Δομικές και λειτουργικές μεταβολές σε ριβοσώματα από Staphylococcus epidermidis εξαρτώμενου από την παρουσία του αντιβιοτικού linezolid

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ ΠΑΘΟΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Δομικές και λειτουργικές μεταβολές σε ριβοσώματα από Staphylococcus epidermidis εξαρτώμενου από την παρουσία του αντιβιοτικού linezolid Κόκκορη Σοφία Βιολόγος Επιβλέπων Καθηγητής Γ. Ντίνος

2 [2]

3 Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Τμήματος Ιατρικής, στα πλαίσια του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών στις εφαρμογές των Βασικών Ιατρικών Επιστημών υπό την επίβλεψη του αναπληρωτή καθηγητή Γεώργιου Ντίνου. Πριν την παρουσίαση των αποτελεσμάτων της παρούσας διπλωματικής εργασίας, αισθάνομαι την υποχρέωση να ευχαριστήσω ορισμένους από τους ανθρώπους που γνώρισα, συνεργάστηκα μαζί τους και έπαιξαν πολύ σημαντικό ρόλο στην πραγματοποίησή της. Πρώτο από όλους θέλω να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα καθηγητή της διπλωματικής εργασίας, αναπληρωτή καθηγητή Γεώργιο Ντίνο για την πολύτιμη καθοδήγησή του, την εμπιστοσύνη και την εκτίμηση που μου έδειξε. Του είμαι ευγνώμων για τη βοήθειά του τόσο κατά τη διάρκεια του πειραματικού μέρους όσο και κατά τη συγγραφή της εργασίας μου. Σε όλη τη διάρκεια της προσπάθειάς μου, στάθηκαν δίπλα μου και τα δύο μέλη της τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής, ο καθηγητής κ. Δημήτριος Καλπαξής ο οποίος καθημερινά παρακολουθούσε την πορεία μου και υπήρξε αρωγός της προσπάθειάς μου και ο αναπληρωτής καθηγητής κ. Κωνσταντίνος Σταθόπουλος ο οποίος υπήρξε δίπλα μου όλες τις φορές που ζήτησα τη βοήθεια και τη συμπαράστασή του, υλική και ηθική. Στη συνέχεια θα ήθελα να ευχαριστήσω τον διδάκτορα Μάριο Κροκίδη και την υποψήφια διδάκτορα Μαρία Σταυροπούλου που συνέβαλαν ουσιαστικά στην ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την διδάκτορα Σοφία Πυθαροπούλου, την διδάκτορα Ουρανία Κωστοπούλου και την υποψήφια διδάκτορα Γεωργία Κουρνούτου για την άριστη συνεργασία που είχαμε στα πλαίσια της εκπόνησης αυτής της διπλωματικής εργασίας, τον πολύτιμο χρόνο που μου διέθεσαν για να μου δώσουν εξηγήσεις πάνω στο θέμα αλλά και για την προθυμία τους και για την βοήθεια, που ποτέ δε δίστασαν να μου δώσουν. Δε θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω θερμά όλα τα μέλη του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας του Τμήματος Ιατρικής, καθηγητές και φοιτητές, οι οποίοι με βοήθησαν πολλές φορές τόσο σε πρακτικό επίπεδο όσο και συμμετέχοντας στη δημιουργία μιας ωραίας συνεργασίας. Ευχαριστώ θερμά τους φίλους μου Θοδωρή, Γιώργο και Αθανασία για τη συνεχή συμπαράσταση τους η οποία είναι απαραίτητη σε κάθε βήμα της ζωής μου. Τέλος, το μεγαλύτερο ευχαριστώ το χρωστώ στην οικογένειά μου, τους γονείς μου και τα αδέρφια μου, Μαρία και Ηλία για τη μεγάλη τους αγάπη. Υπήρξαν για μένα ένα ανεκτίμητο στήριγμα και σε αυτούς οφείλω όλη τη διαδρομή των σπουδών μου μέχρι σήμερα. [3]

4 [4]

5 Πάντ εστίν εξευρείν, αν μη τον πόνον φεύγη τις. (όλα γίνονται, αν δεν αποφεύγει κανείς να κοπιάσει) Δημοσθένης, Αθηναίος ρήτορας [5]

6 [6]

7 Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή Ριβόσωμα S ριβοσωματική υπομονάδα S ριβοσωματική υπομονάδα Λειτουργικές περιοχές του ριβοσώματος Πρωτεϊνοσύνθεση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης Επιμήκυνση της πρωτεϊνικής σύνθεσης Τερματισμός της πρωτεϊνικής σύνθεσης Αντιβιοτικά Στόχοι των αντιβιοτικών Αντιβιοτικά που δρουν στο ριβόσωμα Οξαζολιδινόνες- Λινεζολίδη Μηχανισμός δράσης λινεζολίδης Ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη Στόχος Υλικά Μέθοδοι- Τεχνικές Καλλιέργεια αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων S. epidermidis Παρασκευή κλάσματος S Παρασκευή κλάσματος S Παρασκευή "πλυμένων" ριβοσωμάτων Παρασκευή Ac[ 3 Η]Phe- trna Ε. coli Παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna Απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna Καταθύθιση του [ 3 Η]Phe- trna Ακετυλίωση του [ 3 Η]Phe- trna Σχηματισμός PolyPhe Σχηματισμός εναρκτήριου συμπλόκου Αντίδραση πουρομυκίνης 58 [7]

8 Περιεχόμενα 4.6 Μελέτη του ριβοσωματικού προφίλ με υπερφυγοκέντρηση σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης Αποτελέσματα Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης Αντίδραση πουρομυκίνης απουσία και παρουσία λινεζολίδης Σχηματισμός τριμερούς συμπλόκου παρουσία λινεζολίδης Λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντιδρασης πουρομυκίνης Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου Μελέτη του ριβοσωματικού προφίλ με υπερφυγοκέντρηση σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης Συζήτηση 83 Summary- Περίληψη 87 Βιβλιογραφία 91 [8]

9 [9] Εισαγωγή

10 1.1 Ριβόσωμα Το ριβόσωμα είναι ένα μεγάλο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σωμάτιο το οποίο συνθέτει πρωτεΐνες σε όλα τα κύτταρα, χρησιμοποιώντας το mrna σαν μήτρα και τα αμινοακυλο- trnas (αα-trnas) σαν υποστρώματα. Τα ριβοσώματα παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά στα μέσα της δεκαετίας του 1950 στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο από το βιολόγο George Palade και ταξινομήθηκαν ως πυκνά σωμάτια ή οργανίδια (Palade, 1955), μία μελέτη που του χάρισε μάλιστα και το βραβείο Νόμπελ το Τα βακτηριακά ριβοσώματα αποτελούνται από μία μεγάλη (50S) και μία μικρή (30S) υπομονάδα, οι οποίες μαζί συνθέτουν το 70S ριβόσωμα. Η 50S υπομονάδα αποτελείται από το 23S RNA (περίπου 2900 νουκλεοτίδια), το 5S RNA (περίπου 120 νουκλεοτίδια) και 34 πρωτεΐνες. Η 30S υπομονάδα αποτελείται από το 16S RNA (περίπου 1500 νουκλεοτιδια) και 21 πρωτεΐνες. Κάθε υπομονάδα έχει τρεις θέσεις πρόσδεσης του trna (Εικ.1.1), την Α- στην οποία προσδένεται το εισερχόμενο αα- trna, την P- η οποία συγκρατεί το trna που φέρει την αρτιγενή πολυπεπτιδική αλυσίδα και την Ε- στην οποία βρίσκουμε μόνο το απο-ακυλιωμένο trna πριν την απομάκρυνση του από το ριβόσωμα. Η υπομονάδα 30S προσδένει το mrna και συνεισφέρει στην πιστότητα της μετάφρασης καθώς παρακολουθεί το ζευγάρωμα των βάσεων ανάμεσα στο κωδικόνιο και το αντικωδικόνιο κατά τη διαδικασία της αποκωδικοποίησης (Ogle and Ramakrishnan, 2005). Η υπομονάδα 50S προσδένει τους βραχίονες-δέκτες των trna και καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού ανάμεσα στο εισερχόμενο αμινοξύ του αα- trna της Α- θέσης και στην αρτιγενή πολυπεπτιδική αλυσίδα που βρίσκεται στο trna της P- θέσης. Και οι δύο υπομονάδες εμπλέκονται στην διαδικασία της μετατόπισης κατά την διάρκεια της οποίας τα trnas και το mrna μετακινούνται διαμέσου του ριβοσώματος, κατά ένα κωδικόνιο κάθε φορά. Η διαδικασία της μετάφρασης περιλαμβάνει όχι μόνο το ριβόσωμα αλλά και επιπρόσθετους πρωτεϊνικούς παράγοντες (Ramakrishnan, 2002). [10]

11 Εικόνα 1.1: Λειτουργικές περιοχές του ριβοσώματος ( Yonath, 2009) S ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΗ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ Μελέτες παρουσιάζουν την 30S υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος με ανθρωπόμορφη μορφή και συγκεκριμένα με κεφάλι, λαιμό και σώμα (Εικ.1.2). Το κεφάλι έχει μία μύτη με μία μεγαλύτερη προεξοχή, το ράμφος. Το σώμα απαρτίζεται από την ωμοπλάτη, την πλατφόρμα και το πόδι με ένα δάχτυλο που αποκαλείται και σπιρούνι ( Schluenzen et al., 2000). Εικόνα 1.2: Τρισδιάστατη απεικόνιση της 30S υπομονάδας βασισμένη στην κρυσταλλογραφική ανάλυση με ακτίνες Χ.. Φαίνεται η μικρή υπομονάδα όπου head: κεφαλή, beak: ράμφος, body: σώμα, spur: σπιρούνι, DC: κέντρο αποκωδικοποίησης (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). [11]

12 Όλα τα κύρια λειτουργικά στοιχεία της υπομονάδας αποτελούνται από RNA. Οι πρωτεΐνες έχουν κυρίως συνδετικό και στηρικτικό ρόλο, πρέπει όμως να τονίσουμε ότι ριβοσωματική λειτουργία απουσία πρωτεϊνών δεν έχει ακόμα εντοπισθεί πειραματικά. Η υπομονάδα 30S παρέχει την μηχανή πρόσδεσης του mrna, το μονοπάτι κατά μήκος του οποίου κινείται το mrna, το κέντρο αποκωδικοποίησής του και τα περισσότερα από τα στοιχεία που ελέγχουν την πιστότητα της μετάφρασης. Το κέντρο αποκωδικοποίησης οργανώνει την μετακίνηση των mrnas και των trnas και ελέγχει την πιστότητα με την οποία γίνονται οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στο κωδικόνιο και το αντικωδικόνιο (Green and Noller, 1997; Ramakrishnan, 2009) και βρίσκεται στο ανώτερο τμήμα του σώματος και στο κατώτερο τμήμα του κεφαλιού (Schluenzen et al., 2000) S ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΗ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑ Η μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος έχει τη μορφή ημισφαιρίου με διάμετρο περίπου 250 Å και παρουσιάζει μία συμπαγή μορφή στο κέντρο αποκαλούμενη, το σώμα. Το σώμα σχηματίζει τρεις προεξοχές: α) την κεντρική προεξοχή που αποτελείται από το 5 S rrna, μέρος του 23 S rrna και από τις πρωτεΐνες L5, L18, L25 και L33, β) την αριστερή προεξοχή που αποτελείται από rrna και την πρωτεΐνη L1 και γ) την δεξιά προεξοχή που αποτελείται από τις πρωτεΐνες L7 /L12 Η περιοχή αυτή συχνά αναφέρεται ως «στέμμα». Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PTC), που καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, βρίσκεται κάτω από την κεντρική προεξοχή. Η Α- θέση είναι πιο κοντά στην δεξιά προεξοχή, η P- θέση βρίσκεται περίπου στο κέντρο, ενώ η Ε- θέση βρίσκεται κοντά στην αριστερή προεξοχή. Το τούνελ εξόδου της αρτιγενούς πολυπεπτιδικής αλυσίδας ξεκινά από το κέντρο της πεπτιδύλοτρανσφεράσης και καταλήγει στο πίσω μέρος της υπομονάδας. Η περιοχή πρόσδεσης των μεταφραστικών παραγόντων στο ριβόσωμα βρίσκεται στο κέντρο της GTPάσης (GAC) στη δεξιά περιοχή που αποτελείται από τις πρωτεΐνες L7/L12. Στη σύσταση του GAC (GTP association [12]

13 center) συμμετέχουν οι έλικες Η43 και Η44 του 23S rrna και οι πρωτεΐνες L11 και L7 / L12 (Εικ. 1.3) (Wilson and Noller, 1998 ). Εικόνα 1.3: Τρισδιάστατη απεικόνιση της 50S υπομονάδας. Φαίνονται οι τρεις προεξοχές: α) αριστερή, β) κεντρική και γ) δεξιά (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). [13]

14 1.2 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ 1) ΚΕΝΤΡΟ ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ Το κέντρο αποκωδικοποίησης βρίσκεται μεταξύ του άνω τμήματος του σώματος και του κάτω τμήματος της κεφαλής της 30S υπομονάδας. Αποτελείται κυρίως από RNA και συγκεκριμένα από τις έλικες h44, h18 και h34. Οι έλικες αυτές έρχονται σε επαφή με το σύμπλοκο κωδικονίου-αντικωδικονίου και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πιστότητα της αποκωδικοποίησης. Η πρωτεΐνη S12 εντοπίζεται κοντά στο κέντρο αποκωδικοποίησης και θεωρείται ότι συμμετέχει στην μεταφραστική πιστότητα. Κατά τη δέσμευση του αμινοακυλοtrna στην περιοχή αποκωδικοποίησης, οι αδενίνες Α1492 και Α1493 της έλικας 44, οι οποίες στην κενή 30S υπομονάδα προσανατολίζονται στο εσωτερικό της έλικας 44, εκτείνονται προς την έλικα κωδικονίουαντικωδικονίου. Εκεί, εμπλέκονται σε νουκλεοτιδικές αλληλεπιδράσεις του mrna και του trna στην πρώτη και δεύτερη θέση του κωδικονίου. Ταυτόχρονα, η βάση G530 της έλικας 18, αλλάζει από την διαμόρφωση syn στην anti, επιτρέποντας έτσι την επαφή στην δεύτερη και τρίτη θέση του συμπλόκου κωδικονίου-αντικωδικονίου (Ogle et al., 2001). 2) ΚΕΝΤΡΟ ΠΕΠΤΙΔΥΛΟΤΡΑΝΣΦΕΡΑΣΗΣ Το καταλυτικό κέντρο του ριβοσώματος δημιουργείται με τη συμμετοχή, πέντε ελίκων της περιοχής V του 23S rrna, των ελίκων 69 και 70 της περιοχής IV, και ενός μικρού τμήματος της περιοχής ΙΙ. Εντοπίζεται κάτω από την κεντρική προεξοχή της μεγάλης υπομονάδας (Lieberman and Dahlberg, 1995; Yusupov et al., 2001). Δεδομένα από κρυσταλλογραφικές μελέτες αποκάλυψαν ότι το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης αποτελείται αποκλειστικά από RNA, χαρακτηρίζοντας έτσι το ριβόσωμα ως ριβοένζυμο. Έτσι τα CCA άκρα των trnas στις P- και Α- θέσεις δεσμεύονται και τοποθετούνται στις θέσεις αυτές αποκλειστικά από το 23S rrna (Nissen et al., 2000, Moore and Steitz, 2003). Ιδιαίτερο, όμως, ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι προεκτάσεις των πρωτεϊνών L2, L3, L4 και L27 οι οποίες προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο της [14]

15 PTC σε μικρή απόσταση (Εικ. 1.4) (Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000; Maguire et al., 2005). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το ότι οι παραπάνω πρωτεΐνες, μαζί με το 23S, είναι τα ελάχιστα απαραίτητα δομικά συστατικά για την εκδήλωση της καταλυτικής δράσης της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης έχει επιτρέψει σε ορισμένους ερευνητές να υποστηρίζουν κατά καιρούς την άμεση ή έμμεση εμπλοκή των πρωτεϊνών στην καταλυτική δραστικότητα του ριβοσώματος (Schulze and Nierhaus, 1982; Franceschi and Nierhaus, 1988; Nissen et al., 2000; Ramakrishnan, 2006). Πρέπει όμως να τονιστεί, ότι η υπόθεση που αποδέχεται το ριβόσωμα ως ριβοένζυμο, έχει υιοθετηθεί ευρύτερα από την επιστημονική κοινότητα. Εικόνα 1.4: Α) Πρωτεΐνες που προσεγγίζουν το ενεργό κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Β) Το καταλυτικό κέντρο χωρίς το rrna (Nissen et al., 2000). 3) ΚΑΝΑΛΙ ΕΞΟΔΟΥ Οι νεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες εξέρχονται από το ριβόσωμα μέσω ενός καναλιού εξόδου (Ban et al., 2000; Gabashvili et al., 2001; Wilson et al., 2002; Voss et al., 2006) (Εικ. 1.5). Το κανάλι αυτό αποτελεί ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της μεγάλης υπομονάδας, και μέσω αυτού, η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα. Διασχίζει την 50S υπομονάδα ξεκινώντας από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, στο κάτω τμήμα της κεντρικής προεξοχής, και καταλήγει στη κυτταροπλασματική πλευρά, στη βάση της μεγάλης υπομονάδας. Δημιουργεί έναν πόρο μήκους 100 Å και πλάτους Å, ο οποίος φιλοξενεί 30 έως 50 αμινοξέα της αυξανόμενης πολυπεπτιδικής [15]

16 αλυσίδας. Το τοίχωμά του αποτελείται από νουκλεοτίδια των περιοχών I -V του 23S rrna και από προεκτεινόμενες ουρές των πρωτεϊνών L4 και L22. (Malhotra et al., 1998; Ban et al., 2000; Nissen et al., 2000; Schluenzen et al., 2000; Wimberly et al., 2000; Bashan et al., 2001; Voss et al., 2006). Παλαιότερες μελέτες υπέθεταν ότι πρόκειται για ένα σύνθετο σύστημα αγωγών με επιπλέον εξόδους από την αρχική (Frank et al., 1995a; Frank et al., 1995b; Malhotra et al., 1998; Gabashvili et al., 2001). Εικόνα 1.5: α) Σχηματική απεικόνιση του ριβοσώματος τεμαχισμένου κατά μήκος του καναλιού εξόδου, φαίνεται το μονοπάτι που ακολουθεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης μέχρι το κανάλι εξόδου. Οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με την πολυπεπτιδική αλυσίδα είναι χρωματισμένες. b) Εξωτερική όψη του καναλιού εξόδου. c) Επάνω όψη του σημείου στένωσης όπως φαίνεται από το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης κατά μήκος του καναλιού εξόδου. (Kramer et al., 2009) [16]

17 1.3 Πρωτεϊνοσύνθεση στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Η σύνθεση πρωτεϊνών στο κύτταρο είναι μία πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλά στάδια και πολλά συστατικά. Ο βασικός μηχανισμός παρέχεται από τις ριβοσωματικές υπομονάδες, με τις οποίες αλληλεπιδρούν οι μεταφραστικοί παράγοντες, το mrna και τα αμινοακυλο-trnas. Η πιστή μετάφραση της γενετικής πληροφορίας βασίζεται στο ακριβές ταίριασμα των κωδικονίων του mrna με τα αντίστοιχα αμινοξέα, σύμφωνα με τους κανόνες του γενετικού κώδικα. Συνεπώς, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός προσαρμοστικού μορίου ως ενδιάμεσο ανάμεσα στο mrna και την πολυπεπτιδική αλυσίδα που συντίθεται. Αυτό το μόριο είναι το trna, το οποίο μεταφέρει στο ριβόσωμα το αμινοξύ που είναι προσδεδεμένο στο 3' άκρο του για πρωτεϊνική σύνθεση και το οποίο διαθέτει συμπληρωματικό αντικωδικόνιο προς το κωδικόνιο του mrna. Η πιστότητα έτσι της γονιδιακής έκφρασης εξαρτάται από τη σωστή πρόσδεση ενός αμινοξέος στο trna του, η οποία εξασφαλίζεται από τις αντίστοιχες αμινοακυλο-trna συνθετάσες και από τη σωστή επιλογή του trna από το ριβόσωμα. Ο σχηματισμός του αμινοακυλο-trna διεξάγεται μέσω μίας διαδικασίας δύο βημάτων. Το αμινοξύ αρχικά ενεργοποιείται παρουσία ATP για να σχηματίσει αμινοακυλοαδενυλικό ενδιάμεσο. Το ενεργοποιημένο αμινοξύ στη συνέχεια μεταφέρεται στη 2' ή 3' ΟΗ ομάδα της 3' τελικής αδενοσίνης του αντίστοιχου μορίου trna με ταυτόχρονη απελευθέρωση AMP (Feng et al., 2004). Η πρωτεϊνική σύνθεση θα μπορούσε να διαιρεθεί σε τρία διακριτά στάδια: την έναρξη, την επιμήκυνση και τον τερματισμό/ ανακύκλωση (Εικ. 1.6). Κάθε ένα από αυτά τα στάδια έχει συγκεκριμένη ομάδα μεταφραστικών παραγόντων οι οποίοι ρυθμίζουν τη διαδικασία (Wilson and Nierhaus, 2007). In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι τρεις εναρκτήριοι παράγοντες (IF1, IF2 και IF3) (Simonetti et al., 2009), τρεις παράγοντες της επιμήκυνσης (EF-G, EF-Tu και EF-Ts) και τρεις από τους τέσσερις παράγοντες τερματισμού (RF1 ή RF2, RF3 [17]

18 και RRF) είναι απαραίτητοι και επαρκείς για την πρωτεϊνική σύνθεση (Shimizu et al., 2001). Εικόνα 1.6: Στάδια της πρωτεϊνικής σύνθεσης στα βακτήρια. Διακρίνονται τρία στάδια: A) η έναρξη, B) η επιμήκυνση και C) ο τερματισμός/η ανακύκλωση (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) ΕΝΑΡΞΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ. Η έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης στα βακτήρια αρχίζει με το σχηματισμό ενός 30S προ-εναρκτήριου συμπλόκου (Εικ. 1.7B) (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Αρχικά ο εναρκτήριος παράγοντας 3 (IF3) συνδέεται ταχύτατα με την υπομονάδα 30S και μπλοκάρει τη σύνδεση της με την υπομονάδα 50S (Subramanian and Davis, 1970). Ακολουθεί η πρόσδεση του παράγοντα IF1 στην μικρή υπομονάδα. Στη συνέχεια το mrna προσδένεται στην υπομονάδα 30S κοντά στο 3 άκρο με μία διαδικασία στην οποία εμπλέκεται ο IF3. Η πρόσδεση του mrna στην υπομονάδα 30S διευκολύνεται από την αλληλουχία Shine-Dalgarno (SD) του mrna. Συγκεκριμένα, η πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία Shine-Dalgarno είναι συμπληρωματική της 16S rrna anti-sd αλληλουχίας, πλησίον του 3 άκρου του και βοηθάει στην εύρεση του αρχικού AUG κωδικονίου (Gualerzi and Pon, 1990). Επιπρόσθετα η παρουσία του εναρκτήριου παράγοντα 1 (IF1) αποτρέπει την πρόσδεση του εναρκτήριου [18]

19 trna στην Α- θέση της 30S υπομονάδας (Ramakrishnan, 2002; Simonetti et al., 2009). Ο IF1 αλληλεπιδρά με το κέντρο αποκωδικοποίησης και μπορεί με αυτό τον τρόπο να ρυθμίζει έμμεσα τη σύνδεση των ριβοσωματικών υπομονάδων. Συνεπώς ο IF1 μπορεί να έχει κάποιο ρόλο στην ακρίβεια της έναρξης της μετάφρασης (Ramakrishnan, 2002). Ο IF1 είναι επίσης γνωστό ότι αυξάνει τη συγγένεια ανάμεσα στους IF2 και IF3 ώστε να σχηματίσουν σύμπλοκο με την υπομονάδα 30S και με αυτό τον τρόπο βελτιώνει τη δραστικότητά τους (Antoun et al., 2003; Pavlov et al., 2008). Μόλις σχηματιστεί το σύμπλοκο 30S- IF3- mrna ο παράγοντας IF2 σε σύμπλοκο με GTP προσδένεται στο σύμπλοκο και προωθεί την πρόσδεση του εναρκτήριου fmet-trna fmet ώστε να σχηματιστέι το προ- εναρκτήριο σύμπλοκο 30S (Gualerzi and Pon, 1990; Yusupova et al., 2006; Kaminishi et al., 2007). Στη συνέχεια ακολουθεί η πρόσδεση της 50S υπομονάδας. Ωστόσο υπάρχουν ενδείξεις ότι το 70S σύμπλοκο που μόλις σχηματίστηκε πρέπει να υποστεί μία σειρά από δομικές αλλαγές (Pon and Gualerzi, 1984; Yusupova et al., 2006; Kaminishi et al., 2007). Σε αυτές τις αλλαγές περιλαμβάνεται μία κίνηση της 30S προς την 50S υπομονάδα καθώς και η μετεγκατάσταση του fmet-trna fmet στην P- θέση. Ακολουθεί υδρόλυση του GTP η οποία καταλύεται από τον IF2 και η απελευθέρωση των παραγόντων έναρξης (Allen et al., 2005; Grigoriadou et al., 2007a). Έτσι σχηματίζεται το εναρκτήριο ριβοσωματικό σύμπλοκο 70S ριβόσωμα- mrna- fmet-trna. Όταν ολοκληρωθεί η διαδικασία της έναρξης, το fmet-trna βρίσκεται στην Ρ- θέση, ενώ η Α- θέση είναι κενή (Maitra et al., 1982; Severini et al., 1991). [19]

20 Εικόνα 1.7: Έναρξη της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Α) Πρόσδεση των παραγόντων IF1 και IF3. Β) Σχηματισμός του 30S προ-εναρκτήριου συμπλόκου. C) Αλληλεπίδραση κωδικονίουαντικωδικονίου και σχηματισμός του 30S εναρκτήριου συμπλόκου. D) Απελευθέρωση των παραγόντων IF1 και IF3. Ε) Πρόσδεση της υπομονάδας 50S και απελευθέρωση του συμπλόκου IF2 - GDP (Laursen et al., 2005) ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ Ο κύκλος της επιμήκυνσης αποτελείται από ανεξάρτητα στάδια τα οποία σχετίζονται με τη διαδοχική προσθήκη αμινοξέων στην πολυπεπτιδική αλυσίδα (Εικ.1.6B). Στην αρχή του κύκλου το ριβόσωμα φέρει προσδεμένο ένα πεπτιδύλο- trna με μία αρτιγενή πολυπεπτιδική αλυσίδα στην P- θέση και μία κενή Α- θέση. Κατά την αποκωδικοποίηση εισέρχεται στην Α- θέση το επόμενο αμινοξύ σε σύμπλοκο με τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-Tu, το GTP και το ααtrna (ternary complex). Η αποκωδικοποίηση που εμπεριέχει και τον στερεοχημικό έλεγχο της συμπληρωματικότητας κωδικωνίου- αντικωδικωνίου ακολουθείται από το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού που έχει σαν αποτέλεσμα την επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας κατά ένα αμινοξύ. Η [20]

21 μετατόπιση η οποία καταλύεται από τον παράγοντα EF-G μετακινεί τα trnas και το mrna ως προς το ριβόσωμα. ΑΠΟΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΣΗ. Η αποκωδικοποίηση εξασφαλίζει ότι επιλέγεται το σωστό αα- trna για την Α- θέση. Η πρόσδεση του κατάλληλου ternary συμπλόκου στην Α- θέση του ριβοσώματος έχει σαν αποτέλεσμα την υδρόλυση του GTP από τον EF-Tu, την απελευθέρωση του συμπλόκου EF-Tu-GDP και τη μετακίνηση του αμινοακυλικού άκρου του trna της Α- θέσης μέσα στο PTC. Εικόνα 1.8: Η αναγνώριση των αλληλεπιδράσεων κωδικονίου αντικωδικονίου από το ριβόσωμα. a) Στο ριβόσωμα τα νουκλεοτίδια Α1492 και Α1493 στοιβάζονται στο εσωτερικό της έλικας h44 b) Όταν ένα συγγενικό trna προσδένεται στο mrna στην Α- θέση τα νουκλεοτίδια Α1492, Α1493 και G530 αλλάζουν διαμόρφωση ώστε να αλληλεπιδρούν με τη μικρή αύλακα που σχηματίζεται από το ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ του κωδικονίου και του αντικωδικονίου. c-e) Αλληλεπιδράσεις τις υπομονάδας 30S με το ζεύγος κωδικονίουαντικωδικονίου (Schmeing and Ramakrishnan, 2009). Η υψηλή ακρίβεια στην επιλογή του κατάλληλου trna δεν μπορεί να δικαιολογηθεί μόνο από τη διαφορά της ελεύθερης ενέργειας ανάμεσα στο σωστό και στο λάθος ζευγάρωμα κωδικονίου και αντικωδικονίου (Xia et al., 1998; Ogle and Ramakrishnan, 2005). Η περιοχή αποκωδικοποίησης διαθέτει την ικανότητα να αναγνωρίζει στερεοχημικά τη μικρή αύλακα που σχηματίζεται από το ζευγάρωμα των βάσεων μεταξύ του κωδικονίου του mrna και του [21]

22 αντικωδικονίου του trna (Ogle et al., 2001). Η περιοχή αποκωδικοποίησης εντοπίζεται στην μικρή υπομονάδα και συγκροτείται από τις έλικες h44 και h34 και το βρόγχο 530 του 16S rrna (Εικ. 1.8). Με την πρόσδεση του trna, στο mrna οι βάσεις Α1492 και Α1493, της έλικας 44, στρέφονται προς την περιοχή αποκωδικοποίησης. Η βάση Α1493 αναγνωρίζει τη μικρή αύλακα του πρώτου ζευγαριού κωδικονίου-αντικωδικονίου. Ταυτόχρονα, σχηματίζονται δεσμοί υδρογόνου μεταξύ της Α1492 και της συντηρημένης C518, καθώς και της υψηλά συντηρημένης σερίνης 46 της S12 (E.coli). H τρίτη βάση του κωδικονίου σχηματίζει δεσμό υδρογόνου με την G530, αφήνοντας την τρίτη θέση του αντικωδικονίου σχετικά ελεύθερη για wobble αλληλεπιδράσεις. Η αρχική αυτή πρόσδεση του αα-trna έχει σαν αποτέλεσμα την προσέγγιση της κεφαλής και του ώμου της μικρής κεφαλής και τη σταθεροποίηση της πρόσδεσης του trna. Αυτές οι μεταβολές επάγουν διαμορφωτικές αλλαγές στον EF-Tu, που με τη σειρά τους πυροδοτούν την υδρόλυση του GTP και την απελευθέρωση του παράγοντα (Stark et al., 2002; Valle et al., 2003). Σε αυτό το σημείο, μετά την υδρόλυση του GTP αλλά πριν το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, γίνεται ο τελικός έλεγχος για την εγκατάσταση του αα-trna στην Α- θέση (Zaher and Green, 2009). Στην περίπτωση που βρεθεί ότι το αα- trna που έχει εισέλθει στην Α- θέση δεν είναι κατάλληλο αποβάλλεται από το ριβόσωμα. Ενώ στην περίπτωση που το αα- trna είναι το κατάλληλο μετακινείται το αμινοακυλικό του άκρο μέσα στην Α- θέση του PTC (Εικ. 1.9). Το στάδιο αυτό είναι βραδύ για τα συγγενή, και ταχύ για τα πλήρως συμπληρωματικά αα-trnas (Pape et al., 1999). Η πιθανότητα να απορριφθεί ένα συγγενικό αα-trna στο στάδιο αυτό είναι ιδιαίτερα αυξημένη. Στο τέλος του σταδίου αποκωδικοποίησης το εναρκτήριο ή το πεπτιδύλο-trna βρίσκεται στην Ρ- θέση και το αα-trna στην Α- θέση. [22]

23 Εικόνα 1.9: Kinetic proofreading κατά τη διάρκεια της επιλογής του αα- trna στο ριβόσωμα. 1) Το αρχικό βήμα πρόσδεσης που αφορά την επιλογή του trna (το οποίο ελέγχεται από τις σταθερές k 1 και k -1 ) είναι μία αντίδραση ανάμεσα στο ternary σύμπλοκο και στο ριβόσωμα που δεν εξαρτάται από το κωδικόνιο. 2) Το βήμα της αποκωδικοποίησης είναι ένα εξαρτώμενο από το κωδικόνιο βήμα το οποίο ελέγχεται από τις σταθερές k 2 και k -2. 3) Στο βήμα της ενεργοποίησης της GTPάσης (το οποίο ελέγχεται από τις σταθερές k 3 και k -3 ) το ενεργό κέντρο του EF-Tu υφίσταται διαμορφωτικές αλλαγές. 4) Το επόμενο βήμα της υδρόλυσης του GTP είναι μη αντιστρεπτό και είναι σημαντικό για τη διαδικασία του proofreading (ελέγχεται από τη σταθερά k GTP ). 5) Η απελευθέρωση του παράγοντα EF-Tu ακολουθείται από τη διαδικασία του proofreading κατά την οποία το αα- trna είτε μετακινείται στην Α- θέση του ριβοσώματος, στο κέντρο της PTase (accomodation) είτε απομακρύνεται από το ριβόσωμα. Το accomodation ρυθμίζεται από τη σταθερά k 5 και εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις κωδικονίουαντικωδικονίου (Zaher and Green, 2009). ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΠΕΠΤΙΔΙΚΟΥ ΔΕΣΜΟΥ. Ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού λαμβάνει χώρα στο ενεργό κέντρο του ριβοσώματος, το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η α- αμινομάδα του προσδεδεμένου αα-trna στην Α-θέση, προσβάλλει την καρβονυλομάδα του εστερικού δεσμού που συνδέει τη νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα με το trna της P-θέσης (Beringer and Rodnina, 2007; Frank et al., 2007; Schmeig and Ramakrishnan, 2009; Simonovic and Steitz, 2009). Το αα-trna της Α-θέση γίνεται πεπτιδυλο-trna που έχει επιμηκυνθεί [23]

24 κατά ένα αμινοξύ, ενώ το πρώην πεπτιδυλο-trna στην P-θέση παραμένει ως αποακυλιωμένο trna γιατί το πεπτίδιο μεταφέρθηκε ήδη στην Α- θέση (Vesper and Nierhaus, 2004). Το κέντρο της PTC συγκροτείται από συντηρημένα νουκλεοτίδια (όπως Α2451, U2506, U2585, C2452 και A2602) και αμινοξέα της πρωτεΐνης L27 (Polacek and Mankin, 2005). Αρχικές μελέτες είχαν υιοθετήσει την υπόθεση, ότι ο μηχανισμός κατάλυσης βασίζεται στην ορθή εγκατάσταση των υποστρωμάτων ή/και στην οξεοβασική δράση ειδικών ομάδων του 23S rrna και του trna, χωρίς ωστόσο να έχει επιβεβαιωθεί απολύτως ακόμη και σήμερα (Zaher et al., 2011). ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ Μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, ο παράγοντας EF-G, συμπλοκοποιημένος με GTP, δεσμεύεται στο ριβόσωμα πυροδοτώντας έτσι την μετατόπιση του πεπτίδυλο-trna από την Α-στην Ρ-θέση και του αποακυλιωμένου trna από την Ρ- στην Ε-θέση του ριβοσώματος με μετακίνηση του mrna κατά ένα κωδικόνιο (10-15 Å) (Εικ. 1.10). Κατά την μετατόπιση, το GTP υδρολύεται και ο παράγοντας EF-G απελευθερώνεται από το ριβόσωμα με τη μορφή EF-G- GDP. Οι παράγοντες EF-Tu και EF-G προσδένονται σε αλληλεπικαλυπτόμενες θέσεις στη βάση του μίσχου L7/L12 (Agrawal et al., 2000; Frank and Agrawal, 2000; Stark et al., 2000) ενώ τμήμα του EF-G καλύπτει την Α-θέση, εμποδίζοντας την παλινδρόμηση του πεπτιδυλοtrna στη θέση αυτή κατά την μετατόπιση (Nierhaus, 1998). Η μετατόπιση καθιστά ικανό το επόμενο EF-Tu GTP αα-trna σύμπλοκο να έχει πρόσβαση στο νέο κωδικόνιο που παρουσιάζεται στην Α- θέση. Έτσι, ο κύκλος της επιμήκυνσης συνεχίζεται. Η μετατόπιση περιλαμβάνει πολλαπλές αλλαγές στη διαμόρφωση του ριβοσώματος. Συγκεκριμένα ξεκινάει με μία κίνηση της 30S υπομονάδας προς την 50S (Valle et al., 2003; Horan et al., 2007), ακολουθεί περιστροφή της κεφαλής της μικρής υπομονάδας (Schuwirth et al., 2005; Spahn et al., 2004; Spahn et al., 2010) και ξεκλείδωμα της αύλακας πρόσδεσης του trna ώστε να επιτραπεί στο πεπτιδύλο-trna της P- θέσης να περάσει στην E- θέση (Schuwirth et al., 2005; Pan et al., 2007). Αυτές οι διαμορφωτικές αλλαγές οδηγούν σε ξεχωριστές κινήσεις τον προσδεδεμένων trnas, κατά τις οποίες τα trnas κινούνται πρώτα σε σχέση με την 50S ύπομονάδα σε υβριδικές θέσεις [24]

25 πρόσδεσης και έπειτα κινούνται σε σχέση με τη μικρή υπομονάδα (Moazed and Noller, 1989). Την τελευταία δεκαετία βρέθηκε ότι εκτός από τη μετατόπισή του προς τα εμπρός το ριβόσωμα μπορεί να μετατοπιστεί και προς την αντίθετη κατεύθυνση (retrotranslocation) (Shoji et al., 2006; Konevega et al., 2007). Ο παράγοντας ο οποίος καταλύει το back- translocation είναι μία πρωτεΐνη, γνωστή ως LepA ή 4 ος παράγοντας επιμήκυνσης. Αν και η LepA προσομοιάζει δομικά με τον παράγοντα EF-G, η διαδικασία της μετατόπισης προς την αντίθετη κατεύθυνση έχει διαφορετικά ενδιάμεσα στάδια (Qin et al., 2006; Connell et al., 2008; Liu et al., 2010). Εικόνα 1.10: Μετατόπιση η οποία καταλύεται από τον παράγοντα EF-G (Schmeing and Ramakrishnan, 2009) ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΝΘΕΣΗΣ ΚΑΙ ΑΝΑΚΥΚΛΩΣΗ ΤΩΝ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΩΝ ΥΠΟΜΟΝΑΔΩΝ. Η διαδικασία τερματισμού αρχίζει, όταν ένα κωδικόνιο τερματισμού του mrna βρεθεί στην Α-θέση (Εικ. 1.11). Στα βακτήρια, η αναγνώριση του κωδικονίου τερματισμού εμπλέκει δύο παράγοντες απελευθέρωσης, RF1 και RF2 (Caskey et al., 1984; Weiss et al., 1984; Craigen et al., 1985). Και οι δύο παράγοντες αναγνωρίζουν το κωδικόνιο UAA. Ωστόσο το UAG αναγνωρίζεται από τον RF1, ενώ το κωδικόνιο UGA αναγνωρίζεται από τον RF2. [25]

26 Η πρόσδεση του RF1/2 στο ριβόσωμα με το κατάλληλο κωδικόνιο τερματισμού στην Α-θέση προκαλεί την υδρόλυση και την απελευθέρωση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας από το trna στην P-θέση. Δεν είναι γνωστό, αν ο RF1/2 συμμετέχει απευθείας στην κατάλυση ή αν ενισχύει την κατάλυση από το ριβόσωμα. Ο παράγοντας RF3 προωθεί τον γρήγορο αποχωρισμό των RF1 και RF2. Η πρόσδεση του RF3 στο ριβόσωμα διευκολύνει την δραστηριότητα του ως GTPάσης με ταυτόχρονη απελευθέρωση των RF1/2. Πιο πρόσφατες έρευνες έχουν δείξει ότι η υδρόλυση του πεπτιδύλο trna από το RF1/2 απαιτείται για την πρόσδεση του GTP επί του RF3 στο ριβόσωμα (Gao et al., 2007). Αυτό οδηγεί στην προσαρμογή του RF3, ώστε να αποκτήσει υψηλή συγγένεια για το ριβόσωμα και στην απελευθέρωση των RF1/2. Η υδρόλυση του GTP απαιτείται για την επακόλουθη απελευθέρωση του RF3. Ο RF3 δεν είναι απαραίτητος στα βακτήρια (Zavialov et al., 2001). Εικόνα 1.11: Κρυσταλλική δομή του 70S ριβοσώματος σε σύμπλοκο με τους παράγοντες τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης (Korostelev, 2011). Η ανακύκλωση (Εικ. 1.6D) μπορεί να θεωρηθεί και το τέταρτο στάδιο της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Κατά τη διάρκεια του τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης ο παράγοντας RRF σε συνεργασία με τους παράγοντες EF-G και IF3 προωθεί το διαχωρισμό του ριβοσώματος στις ριβοσωματικές υπομονάδες (Karimi et al., 1999; Hirokawa and Demeshkina, 2006). Υπάρχουν δύο μοντέλα που σχετίζονται με τη δράση των RRF και EF-G (Karimi et al., 1999; Peske et [26]

27 al., 2005; Zavialov et al., 2005; Hirokawa and Demeshkina, 2006; Gao et al., 2005). Στο πρώτο μοντέλο (Hirokawa and Demeshkina, 2006), οι RRF και EF-G δεν καταλύουν μόνο το διαχωρισμό του 70S ριβοσώματος στις υπομονάδες του αλλά επιπλέον καταλύουν την απελeυθέρωση του mrna και του trna. Στο δεύτερο μοντέλο (Karimi et al., 1999; Peske et al., 2005; Zavialov et al., 2005; Gao et al., 2005), οι παράγοντες RRF και EF-G καταλύουν μόνο το διαχωρισμό του 70S ριβοσώματος στις υπομονάδες του και απαιτείται ο παράγοντας IF3 για την απελευθέρωση του trna, ενώ στη συνέχεια το mrna απελευθερώνεται αυθόρμητα (Εικ. 1.12). Εικόνα 1.12: Μοντέλο διαχωρισμού του ριβοσώματος στις ριβοσωματικές του υπομονάδες. (Α) Το post termination complex (posttc). (B) Η πρόσδεση του RRF στο posttc επάγει την περιστροφή των ριβοσωματικών υπομονάδων. (C) Το σύμπλοκο EF-G GDP προσδένεται στο ριβόσωμα και καταλύει την ανταλλαγή του GDP με το GTP στον EF-G. (D) Το σύμπλοκο EF-G GΤP συναγωνίζεται με τον RRF για την πρόσδεση στην Α- θέση του ριβοσώματος. (Ε),(F) Η υδρόλυση του GTP που είναι προσδεμένο στον EF-G οδηγεί στο σχηματισμό του συμπλόκου EF-G GDP P i. Μετά την απελευθέρωση του ανόργανου φωσφόρου δημιουργείται το σύμπλοκο EF-G GDP και αυτό οδηγεί στον αποχωρισμό των ριβοσωματικών υπομονάδων. (G) Ο IF3 προσδένεται στη μικρή υπομονάδα και εμποδίζει τη σύνδεσή της με τη μεγάλη. (Η) Το mrna απελευθερώνεται από τη 30S υπομονάδα σε σύμπλοκο με τον IF3 (Zavialov et al., 2005). [27]

28 1.4 Αντιβιοτικά ΣΤΟΧΟΙ ΤΩΝ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΩΝ Ο όρος αντιβιοτικό χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά από το Selman Waksman και τους συνεργάτες του για να περιγράψουν οποιαδήποτε ουσία παράγεται από μικροοργανισμούς, και η οποία ανταγωνίζεται την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών. Τα αντιβιοτικά μπορεί να παράγονται από μύκητες και βακτήρια (φυσικά) ή να είναι ημισυνθετικά ή συνθετικά παράγωγα. Ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους τα αντιβιοτικά διακρίνονται σε αυτά που αναστέλλουν: α) τη σύνθεση του DNA, όπως η μετρονιδαζόλη, β) τη σύνθεση του RNA, όπως η ριφαμπικίνη, γ) τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, όπως οι κεφαλοσπορίνες, δ) τη λειτουργία της κυτταρικής μεμβράνης, όπως τα πεπτίδια και ε) την βακτηριακή πρωτεϊνική σύνθεση, όπως τα μακρολίδια και οι οξαζολιδινόνες (Εικ. 1.13). Εικόνα 1.13 Στόχοι των αντιβιοτικών (Coates et al., 2002). [28]

29 1.4.2 ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ ΠΟΥ ΔΡΟΥΝ ΣΤΟ ΡΙΒΟΣΩΜΑ. Ένας μεγάλος αριθμός φυσικών, ημισυνθετικών και συνθετικών αντιβιοτικών αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των παθογόνων βακτηρίων μέσω της πρόσδεσή τους στο ριβόσωμα των βακτηρίων, παρεμβαίνοντας με αυτό τον τρόπο στην πρωτεϊνική σύνθεση (Sohmen et al., 2009). Για δεκαετίες οι αναστολείς της πρωτεϊνικής σύνθεσης που δρουν στο ριβόσωμα αποτελούν από τα πιο επιτυχημένα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται κλινικά. Τα τελευταία χρόνια, έχει σημειωθεί σημαντική πρόοδος στην κατανόηση του μηχανισμού πρόσδεσης και δράσης των αντιβιοτικών στο ριβόσωμα και του πως ακριβώς παρεμβαίνουν στην πρωτεϊνοσύνθεση (Wilson, 2009). Η κρυσταλλογραφική απεικόνιση του ριβοσώματος μας έδωσε πολλές πληροφορίες αναφορικά με τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αντιβιοτικών και του rrna. Η πρόοδος στις βιοχημικές τεχνικές μας επιτρέπει να κατανοήσουμε, πως η πρόσδεση ενός μικρού μορίου μπορεί να παρεμβαίνει στις λειτουργίες ενός ενζύμου που είναι μεγαλύτερο κατά τέσσερις τάξεις μεγέθους από τον αναστολέα (Tenson and Mankin, 2006). Από τα κρυσταλλογραφικά δεδομένα φαίνεται ότι τα αντιβιοτικά στοχεύουν κυρίως στα λειτουργικά κέντρα του ριβοσώματος, δηλαδή στο κέντρο αποκωδικοποίησης της μικρής υπομονάδας, στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης της μεγάλης υπομονάδας και στο παρακείμενο κανάλι εξόδου της μεγάλης υπομονάδας. Στην εικόνα 1.14 παρουσιάζονται οι κατηγορίες των αντιβιοτικών που εμπλέκονται στα διάφορα στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης. [29]

30 Εικόνα 1.14 : Σχηματική απεικόνιση που παρουσιάζει τις περιοχές δράσης των αντιβιοτικών στα διάφορα στάδια της πρωτεϊνοσύνθεσης (Wilson, 2009) ΟΞΑΖΟΛΙΔΙΝΟΝΕΣ- ΛΙΝΕΖΟΛΙΔΗ Μέχρι το τέλος του προηγούμενου αιώνα, η ανάπτυξη των αντιβιοτικών βασιζόταν, είτε στην απομόνωση νέων φυσικών προϊόντων, είτε στη τροποποίηση των ήδη υπαρχόντων. Η συνεχώς αυξανόμενη όμως ανθεκτικότητα που εμφανίζουν τα βακτήρια έχει δημιουργήσει την επιτακτική ανάγκη για τη συνεχή εύρεση νέων πιο αποτελεσματικών αντιβιοτικών. Έτσι, την σκυτάλη ανέλαβε ο σχεδιασμός και η χημική σύνθεση, επιτυχημένο προϊόν των οποίων αποτελούν και οι οξαζολιδιλόνες. Οι οξαζολιδινόνες είναι δηλαδή οικογένεια συνθετικών αντιβιοτικών, η οποία έχει ανακαλυφθεί τα τελευταία χρόνια. Οι οξαζολιδινόνες συντέθηκαν από χημικούς στο E.I. du Pont de Nemours & Co. στα μέσα της δεκαετίας του '80 (Slee et al., 1987; Gregory et al., 1989). Αν και αυτές οι συνθετικές ενώσεις ήταν δραστικές έναντι Gram- θετικών βακτηρίων, όπως τα στελέχη Staphylococci, Streptococci και Enterococci, δεν χρησιμοποιήθηκαν κλινικά καθώς βρέθηκαν τοξικές σε μελέτες που έγιναν σε οργανισμούς μοντέλα (Barbachyn et al., 2003). Ερευνητές σε φαρμακευτικές εταιρίες βρήκαν ότι η τοξικότητα αυτή των οξαζολιδινονών σχετίζεται με τη δομή τους και ξεκίνησαν μία προσπάθεια να [30]

31 εξελίξουν αυτές τις συνθετικές ενώσεις, ώστε να καταστούν κατάλληλοι αντιμικροβιακοί παράγοντες. Το αποτέλεσμα αυτής της προσπάθειας ήταν η ανακάλυψη της λινεζολίδης (Εικ. 1.15), η οποία πήρε την έγκριση από το FDA το 2000 και κυκλοφορεί με την εμπορική ονομασία Zyvox (Barrett, 2000). Χρησιμοποιείται κλινικά για την καταπολέμηση λοιμώξεων του δέρματος και του αναπνευστικού συστήματος που προκαλούνται από στελέχη στρεπτόκοκκου και σταφυλόκοκκου και στελέχη εντερόκοκκου που είναι ανθεκτικά στην βαγκομυκίνη (Αment et al., 2002). Το μόριο της λινεζολίδης αποτελείται από τέσσερα διαφορετικά τμήματα, τρεις αρωματικούς δακτύλιους και μία ακεταμιδομέθυλο ουρά (Εικ. 1.15). Ο δακτύλιος-α παριστά το φαρμακοκινητικό δακτύλιο της οξαζολιδινόνης, από τον οποίο αυτή η τάξη έχει πάρει το όνομά της. O Ring C N F Ring B O N O Ring A HN O Εικόνα 1.15: Χημική δομή λινεζολίδης. Διακρίνονται οι τρεις αρωματικοί δακτύλιοι (Α- C) και η ακεταμιδομέθυλο ουρά. Η λινεζολίδη προσδένεται στο κέντρο της PTase σε θέση που αποτελείται από καθολικά συντηρημένα νουκλεοτίδια και είναι τοποθετημένη με τέτοιο τρόπο ώστε ο δακτύλιος C να προσανατολίζεται προς το καταλυτικό κέντρο, ενώ ο δακτύλιος Α καθώς και η ακεταμιδομέθυλο ουρά να είναι [31]

32 προσανατολισμένα προς το κανάλι εξόδου. Πιο συγκεκριμένα ο δακτύλιος Α προσδένεται στη βάση U2504 και η ακεταμιδομέθυλο ουρά εκτείνεται προς την A2503. Ο δακτύλιος Β βρίσκεται ανάμεσα στο νουκλεοτίδιο A2451 και το U2506 (Εικ. 1.16) (Wilson et al., 2008). Με εξαίρεση τo U2585, κατά τη δέσμευση της λινεζολίδης δεν έχει παρατηρηθεί σημαντική αλλαγή στη διαμόρφωση του RNA που σχηματίζει το θύλακα σύνδεσης. Στη φυσιολογική δομή της 50S υπομονάδας του D. Radiodurans, το U2585 φαίνεται να είναι εξαιρετικά ευέλικτο και να έχει χαμηλή ηλεκτρονιακή πυκνότητα, γεγονός το οποίο συμφωνεί με τις πολλαπλές διακριτές θέσεις που υιοθετεί το συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο κατά τη διάρκεια των αλλαγών της διαμόρφωσης του ριβοσώματος (Wilson et al., 2008). Κατά τη σύνδεση της λινεζολίδης, ωστόσο, παρατηρείται αύξηση της ηλεκτρονιακής πυκνότητας της βάσης υποδεικνύοντας ότι η λινεζολίδη σταθεροποιεί το U2585 με άμεση αλληλεπίδραση. Η ευελιξία του U2585 είναι σημαντική για την επαγόμενη δέσμευση του Ρ-tRNA στο κέντρο της PTase (Schmeing et al., 2005) και έχει βρεθεί ότι η πρόσδεση των trnas στο κέντρο της PTase παρεμποδίζεται από τη μετάλλαξη του U2585 (Green et al., 1997). Επομένως, η μη λειτουργική διαμόρφωση του U2585 παρουσία του αντιβιοτικού μπορεί να συμβάλει στην ανασταλτική δράση της λινεζολίδης στο σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού (Wilson et al., 2008) και είναι ανάλογη με την επίδραση που παρατηρείται στο U2585 όταν προσδένεται στρεπτογραμίνη Β στο PTC (Harms et al., 2004). [32]

33 Εικόνα 1.16: Α) Κρυσταλλική δομή της 50S υπομονάδας του D. radiodurans, στην οποία τονίζεται με κόκκινο χρώμα η θέση πρόσδεσης της λινεζολίδης και με μπλε οι πρωτεΐνες L1 και L11, B) Παρατηρούμε τη λινεζολίδη (ροζ χρώμα) στη θέση πρόσδεσής της που αποτελείται από οκτώ καθολικώς συντηρημένα νουκλεοτίδια (μπλε) του 23S rrna (Wilson et al., 2008) ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΣ ΔΡΑΣΗΣ ΛΙΝΕΖΟΛΙΔΗΣ Μετά την έναρξη της πρωτεϊνοσύνθεσης το εναρκτήριο trna βρίσκεται στην P-θέση του ριβοσώματος. Η πρόσδεση αυτή του trna επάγει μία συγκεκριμένη διαμόρφωση του U2585 (P i κατάσταση) (Εικ. 1.17Α) (Schmeing et al., 2005). Το αα- trna εισέρχεται στην Α- θέση σε σύμπλοκο με τον παράγοντα EF-Tu και το GTP (τριμερές σύμπλοκο) και προσδένεται αρχικά με τέτοιο τρόπο ώστε να βρίσκεται σε μία Α/Τ κατάσταση (Εικ. 1.17Β) και στη συνέχεια μεταπίπτει σε μία Α/Α κατάσταση (Εικ. 1.17C) (Blanchard, 2004) για να βρεθεί τελικά το ριβόσωμα στην Pre- translocation διαμόρφωση με trnas στην Α- και στην P-θέση (Εικ. 1.17C). Ακολουθεί ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού κατά τον οποίο η αρτιγενής πολυπεπτιδική αλυσίδα μεταφέρεται στο trna της Α- θέσης. Στη συνέχεια ο EF-G καταλύει την μετατόπιση των trnas [33]

34 από την Pre- στην Post- translocation κατάσταση (Εικ.1.17D). Η λινεζολίδη μπορεί να προσδένεται στην ελεύθερη Α- θέση μίας 50S υπομονάδας ή ενός ριβοσώματος που βρίσκεται στην P i κατάσταση (Sander et al., 2002; Burghardt et al., 1998) και σταθεροποιεί το U2585 σε μία μη λειτουργική διαμόρφωση (Εικ. 1.17Ε). Επειδή για τη σωστή τοποθέτηση του εναρκτήριου trna απαιτείται η κατάλληλη διαμόρφωση του U2585 (Green et al., 1997) η δέσμευση της λινεζολίδης επηρεάζει έμμεσα την πρόσδεση ή/ και την τοποθέτηση του εναρκτήριου trna στην P- θέση (Aoki, 2002) αλλά δεν επηρεάζει την πρόσδεση του τριμερούς συμπλόκου (Εικ. 1.17F) (Matassova, 1999). Ωστόσο μετά την υδρόλυση του GTP και την αποδέσμευση του EF-Tu, το αα- trna δε μπορεί να πάρει την τελική του διαμόρφωση στην Α- θέση του PTC, καθώς η διαμόρφωση αυτή μπλοκάρεται από τη λινεζολίδη (Εικ. 1.17G) και για αυτό αποσυνδέεται από το ριβόσωμα, με τρόπο ανάλογο όπως η τετρακυκλίνη (1.17Η) (Blanchard, 2004). Η απώλεια του trna της Α- θέσης κατά την επιμήκυνση αφήνει το πεπτιδύλο- trna στην P- θέση, το ριβόσωμα θεωρείται κλειδωμένο και δεν αποτελεί πλέον υπόστρωμα για τον παράγοντα EF-G (Εικ. 1.17Η) (Zavialov and Ehrenberg, 2003). Εικόνα 1.17: Μοντέλο της ανασταλτικής δράσης των οξαζολιδινονών κατά τη διάρκεια της πρωτεϊνοσύνθεσης. (Α-D) Γεγονότα που συμβαίνουν φυσιολογικά κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. (Ε-Η) Γεγονότα που συμβαίνουν παρουσία της λινεζολίδης κατά την πρωτεϊνοσύνθεση (Wilson et al., 2008). [34]

35 1.4.5 ΑΝΘΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΤΗ ΛΙΝΕΖΟΛΙΔΗ Η θέση στην οποία προσδένεται η λινεζολίδη αποτελείται αποκλειστικά από RNA και μέχρι πρόσφατα οι μόνες μεταλλάξεις οι οποίες ήταν γνωστό ότι προκαλούσαν ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη αφορούσαν το 23S rrna. Η θέση πρόσδεσης της λινεζολίδης αποτελείται από καθολικώς συντηρημένα νουκλεοτίδια και πιο συγκεκριμένα τα G2061, A2451, C2452, A2503, U2504, G2505, U2506 και U2585 τα οποία αλληλεπιδρούν απευθείας με το αντιβιοτικό (Εικ. 1.18) (Wilson et al., 2008). Τα στελέχη που έχουν μελετηθεί λόγω της ανθεκτικότητας που εμφανίζουν στη λινεζολίδη φέρουν μεταλλάξεις στα νουκλεοτίδια G2061, C2452, A2503, U2504 και G2505 του 23S rrna τα οποία έρχονται σε επαφή με το μόριο του αντιβιοτικού αλλά και σε νουκλεοτίδια που δεν έρχονται σε άμεση επαφή όπως τα A2062, G2447, A2453, C2499, U2500 και G2576 (Carsenti-Dellamonica, 2005; Feng, 2009; Hillemann et al., 2008). O μηχανισμός ανθεκτικότητας δεν είναι ίδιος σε όλους τους οργανισμούς, καθώς οι μεταλλάξεις αφορούν διαφορετικές θέσεις στον εκάστοτε οργανισμό με μικρή μόνο επικάλυψη ανάμεσα στους H. halobium, E. coli, E. faecalis, E. faecium, M. smegmatis, M. tuberculosis, S. aureus, and S. Pneumonia (Εικ. 1.18). Ο βαθμός της ανθεκτικότητας των διαφόρων οργανισμών στη λινεζολίδη που οφείλεται σε μεταλλάξεις δεν εξαρτάται μόνο από την απόσταση που έχουν τα μεταλλαγμένα νουκλεοτίδια από τη θέση πρόσδεσης της λινεζολίδης, καθώς μεταλλάξεις σε νουκλεοτίδια, όπως το G2576 και το G2447, προκαλούν σημαντική αντίσταση στο αντιβιοτικό, προφανώς λόγω έμμεσων μεταβολών που έχουν σχέση κυρίως με κάποια αλλαγή διαμόρφωσης που επιφέρουν οι μεταλλάξεις στη θέση πρόσδεσης του αντιβιοτικού. [35]

36 Εικόνα 1.18: Δευτεροταγής δομή του δακτυλίου της PTC του 23S rrna του M. Smegmatis με αρίθμηση E. coli. Υποδεικνύονται τα νουκλεοτίδια που αλληλεπιδρούν άμεσα με τη λινεζολίδη με μαύρα τρίγωνα, οι θέσεις μετάλλαξης στις οποίες οφείλεται η ανθεκτικότητα στη λινεζολίδη με κίτρινους κύκλους, οι θέσεις μετάλλαξης οι οποίες επηρεάζουν σημαντικά το MIC της λινεζολίδης με έντονους χαρακτήρες ενώ αυτές που έχουν μικρότερη επίδραση στο MIC με κανονικούς χαρακτήρες. Οι μεταλλάξεις και οι οργανισμοί στους οποίους εμφανίζονται συμβολίζονται ως εξής: Ec (E. coli), Sa (S. aureus), Se (S. epidermidis), Sh (S. haemolyticus), Sp (S. pneumoniae), Es (E. faecalis), Em (E. faecium), Ms (M. smegmatis), Mt (M. tuberculosis) and Hh (H. halobium). ( Long et al., 2011). Η πιο συχνά παρατηρούμενη μετάλλαξη σε ανθεκτικά στη λινεζολίδη βακτηριακά στελέχη είναι η μετάλλαξη του νουκλεοτιδίου G2576U του 23S rrna. Αυτή η μετάλλαξη έχει εντοπιστεί τόσο σε στελέxη σταφυλόκοκκου όσο και σε στελέχη εντερόκοκκου (Bonilla et al., 2010; Endimiani, 2011; Kelly, 2008) και υπάρχει μία ξεκάθαρη συσχέτιση ανάμεσα στον αριθμό των μεταλλαγμένων rrna οπερονίων και του MIC της λινεζολίδης (Ikeda-Dantsuji, 2011; Besier et al., 2008). Οι περισσότερες αναφορές της μετάλλαξης G2576U σχετίζονται με στελέχη που έχουν απομονωθεί από ασθενείς σε νοσοκομεία οι οποίοι έχουν υποστεί παρατεταμένης διάρκειας θεραπεία με λινεζολίδη (Hill, 2010). Υπογραμμίζεται έτσι, η σημασία της σωστής χρήσης της λινεζολίδης [36]

37 κλινικά. Αν και σε ορισμένες μελέτες έχει αναφερθεί αναστροφή της μετάλλαξης G2576U όταν απουσιάζει η λινεζολίδη από το θρεπτικό υλικό (Meka et al., 2004; Swoboda et al., 2005), μία πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η μετάλλαξη αυτή διατηρήθηκε ακόμα και όταν χρησιμοποιήθηκε 30 φορές θρεπτικό υλικό χωρίς λινεζολίδη (Mazzariol, 2011). Ένα άλλο είδος μεταλλάξεων το οποίο φαίνεται να είναι υπεύθυνο για την εμφάνιση ανθεκτικών στη λινεζολίδη στελεχών είναι οι μεταλλάξεις στην L3 και στην L4 ριβοσωματική πρωτεΐνη. Το μεγαλύτερο τμήμα της πρωτεΐνης L3 βρίσκεται στην επιφάνεια της υπομονάδας 50S αλλά μία θηλιά της προεκτείνεται εσωτερικά της υπομονάδας μέχρι το κέντρο της PTase (Εικ. 1.19). Μεταλλάξεις της L3 πρωτεΐνης έχουν συσχετιστεί από το 2003 με την ανθεκτικότητα που εμφανίζουν βακτηριακά στελέχη στη λινεζολίδη, την τιαμουλίνη και την ανισομυκίνη, τα οποία προσδένονται σε επικαλυπτόμενες θέσεις στο PTC (Bosling et al., 2003). Τμήμα της L4 πρωτεΐνης τοποθετείται επίσης σχετικά κοντά στο κέντρο της PTase (Εικ. 1.19), συγκεκριμένα στο κανάλι εξόδου της πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Καθώς η αλληλούχιση γονιδίων βακτηριακών στελεχών που είναι ανθεκτικά στο αντιβιοτικό γίνεται όλο και πιο συνηθισμένη, αποκαλύπτονται πολλές μεταλλάξεις οι οποίες όμως δεν σχετίζονται όλες με την παρατηρούμενη ανθεκτικότητα. Μερικές μεταλλάξεις μπορεί να είναι απλά τυχαίες αλλαγές χωρίς να προκαλούν κάποια σημαντική λειτουργική απόκλιση, ενώ άλλες μπορεί να σχετίζονται με την εμφάνιση ανθεκτικότητας στα στελέχη αυτά. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζεται από το γεγονός ότι πολλές από τις μεταλλάξεις στις L3 και L4 πρωτεΐνες που συναντώνται σε ανθεκτικά στελέχη συνδυάζονται με μεταλλάξεις στο 23S rrna κοντά στο PTC (Long et al., 2010; Pringle et al., 2004; Hidalgo et al., 2011). Η μόνη γνωστή μεταβιβάσιμη μορφή ανθεκτικότητας στη λινεζολίδη σχετίζεται με το γονίδιο cfr, το οποίο κωδικοποιεί μία rrna μεθυλοτρανσφεράση (Kehrenberg et al., 2005). Η μοναδική τροποποίηση που έχει βρεθεί να προκαλεί η μεθυλοτρανσφεράση αυτή στο φυσικό RNA μέχρι τώρα είναι ότι προσθέτει μία μέθυλο ομάδα στη θέση C-8 του νουκλεοτιδίου Α2503 του 23S rrna (Giessing, 2009). Σε αυτή τη μεθυλίωση οφείλεται η ανθεκτικότητα που παρουσιάζουν διάφορα στελέχη σε πέντε διαφορετικές τάξεις αντιβιοτικών τα οποία προσδένονται σε επικαλυπτόμενες αλλά όχι στις ίδιες [37]

38 θέσεις στο PTC (Long et al., 2006). H μεθυλίωση αυτή αφορά νουκλεοτίδιο που βρίσκεται στο PTC και η άμεση αλληλεπίδρασή του με το αντιβιοτικό υποστηρίζεται από την κρυσταλλογραφική απεικόνιση της λινεζολίδης προσδενόμενης στη 50S υπομονάδα των D. radiodurans και H. Marismortui (Wilson et al., 2008). Εικόνα 1.19: Τμήματα των ριβοσωματικών πρωτεϊνών L3 (μωβ χρώμα) και L4 (πράσινο χρώμα) εκτείνονται μέσα στο PTC, εκεί όπου προσδένεται η λινεζολίδη (κόκκινο χρώμα). Διακρίνονται επιλεγμένα αμινοξέα με αρίθμηση που αντιστοιχεί στο S. aureus ( Long and Vester, 2011). [38]

39 2. ΣΤΟΧΟΣ Ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα στην αντιμετώπιση λοιμώξεων είναι η αυξανόμενη ανθεκτικότητα των βακτηρίων στα αντιβιοτικά, η οποία δημιουργεί την επιτακτική ανάγκη για την εύρεση νέων πιο αποτελεσματικών αντιβιοτικών. Η λινεζολίδη είναι ένα συνθετικό αντιβιοτικό που ανήκει στην οικογένεια των οξαζολιδινονών. Προσδένεται στο κέντρο της πεπτιδύλοτρανσφεράσης αναστέλλοντας την πρωτεϊνική σύνθεση. Χρησιμοποιείται κλινικά από το 2000 για τη θεραπεία λοιμώξεων που προκαλούνται κυρίως από θετικούς κατά Gram παθογόνους μικροοργανισμούς. Αν και αποτελεί αντιβιοτικό νέας γενιάς, έχουν ήδη αναφερθεί ανθεκτικά βακτηριακά στελέχη. Η ανθεκτικότητα έχει συσχετισθεί με συγκεκριμένες μεταλλάξεις κυρίως στο 23S rrna και δευτερευόντως στις ριβοσωματικές πρωτεΐνες. Πρόσφατα δημοσιεύτηκε (Pournaras et al., 2013) ότι το στέλεχος του Staphylococcus epidermidis Α2864 το οποίο έφερε παρόμοιες μεταλλάξεις ανθεκτικότητας, όχι μόνο δεν αναστέλλεται από τη λινεζολίδη, αλλά παρουσία του αντιβιοτικού αναπτύσσεται ταχύτερα από το αγρίου τύπου. Πρόκειται δηλαδή για μία από τις ελάχιστες περιπτώσεις της βιβλιογραφίας, που η παρουσία του αντιβιοτικού όχι μόνο δεν είναι αποτελεσματική λόγω των μεταλλάξεων αλλά αντίθετα, αποτελεί προϋπόθεση ταχείας ανάπτυξης του στελέχους Η λινεζολίδη είναι γνωστό ότι δρα στο ριβόσωμα για αυτό το λόγο προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε πιθανές μεταβολές που προκαλεί η παρουσία της στη λειτουργία και στη δομή των ριβοσωμάτων του συγκεκριμένου στελέχους που αναφέραμε παραπάνω προκειμένου να εξηγήσουμε την ταχύτερη ανάπτυξή του παρουσία του αντιβιοτικού αλλά και γενικότερα την ιδιόρρυθμη συμπεριφορά αυτών των ριβοσωμάτων. [39]

40 [40]

41 ΥΛΙΚΑ- ΜΕΘΟΔΟΙ [41]

42 3. Υλικά Χημικές ουσίες και αντιδραστήρια Α Αδενοσίνη 5 τριφωσφορική [ATP, adenosine triphosphate] από Sigma Aldrich Αιθανόλη (C 2 H 5 OH) από AppliChem B β-μερκαπτοαιθανόλη (β-etsh), από Sigma Aldrich Γ Γουανοσίνη 5 τριφωσφορική [GTP, guanosine triphosphate] από Sigma- Aldrich Γλυκερόλη από Μerck Δ Διάλυμα Bradford από Sigma- Aldrich Ε ΕDTA, από Sigma-Aldrich Εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) από Duchefa Εκχύλισμα κρέατος (peptone from meat) από Duchefa Κ KOH από Merck M Μεθανόλη από Merck [42]

43 Μεμβράνες διαπίδυσης από Serva O Ολικό trna (crude) από Ε. Coli Οξικό κάλιο (CH 3 COOK) Οξικό μαγνήσιο [(CH 3 COO) 2 Mg], από Merck Οξικό νάτριο (CH 3 COONa) από Merck Οξικός αιθυλεστέρας (CH 3 COOC 2 H 5 ) από Merck Π Πολυουριδυλικό οξύ [poly U] από Sigma Aldrich Πουρομυκίνη από Sigma Aldrich Ρ Ραδιενεργή φαινυλαλανίνη ([2,3,4,5,6-Η 3 ]Phe), ειδικής ραδιενέργειας 4,70Tbq/mmol, 118 Ci/mmol, από Amersham Biosiences Inc. Σ Σουκρόζη [Sucrose] από MP Biomedicals Σπερμιδίνη τριυδροχλωρική, από Sigma Aldrich Σπερμίνη τετραϋδροχλωρική, από Sigma Aldrich Τ TCA στερεό ( CCl 3 COOH ), από Merck trna phe, από E.Coli Τρις (υδροξυμεθυλ)-αμινομεθάνιο [(CH 3 O) 3 CNH 2 ], από MP Biomedicals Υ Υγρό σπινθηρισμού Filter-count, από Perkin Elmer Υγρό σπινθηρισμού Optifluor, από Perkin Elmer Υδροξείδιο του καλίου (KOH) [43]

44 Υδροξείδιο του νατρίου (ΝaΟΗ), από Merck Υδροχώριο (HCl), από Merck Φ Φαινόλη (C 6 H 6 O) από Sigma- Aldrich Φαινυλαλανίνη Φίλτρα κυτταρίνης 3ΜΜ από Whatman, UK Φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης τύπου ΗΑ, διαμέτρου 24 nm από Millipore, USA Χ Χλωριούχο αμμώνιο (NH 4 Cl), από Sigma- Aldrich Χλωριούχο κάλιο (KCl) από Merck Χλωριούχο μαγνήσιο (MgCl 2 ), από Riedel-de Haen, GE Χλωριούχο νάτριο (NaCl) από Merck [44]

45 4.ΜΕΘΟΔΟΙ- ΤΕΧΝΙΚΕΣ 4.1 Καλλιέργειες αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων κυττάρων S. epidermidis Χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα του στελέχους S. epidermidis, που παραχωρήθηκε από το εργαστήριο του κ. Πουρνάρα (Αναπληρωτή καθηγητή τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Αθηνών). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε περιστροφικά ανακινούμενο επωαστή (orbital incubator, 120 στροφές/min) στους 37 o C με θρεπτικό υλικό, που περιείχε σε 1lt τα ακόλουθα συστατικά: 10 gr εκχύλισμα κρέατος (Peptone from meat) 10 gr NaCl 5 gr εκχύλισμα ζύμης (Yeast extract) 1ml NaOH 1M Στο θρεπτικό υλικό των μεταλλαγμένων στελεχών που αναπτύσσονται παρουσία του αντιβιοτικού προστέθηκε κατάλληλη ποσότητα λινεζολίδης ώστε η τελική συγκέντρωσή της να είναι 128 μg/ml. Όταν η οπτική απορρόφηση σε κάθε κωνική φτάσει τη λογαριθμική φάση ανάπτυξης, δηλαδή όταν Α 540nm = , τα κύτταρα συλλέγονται γιατί τα ριβοσώματά τους διαθέτουν τη μέγιστη ενεργότητα (Kalpaxis et al., 1995). Η συλλογή των κυττάρων γίνεται με φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall RC-5B και κεφαλή GSA, στις rpm, για 15 min στους 4 o C. Μετά τη φυγοκέντρηση προστίθεται ποσότητα KCl 0.9 Μ, ώστε να πλυθούν τα κύτταρα. Με δεύτερη φυγοκέντρηση, κάτω από τις ίδιες συνθήκες, τα κύτταρα συλλέγονται ως ίζημα και διατηρούνται στο ψυγείο στους -20 ο C μέχρι τη στιγμή της χρησιμοποιήσεώς τους. Σημείωση: Τα διαλύματα και τα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη της καλλιέργειας ήταν αποστειρωμένα και η όλη διαδικασία (ο εμβολιασμός και η μέτρηση O.D) έγινε υπό στείρες συνθήκες και στους 4 o C. [45]

46 4.1.1 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ S-30: Τα κύτταρα αφήνονται στον πάγο για 30 min, τοποθετούνται ξανά στους -20 C για 30 min και στη συνέχεια αφήνονται να αποψυχθούν. Στη συνέχεια αναδιαλύονται σε 3 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α ανά gr κυττάρων. Στο κυτταρικό διάλυμα προστίθεται λυσοζύμη σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml και ακολουθεί επώαση στο πάγο για 30 min και ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Εν συνεχεία, το κυτταρικό διάλυμα αφήνεται στους 37 C για 30 min. Η ομογενοποίηση των κυττάρων γίνεται σε συσκευή υπερήχων (12x/20 sec με ενδιάμεση παύση 1 min στον πάγο). Στο εναιώρημα προστέθηκε DNάση I (3 μg/ml), ακολούθησε επώαση για 20 min στον πάγο και φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34 στα g για 30 min) στους 4 ο C. Το υπερκείμενο (S-30) συλλέγεται για την παραλαβή του κλάσματος S-100 και των ριβοσωμάτων. Ρυθμιστικό Διάλυμα Α 10 mm Tris-HCl, ph mM (AcO) 2 Mg 60mM KCl 6 mm β-etsh ΠΑΡΑΛΑΒΗ ΚΛΑΣΜΑΤΟΣ S-100 Το κλάσμα S-30 φυγοκεντρήθηκε σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο (Beckman, κεφαλή Ti 75, στα g, στους 4 ο C επί 4 h). Το κλάσμα S-100 (υπερκείμενο) περιέχει διαλυτές πρωτεΐνες και άλλους, απαραίτητους για την πρωτεινοσύνθεση παράγοντες, όπως μεταφραστικούς παράγοντες, συνθετάσες των aa-trna, trnas κ.λ.π. Για την αποφυγή προσμίξεων ριβοσωμικής φύσης, χρησιμοποιήθηκαν μόνο τα άνω 2/3 του υπερκειμένου για την παρασκευή του S- 100, ενώ το ίζημα φυλάχθηκε για την παραλαβή των μεταφραστικών παραγόντων και των ριβοσωμάτων. Το υπερκείμενο S-100 υπέστη ακολούθως διαπίδυση σε ρυθμιστικό διάλυμα Α. Ακολούθησε φυγοκέντρηση σε ψυχόμενη φυγόκεντρο (Sorvall, κεφαλή SS34 σε 7000 rpm, για 20 min). Το ίζημα απομακρύνθηκε και το [46]

47 υπερκείμενο (κλάσμα S-100), αφού προστέθηκε γλυκερόλη (τελική συγκέντρωση 5%), χωρίσθηκε σε μικρά κλάσματα των 0,5-1 ml τα οποία, μετά από απότομη ψύξη σε υγρό άζωτο, φυλάχθηκαν στους -80 ο C. Ακολούθησε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Bradford και υπολογισμός της ενεργότητας του κλάσματος S-100 σε μικρής κλίμακας πειράματα σύνθεσης Phe-tRNA ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ "ΠΛΥΜΕΝΩΝ" ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΩΝ: Η παρασκευή "πλυμένων" ριβοσωμάτων έγινε σύμφωνα με το σχήμα 3 (Kalpaxis et al., 1986). Το ίζημα της φυγοκέντρησης σε g, αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Β (10 mm Tris/HCl ph=7,2, 10 mm (CH 3 COO) 2 Mg, 500 mm NH 4 Cl, 6 mm β-etsh), για μια νύχτα, στους 4ºC. Την επόμενη μέρα, το αιώρημα που περιείχε τα ριβοσώματα αναδεύτηκε για 10 λεπτά στους 4ºC και κατόπιν φυγοκεντρήθηκε στην υπερφυγόκεντρο Beckman (κεφαλή Ti 75, σε g, για 6 ώρες, στους 4ºC). Μετά την φυγοκέντρηση, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το ίζημα των ριβοσωμάτων αιωρήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Β, περίπου 1,5 ml/σωλήνα και αφέθηκαν στους 4ºC o/n. Την επόμενη μέρα ακολούθησε επαναδιάλυση των ριβοσωμάτων σε ρυθμιστικό διάλυμα Β και ακολούθησε δεύτερη υπερφυγοκέντρηση στην υπερφυγόκεντρο Beckman (κεφαλή Ti 75, στις g, για 6 ώρες, στους 4ºC). Το υπερκείμενο της δεύτερης υπερφυγοκέντρησης απορρίφθηκε, ενώ το ίζημα αιωρήθηκε σε 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α και αφέθηκε για μια νύχτα στους 4ºC. Την επόμενη μέρα κατόπιν ανάδευσης, το διάλυμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση έναντι 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος Α για 4 ώρες στους 4ºC. Ακολούθησε ήπια φυγοκέντρηση του διαπιδύματος σε ψυχόμενη φυγόκεντρο Sorvall (κεφαλή SS34, σε 2000 rpm, για 10 min). Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και φωτομετρήθηκε στα 260 και τα 280 nm. Βάσει φωτομετρήσεως στα 260nm υπολογίσθηκε η συγκέντρωση των ριβοσωμάτων, ενώ βάσει του λόγου OD 260nm /OD 280nm 2 ελέγχθηκε η καθαρότητά τους. Τέλος, το παρασκεύασμα διατηρήθηκε σε μικρά κλάσματα των μl στους -80ºC. [47]

48 Κύτταρα S. epidermidis Aναδιάλυση σε ρυθμιστικό διάλυμα Α (3 ml ανά gr κυττάρων) Προσθήκη λυσοζύμης (τελική συγκέντρωση 1 mg/ml) και επώαση στον πάγο για 30 min Επώαση στους 37 C για 30 min Ομογενοποίηση των κυττάρων σε συσκευή υπερήχων Προσθήκη DNAse Ι (3μg/ml) και επώαση στον πάγο για 20 min Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, g, 30min) Ίζημα Υπερκείμενο (απομάκρυνση ) Κλάσμα S-30 (συλλογή ) Σχήμα 1: Παρασκευή κλάσματος S-30 [48]

49 Κλάσμα S-30 Φυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, g, 4h) Ίζημα Υπερκείμενο Χρησιμοποιείται για την απομόνωση ριβοσωμάτων κατώτερα στρώματα ανώτερα στρώματα (1/3 του όγκου) (2/3 του όγκου) (απόρριψη) Διαπίδυση σε 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος Α Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, g, 15 min) Ίζημα Υπερκείμενο (απόρριψη) Κλάσμα S-100 Σχήμα 2: Παρασκευή κλάσματος S-100 [49]

50 Ίζημα από την υπερφυγοκέντρηση του κλάσματος S-30 Αιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα B, o/n Ανάδευση για 10 min, 4 0 C Φυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, g, 6 h) Υπερκείμενο ( απομάκρυνση ) Ίζημα (ριβοσώματα) Αιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα Β, o/n Ανάδευση για 10min, 4 0 C Φυγοκέντρηση (Beckman, κεφαλή Ti 75, g, 6 h) Υπερκείμενο (απομάκρυνση) Ίζημα Αιώρηση σε ρυθμιστικό διάλυμα Α, o/n Διαπίδυση σε 4 lt ρυθμιστικού διαλύματος Α, για 4 h, 4 0 C [50]

51 Φυγοκέντρηση (Sorvall, κεφαλή SS34, 5000 g, 10 min) Ίζημα (απομάκρυνση) Υπερκείμενο "Πλυμένα" ριβοσώματα Σχήμα 3: Παρασκευή "πλυμένων" ριβοσωμάτων. [51]

52 4.2 Παρασκευή Ac[ 3 Η]Phe- trna από Ε. coli Παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna Το πρώτο στάδιο για την παρασκευή του AcPhe- trna περιλαμβάνει την παρασκευή του [ 3 Η]Phe- trna. Προηγείται πείραμα μικρής κλίμακας ώστε να βεβαιωθούμε για την λειτουργικότητα των συνθετασών και εν συνεχεία προχωράμε σε σύνθεση μεγάλης κλίμακας. Η μικρή κλίμακα γίνεται σε τελικό όγκο 50 μl και η μεγάλη σε 5 ml. Τα συστατικά και η τελική τους συγκέντρωση έχουν ως εξής: Υλικά Tris/HCl, ph=7,2 (CH3COO) 2 Mg KCl β -EtSH trna trna Phe Τελικές συγκεντρώσεις 100 mm 10 mm 10 mm 6 mm 150 A 260 Units/ml 4 A 260 Units/ml Ακολούθησε επώαση για 20 min στους 37 0 C και στη συνέχεια προστέθηκαν τα εξής συστατικά: [52]

53 Υλικά Τελικές συγκεντρώσεις ATP GTP 4 mm 0,1 mm [ 3 H]-Phenylalanine 5 nmole/ 5 ml L-Phenylalanine S-100 (8.6 mg/ml) 17 nmole/ 5 ml 5μl ανα 50 μl η βέλτιστη ποσότητα σύμφωνα με το πειραμα μικροκλίμακας H πρόοδος της αντίδρασης (η εστεροποίηση του trna) ελέγχεται ως εξής: Γίνεται λήψη μικρής ποσότητας μίγματος και τοποθέτησή του σε χαρτί Whatman 3 ΜΜ. Στεγνώνεται το χαρτί και ακολουθεί πλύσιμο τρεις φορές με ψυχρό διάλυμα 5% TCA και μία φορά με ψυχρή 95% αιθανόλη. Ο υπολογισμός της προσδεδεμένης στο χαρτί ραδιενέργειας πραγματοποιείται μετά από εμβάπτισή του σε σπινθηριστικό υγρό Filter Count και μέτρηση αυτής σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Εφόσον η διαδικασία ήταν επιτυχής ακολουθούσε η παρασκευή 5 ml διαλύματος και η απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna με εκχύλιση και απομάκρυνση των πρωτεϊνών Απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna Η εκχύλιση του [ 3 Η]Phe- trna γίνεται ως εξής: Το [ 3 Η]Phe- trna απαλλάσσεται από τα πρωτεϊνικά συστατικά με την προσθήκη ίσου όγκου 95% υδατικού διαλύματος φαινόλης και έντονη ανάδευση του εκχυλιζόμενου μίγματος για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του μίγματος στη φυγόκεντρο Sorvall (σε κεφαλή SS34, στις 3000 rpm για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου). Απομακρύνεται και φυλάσσεται η υδατική φάση (α), ενώ στη φαινολική φάση προστέθηκαν 2 ml Η 2 Ο. [53]

54 Ακολούθησε δεύτερη εκχύλιση της φαινολικής φάσης και φυγοκέντρηση στη Sorvall (κεφαλή SS34, στις 3000 rpm για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου). Φυλάσσεται και η νέα υδατική φάση (β) και στη φαινολική φάση προστέθηκαν επί πλέον 2 ml Η 2 Ο. Έπειτα έγινε και τρίτη εκχύλιση της φαινολικής φάσης με τον ίδιο τρόπο και φυλάσσεται η υδατική φάση (γ) Καταθύθιση του [ 3 Η]Phe- trna Η απομόνωση του [ 3 Η]Phe- trna συνεχίζεται με: Ανάμιξη των υδατικών φάσεων (α), (β) και (γ) που έχουν συλλεχθεί. Προσθήκη CH 3 COOK 25%, ph 5.8 σε ίσο όγκο με το 1/10 του όγκου της ολικής υδατικής φάσης, καθώς και προσθήκη διπλάσιου (προς τον όγκο της ολικής υδατικής φάσης) όγκου αιθανόλης 95%. Το μίγμα αυτό παραμένει για 16 περίπου ώρες σε θερμοκρασία C, ώστε να λάβει χώρα η κατακρήμνιση του [ 3 H]Phe-tRNA. Την επόμενη μέρα ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Φυγοκέντρηση στη Sorvall σε κεφαλή SS34 στις rpm για 10min στους 4 0 C. Το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα πλύθηκε με 70% αιθανόλη και φυγοκεντρήθηκε ξανά στις ίδιες συνθήκες. Μετά τη φυγοκέντρηση το υπερκείμενο απομακρύνθηκε και το ίζημα αναδιαλύθηκε σε μικρό όγκο ψυχρού απιονισμένου και αποστειρωμένου Η 2 Ο. Ακολούθησε διαπίδυση σε Η 2 Ο για 4 h στους 4 0 C. Έγιναν δύο αλλαγές νερού. Με αυτή τη διαδικασία επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της φαινόλης και των αλάτων από το μίγμα. Το τελικό προϊόν που αποτελείται από [ 3 Η]Phe-tRNA και μη αμινοακυλιωμένο trna συλλέγεται και προσδιορίζεται τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm, όσο και η περιεχόμενη ραδιενέργεια με τη χρήση μετρητή υγρού σπινθηρισμού. [54]

55 4.2.4 Ακετυλίωση του [ 3 Η]Phe- trna Η ακετυλίωση του [ 3 H]Phe πραγματοποιήθηκε στους 0 0 C με την παρακάτω διαδικασία: Στο [ 3 Η]Phe-tRNA που απομονώθηκε με την προηγούμενη διαδικασία προστέθηκε ίση ποσότητα κορεσμένου διαλύματος οξικού καλίου ph=5 και 1,16 ml οξικού ανυδρίτη σε δόσεις (ανά 15 min η κάθε δόση). Στη συνέχεια προστέθηκε 1/10 του όγκου του δείγματος 20% οξικό κάλιο στους 4 0 C και 2.5 όγκοι ψυχρής αιθανόλης 95%. Το παρασκεύασμα διατηρήθηκε στους C για 16 ώρες, ώστε να κατακρημνισθεί το Ac[ 3 Η]-Phe-tRNA. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στη Sorvall (σε κεφαλή SS34 στις rpm για 15 min, στους 4 0 C) συλλογή του ιζήματος και διαλυτοποίησή του σε μικρή ποσότητα απιονισμένου και αποστειρωμένου ύδατος. Έπειτα το διάλυμα υποβλήθηκε σε διαπίδυση σε απεσταγμένο Η 2 Ο για 4 h στους 4 0 C με δύο αλλαγές νερού. Στο τελικό παρασκεύασμα προσδιορίστηκαν τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm όσο και η περιεχόμενη ραδιενέργεια. Το δείγμα χωρίσθηκε σε κλάσματα των 0,5 ml και διατηρήθηκε στους C. 4.3 Σχηματισμός Poly-Phe : H αντίδραση λαμβάνει χώρα σε διάλυμα με τις παρακάτω τελικές συγκεντρώσεις: 20 mm Tris- HCL (ph=7.5), 4.5 mm (CH 3 COO) 2 Mg, 150 mm CH 3 COONH 4, 4 mm β'- EtSH, 2 mm Spermidine, 0.05 mm Spermine, 2 mg/ ml Poly-U, 70 S ριβοσώματα από S. epidermidis, 3 mm ATP, 1.5 mm GTP, 5 mm Ac- phosphate, μείγμα ραδιενεργής και ψυχρής φαινυλαλανίνης (10 μμ και 70 dpm/ pmol), 1unit A 260 trna crude ανά δείγμα (15 μl τελικός όγκος) και κλάσμα S-100. Προηγείται δοκιμασία για την εύρεση της άριστης ποσότητας. Η αντίδραση γίνεται στα επιλεγμένα κάθε φορά ριβοσώματα, απουσία αλλά και παρουσία της επιθυμητής συγκέντρωσης αντιβιοτικού. [55]

56 Ακολουθεί επώαση του μείγματος για 30 λεπτά στους 37 0 C και προσδιορισμός του προϊόντος. 13 μl δείγματος μεταφέρθηκαν σε γυάλινο σωλήνα Wasserman. Προσθέσαμε σε αυτόν 2 ml διαλύματος 5% TCA και 2 σταγόνες 1 % BSA και επωάσαμε για 15 λεπτά σε υδατόλουτρο στους 90 0 C. Στη συνέχεια βάλαμε τους σωλήνες κατευθείαν στον πάγο. Ακολούθησε φιλτράρισμα χρησιμοποιώντας Fibre Glass Filters, πλύσιμο με 5% TCA 3 φορές και μία φορά με ψυχρή 95% αιθανόλη (Bommer et al., 1996). Κατόπιν, το φίλτρο ξηράνθηκε και εμβαπτίστηκε σε σπινθηριστικό υγρό για μέτρηση της προσδεμένης ραδιενέργειας σε μετρητή σπινθηριστικού υγρού. Στη συνέχεια από τη μετρούμενη ειδική ραδιενέργεια (dpm) μπορούμε να υπολογίσουμε τα pmoles του ραδιενεργού ισοτόπου που ενσωματώθηκαν σε πρωτεΐνη ανά pmol ριβοσωμάτων. 4.4 Σχηματισμός εναρκτήριου συμπλόκου Με τον όρο εναρκτήριο τριμερές σύμπλοκο C καλούμε το σύμπλοκο που δημιουργείται από το Αc[ 3 Η]Phe- trna, το poly(u) ως mrna και το ριβόσωμα. Το εναρκτήριο τριμερές σύμπλοκο C σχηματίζεται με την εξής διαδικασία (Drainas and Kalpaxis, 1994): Τα ριβοσώματα που χρησιμοποιήθηκαν προεπωάστηκαν για 10 min στους 37 0 C προκειμένου να ενεργοποιηθούν. Στη συνέχεια σχηματίστηκε διάλυμα με την ακόλουθη σύσταση: Συστατικά Τελικές συγκεντρώσεις H 2 O - Tris-HCl 100 mm ph 7,2 NH 4 Cl 100 mm ph 7,2 β'-etsh Mg(CH 3 COO) 2 GTP 6 mm 10 mm 0.4 mm [56]

57 Ribosomes Poly U Αc[ 3 Η]Phe- trna 32 OD/ml 0,4 mg/ml 13 OD/ml Το διάλυμα αυτό επωάσθηκε στους 25 0 C για 15 min και η αντίδραση διακόπηκε με μεταφορά του διαλύματος σε πάγο. Στη συνέχεια το διάλυμα προσροφήθηκε σε φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης μέσω διήθησης υπό κενό. Το φίλτρο που φέρει το τριμερές σύμπλοκο, ξεπλύθηκε 3 φορές με 2 ml binding buffer κάθε φορά, ώστε το σύμπλοκο C που προσροφήθηκε στη μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης να διαχωριστεί από την περίσσεια του Αc[ 3 Η]Phe- trna, η οποία δε συγκρατείται στη μεμβράνη. Κατόπιν ακολούθησε διαλυτοποίηση του φίλτρου νιτρικής κυτταρίνης σε σπινθηριστικό υγρό και μέτρηση της ραδιενέργειάς του σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού και στη συνέχεια γίνεται ο υπολογισμός της δέσμευσης του ααtrna στο ριβόσωμα. Για την αντίδραση πουρομυκίνης, ακολουθείται η ίδια πορεία, τα φίλτρα κόβονται στη μέση πριν χρησιμοποιηθούν και παραμένουν σε ρυθμιστικό Α στους 0 o C μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Όταν όμως η αντίδραση γίνεται στο διάλυμα, ακολουθείται διαφορετική πορεία η οποία θα περιγραφεί στην επόμενη παράγραφο. Στον πίνακα που ακολουθεί δίνεται η σύσταση του binding buffer: Συστατικά Τελικές συγκεντρώσεις Tris-HCl 100 mm ph 7,2 NH 4 Cl 100 mm ph 7,2 β'-etsh MgCl 2 6 mm 4,5 mm [57]

58 4.5 Αντίδραση πουρομυκίνης Για να προσδιοριστεί η ταχύτητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού από την πεπτιδυλοτρανσφεράση παρουσία αλλά και απουσία του αντιβιοτικού χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση πουρομυκίνης. Η πουρομυκίνη είναι ένα δομικό ανάλογο του CCA άκρου του αμινοακυλο- trna, το οποίο μπορεί να προσδένεται στην Α- θέση της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος και επίσης αποτελεί ψευδοϋπόστρωμα για την πεπτιδυλοτρανσφεράση. Στην αντίδραση πουρομυκίνης το AcPhe- trna έχει το ρόλο του πεπτυδυλο- trna, ενώ η πουρομυκίνη έχει το ρόλο του αμινοακυλο- trna. Εικόνα 4.5: Ομοιότητα της πουρομυκίνης με το 3 άκρο του τυροσινυλο-trna. Η αντίδραση πουρομυκίνης διεξάγεται με δύο τρόπους, ανάλογα με την κατάσταση του συμπλόκου C. Αν δηλαδή το σύμπλοκο C βρίσκεται προσροφημένο σε μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης ή στο διάλυμα. Α) Το σύμπλοκο C βρίσκεται σε διάλυμα. Ποσότητα από το διάλυμα τριμερούς συμπλόκου που σχηματίστηκε όπως περιγράψαμε προηγουμένως στην παράγραφο 4.4 μεταφέρεται στον πάγο. Στη συνέχεια προστίθεται η κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος Α που περιέχει πουρομυκίνη στην επιθυμητή συγκέντρωση. Ακολουθεί επώαση του διαλύματος στους 25 0 C για 2 min και προσθήκη 0,3Μ NaAc ph 5,5 κορεσμένου σε MgSO 4 ώστε να σταματήσει η αντίδραση. Στη συνέχεια προστίθεται 1 ml οξικού αιθυλεστέρα και ακολουθεί έντονη ανάδευση του διαλύματος σε vortex για 3 min στους 0 0 C και φυγοκέντρηση σε 2000g για 1 min. Τέλος 0,8 ml από την οργανική φάση [58]

59 μεταφέρονται σε φιαλίδιο, στο οποίο προστίθεται υγρό σπινθηρισμού optifluor (5 ml) και ακολουθεί μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β ακτινοβολίας. Β) Το σύμπλοκο C βρίσκεται προσροφημένο σε μεμβράνη νιτρικής κυτταρίνης. Αρχικά γίνεται σχηματισμός του εναρκτήριου τριμερούς συμπλόκου C όπως περιγράψαμε προηγουμένως στην παράγραφο 4.4. Στη συνέχεια 120 μl από το σύμπλοκο C διηθούνται υπό κενό σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Τα φίλτρα που φέρουν το τριμερές σύμπλοκο κόβονται σε δύο περίπου ίσα μέρη. Το μισό φίλτρο μεταφέρεται σε φιαλίδιο που περιέχει 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α το οποίο περιέχει πουρομυκίνη στην επιθυμητή συγκέντρωση. Ακολουθεί επώαση του φίλτρου στο μίγμα της πουρομυκίνης για τους προεπιλεγμένους χρόνους (σε υδατόλουτρο στους 25 0 C, υπό έντονη ανάδευση). Η αντίδραση τερματίζεται με προσθήκη σε κάθε φιαλίδιο 1 ml 1 Μ ΝaOH. Τα φιαλίδια παραμένουν στους 25 0 C τουλάχιστον 20 min μετά την προσθήκη NaOH, ώστε να υδρολυθεί πλήρως η περίσσεια του AcPhe- trna που δεν αντέδρασε (Synetos and Coutsogeorgopoulos, 1987). Για να υπολογιστεί το ολικό ποσό της ραδιενέργειας που ευρίσκεται είτε ως προϊόν AcPhe- puro είτε ως AcPhe που προέκυψε από το AcPhetRNA που δεν αντέδρασε, 0,8 ml από το μίγμα της αντίδρασης μεταφέρονται σε φιαλίδιο, στο οποίο προστίθεται υγρό σπινθηρισμού optifluor (5 ml) και ακολουθεί μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β ακτινοβολίας. Έπειτα σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 2 ml οξικού αιθυλεστέρα μεταφέρονται άλλα 0,8 ml από το μίγμα της αντίδρασης. Ακολουθεί έντονη ανάδευση σε vortex για 2 min και φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για 1 min ώστε να διαχωριστούν οι δύο φάσεις. Η υπερκείμενη οργανική φάση περιέχει το προϊόν της αντίδρασης (AcPhepuro), ενώ η κατώτερη υδατική φάση περιέχει την ραδιενεργό AcPhe που δεν έχει αντιδράσει. Από την ανώτερη φάση λαμβάνεται 1,5 ml που μεταφέρεται σε φιαλιδιο που περιέχει 5 ml υγρού σπινθηρισμού Optifluor και ακολουθεί μέτρηση [59]

60 της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή β ακτινοβολίας. Η τιμή της ραδιενέργειας αντιστοιχεί στο ποσό του σχηματισμένου προϊόντος AcPhe- puro. διαλύματος Α: Στον πίνακα που ακολουθεί δίνεται η σύσταση του ρυθμιστικού Συστατικά Τελικές συγκεντρώσεις TrisHCl 100 mm ph 7,2 NH 4 Cl 150 mm ph 7,2 β'-etsh MgCl 2 Puromycin 6 mm 10 mm 0,083 mm, 0,125 mm, 0,25 mm ή 0,5 mm Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης Η αντίδραση πουρομυκίνης ακολουθεί το παρακάτω κινητικό σχήμα: K S k cat C + S CS C + P Σχήμα 1) Κινητικό σχήμα της αντίδρασης πουρομυκίνης: C είναι το σύμπλοκο Αc[ 3 Η]Phe- trna 70S ριβόσωμα poly(u), S είναι η πουρομυκίνη, P είναι το προϊόν (AcPhe- Puro) και C είναι το ριβοσωματικό σύμπλοκο C που δεν έχει AcPhe- trna στη θέση Ρ, με αποτέλεσμα να μην είναι δραστικό έναντι της πουρομυκίνης. Η αντίδραση πουρομυκίνης ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως, επειδή η πουρομυκίνη προστίθεται σε περίσσεια ως προς το ριβοσωματικό σύμπλοκο C. Η συγκέντρωση πουρομυκίνης μεταβάλλεται ελάχιστα κατά τη διάρκεια της αντίδρασης και θεωρείται σταθερή. Ένα άλλο σημείο που καθιστά την [60]

61 αντίδραση αυτή ξεχωριστή είναι ότι αν και αντίδραση δύο υποστρωμάτων, το πρώτο υπόστρωμα (AcPhe- trna) ευρίσκεται προσδεδεμένο στο ριβόσωμα με αποτέλεσμα όταν σχηματίζεται το προιόν (AcPhe-Puro) να μην υπάρχει στο περιβάλλον AcPhe- trna για να σχηματιστεί ένα καινούριο τριμερές σύμπλοκο. Υπολογισμός των κινητικών σταθερών Κs και k cat Η παραπάνω ιδιαιτερότητα της αντίδρασης πουρομυκίνης μας δίνει τη δυνατότητα να εφαρμόσουμε τον ολοκληρωμένο κινητικό της νόμο, γιατί εκτός από ενζυμική αντίδραση με την οποία καταλύεται ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού, θεωρείται ταυτόχρονα και αντίδραση απενεργοποίησης, αφού το μόριο της πουρομυκίνης αντιδρώντας με το AcPhe- trna του συμπλόκου C, απενεργοποιεί ταυτόχρονα και το σύμπλοκο C. Πιο συγκεκριμένα όταν η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε περίσσεια πουρομυκίνης ισχύουν τα ακόλουθα: 0 Η ολική συγκέντρωση C του συμπλόκου C είναι: C C CS P 0 (1) K S και ισχύει: C S CS (2) Καλούμε C T τις ενεργές μορφές του συμπλόκου C, δηλαδή C και CS. Άρα από τις σχέσεις (1) και (2) προκύπτει : K S S CT C CS CS S και CS C K T S S S (3) Το διαφορικό του C T δίδεται από τη σχέση: [61]

62 d C dt T k cat CS k K cat S S S C T (4) και ολοκληρώνοντας για χρόνο για χρόνο t: kobst C C e T 0 ή C 0 C P CT ln kobs t ή C k K 0 S S t cat ln (6) 0 S (5) Καταλήγουμε λοιπόν στον ολοκληρωμένο κινητικό νόμο που εκφράζεται με την ισότητα (6) και είναι εμφανές ότι η αντίδραση ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξης. Από τη γραφική παράσταση του ln[c 0 ] / ([C 0 ]-[P]) έναντι του χρόνου παίρνουμε μία ευθεία γραμμή, η κλίση της οποίας μας δίνει την τιμή της k obs (σχήμα 2Α). Η τελευταία έχει διαφορετική τιμή για κάθε συγκέντρωση πουρομυκίνης και για αυτό άλλωστε την καλούμε φαινομενική ειδική ταχύτητα. Προσδιορίζοντας της τιμή της σε διαφορετικές συγκεντρώσεις πουρομυκίνης υπολογίζουμε την k cat και την K s, από το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (1/ k obs έναντι 1/S) (σχήμα 2Β). [62]

63 A ln(c 0 /C 0 -P) k obs time (min) B 1/k 0bs (min) 1/K S 1/k cat 1/S (mm -1 ) Σχήμα 2. Α) Θεωρητική λογαριθμική καμπύλη της αντιδρασης πουρομυκίνης σε μία συγκέντρωση πουρομυκίνης. Β) Θεωρητικό διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για την αντίδραση πουρομυκίνης σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. [63]

64 4.6 Μελέτη του ριβοσωματικού προφίλ με υπερφυγοκέντρηση σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης Για την παρασκευή των διαλυμάτων διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (sucrose gradient) απαιτούνται τα ακόλουθα διαλύματα : 20 mm HEPES-KOH, ph 7.5, at 4, A) HEAVY 30% Συστατικά Τελικές συγκεντρώσεις Τελικές συγκεντρώσεις στο association buffer στο dissociation buffer sucrose 30% 30% Tris-HCl ph 7,2 10 mm 10 mm NH 4 Cl ph 7,2 30 mm 200 mm (CH 3 COO) 2 Mg 6 mm 1 mm β'-etsh 4 mm 4 mm B) LIGHT 10% Συστατικά Τελικές συγκεντρώσεις Τελικές συγκεντρώσεις στο association buffer στο dissociation buffer sucrose 10% 10% Tris-HCl ph 7,2 10 mm 10 mm NH 4 Cl ph 7,2 30 mm 200 mm (CH 3 COO) 2 Mg 6 mm 1 mm β'-etsh 4 mm 4 mm Σε σωλήνα υπερφυγοκέντρου (κεφαλή SW41) και με τη βοήθεια συσκευής για παρασκευή βαθμίδωσης σουκρόζης, δημιουργείται το διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (9 ml) με προοδευτική ανάμειξη και εναπόθεση του διαλύματος. [64]

65 Όταν επιθυμούμε το διαχωρισμό των υπομονάδων εκθέτουμε τα ριβοσώματα στο dissociation buffer (10mM Tris- HCL ph 7,2, 200 mm ΝΗ 4 Cl, 1 mm (CH 3 COO) 2 Mg, 4 mm β'-etsh). Το διάλυμα που δημιουργείται αφήνεται 10 min στους 37 0 C και στη συνέχεια για 1 h στον πάγο. Στο σωλήνα της υπερφυγοκέντρου (κεφαλή SW41) που αναφέραμε προηγουμένως επιστοιβάζεται προσεχτικά το διάλυμα που περιέχει τα 10 Α 260 ριβοσωμάτων. Ακολουθεί υπερφυγοκέντρηση (Beckman στην κεφαλή SW41 στις rpm στους 4 0 C για 3 h και 45 min). Μετά την ολοκλήρωση της υπερφυγοκέντρησης αναλύεται η κατανομή των ριβοσωματικών σωματιδίων μετρώντας την οπτική απορρόφηση στα 260 nm με φωτόμετρο συνεχούς ροής. [65]

66 [66]

67 5. Αποτελέσματα 5.1. Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης in vitro απουσία και παρουσία λινεζολίδης. Για να μελετήσουμε την επίδραση της λινεζολίδης in vitro στo παραπάνω στέλεχος Α2864 απομονώσαμε δύο διαφορετικά είδη ριβοσωμάτων: από το mutant Α2864 που έχει αναπτυχθεί απουσία λινεζολίδης (Mt) και από το mutant Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία λινεζολίδης (Mt Linz ). Αρχικά μελετήσαμε το σχηματισμό πολυφαινυλαλανίνης απουσία και παρουσία του αντιβιοτικού. Το στέλεχος Α2864 φέρει τις μεταλλάξεις U2504Α σε πέντε και C2534U σε τέσσερα οπερόνια του 23S rrna και τις μεταλλάξεις G152D, D159Y και L101V στη ριβοσωματική πρωτεΐνη L pmoles phe/ pmol Ribs Mt Mt + 50 μμ Linz Mt μμ Linz Mt Linz Mt Linz + 50 μμ Linz Mt Linz μμ Linz Εικόνα 5.1: Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης παρουσία και απουσία λινεζολίδης σε ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το mutant στέλεχος και από το mutant που έχει αναπτυχθεί παρουσία λινεζολίδης. Σύμφωνα με την εικόνα 5.1 παρατηρούμε ότι η σύνθεση της πολυφαινυλαλανίνης δεν αναστέλλεται παρουσία του αντιβιοτικού στο Mt. Αντίθετα στο Mt Linz παρατηρήθηκε μία μικρή αύξηση της σύνθεσης της πολυφαινυλαλανίνης παρουσία της λινεζολίδης. [67]

68 5.2 Αντίδραση πουρομυκίνης απουσία και παρουσία λινεζολίδης Α) Ριβοσώματα Mt Για να εξειδικεύσουμε περαιτέρω το στάδιο δράσης του αντιβιοτικού στα μεταλλαγμένα ριβοσώματα πραγματοποιήσαμε το πείραμα της αντίδρασης πουρομυκίνης. Το σύμπλοκο C σε αυτή την περίπτωση βρίσκεται σε διάλυμα και ακολουθήθηκε η πορεία που περιγράφηκε στην παράγραφο 3.5Β. Η πουρομυκίνη είναι ψευδουπόστρωμα του ριβοσώματος που προσδένεται στην Α- θέση μιμούμενο το αα- trna και σχηματίζει πεπτιδικό δεσμό ΑcPhe- Puromycin (dpm) control Linz 10 μm Linz 50 μm Linz 100 μm Εικόνα 5.2: Αντίδραση πουρομυκίνης σε Mt ριβοσώματα, απουσία και παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης λινεζολίδης. Σύμφωνα με την εικόνα 5.2 κατά την αντίδραση πουρομυκίνης σε ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το mutant στέλεχος Α2864 του S. epidermidis δεν παρατηρήθηκε αναστολή στο σχηματισμό του προϊόντος στις διαφορετικές συγκεντρώσεις λινεζολίδης. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με παλαιότερες μελέτες (Lin et al., 1997) στις οποίες φαίνεται ότι οι οξαζολιδινόνες δεν αναστέλλουν πάντα την αντίδραση πουρομυκίνης. [68]

69 Β) Ριβοσώματα Μt Linz Στη συνέχεια μελετήσαμε λεπτομερώς την παραπάνω αντίδραση με ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το στέλεχος Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία του αντιβιοτικού AcPhe- Puromycin (dpm) control Linz 10 μm Linz 20 μm Linz 50 μμ Linz 100 μμ Linz 200 μm Εικόνα 5.3: Αντίδραση πουρομυκίνης σε Mt Linz παρουσία αυξανόμενης συγκέντρωσης λινεζολίδης. ριβοσώματα, απουσία και Παρατηρήθηκε αύξηση στο σχηματισμό του προϊόντος ΑcPhe-puro. Μάλιστα όπως φαίνεται στην εικόνα 5.3 αυξανόμενης της συγκέντρωσης της λινεζολίδης αυξάνεται και το σχηματιζόμενο προϊόν. Επειδή όμως από τα 100 μμ στα 200 μμ είδαμε πολύ μικρή διαφορά επιλέξαμε να κάνουμε τα in vitro πειράματά μας στη συγκέντρωση των 100 μμ. Συνεπώς μπορούμε να συμπεράνουμε ότι πράγματι τα ριβοσώματα που σχηματίζονται παρουσία του αντιβιοτικού είναι πιο αποτελεσματικά στην αντίδραση πουρομυκίνης όταν το πείραμα πραγματοποιείται παρουσία της λινεζολίδης. [69]

70 5.3 Σχηματισμός τριμερούς συμπλόκου παρουσία λινεζολίδης. Επειδή η αντίδραση πουρομυκίνης είναι αντίδραση δύο υποστρωμάτων και ενδεχομένως η αύξηση του σχηματιζόμενου προϊόντος να μην οφείλεται στην αντίδραση πουρομυκίνης (στο σχηματισμό δηλαδή του πεπτιδικού δεσμού) αλλά στην ταχύτερη πρόσδεση του AcPhe- trna στο ριβόσωμα, διακρίναμε χρονικά την πρόσδεση του AcPhe- trna από την αντίδραση πουρομυκίνης. Μελετάμε δηλαδή αναξάρτητα από την αντίδραση πουρομυκίνης, την πρόσδεση του AcPhe- trna πάνω στο ριβόσωμα για το σχηματισμό του ριβοσωματικού συμπλόκου C. 0,7 0,6 pmoles (AcPhe- trna/ Rib) 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Μt Mt + 50 μμ Linz Mt μμ Linz Mt Linz Mt Linz + 50 μμ Linz Mt Linz μμ Linz Εικόνα 5.4: Πρόσδεση του AcPhe- trna σε Poly(U) προγραμματισμένα ριβοσώματα απουσία αλλά και παρουσία της λινεζολίδης. Στην εικόνα 5.4 βλέπουμε ότι όλα τα είδη ριβοσωμάτων απουσία αλλά και παρουσία της λινεζολίδης δεν παρουσιάζουν κάποια μεταβολή στο σχηματισμό του τριμερούς συμπλόκου. Συνεπώς η δράση του αντιβιοτικού στα ενεργοποιημένα ριβοσώματα οφείλεται στην ενεργοποίηση της πεπτιδύλοτρανσφεράσης, αν και δεν μπορούμε ακόμα να εκτιμήσουμε αν το προσδεδεμένο AcPhe- trna εξακολουθεί να αντιδρά με πουρομυκίνη (Α-site binding). [70]

71 5.4 Λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης. Σύμφωνα με το παραπάνω πείραμα η παρουσία της λινεζολίδης δεν έχει καμία επίπτωση στην πρόσδεση του AcPhe- trna στο ριβοσωματικό σύμπλοκο. Ως εκ τούτου το ενδιαφέρον μας εστιάζεται στο επόμενο στάδιο, την αντίδραση δηλαδή του συμπλόκου που μελετήσαμε προηγουμένως με την πουρομυκίνη. Η αντίδραση σχεδιάστηκε όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 3.5Α, απομονώθηκε δηλαδή το ριβοσωματικό σύμπλοκο C σε φίλτρο νιτρικής κυτταρίνης απουσία περίσσειας AcPhe-tRNA και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε διάλυμα πουρομυκίνης. Η πουρομυκίνη βρίσκεται σε περίσσεια ενώ κάθε φορά έχει διαφορετική συγκέντρωση (0,5 mm, 0,25 mm, 0,125 mm και 0,083 mm) και αντιδρά για συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (0 min,0,5 min, 1 min, 2 min) και στα τρία είδη ριβοσωμάτων του S. epidermidis. Το προϊόν AcPhe-puro προσδιορίζεται με εκχύλιση στην οργανική φάση και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σε λογαριθμική μορφή στα διαγράμματα που ακολουθούν. Από την κλίση της κάθε ευθείας υπολογίζεται η φαινομενική σταθερά ψευδοπρώτης τάξεως (k obs) για την αντίστοιχη συγκέντρωση πουρομυκίνης. 2,5 S 4 = 0,5 mm 2,0 ln( C 0 /C 0 -P) 1,5 1,0 S 3 = 0,25 mm S 2 = 0,125 mm S 1 = 0,083 mm 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 t (min) Εικόνα 5.5: Λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης για ριβοσώματα w.t. του S. epidermidis παρουσία και απουσία λινεζολίδης. [71]

72 2,0 1,8 S 4 = 0,5 mm 1,6 ln(c 0 /C 0 -P) 1,4 1,2 1,0 0,8 S 3 = 0,25 mm S 2 = 0,125 mm 0,6 0,4 0,2 S 1 = 0,083 mm 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 t (min) Εικόνα 5.6: Λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης για Mt ριβοσώματα του S. epidermidis παρουσία και απουσία λινεζολίδης. 4,0 3,5 3,0 S 4 = 0,5 mm ln(c 0 /C 0 -P) 2,5 2,0 1,5 1,0 S 3 = 0,25 mm S 2 = 0,125 mm S 1 = 0,083 mm 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 t (min) Εικόνα 5.7: Λογαριθμική χρονοκαμπύλη της αντίδρασης πουρομυκίνης παρουσία 100 μm λινεζολίδης για τα Mt Linz ριβοσώματα του S. epidermidis. [72]

73 Διαπιστώνουμε πράγματι ότι η ταχύτητα της αντίδρασης είναι πιο μεγάλη όταν η αντίδραση γίνεται παρουσία του αντιβιοτικού και μόνο στα ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από τα κύτταρα που έχουν μεγαλώσει παρουσία της λινεζολίδης. Οι αυξημένες τιμές της k obs φαίνονται και στον παρακάτω πίνακα. Ριβοσώματα w.t. Mt Mt Linz Πουρομυκίνη (mm) k obs (min -1 ) k obs (min -1 ) k obs (min -1 ) 0,083 0,41 0,38 0,80 0,125 0,62 0,51 1,02 0,25 0,83 0,73 1,38 0,5 1,10 0,90 1,72 Πίνακας 5.1: Φαινομενική ειδική ταχύτητα ψευδοπρώτης τάξεως k obs για τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης σε διαφορετικά ριβοσώματα από S. epidermidis. [73]

74 5.5 Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου. Από την κλίση της κάθε λογαριθμικής χρονοκαμπύλης που παρουσιάστηκαν παραπάνω υπολογίστηκε η k obs για την αντίστοιχη συγκέντρωση πουρομυκίνης. Από τις τιμές αυτές σχεδιάστηκε το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου, δηλαδή η γραφική παράσταση της συναρτήσης 1/k obs έναντι του 1/[S]. 2,5 2,0 1/k obs (min) 1,5 1,0 0,5 0, /S (mm -1 ) Εικόνα 5.8: Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για το w.t. στέλεχος του S. epidermidis. [74]

75 3,0 2,5 2,0 1/k obs (min) 1,5 1,0 0,5 0, /S (mm -1 ) Εικόνα 5.9: Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για το Mt στέλεχος του S. epidermidis. 1,4 1,2 1,0 1/k 0bs (min) 0,8 0,6 0,4 0,2 0, /S (mm -1 ) epidermidis. Εικόνα 5.10: Διάγραμμα διπλού αντιστρόφου για το Mt Linz στέλεχος του S. [75]

76 Τα διαγράμματα αυτά μας παρέχουν τη δυνατότητα υπολογισμού της k cat και της Κ s, από τα σημεία που η ευθεία τέμνει τους άξονες 1/ k obs και 1/ [S] αντίστοιχα. Έτσι προκύπτει ο παρακάτω πίνακας. Strain k cat (min -1 ) K S (mm) K cat /K S Wild 1,60 0,22 7,27 Mutant 1,30 0,20 6,50 Mutant Linz 2,20 0,15 14,66 Πίνακας 5.2: Κινητικές σταθερές k cat και K S των διαφορετικών ριβοσωμάτων από S. epidermidis παρουσία λινεζολίδης. Συνεπώς φαίνεται καθαρά ότι τα μεταλλαγμένα ριβοσώματα Mt Linz έχουν ενεργοποιημένη την πεπτιδυλοτρανσφεράση τους παρουσία της λινεζολίδης, όπως φαίνεται από το λόγο k cat / K S. [76]

77 5.6 Μελέτη του ριβοσωματικού προφίλ με υπερφυγοκέντρηση σε διάλυμα διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης Για να ελέγξουμε την ακεραιότητα των ριβοσωμάτων εναποθέσαμε σε βαθμίδωση σουκρόζης μικρή ποσότητα ριβοσωμάτων που έχουν απομονωθεί από το μεταλλαγμένο στέλεχος που μεγάλωσε παρουσία και απουσία λινεζολίδης. Η μελέτη έγινε σε συνθήκες που ευνοούν ή αποτρέπουν τη σύζευξη των ριβοσωματικών υπομονάδων. Σχήμα 5.11: Ανάλυση ριβοσωματικού πληθυσμού σε βαθμίδωση σουκρόζης από το Mt στέλεχος Α2864 S. epidermidis σε συνθήκες 70S. [77]

78 Σχήμα 5.12: Ανάλυση ριβοσωματικού πληθυσμού σε βαθμίδωση σουκρόζης από το Mt Linz στέλεχος S. epidermidis σε συνθήκες 70S. Όπως βλέπουμε στα σχήματα 11 και 12 η κατανομή των ριβοσωμάτων που έχουν απομονωθεί από το στέλεχος Α2864 και από το Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία λινεζολίδης σε συνθήκες που ευνοούν τη σύξευξη των υπομονάδων παραμένει σταθερή τόσο σε πολυσώματα όσο και σε υπομονάδες. [78]

79 Εικόνα 5.13: Ανάλυση ριβοσωματικού πληθυσμού σε βαθμίδωση σουκρόζης από το Mt στέλεχος S. epidermidis σε συνθήκες που ευνοούν το διαχωρισμό των υπομονάδων. Εικόνα 5.14: Ανάλυση ριβοσωματικού πληθυσμού σε βαθμίδωση σουκρόζης στο στέλεχος Mt Linz S. epidermidis σε συνθήκες που ευνοούν το διαχωρισμό των υπομονάδων. [79]

80 Mt Linz Εικόνα 5.15: Ανάλυση ριβοσωματικού πληθυσμού σε βαθμίδωση σουκρόζης από το στέλεχος S. epidermidis, σε συνθήκες που ευνοούν το διαχωρισμό των υπομονάδων, παρουσία λινεζολίδης. Όπως παρατηρούμε στις εικόνες 5.13, 5.14 και 5.15 η κατανομή των ριβοσωμάτων που έχουν απομονωθεί από το Mt στέλεχος Α2864 και από το Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία λινεζολίδης σε συνθήκες διαχωρισμού των υπομονάδων έδωσε τελείως διαφορετική εικόνα για τα δύο είδη των ριβοσωμάτων. Πιο συγκεκριμένα όπως φαίνεται στο διάγραμμα ανάλυσης διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (Εικ. 5.13) τα ριβοσώματα που προέρχονται από το Mt στέλεχος Α2864 σε συνθήκες διαχωρισμού υπομονάδων διαχωρίζονται ικανοποιητικά στις υπομονάδες τους, ενώ τα ριβοσώματα που προέρχονται από το Mt στέλεχος Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία του αντιβιοτικού (Εικόνα 5.14) αδυνατούν να διαχωριστούν αποτελεσματικά στις υπομονάδες τους. Όταν, όμως προστεθεί στο διάλυμα διαχωρισμού των υπομονάδων λινεζολίδη (128 μg/ml), τότε τα ριβοσώματα που προέρχονται από το Mt Linz στέλεχος αποδιατάσσονται επιτυχώς στις υπομονάδες τους, αν και το ριβοσωματικό προφίλ δεν ταιριάζει στη φυσιολογική κατανομή ριβοσωματικών υπομονάδων, δηλαδή περίπου 2:1 50S:30S, όπως ακριβώς φαίνεται και στην εικόνα Συνεπώς η λειτουργικότητα των ριβοσωμάτων έχει διαταραχθεί [80]

81 απουσία της λινεζολίδης και μάλλον αποκαθίσταται τουλάχιστον εν μερει με την προσθήκη του αντιβιοτικού. Η ανισοκατανομή όμως των υπομονάδων έχει αναφερθεί και αλλού στη βιβλιογραφία, και πιο συγκεκριμένα σε ριβοσώματα S. aureus που έχει μεγαλώσει παρουσία λινεζολίδης και διαπιστώνεται η ελάττωση του πληθυσμού των 50S συγκριτικά με την ποσότητα των 30S (Champney and Miller, 2001). [81]

82 [82]

83 6. Συζήτηση Η λινεζολίδη είναι ένα συνθετικό αντιβιοτικό που ανήκει στην οικογένεια των οξαζολιδινονών. Αν και αποτελεί αντιβιοτικό νέας γενιάς και η χρήση του είναι ακόμα περιορισμένη, εν τούτοις έχει ήδη εκδηλωθεί ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό. Πρόσφατα δημοσιεύτηκε (Pournaras et al., 2013) ότι το στέλεχος του Staphylococcus epidermidis Α2864 όχι μόνο δεν αναστέλλεται από τη λινεζολίδη αλλά παρουσία του αντιβιοτικού αναπτύσσεται ταχύτερα από ότι απουσία του αντιβιοτικού. Γνωρίζουμε ότι το ριβόσωμα είναι ο κύριος στόχος της λινεζολίδης, για αυτό το λόγο διερευνήσαμε πιθανές μεταβολές που προκαλεί η παρουσία του παραπάνω αντιβιοτικού στη λειτουργία του ριβοσώματος. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης συγκρίναμε την ενεργότητα της πεπτιδύλοτρανσφεράσης, δηλαδή του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος, που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού. Απομονώσαμε τρία διαφορετικά είδη ριβοσωμάτων από κύτταρα: wild type, το μεταλλαγμένο Α2864 και το ίδιο πάλι το μεταλλαγμένο που αναπτύσσεται παρουσία λινεζολίδης. Τα ριβοσώματα αυτά αρχικά χρησιμοποιήθηκαν στον πολυμερισμό της φαινυλαλανινης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας (Εικόνα 5.1), η σύνθεση της πολυφαινυλαλανίνης δεν αναστέλλεται παρουσία του αντιβιοτικού στα ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το μεταλλαγμένο στέλεχος Α2864, σε αντίθεση με τα ριβοσώματα που έχουν απομονωθεί από το μεταλλαγμένο στέλεχος που αναπτύχθηκε παρουσία λινεζολίδης στα οποία παρατηρείται αύξηση του πολυμερισμού της φαινυλαλανίνης. Άρα η πρώτη μας διαπίστωση είναι ότι τα μεταλλαγμένα ριβοσώματα που έχουν σχηματιστεί παρουσία της λινεζολίδης, εμφανίζουν κάποια σημαντική διαφορά στην ενεργότητά τους μόνο, παρουσία του αντιβιοτικού. Τη διαφορά αυτή στην ενεργότητα των ριβοσωμάτων την επιβεβαιώνουμε και με την αντίδραση πουρομυκίνης (Εικόνα 5.3). Τα ίδια ριβοσώματα καθίστανται πιο ενεργά πάλι, μόνο παρουσία του αντιβιοτικού. Είναι δηλαδή εξαρτώμενα από την παρουσία της λινεζολίδης. [83]

84 Γνωρίζοντας ότι η αντίδραση πουρομυκίνης είναι μία αντίδραση δύο υποστρωμάτων, η οποία πραγματοποιείται σε δύο διακριτά βήματα, μελετήσαμε το πρώτο βήμα, δηλαδή την πρόσδεση του πρώτου υποστρώματος (AcphetRNA) στο ριβόσωμα. Σύμφωνα με τα δεδομένα από την εικόνα 5.4 στην οποία απεικονίζεται η πρόσδεση του Acphe- trna στην P- θέση δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά στην πρόσδεση του υποστρώματος στο ριβόσωμα παρουσία του αντιβιοτικού. Αποκλείουμε λοιπόν την δράση του αντιβιοτικού στο στάδιο της πρόσδεσης του Acphe-tRNA στο ριβοσωματικό σύμπλοκο. Τα αποτελέσματα της εικόνας 5.3 επιβεβαιώθηκαν και από την κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης. Παρατηρούμε δηλαδή αυξημένη ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης στα ριβοσώματα Mt Linz όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα του πίνακα 5.2. Από τις επιμέρους τιμές βλέπουμε ότι κυρίως αυξάνεται το k cat και επηρεάζεται λιγότερο το Κ S που περιγράφει το affinity της πουρομυκίνης για το ριβοσωματικό σύμπλοκο. Αυτή η αύξηση της καταλυτικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του στελέχους Α2864 παρουσία του αντιβιοτικού. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε όμως και κάποια άλλη δράση της παρουσίας του αντιβιοτικού στη λειτουργικότητα του ριβοσώματος. Επειδή προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η λινεζολίδη αναστέλλει το σχηματισμό των 50S υπομονάδων (Champney and Miller, 2001), ελέγχθηκε και το ριβοσωματικό προφίλ των ριβοσωμάτων που απομονώθηκαν από το μεταλλαγμένο στέλεχος που έχει αναπτυχθεί είτε απουσία είτε παρουσία του αντιβιοτικού, σε 70S συνθήκες και σε συνθήκες διαχωρισμού των υπομονάδων. Σύμφωνα με τα διαγράμματα ανάλυσης διαβαθμισμένης πυκνότητας σουκρόζης (εικόνα 5.11 και 5.12) η κατανομή των ριβοσωμάτων που έχουν απομονωθεί από το στέλεχος Α2864 και από το Α2864 που έχει αναπτυχθεί παρουσία λινεζολίδης παραμένει σταθερή τόσο σε πολυσώματα όσο και σε υπομονάδες. Σε συνθήκες όμως διαχωρισμού των υπομονάδων τα ριβοσώματα που προέρχονται από το Α2864 στέλεχος διαχωρίζονται ικανοποιητικά στις υπομονάδες τους (Εικ. 5.13) ενώ τα ριβοσώματα που προέρχονται από το Α2864 στέλεχος που έχει αναπτυχθεί παρουσία του αντιβιοτικού (Εικ. 5.14) αδυνατούν να διαχωριστούν αποτελεσματικά στις υπομονάδες τους. Όπως παρατηρήθηκε όμως στην εικόνα 5.15 όταν προστεθεί στο διάλυμα διαχωρισμού των υπομονάδων λινεζολίδη (128 [84]

85 μg/ml), τότε τα ριβοσώματα αυτά διαχωρίζονται επιτυχώς στις υπομονάδες τους αν και η ποσοτική κατανομή των υπομονάδων δεν ταιριάζει στις φυσιολογικές συνθήκες. Βλέπουμε δηλαδή πάλι ότι τα συγκεκριμένα ριβοσώματα εξαρτώνται από τη λινεζολίδη και ότι η λειτουργικότητά τους αποκαθίσταται με την προσθήκη του αντιβιοτικού. Σύμφωνα με τις κρυσταλλογραφικές μελέτες (Wilson et al., 2008; Ippolito et al., 2008) η λινεζολίδη προσδένεται κοντά στο νουκλεοτίδιο U2504 αλλά σε αρκετά μεγάλη απόσταση από το νουκλεοτίδιο C2534. Όπως φαίνεται όμως στην εικόνα 6.1 η πρωτεΐνη L3 βρίσκεται ανάμεσα στα δύο αυτά νουκλεοτίδια και τα συνδέει με τέτοιο τρόπο ώστε να σχηματίζουν ένα δίκτυο το οποίο παρουσία της λινεζολίδης θα μπορούσε τροποποιήσει την καθορισμένη ιεραρχία της συναρμολόγησης των ριβοσωμάτων, οδηγώντας με αυτό τον τρόπο στην εμφάνιση ενός νέου είδους, ενεργού μόνο παρουσία του αντιβιοτικού. Είναι γνωστή από τη βιβλιογραφία η περίπτωση της καζουγκαμυκίνης (Kaberdina et al., 2009) η παρουσία της οποίας επάγει το σχηματισμό 61S ριβοσωματικών σωματίων αντί των φυσιολογικών 70S. Αυτά τα ριβοσωματικά σωμάτια στερούνται τουλάχιστον 6 ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Στην περίπτωσή μας αυτό δεν ταιριάζει, γιατί η κορυφή των 70S στο gradient της σουκρόζης δεν έχει μετατοπιστεί παρουσία του αντιβιοτικού. Θα μπορούσε όμως ενδεχομένως να απουσιάζουν μία ή δύο ριβοσωματικές πρωτεΐνες χωρίς αυτό να γίνεται αντιληπτό με την ανάλυση στη βαθμίδωση σουκρόζης. Έτσι λοιπόν θα πρέπει να μελετηθεί περαιτέρω αν οι 50S υπομονάδες του μεταλλαγμένου στελέχους που έχει αναπτυχθεί παρουσία της λινεζολίδης φέρουν όλες τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες και αν όντως στερούνται ριβοσωματικών πρωτεϊνών θα πρέπει να βρεθεί αν αυτές οι πρωτεΐνες έχουν απομακρυνθεί από το σωμάτιο 50S μετά το σχηματισμό του ή αν έχει αλλάξει η διαδικασία με την οποία σχηματίζεται η καινούρια ριβοσωματική υπομονάδα. Τέλος από τη μελέτη αυτή φαίνεται ότι ο κίνδυνος χρήσης των αντιβιοτικών πολλές φορές είναι πολύ μεγάλος και δεν περιορίζεται μόνο στην εμφάνιση ανθεκτικών στελεχών. Αντιθέτως, αναπτύσσονται στελέχη των οποίων η ανάπτυξη εξαρτάται από την παρουσία του αντιβιοτικού και αντί για αναστολή της ανάπτυξης η χορήγηση του αντιβιοτικού δημιουργεί συνθήκες ενεργοποίησης. [85]

86 Εικόνα 6.1: Α) Κρυσταλλική δομή της 50S υπομονάδας του D. radiodurans στην οποία τονίζεται με κόκκινο χρώμα η θέση πρόσδεσης της λινεζολίδης, με πράσινο η πρωτεΐνη L3 και με κίτρινο το νουκλεοτίδιο C2534. B) Παρατηρούμε τη λινεζολίδη (ροζ χρώμα) στη θέση πρόσδεσής της που αποτελείται από οκτώ καθολικώς συντηρημένα νουκλεοτίδια (μπλε) του 23S rrna καθώς και την πρωτεΐνη L3 (πράσινο χρώμα) (Wilson et al., 2008, PDB files (3DLL)). [86]