Νικόλαος Σιαφάκας Λέκτορας Διαγνωστικής Ιολογίας Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας ΠΓΝ «ΑΤΤΙΚΟΝ»
DNA RNA: ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ, ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ DNA RNA: Βασικά Χαρακτηριστικά Ρόλος Κεντικό Δόγμα της Βιολογίας: Αντιγραφή DNA Μεταγραφή DNA mrna Μετάφραση mrna Πρωτεΐνες Διαφορές Μεταξύ Προκαρυωτικών και Ευκαρυωτικών Οργανισμών Αποκλίσεις από το Κεντρικό Δόγμα Παραδείγματα
DNA RNA: ΒΑΣΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Κυτοσίνη Συμπληρωματικές Βάσεις: Α Τ (A U) C G Κυτοσίνη Γουανίνη Γουανίνη Αδενίνη Ουρακίλη Αζωτούχες Βάσεις Συμπληρωματικό Ζεύγος Βάσεων Κορμός Πεντόζης Φωσφορικής Ρίζας Αδενίνη Θυμίνη Δεσμοί Υδρογόνου Αζωτούχες Βάσεις Ριβονουκλεϊκό Οξύ Δεοξυριβονουκλεϊκό Οξύ Αζωτούχες Βάσεις
DNA: RNA: DNA RNA: ΡΟΛΟΣ Μακρομόριο Αποθήκευσης Πληροφοριών και Εντολών για τα Δομικά και Λειτουργικά Χαρακτηριστικά του Έμβιου Κόσμου Αγγελιαφόρο (messenger) RNA (mrna) Μεταφορέας Εντολών από το DNA στο «Εργοστάσιο Παραγωγής»Δομικών και Λειτουργικών Πρωτεϊνών (Ριβοσώματα) Μεταφορικό (transfer) RNA (trna) Μεταφορέας Αμινοξέων για τη Σύνθεση των Πρωτεϊνών Ριβοσωμικό (ribosomal) RNA (rrna) Κύριο Δομικό Συστατικό των Ριβοσωμάτων
ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΔΟΓΜΑ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΡΟΗ ΚΩΔΙΚΟΠΟΙΗΜΕΝΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ DNA mrna ΠΡΩΤΕΪΝΗ
ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Γενετικό Αλφάβητο Καταγραφής Εντολών για την Παραγωγή των Δομικών και Λειτουργικών Πρωτεϊνών (Φαινότυπος) Κωδικόνιο: Τριπλέτα Νουκλεοτιδίων που περιέχει την πληροφορία για 1 Αμινοξύ 4 3 =64 Δυνατοί Συνδυασμοί Τριπλετών Νουκλεοτιδίων 20μόνο Αμινοξέα ΓΙΑΤΙ; Εκφυλισμός Γενετικού Κώδικα: Περισσότερα από 1 Κωδικόνια για 1 Αμινοξύ (Ποτέ το Αντίστροφο!) Κ ω δ ι κ ό ν ι α Ποικιλομορφία στο Τρίτο Αμινοξύ Μείωση πιθανότητας έκφρασης μίας μετάλλαξης στην πρωτεΐνη
1 η Βάση Κωδικονίου 2 η Βάση Κωδικονίου 3 η Βάση Κωδικονίου ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ ΠΟΛΥΠΕΠΤΙΔΙΟ ΠΡΩΤΕΪΝΗ ΚΥΤΤΑΡΟ ΑΛΦΑΒΗΤΟ ΠΡΟΤΑΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΒΙΒΛΙΟ
Συνεπώς: ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Μην Ξεχνάμε: Αλληλουχία DNA (Μέσω Γενετικού Κώδικα) Αλληλουχία Αμινοξέων Δομική Διαμόρφωση Πρωτεΐνης Προσδιορισμός Λειτουργίας Πρωτεΐνης Ο Γενετικός Κώδικας είναι Καθολικός Υποδηλώνει την Εξειδικευμένη Σχέση Γονοτύπου Φαινοτύπου ΒΑΣΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΚΑΙ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑΣ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΤΗ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ
Παράδειγμα: ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Εντεροϊοί του Ανθρώπου: 79 Ορότυποι και συνεχώς ανακαλύπτονται νέοι Η Αντιγονική Ταυτότητα που προσδιορίζει τον Ορότυπο βρίσκεται στη VP1 Καψιδική Πρωτεΐνη:
ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΚΩΔΙΚΑΣ Νουκλεοτιδική Αλληλουχία Γονιδίου που Κωδικοποιεί την Αλληλουχία Αμινοξέων της Αντιγονικής VP1 Περιοχής του Καψιδίου που προσδιορίζει τον Ορότυπο Ταυτοποίηση Οροτύπων: Ανοσοβιολογικές Μέθοδοι: Δύσκολο, πολλοί Ορότυποι και Διασταυρούμενες Αντιδράσεις Ανίχνευση με PCR γονιδίου που κωδικοποιεί VP1 και Εύρεση Νουκλεοτιδικής Αλληλουχίας του: Πλέον Κατάλληλη Μεθοδολογία Λόγω Γενετικού Κώδικα η Νουκλεοτιδική Αλληλουχία Αντιστοιχεί Απόλυτα στην Αλληλουχία των Αμινοξέων που προσδιορίζουν τον Ορότυπο
ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ DNA Διαιώνιση της Ζωής (Διατήρηση των Γενετικών Πληροφοριών που την Εκφράζουν) Μητρικός Κλώνος Ημισυντηρητικός Τρόπος: Κάθε ένας από τους 2 Κλώνους λειτουργεί ως Μήτρα για την παραγωγή ενός Θυγατρικού Κλώνου μέσω της συμπληρωματικότητας των αζωτούχων βάσεων Πολύπλοκο Ενζυμικό Σύστημα για τη διάνοιξη των κλώνων και τη δημιουργία των 2 θυγατρικών από την DNA Πολυμεράση: Μητρικός Κλώνος Θυγατρικός Κλώνος Θυγατρικός Κλώνος
ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ DNA
ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ DNA
ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ DNA mrna Παραλαβή της Γενετικής Πληροφορίας από τον Αγγελιαφόρο mrna για να τη μεταφέρει στα «Εργοστάσια» Εκτέλεσής της (Ριβοσώματα) Ένας από τους 2 Κλώνους λειτουργεί ως Μήτρα για την παραγωγή του mrna μέσω της συμπληρωματικότητας των νουκλεοτιδικών αζωτούχων βάσεων DNA εξαρτώμενη RNA Πολυμεράση: Κεντρικό Ένζυμο παραγωγής του mrna
ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ DNA mrna Παράγοντες Μεταγραφής (Πρωτεΐνες) RNA Πολυμεράση (Πρωτεΐνη) C T A A T G T... 5 3 G A T T A C A... Περιοχές Σύνδεσης 3 5 5 3 C T A A T G T... G A T T A C A... 3 5
ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ DNA mrna Παράγοντες Μεταγραφής (Πρωτεΐνες) RNA Πολυμεράση (Πρωτεΐνη) 5 3 3 5 Συμπληρωματικό mrna 5 3 3 5
ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ DNA mrna
ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Πραγματοποιείται στα ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΑ: Σύμπλοκα rrna και Πρωτεϊνών Μεγάλη (60S Ευκαρυωτικοί 50S Προκαρυωτικοί) και Μικρή (40S Ευκαρυωτικοί 30SΠροκαρυωτικοί) Υπομονάδα Το Μεταφορικό RNA (trna) μεταφέρει τα αμινοξέα τα οποία αντιστοιχούν σε συγκεκριμένα κωδικόνια του mrna Συνεπώς, κάθε μόριο trna είναι ειδικό για τη μεταφορά ενός και μόνο από τα 20 αμινοξέα μέσω της συμπληρωματικής σύνδεσης κωδικονίου στο mrna και αντικωδικονίου στο trna:
ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Κορμός Υποδοχής Αμινοξέων Θηλειά ΤΨC Θηλειά D Ποικιλόμορφη Θηλειά Αντικωδικόνιο
ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Το ριβόσωμα προσκολλάται στο σημείο έναρξης της μετάφρασης πάνω στο mrna Μεγάλη Ριβοσωμική Υπομονάδα Αντικωδικόνιο trna Κωδικόνιο Έναρξης (Αμινοξύ Μεθειονίνη) Μικρή Ριβοσωμική Υπομονάδα
ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Στη συνέχεια, το ριβόσωμα προχωρά κατά μήκος του mrna, συνθέτοντας μία αλληλουχία αμινοξέων (πολυπεπτιδική αλυσίδα) που αντιστοιχεί στην αλληλουχία του mrna: Αναπτυσσόμενο Πολυπεπτίδιο Ολοκληρωμένη Πρωτεΐνη Κωδικόνιο Έναρξης Κωδικόνιο Λήξης Κίνηση Ριβοσώματος
ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ
ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΜΕΤΑΞΥ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Απουσία Διαμερισματοποίησης στα Προκαρυωτικά Κύτταρα Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιούνται στον ίδιο ενδοκυττάριο χώρο Έναρξη Μετάφρασης πριν τελειώσει η διαδικασία της Μεταγραφής Πυρήνας Πυρηνίσκος Μιτοχόνδριο Πυρηνοειδές Μαστίγιο Τοίχωμα Ριβοσώματα Μεμβράνη Ευκαρυωτικό Κύτταρο Προκαρυωτικό Κύτταρο
ΔΙΑΦΟΡΕΣ ΜΕΤΑΞΥ ΠΡΟΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Ιντρόνια (Μη Κωδικές Περιοχές) και Εξόνια (Κωδικές Περιοχές) στο ευκαρυωτικό mrna Επεξεργασία του mrna αμέσως μετά τη Μεταγραφή για αφαίρεση των Ιντρονίων (Μάτισμα) και την τελική Μετάφραση των Εξονίων στα Ριβοσώματα Συστήματα ελέγχου ροής της Γενετικής Πληροφορίας σε όλα τα επίπεδα και στους 2, με περισσότερο πολύπλοκα συστήματα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΣΤΗ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Αντιγραφή DNA: Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (PCR) In vitro Κλωνοποίηση Γενετικού Υλικού Τμήμα DNA για ανίχνευση 3ος Κύκλος 4ος Κύκλος ΕΚΘΕΤΙΚΗ ΑΥΞΗΣΗ 1ος Κύκλος 2ος Κύκλος 2 2 = 4 αντίγραφα 2 3 = 8 αντίγραφα 32 αντίγραφα 16 αντίγραφα
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΣΤΗ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Μεταγραφή DNA mrna: Transcription Mediated Amplification (TMA): Ισοθερμική μέθοδος ανίχνευσης RNA και DNA στόχων μέσω ενός συστήματος DNA εξαρτώμενης RNA Πολυμεράσης και Αντίστροφης Μεταγραφάσης Χρησιμοποιείται στην ανίχνευση M. tuberculosis, C. trachomatis & HCV NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification): Αντίστοιχη ισοθερμική μέθοδος πολλαπλασιασμού RNA στόχων που βασίζεται στηδράση παρόμοιυ συστήματος T7 RNA Πολυμεράσης και Αντίστροφης Μεταγραφάσης
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΕΦΑΡΜΟΓΗΣ ΣΤΗ ΣΥΓΧΡΟΝΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ Μετάφραση DNA mrna: Γενετική Μηχανική για την παραγωγή Επιθυμητών Γονιδιακών Προϊόντων, π.χ.: Παραγωγή Ανοσογόνων Πολυπεπτιδίων για τη χρήσης τος ως Εμβόλια Επιφανειακό Αντιγόνο Ιού Ηπατίτιδας Β
ΑΠΟΚΛΙΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΔΟΓΜΑ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ ΑΝΤΙΓΡΑΦΗ RNA DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ mrna ΠΡΩΤΕΪΝΗ
ΑΠΟΚΛΙΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΔΟΓΜΑ Αντιγραφή RNA RNA Ιούς (π.χ. Οικογένειες Picornaviridae, Retroviridae) πραγματοποιείται από RNA εξαρτώμενη RNA Πολυμεράση RNA Ιοί: Το Γενετικό Υλικό δρα άμεσα ως mrna (Θετικής Πολικότητας), ήείναιαρνητικής Πολικότητας και Αντιγράφεται στο Συμπληρωματικό του Κλώνο για να γίνει mrna (Θετικής Πολικότητας) και να καθοδηγήσει τη Μετάφραση των Ιϊκών Πρωτεϊνών Hepadnaviridae (Ιός Ηπατίτιδας Β) Retroviridae (HIV) Αντίστροφη Μεταγραφή (Μετατροπή RNA σε DNA Αντίστροφη Ροή Γενετικής Πληροφορίας)
ΑΠΟΚΛΙΣΕΙΣ ΑΠΟ ΤΟ ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΔΟΓΜΑ Αντίστροφη Μεταγραφή: Συμπληρώνει Μοριακές Τεχνικές για την Ανίχνευση RNA Ιών και mrna, π.χ.: RT PCR (Reverse Transcription PCR) για την ανίχνευση Εντεροϊών, Ιών της Γρίππης, κ.λ.π., καθώς και mrna γονιδίων υπεύθυνων για μικροβιολογικά σημαντικούς φαινοτύπους (π.χ. Σχηματισμό Βιοφίλμ)
ΣΑΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ
Σε ποια είδη μικροοργανισμών παρατηρείται αντιγραφή RNA: Βακτήρια Μύκητες Ιοί Πρωτόζωα ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ
ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ Η αντίστροφη μεταγραφή αποτελεί εξαίρεση του κεντρικού δόγματος της Βιολογίας. Συνεπώς, ως εργαστηριακή τεχνική μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο: Για τη διάγνωση λοιμώξεων από ρετροϊούς και τον ιό της Ηπατίτιδας Β Για τη διάγνωση λοιμώξεων από όλους τους ιούς Για τη διάγνωση μόνο ιογενών λοιμώξεων Για τη διάγνωση ιογενών λοιμώξεων και τη διερεύνηση της ποσοτικής έκφρασης κλινικά σημαντικών γονιδίων προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών