυκίνης Α (γκρι μπάρες). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 25 δεν υπάρχει συναγωνισμός μεταξύ των δυο αντιβιοτικών αφού δεν υπάρχει αλληλεπικάλυψη των θέσεων πρόσδεσής τους. 65

66 Ac-Phe Puromycin (%control) Hygromycin A 20 0 control Ery 0.1µM Hygromycin 0.5µM Hygromycin 1µM Hygromycin 2µM Hygromycin 5µM Hygromycin 10µM Εικόνα 25: Αντίδραση πουρομυκίνης απουσία και παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων υγρομυκίνης Α. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πορομυκίνη για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μωβ μπάρα), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων μόνο υγρομυκίνης Α (γαλάζιες μπάρες) ή παρουσία ερυθρομυκίνης 0.1 μμ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων υγρομυκίνης Α (0.5 μμ, 1 μμ, 2 μμ, 5 μμ, 10 μμ) (γκρι μπάρες) Συναγωνισμός Ερυθρομυκίνης με Α201Α Το A201A είναι ένα αμινοακυλο-νουκλεοτιδικό αντιβιοτικό που απομονώθηκε για πρώτη φορά από το στέλεχος Streptomyces capreolus NRRL 3817 (Kirst et al., 1985) και πιο πρόσφατα από τον θαλάσσιο ακτινομύκητα Marinactinospora thermotolerans SCSIO (Zhu et al., 2012). Είναι δραστικό έναντι θετικών κατά Gram αερόβιων και αναερόβιων βακτηριδίων και των περισσότερων αρνητικών κατά Gram αναερόβιων μικροοργανισμών. Το Α201Α, όπως και η υγρομυκίνη Α, συνδέεται στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, σε θέση που αλληλεπικαλύπτεται με εκείνη της αμινοακυλιωμένης βάσης Α76 ενός Α-tRNA. Η παρουσία των αντιβιοτικών αυτών, παρεμποδίζει την λειτουργική διαμόρφωση του αα-trna στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανφεράσης (Polikanov et al., 2015). Αρχικά, το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού A201A (πράσινες μπάρες), ενώ στη συνέχεια, εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση ερυθρομυκίνης 0,1μΜ και αυξανόμενες συγκεντρώσεις A201A (γκρι μπάρες). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 26 υπάρχει συναγωνισμός μεταξύ των δυο αντιβιοτικών αφού όπως είναι γνωστό από την κρυσταλλική δομή του αντιβιοτικού Α201Α υπάρχει αλληλεπικάλυψη των θέσεων πρόσδεσής τους στο ριβόσωμα. (Polikanov et al., 2015). 66

67 A201A 120 Ac-Phe Puromycin (%Control) control Ery 0.1µM A201A 10µM A201A 20µM A201A 40µM A201A 60µM A201A 80µM A201A 100µM Εικόνα 26: Αντίδραση πουρομυκίνης απουσία και παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων Α201Α. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνης για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0.1 μμ (μώβ μπάρα), παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων μόνο Α201Α (πράσινες μπάρες) ή παρουσία ερυθρομυκίνης 0.1 μμ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων Α201Α (10 μμ, 20 μμ, 40 μμ, 60 μμ, 80μΜ, 100 μμ) (γκρι μπάρες) Συναγωνισμός ερυθρομυκίνης με λινεζολίδη Η λινεζολίδη είναι ένα συνθετικό αντιβιοτικό που ανήκει στην οικογένεια των οξαζολιδινών. Προσδένεται στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης σε θέση που αποτελείται από καθολικά συντηρημένα νουκλεοτίδια και είναι τοποθετημένη με τέτοιο τρόπο ώστε ο δακτύλιος μορφολίνης να προσανατολίζεται προς την επιφάνεια της υπομονάδας, ενώ η Ν- ακυλο αμινομέθυλο ουρά να είναι προσανατολισμένη προς το τούνελ εξόδου (Wilson et al., 2008). Είναι γνωστό, από παλιότερη δημοσίευση του εργαστηρίου μας (Kokkori et al., 2014), ότι η λινεζολίδη δεν επηρεάζει τον σχηματισμό του συμπλόκου C ούτε την πρόσδεση της πουρομυκίνης στη θέση Α, σε αντίθεση με τη χλωραμφενικόλη, σε ριβοσώματα Staphylococus 67

68 epidermidis. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώσαμε και στο σύστημα μας με ριβοσώματα E. coli παρουσία λινεζολίδης και ερυθρομυκίνης (Εικόνα 27). 120 AcPhe-Puromycin (% control) Linezolid 0 control Ery 0.1 µm Ery+Linezolid 10 µm Ery+Linezolid 20 µm Ery+ Linezolid 50 µm Ery+Linezolid 100 µm Ery+Linezolid 200 µm Εικόνα 27: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης ερυθρομυκίνης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων λινεζολίδης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνης για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο ερυθρομυκίνης 0,1 μμ (μωβ μπάρα), ή παρουσία ερυθρομυκίνης 0,1μΜ και αυξανόμενων συγκεντρώσεων λινεζολίδης (1 μμ, 10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ) (γκρι μπάρες). Για περαιτέρω διερεύνηση, πραγματοποιήσαμε την αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία λινεζολίδης, με και χωρίς χλωραμφενικόλη, γιατί έχει δημοσιευτεί ότι η τελευταία συναγωνίζεται τη λινεζολιδη (Skripkin et al., 2008). Όταν το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση λινεζολίδης (20 μμ) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωραμφενικόλης (1-100 μμ) (Εικόνα 28a), βλέπουμε σταδιακή ελάττωση του προϊόντος χωρίς να είμαστε σίγουροι αν αυτό οφείλεται μόνο στην αύξηση της συγκέντρωσης της χλωραμφενικόλης ή και την παρουσία της λινεζολίδης. Όταν το σύμπλοκο C εκτέθηκε σε σταθερή συγκέντρωση χλωραμφενικόλης (10μΜ) με αυξανόμενες συγκεντρώσεις λινεζολίδης (Εικόνα 28b), διαπιστώνουμε ότι δεν υπάρχει αύξηση του προϊόντος ή διαφορετικά παρεμπόδιση της αναστολής της χλωραμφενικόλης από την αυξανόμενη παρουσία της λινεζολίδης. Συνεπώς η εξαγωγή ασφαλους συμπεράσματος είναι δύσκολη και η αλληλεπίδραση των δυο αντιβιοτικών παραμένει προς διερεύνηση. 68

69 Ac-Phe Puromycin (%Control) control linezolid 20µM CAM 10µM Linezolid+ CAM 1µM Linezolid+ CAM 10µM Linezolid+ CAM 20µM Linezolid+ CAM 50µM Linezolid+ CAM 100µM Εικόνα 28a: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης λινεζολίδης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνης για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο λινεζολίδης 20 μμ (πράσινη μπάρα), παρουσία μόνο χλωραμφενικόλης 10μΜ (κίτρινη μπάρα) ή παρουσία 20 μμ λινεζολίδης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων χλωραμφενικόλης (1 μμ, 10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ) (γκρι μπάρες) Ac-Phe Puromycin (%Control) control linezolid 20µM CAM 10µM CAM+ linezolid 1µM CAM+ linezolid 10µM CAM+ linezolid 20µM CAM+ linezolid 50µM CAM+ linezolid 100µM Εικόνα 28b: Αντίδραση πουρομυκίνης παρουσία σταθερής συγκέντρωσης χλωραμφενικόλης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων λινεζολίδης. Το προϊόν μετρήθηκε μετά από έκθεση σε 1 mm πουρομυκίνης για 1 λεπτό απουσία αντιβιοτικών (control), παρουσία μόνο λινεζολίδης 20 μμ, παρουσία μόνο χλωραμφενικόλης 10μΜ ή παρουσία 10 μμ χλωραμφενικόλης και αυξανόμενων συγκεντρώσεων λινεζολίδης (1 μμ, 10 μμ, 20 μμ, 50 μμ, 100 μμ) (γκρι μπάρες). 69

70 5.3 Κρυσταλλογραφικά δεδομένα Τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα που υπήρχαν μέχρι σήμερα έδειχναν πως δεν υπήρχε αλληλεπικάλυψη μεταξύ των μορίων της ερυθρομυκίνης και της χλωραμφενικόλης (Εικόνα 12Β), γεγονός που με την παρούσα εργασία ερχόμαστε να ανατρέψουμε καθώς τα λειτουργικά πειράματα που πραγματοποιήσαμε σε ριβοσώματα E. coli, σε συνδυασμό με κρυσταλλογραφικά δεδομένα υψηλής ανάλυσης, που προέκυψαν μετά από τη συνεργασία μας με τον Dr. Polikanov, δίνουν μια ολοκληρωμένη εικόνα για τον συναγωνισμό μεταξύ ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης και βρίσκονται σε συμφωνία μεταξύ τους. Στην εικόνα 29 φαίνεται ξεκάθαρα η αλληλεπικάληψη που υπάρχει μεταξύ ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης. Ένα από τα δύο άτομα χλωρίου της διχλωροακέτυλο ομάδας της χλωροαμφενικόλης, έρχεται σε επαφή με την Ν-μεθυλομάδα της κλαδινόζης κι επομένως μπορεί να αναστείλει την ταυτόχρονη ύπαρξη και των δύο αντιβιοτικών στο ίδιο ριβόσωμα. Εικόνα 29: Οι θέσεις πρόσδεσης της χλωραμφενικόλης και της ερυθρομυκίνης σε ένα λειτουργικό ριβοσωμικό σύμπλοκο T. thermophilus υποδεικνύουν την ύπαρξη στερεοχημικής παρεμπόδισης μεταξύ των δύο μορίων. Οι δυο αυτές εικόνες αποτελούν προιον σύζευξης αδημοσίευτων αποτελεσμάτων για την χλωραμφενικόλη (Polikanov unpublished data) και δημοσιευμένων αποτελεσμάτων για την ερυθρομυκίνη (Dunkle et al., 2010). 70

71 Εικόνα 30: Κρυσταλλογραφικά δεδομένα που απεικονίζουν τα αντιβιοτικά: Α. χλωραμφενικόλη Β. ερυθρομυκίνη και C. τελιθρομυκίνη, προσδεδεμένα στο ριβοσωμα T. thermophilus που έχει τα υποστρώματα της Α και P θέσης προσδεδεμένα. Στην Εικονα Β διακρίνεται το σάκχαρο της κλαδινόζης, που αποτελεί συστατικό της ερυθρομυκίνης ενώ απουσιάζει από το μόριο της τελιθρομυκίνης (Εικόνα C). 71

72 72

73 6. Συζήτηση Στην παρούσα εργασία, εξετάζουμε τον ιδιαίτερο συναγωνισμό ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης για την πρόσδεσή τους στο ριβόσωμα, μια αλληλεπίδραση γνωστή στη βιβλιογραφία για πολλές δεκαετίες αλλά χωρίς ικανοποιητική εξήγηση (Lessard and Pestka 1972; Langlois et al., 1977; Vasquez, 1966). Μελετώντας γενικότερα το τούνελ του ριβοσώματος και τη θέση πολλών αναστολέων της πρωτεϊνικής σύνθεσης γύρω από αυτό, διαπιστώνουμε ότι στις περισσότερες περιπτώσεις συναγωνισμού υπάρχει πάντα μικρότερη ή μεγαλύτερη αλληλεπικάλυψη των εκάστοτε αντιβιοτικών, γεγονός που επιβεβαιώνεται και στις δικές μας μελέτες, με τη βοήθεια πάντα των δημοσιευμένων κρυσταλλικών δομών. Το μεγάλο κενό στη συμφωνία λειτουργικών και κρυσταλλογραφικών δεδομένων αφορούσε από παλιά κυρίως την αλληλεπίδραση ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης που παραμένει ως σήμερα ανεξήγητη. Προκειμένου να συμβάλουμε στην παραπάνω ασυμφωνία λειτουργικών και κρυσταλλογραφικών δεδομένων, μελετήσαμε εκτενώς το συναγωνισμό ερυθρομυκίνης και χλωραμφενικόλης. Η μελέτη αυτή, συνδυάστηκε και με κρυσταλλογραφικές μελέτες οι οποίες βοήθησαν για μια πιο ολοκληρωμένη θεώρηση του παραπάνω συναγωνισμού, αλλά οδήγησαν και σε μια πιθανή εξήγηση της μοναδικής και ιδιαίτερης αυτής αλληλεπίδρασης. Όλα τα πειραματικά δεδομένα παλιά και καινούργια συμφωνούν στο ότι το ένα αντιβιοτικό καταλαμβάνει τη θέση του αλλού ενώ η αλληλεπίδραση τους δεν είναι πλήρως αντιστρεπτή. Ενώ δηλαδή η ερυθρομυκίνη εκτοπίζει πάντα τη χλωραμφενικόλη, η χλωραμφενικόλη αδυνατεί να εκτοπίσει την ήδη προσδεδεμένη ερυθρομυκίνη. Στα πειράματά μας χρησιμοποιήσαμε είτε ελευθέρα ριβοσώματα και ραδιενεργά αντιβιοτικά είτε λειτουργικά προγραμματισμένα με polyu ριβοσώματα που φέρουν Ac-Phe trna στην P-θέση και το ψευδοϋπόστρωμα πουρομυκίνη αντί για αα-trna. Και στα δυο πειραματικά συστήματα επιβεβαιώσαμε το συναγωνισμό των δυο αντιβιοτικών και ταυτόχρονα την αδυναμία της χλωραμφενικόλης να εκτοπίσει την ερυθρομυκίνη. Ο παρατηρούμενος συναγωνισμός εξηγείται ικανοποιητικά με τα καινούργια κρυσταλλογραφικά δεδομένα που παραθέσαμε σε αυτή τη μελέτη. Όπως είδαμε στην εικόνα 28 υπάρχει παρεμπόδιση του ενός μορίου από το άλλο με αποτέλεσμα να είναι αδύνατη η ταυτόχρονη πρόσδεση και των δυο. Το αποτέλεσμα αυτό ικανοποιεί τα πειραματικά αποτελέσματα αλλά έρχεται σε αντίθεση με τα προηγούμενα κρυσταλλογραφικά δεδομένα που είχαν δημοσιευθεί από την ομάδα της Ada Yonath (Schlunzen et al., 2001). Είναι λοιπόν γεγονός ότι εκείνες οι 73

74 κρυσταλλικές δομές (Εικόνα 12Β) είχαν δημιουργήσει μια πλάνη γύρω από τον προσανατολισμό της χλωραμφενικόλης με αποτέλεσμα από τότε μέχρι και σήμερα να μην υπάρχει ικανοποιητική εξήγηση για την αδυναμία της ταυτόχρονης πρόσδεσης των μορίων στο ριβόσωμα. Σε εκείνη τη δημοσίευση η θέση του ενός αντιβιοτικού ήταν μακριά από τη θέση του άλλου έτσι ώστε να μην δικαιολογείται το φαινόμενο του συναγωνισμού. Σύμφωνα όμως με τα νέα δεδομένα η αμινομάδα της κλαδινόζης επικαλύπτει εν μέρει το χώρο που καταλαμβάνει η διχλωροακέτυλο ουρά της χλωραμφενικόλης προκαλώντας έτσι στερεοχημική παρεμπόδιση στην πρόσδεση της τελευταίας. Εκτός όμως από το συναγωνισμό ερυθρομυκίνης με χλωραμφενικόλη μελετήσαμε το συναγωνισμό και άλλων αντιβιοτικών που καταλαμβάνουν την Α-θεση και άλλοτε προσεγγίζουν την είσοδο του τούνελ άλλοτε όχι. Σε κάθε περίπτωση τα αποτελέσματά μας είναι σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα κρυσταλλογραφικά αποτελέσματα. Στην Εικόνα 31 βλέπουμε τη σχετική θέση της κλινδαμυκίνης με την ερυθρομυκίνη και φαίνεται ξεκάθαρα ότι υπάρχει αλληλεπικάλυψη των δυο θέσεων των δυο μορίων. Σε συμφωνία με την εικόνα αυτή είναι και τα δικά μας αποτελέσματα (Εικόνα 23), που βλέπουμε καθαρά το συναγωνιστικό μοντέλο. Στην εικόνα 32 παρατηρείται επίσης αλληλεπικάλυψη μεταξύ των μορίων της ερυθρομυκίνης με το Α201Α, γεγονός που επιβεβαίωσαν τα λειτουργικά μας πειράματα αφού παρατηρήσαμε συναγωνισμό και σε αυτή την περίπτωση (Εικόνα 26). Αντιθέτως, στην εικόνα 33, που βλέπουμε τη σχετική θέση της υγρομυκίνης Α με τη ερυθρομυκίνη, παρατηρούμε πως δεν υπάρχει αλληλεπικάλυψη μεταξύ των δομών των δυο αντιβιοτικών. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν κι εδώ με τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα αφού, όπως είδαμε (Εικόνα 25), δεν υπάρχει συναγωνισμός μεταξύ των δυο αντιβιοτικών. Εικόνα 31: Σχετική θέση δέσμευσης της κλινδαμυκίνης και ερυθρομυκίνης σε ριβοσώματα Ε. coli. Παρατηρείται αλληλεπικάλυψη μεταξύ των δομών των μορίων (Wilson 2011). 74

75 Εικόνα 32: Σχετικές δομές των μορίων της ερυθρομικίνης και του Α201Α σε ριβοσώματα T. thermophilus. Η φουκοφουρανόζη του Α201Α επικαλύπτεται με τη θέση πρόσδεσης του σακχάρου της δεσοσαμίνης της ερυθρομυκίνης (Polikanov et al., 2015). Εικόνα 33: Σχετικές δομές των μορίων της ερυθρομικίνης και της υγρομυκίνης Α σε ριβοσώματα T. thermophilus. Φαίνεται πως οι θέσεις πρόσδεσης των δυο μορίων δεν αλληλεπικαλύπτονται (Polikanov et al., 2015). Δυσκολία στην κατανόηση των πειραματικών αποτελεσμάτων με βάση τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα, έχουμε μόνο στην περίπτωση της λινεζολίδης. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία η θέση πρόσδεσης του αντιβιοτικού είναι μακριά από τη θέση πρόσδεσης της ερυθρομυκίνης οπότε η Εικόνα 27 είναι συμβατή είτε με αλληλεπικάλυψη της θέσης είτε όχι αφού και τα δυο αντιβιοτικά (λινεζολίδη και ερυθρομυκίνη) δεν αναστέλλουν την αντίδραση πουρομυκίνης. Αντίθετα, η Εικόνα 28, που δε δείχνει συναγωνισμό μεταξύ λινεζολίδης και χλωραμφενικόλης, δεν είναι καθόλου αναμενόμενη αφού είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία (Wilson et al., 2008), ότι υπάρχει αλληλεπικάλυψη των δυο αντιβιοτικών. Συνεπώς χρειάζεται περαιτέρω μελέτη, η αλληλεπίδραση των συγκεκριμένων αντιβιοτικών, για να διερευνηθεί ακριβώς η πρόσδεσή τους στο ριβόσωμα του E. coli. Το συναγωνιστικό μοντέλο αλληλεπίδρασης δυο προσδετών δεν συμφωνεί πάντοτε, ή δεν προκύπτει μόνο με την αλληλεπικάλυψη των θέσεων πρόσδεσης. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν πολλά τέτοια παραδείγματα. Ενα τέτοιο παράδειγμα είναι η εδείνη που αποτελεί αναστολέα της έναρξης της πρωτεϊνοσύνθεσης. Προσδένεται στην μικρή υπομονάδα (Pioletti et al., 2001) και προκαλεί σύζευξη μεταξύ των βάσεων G693:C795 που αποτελούν τη θέση πρόσδεσης της πακταμυκίνης (Brodersen et al., 2000). Η πρόσδεση της πακταμυκίνης όμως αναιρεί την σύζευξη των βάσεων αυτών με αποτέλεσμα η εδεϊνη να προσδένεται, αλλά χωρίς αναστολή της έναρξης (Dinos et al., 2004). Κατά γενικό κανόνα, μια πλήρως αμφίπλευρη συναγωνιστική πρόσδεση χρειάζεται να υπάρχουν πάντα διαθέσιμες ελεύθερες συγκεντρώσεις των προσδετών και παρόμοιοι χρόνοι 75

76 παραμονής (residence time), ώστε να επιτραπεί θερμοδυναμική επιλεκτικότητα (Tonge, 2017). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα μας (Eικόνες 19a,b), όταν η ερυθρομυκίνη είναι προδεσμευμένη στο ριβόσωμα, η περίσσεια της χλωραμφενικόλης δεν μπορεί να την αντικαταστήσει, υποδεικνύοντας δύο πιθανές εκδοχες: είτε η διαθέσιμη συγκέντρωση της χλωραμφενικόλης δεν είναι θερμοδυναμικά επαρκής, ή η ερυθρομυκίνη δεν μπορεί να αποδεσμευτεί εύκολα λόγω του υψηλού χρόνου παραμονής της (Copeland, 2016). Η πρώτη περίπτωση θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η πρόσδεση της ερυθρομυκίνης κλείνει τη διέλευση του τούνελ, αποτρέποντας έτσι την ελεύθερη διέλευση της χλωραμφενικόλης. Ο λόγος που το μόριο της ερυθρομυκίνης εμποδίζει τη δίοδο του τούνελ, είναι το σάκχαρο της κλαδινόζης, που βρίσκεται προσκολλημένο στον λακτονικό δακτύλιο στη θέση C3 και προβάλλει προς το τούνελ, περιορίζοντας τον ελεύθερο χώρο για την είσοδο της χλωραμφενικόλης. Αντιθέτως, στην περίπτωση των μακρολιδίων OMT (Εικόνα 21) και τελιθρομυκίνης (Εικόνα 22) στα οποία λείπει το σάκχαρο κλαδινόζης, υπάρχει μεγαλύτερος ελεύθερος όγκος στο τούνελ, επιτρέποντας έτσι στη χλωραμφενικόλη να φθάσει στην Α-θέση του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Εικόνα 29). Η παρατήρηση αυτή είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα του Mankin που μελετά το πρωτέομα παρουσία πολλών μακρολιδίων σε ριβοσώματα Ε. coli. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά του, η τελιθρομυκίνη επιτρέπει την διέλευση περισσότερων πεπτιδίων από το τούνελ σε σύγκριση με την ερυθρομυκίνη (Kanan et al., 2012). Λαμβάνοντας υπόψη ότι οι σταθερές συγγένειας της ερυθρομυκίνης και της χλωραμφενικόλης για το ριβόσωμα διαφέρουν σχεδόν κατά δύο τάξεις μεγέθους (1x10-8 έναντι 1x10-6 Μ), είναι πολύ σημαντικό να έχουμε πάντοτε κατά νου ότι οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιούνται στα πειράματα πρέπει να ικανοποιούν την απαίτηση, [I]/Κi για κάθε αντιβιοτικό να είναι της ίδιας τάξης μεγέθους. Ένα άλλο κρίσιμο σημείο της αλληλεπίδρασης αυτών των δυο αντιβιοτικών είναι ο θερμοδυναμικός και κινητικός έλεγχος. Εκτός από τις θερμοδυναμικές σταθερές Κd και Κi, οι κινητικές σταθερές, δηλαδή οι σταθερές της σύνδεσης και αποσύνδεσης στο ριβόσωμα (kon, koff), είναι εξίσου πολύ σημαντικές και κυρίως ο χρόνος παραμονής στο ριβόσωμα (residence time). Το σύμπλοκο ριβοσώματος-αντιβιοτικού σχηματίζεται επειδή το τελικό σύμπλοκο είναι θερμοδυναμικά περισσότερο σταθερό από το ελεύθερο ριβόσωμα και το αντιβιοτικό ξεχωριστά. Η τιμή της σταθεράς ισορροπίας που περιγράφει τον σχηματισμό του ριβοσωμικού συμπλόκου δεν παρέχει καμία πληροφορία σχετικά με τις ταχυτητες με τις οποίους το σύμπλοκο σχηματίζεται και διασπάται, ενώ αντίθετα οι kon και koff που είναι οι σταθερές ταχύτητας, ρυθμίζονται από τη διαφορά στην ελεύθερη 76

77 ενέργεια μεταξύ της μηδενικής και μεταβατικής κατάστασης κατά την αντίδραση δέσμευσης (Tonge, 2017). Επιπλέον, ο χρόνος ζωής του συμπλόκου ριβοσώματος-αντιβιοτικού ποσοτικοποιείται από τον χρόνο παραμονής, ο οποίος ισούται με το λόγο 1/koff (Copeland et al., 2006; Shramm, 2011; Kalpaxis 2013). Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, η σταθερά της ταχύτητας αποδέσμευσης της χλωραμφενικόλης είναι ίση με 1 min -1 (Xaplanteri et al., 2003) και για την ερυθρομυκίνη ποικίλει, ανάλογα με τη διαδικασία που μετρήθηκε από 1,54 μέχρι 17 min (Dinos and Kalpaxis, 2000; Lovmar et al., 2004; DiGiambattista et al., 1987). Με μια πρώτη ματιά φαίνεται ότι οι διαφορές στο χρόνο παραμονής τους είναι υπεύθυνες για τη συγκεκριμένη αλληλεπίδραση των αντιβιοτικών. Μελετώντας όμως πιο προσεκτικά στη βιβλιογραφία, διαπιστώσαμε ότι το OMT και η τελιθρομυκίνη δεσμεύονται πιο ισχυρά στο ριβόσωμα, με χρόνους παραμονής ίσους με 183,15 και 263 λεπτά αντιστοίχως (Karahalios et al., 2006, Kostopoulou et al., 2012). Επομένως, φαίνεται πιο λογικό, η αδυναμία αντικατάστασης της ερυθρομυκίνης από την χλωραμφενικόλη να οφείλεται όχι στον αυξημένο χρόνο παραμονής της ερυθρομυκίνης αλλα στην μειωμενη διαθέσιμη συγκεντρωση της χλωραμφενικόλης λόγω στερεοχημικής παρεμπόδισης. Αυτό λοιπόν μας οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα μακρολίδια εκτός από αλλοστερικοί τροποποιητές του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, είναι και φυσικά εμπόδια του τούνελ εξόδου. Το συμπερασμά μας έρχεται σε συμφωνία με πρόσφατες δημοσιεύσεις του 2017, που δείχνουν 1) ότι η τροποποίηση αμινοξέων με μεγάλες πλευρικές ομάδες επιβραδύνει την ταχύτητα επιμήκυνσης και 2) ότι η κλεψαζολισίνη είναι αναστολέας γιατί κλείνει το τούνελ εξόδου (Metelev et al., 2017). 77

78 Βιβλιογραφία 78