Κύταρο και DNA Γονίδια: µεταγραφή µετάφραση Προκαρυωτικοί οργανισµοί Ευκαρυωτικοί οργανισµοί Τεχνολογίες συλλογής δεδοµένων υψηλής απόδοσης Αλληλούχιση γονιδιακού DNA Μέτρηση mrna (transcriptomics) Μικροσυστοιχίες, SAGE, real-time PCR Μέτρηση πρωτεϊνών (proteomics) 2D gels, 2D DIGE, mass spec Αλληλεπιδράσεις DNA και πρωτεϊνών Band shifts, ChIP-chip Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 2 1
Τα κύταρα είναι πολύπλοκες οντότητες Εµείς το βλέπουµε απλουστευµένο: Εξωκυτάριος χώρος Μεµβράνη (ή κυταρ τοίχωµα) Κυτόπλασµα Πυρήνας (ευκαρυωτικοί) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 3 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 4 2
2-4 billion yrs Source: http://www.bmb.psu.edu/courses/micro401/default.htm Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 5 Κύτταρικός τύπος mrna Αρχιτεκτονική γονιδίων Προκαρυωτικοί Κυτ τοίχωµα, χωρίς πυρήνα/οργανοσωµ. Πολυκιστρονικό Απλή (χωρίς ιντρόνια, µικρά UTRs) Ευκαρυωτικοί Κυτ µεµβράνη, µε πυρήνα & οργανοσωµ. Μονοκιστρονικό (µε κάποιες εξαιρέσεις) Σύνθετη Μεταγραφή Απλή Σύνθετη Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 6 3
Υποκινητής ιστός, χρόνος, ρυθµός µεταγρ Χρόνος ηµίσειας ζωής «Μετα-» τροποιήσεις Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 7 trna (*) Ριβοσωµικό RNA (*) snorna (*) microrna Και άλλα που πιθανώς αγνοούµε Source: http://www.emc.maricopa.edu/faculty/farabee/biobk/biobookprotsyn.html (*) δε θα συζητηθούν στα πλαίσια αυτού του µαθήµατος Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 8 4
Μεταθετά στοιχεία (*) Επαναλαµβανόµενο (repetitive) DNA (*) junk DNA (*) (*) δε θα συζητηθούν στα πλαίσια αυτού του µαθήµατος Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 9 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 10 5
Τι είναι; Γιατί είναι σηµαντική; Πώς γίνεται; Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 11 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 12 6
Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 13 1977: Φάγος φx174 (5,368 bp) 1995: Heamophilus influenza (1.8M bp) Whole Genome Shotgun sequencing 1997: Escherichia coli (4.6M bp) 1992: Saccharomyces cerevisiae (12M bp) 1998: Caenorhabditis elegans (97M bp) 2000: Drosophila melanogaster (120M bp) WGS sequencing 2001: Homo sapiens (2.9B bp) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 14 7
Eric S. Lander et al. (2001) Nature 409: 860-921 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 15 Archea: Bacteria: 100 γονιδιώµατα 1,704 γονιδιώµατα Eukaryotae: 1,939 γονιδιώµατα (συµπεριλ. Μιτοχ) Viruses: 2,451 γονιδιώµατα Πηγή: NCBI, 4 Ιανουαρίου 2008 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 16 8
Πηγή: GOLD database, http://www.genomesonline.org/ Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 17 Πηγή: GOLD database, http://www.genomesonline.org/ Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 18 9
Αρχικά: ευκολία (φάγοι, βακτήρια, κλπ) Αργότερα: οργανισµοί µοντέλα (yeast, worm, fly, etc) Τώρα: οικονοµικά σηµαντικά (αγελάδα, άλογο, µέλισσα, κλπ) ή άλλοι λόγοι (chimp, opossum, mosquito, sea urchin, etc) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 19 Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) 330-420 Myrs Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 20 10
Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 21 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 22 11
2/1/09 Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 NCBI/NLM Databases: ENTREZ (κοινή είσοδος) GenBank: γενική νουκλεοτιδική PubMed: βιοϊατρική αρθρογραφία GEO: gene expression omnibus SWISS-PROT/TrEMBL (ExPASY) 23 Πρωτεϊνικές αλληλουχίες µε πληροφορίες (annotation) Protein Data Bank (PDB) Δοµές πρωτεϊνών (3D) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 24 12
Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 25 Αρχική παραγωγή 100-200 bp/lane x 20 lanes Διάβασµα: «µε το µάτι» Fluorescent dye sequencing 100-200 bp/lane x 20 lanes Διάβασµα: αυτόµατο (scanner) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 26 13
454 sequencer 250 bp x 400,000 reads/run Τµήµατα DNA είναι προσκολληµένα σε σφαιρίδια (beads), πολλαπλασιάζονται (PCR) και αλληλουχούνται Μοπρεί να αλληλουχήσει 2 βακτηριακά γονιδιώµατα σε ένα τρέξιµο (4.5 hr)!! Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 27 Μικροσυστοιχίες (microarrays) cdna arrays Oligonucleotide arrays (Affymetrix) Real-time PCR SAGE Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 28 14
Ερώτηση: ποιά γονίδια ή οµάδες γονιδίων εκφράζονται διαφορετικά µεταξύ δύο (ή περισσοτέρων) κυταρικών τύπων, δειγµάτων, κλπ; Microarrays: mrna/cdna is labeled and hybridizes on an array of genes (cdnas); the intensity of the signal corresponds to the abundance of the mrna Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 29 cdna arrays Oligonucleotide arrays Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 30 15
SAGE (serial analysis of gene expression Real-time PCR Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 31 Microarrays: (Cross)hybridization variability a priori knowledge of the genes (exact or non-exact structure) SAGE: Real-time RT-PCR: Low throughput time/resource consuming sequencing errors decrease efficiency a priori knowledge of the gene of interest Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 32 16
2D gels (κλασσικά) 2D Difference gel electrophoresis (DIGE) Mass fingerprinting (e.g., MALDI-TOF) Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 33 Εύρεση στόχων in vitro SELEX, phage display Μικροσυστοιχίες για protein-dna interaction Band shifts, QuMFRA Εύρεση στόχων in vivo ChIP, ChIP-on-chip STAGE Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 34 17
Source: http://www.piercenet.com/media/super_oct1.jpg Source: http://www.biomedcentral.com/content/figures/1471-2091-3-13-3.jpg Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 35 Source: EMBO Reports Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 36 18
Τις κυριώτερες στρατηγικές αλληλούχισης DNA Πλεονεκτήµατα - µειονεκτήµατα Άλλες µεθόδους συλλογής γενοµικών δεδοµένων που χρησιµοποιούµε για: Transcriptomics Proteomics Αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών µε DNA Μπένος ΒΙΟ315 9-ΦΕΒ-2009 37 19