DNA MICROARRAYS. Σελίδα 1 ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ. Τ. Θηραίου

Transcript

1 DNA MICROARRAYS Σελίδα 1

2 Μελέτη του γονιδιώματος Ποια είναι τα γονίδια και που βρίσκονται; Ποιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν την έκφραση κάθε γονιδίου; Σε τι επίπεδα εκφράζονται τα γονίδια υπό διαφορετικές συνθήκες; Ποια είναι η λειτουργία των γονιδίων; Πως τα προϊόντα των διαφόρων γονιδίων αλληλεπιδρούν μεταξύ τους ή με άλλα μόρια στο κύτταρο; Σελίδα 2

3 transcriptome Ευρείας κλίμακας μετρήσεις συγκέντρωσης του RNA Αλληλούχιση (RNA-seq) Μικροσυστοιχίες (microarrays) Μεταβολές RNA είδος κυττάρου στάδιο ανάπτυξης εξωτερικά ερεθίσματα ασθένειες Σελίδα 3

4 Μικροσυστοιχίες (microarrays) Ανιχνεύουν την παρουσία και αφθονία επισημασμένων νουκλεϊνικών οξέων από ένα βιολογικό δείγμα. επιφάνεια (πλακίδιο) πάνω στην οποία τοποθετούνται γνωστά μόρια DNA (probes) σε συγκεκριμένες θέσεις υβριδοποίηση των γνωστών μορίων DNA (probes) με νουκλεϊνικά οξέα από το βιολογικό δείγμα (targets) Σελίδα 4

5 probes μεγαλύτερο probe ανιχνεύει targets σε μικρότερες συγκεντρώσεις ανέχεται περισσότερους πολυμορφισμούς (mismatches) cdna ολιγομερή (oligonucleotides) μήκους βάσεων Σελίδα 5

6 Κατασκευή μικροσυστοιχιών Spotted arrays εκ των προτέρων σύνθεση των probes ή cdna ή προϊόντα PCR ρομποτική εκτύπωση προσαρμογή στις ανάγκες κάθε εργαστηρίου χαμηλό κόστος Σελίδα 6

7 In situ synthesis Κατασκευή μικροσυστοιχιών Σελίδα 7

8 In situ synthesis Κατασκευή μικροσυστοιχιών Οι προς ανάλυση ακολουθίες "χτίζονται" πάνω στο πλακίδιο. Φωτολιθογραφία Φωτοευαίσθητη ομάδα που εμποδίζει τον πολυμερισμό. Επανάληψη βημάτων για τη δημιουργία διαφορετικών ολιγονουλεοτιδίων Χρήση κατάλληλης μάσκας Ακτινοβόληση Προσθήκη νουκλεοτιδίων Απομάκρυνση των εναπομείναντων νουκλεοτιδίων Σελίδα 8

9 Ανίχνευση Two color detection Δύο δείγματα υβριδοποιούνται στο ίδιο array, κάθε ένα επισημασμένο με διαφορετική φθορίζουσα ουσία. Επιτρέπει διαφορική ανάλυση. One color detection Ένα δείγμα επισημασμένο με μια φθορίζουσα ουσία υβριδοποιείται στο array. Η επιλογή βασίζεται στην τεχνολογία microarrays που χρησιμοποιείται. Σελίδα 9

10 πείραμα cdna Microarray Βιολογικό Ερώτημα Ανάλυση Δεδομένων και Μοντελοποίηση Σχεδιασμός Πειράματος Ανάγνωση Μικροσυστοιχίας Προετοιμασία Δείγματος Υβριδοποίηση Σελίδα 10

11 πείραμα cdna Microarray Σελίδα 11

12 πείραμα cdna Microarray Εξαγωγή του RNA για την υπό μελέτη συνθήκη και τη συνθήκη αναφοράς. Αντίστροφη μεταγραφή, πολλαπλασιασμός και επισήμανση του DNA κάθε δείγματος με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική. Συνήθως Cy3 (~570nm) για τη συνθήκη αναφοράς και Cy5 (~680nm) για την υπό μελέτη συνθήκη. Ανάμειξη των δειγμάτων και υβριδοποίηση στη μικροσυστοιχία. Απομάκρυνση του μη δεσμευμένου cdna. Σελίδα 12

13 πείραμα cdna Microarray Ανάγνωση της μικροσυστοιχίας. confocal scanning laser fluorescence microscopy διέγερση και λήψη σήματος για κάθε μία χρωστική σύνθεση των δύο εικόνων Cy3 Cy5 overlay RGB image Σελίδα 13

14 πείραμα cdna Microarray Ανάγνωση της μικροσυστοιχίας. πράσινο: εκφράζεται στο δείγμα αναφοράς κόκκινο: εκφράζεται στο υπό μελέτη δείγμα κίτρινο: εκφράζεται και στα δύο δείγματα μαύρο: δεν εκφράζεται σε κανένα δείγμα Υπολογισμός του λόγου των εντάσεων των δύο χρωστικών για κάθε κηλίδα (spot). Σελίδα 14

15 GeneChip Σελίδα 15

16 Βιολογική Μεταβλητότητα διακυμάνσεις έκφρασης Πειραματική Μεταβλητότητα Πηγές μεταβλητότητας κατασκευή εξαγωγή mrna και αντίστροφη μεταγραφή υβριδισμός ενσωμάτωση χρωστικών κ.α. Σελίδα 16

17 Σχεδιασμός Πειράματος technical vs biological replicates επανάληψη πειράματος με RNA που έχει εξαχθεί από το ίδιο vs διαφορετικό δείγμα dye swaps επανάληψη πειράματος με ανταλλαγή των χρωστικών που επισημαίνουν το δείγμα υπό μελέτη και το δείγμα αναφοράς S 1 S 2 S 1 S 2 Σελίδα 17

18 Επεξεργασία εικόνας καταγραφή της έντασης για κάθε κηλίδα Addressing Ανάθεση συντεταγμένων σε κάθε κηλίδα Σελίδα 18

19 Επεξεργασία εικόνας Segmentation Ταξινόμηση των pixels ως πραγματικό σήμα (foreground) ή υπόβαθρο (background)

20 Επεξεργασία εικόνας Intensity extraction εντάσεις R, G για την κηλίδα ένταση υποβάθρου διόρθωση για την ένταση υποβάθρου Σελίδα 20

21 Μέτρηση έκφρασης Μέτρηση σχετικών και όχι απόλυτων τιμών. Για το γονίδιο i Red i = red - background Green i = green - background T i = Red i /Green i Μετατροπή σε λογάριθμο με βάση το 2 log 2 (T i ) ευκολότερη ερμηνεία log 2 (1)=0 log 2 (2)=1 log 2 (1/2)=-1 Σελίδα 21

22 Μέτρηση έκφρασης Μ = log 2 (Red/Green) = log 2 (Red) - log 2 (Green) Α = 1/2 [log 2 (Red) + log 2 (Green)] = 1/2 log 2 (Red*Green ) Σελίδα 22

23 Κανονικοποίηση διόρθωση συστηματικών πειραματικών διακυμάνσεων σύγκριση μικροσυστοιχιών γενική αρχή: μικρός αριθμός γονιδίων επιδεικνύει διαφοροποιήσεις στην γονιδιακή έκφραση Σελίδα 23

24 Spots Genes Ανάλυση Δεδομένων Raw data Array scans Intermediate data Images Final data Gene Expression Matrix Samples Spot/Image quantitations Gene expression levels Σελίδα 24

25 Ανάλυση Δεδομένων πίνακας έκφρασης γονιδίων γραμμές γονίδια στήλες διαφορετικά δείγματα επίπεδο έκφρασης του 5ου γονιδίου στο 4ο δείγμα: (normalized) log2(r/g) Σελίδα 25

26 Ανάλυση Δεδομένων Αναγνώριση γονιδίων με παρόμοιο προφίλ έκφρασης Λειτουργικά σχετιζόμενα γονίδια Συν-ρυθμιζόμενα γονίδια Αναγνώριση δειγμάτων με παρόμοια επίδραση στην έκφραση γονιδίων Clustering (Ομαδοποίηση) Σελίδα 26

27 Ανάλυση Δεδομένων Πρόβλεψη της κλάσης στην οποία ανήκει ένα καινούργιο δείγμα Classification (Κατηγοριοποίηση) Σελίδα 27

28 Ανάλυση Δεδομένων Feature Selection επιλογή των γονιδίων που διαφοροποιούν δείγματα σε κατηγορίες ενδιαφέροντος (π.χ. ιστοί, ασθένειες) Ποιος είναι ο ελάχιστος αριθμός γονιδίων που απαιτούνται για την κατηγοριοποίηση? (avoid chance classification) Ποιος είναι ο μέγιστος αριθμός γονιδίων που απαιτούνται για την κατηγοριοποίηση? (avoid overfitting) Σελίδα 28

29 Ανάλυση Δεδομένων differentially expressed genes Επιλογή των γονιδίων που η έκφρασή τους διαφέρει σημαντικά μεταξύ συνθηκών (π.χ. υγιής vs ασθενής ιστός) Στατιστικές μέθοδοι Βιολογική ερμηνεία υπερ- / υπο- εκπροσωπούμενοι όροι λειτουργικού σχολιασμού των γονιδίων (π.χ. GO terms, KEGG pathways) Σύγκριση ή συνδυασμός πειραμάτων μικροσυστοιχιών Σελίδα 29

30 Προτυποποίηση Δεδομένων ΜIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment) πληροφορίες σχετικά με το πείραμα που πρέπει να δημοσιοποιηθούν αναπαραγωγή των αποτελεσμάτων και σύγκριση με άλλα Σελίδα 30

31 Βάσεις Δεδομένων Απαραίτητη η κατάθεση των δεδομένων πριν τη δημοσίευση σε κάποια περιοδικά. ArrayExpress Gene Expression Omnibus (GEO) Σελίδα 31

32 Εφαρμογές Σελίδα 32

33 Εφαρμογές Gene expression profiling λειτουργία γονιδίων δίκτυα ρύθμισης γονιδιακής έκφρασης Comparative genomics χαρακτηρισμός των γονιδίων ενός οργανισμού καθορισμός του τρόπου έκφρασης με βάση έναν πρότυπο οργανισμό Σελίδα 33

34 Εφαρμογές DNA copy number πολλαπλασιασμός ή απώλεια γενομικών περιοχών ποικιλομορφία ασθένειες Σελίδα 34

35 Εφαρμογές Single Nucleotide Polymorphism (SNP) σημειακοί νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί Family-based linkage studies αναγνώριση γονιδίων που σχετίζονται με κάποια ασθένεια σε μια οικογένεια Population-based association studies αναγνώριση SNPs που σχετίζονται με κάποια ασθένεια σ ένα πληθυσμό Σελίδα 35

36 Εφαρμογές Ιατρική Κατανόηση ασθενειών Διάγνωση Πρόγνωση Εξατομικευμένη θεραπεία Σελίδα 36

37 Εφαρμογές Φαρμακολογία στόχοι νέων φαρμάκων εκτίμηση τοξικότητας φαρμακογενομική κωδικοποίηση πρωτεϊνών ενζύμων που καθορίζουν την απορρόφηση, το μεταβολισμό και την αποβολή των φαρμάκων από τον οργανισμό παρενέργειες - one size does NOT fit all Σελίδα 37

38 διαφοροποίηση στην απόκριση στο φάρμακο 6-mercaptopurine στους περισσότερους μεταβολίζεται γρήγορα, απαιτώντας μεγάλες δόσεις Εφαρμογές οι διαφορές οφείλονται στο γονίδιο του ενζύμου ΤΡΜΤ με έναν απλό έλεγχο μπορεί να καθορίζεται η δόση, ανάλογα με το γενετικό προφίλ σε άλλους μεταβολίζεται πιο αργά και απαιτείται χαμηλότερη δόση σε ένα μικρό ποσοστό δεν μεταβολίζεται σωστά με αποτέλεσμα η συνήθης δόση να είναι ακόμα και μοιραία κανονική δόση μειωμένη δόση για άτομο με προβληματική έκφραση του ΤΡΜΤ Σελίδα 38

39 Εφαρμογές Τοξικογενομική έκθεση σε τοξικό παράγοντα μοριακός μηχανισμός δράσης μοναδική μοριακή υπογραφή ανίχνευση του τοξικού παράγοντα ομαδοποίηση τοξικών παραγόντων με κοινή δράση, με βάση την ομοιότητα των μοριακών προφίλ τους

40 Εφαρμογές PhyloChip DNA Microarray for Rapid Profiling of Microbial Populations Σελίδα 40

41 Protein microarrays (Protein chips) Η μελέτη των γονιδίων δεν μπορεί να προσφέρει πολλές πληροφορίες για τις ιδιότητες των πρωτεϊνών >200 τύποι μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων που επηρεάζουν την λειτουργία και τις ιδιότητες και δεν μπορούν να προβλεφθούν από την ακολουθία DNA Προετοιμασία, διάταξη και ανάλυση πρωτεϊνών σε υψηλή χωρική πυκνότητα (microarray format) Μεγαλύτερη δυσκολία στην προετοιμασία Διατήρηση πρωτεϊνών στη βιολογικά ενεργή τους μορφή Σελίδα 41

42 Protein microarrays Βασικοί τύποι Αναλυτικές μικροσυστοιχίες με τη χρήση κατάλληλων μορίων στο πλακίδιο μπορούν να ποσοτικοποιήσουν την παρουσία πρωτεϊνών σε ένα δείγμα Λειτουργικές μικροσυστοιχίες ομάδες πρωτεϊνών διατάσσονται στο πλακίδιο για τη μελέτη διαφόρων βιοχημικών διεργασιών Σελίδα 42

43 Protein microarrays Εφαρμογές Σελίδα 43