ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ : ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ. Γεώργιος Θ. Τσάγκαρης, PhD Ερευνητική Μονάδα Πρωτεωµικής

Transcript

1 ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ : ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Γεώργιος Θ. Τσάγκαρης, PhD Ερευνητική Μονάδα Πρωτεωµικής

2 Γένωµα v/s Πρωτέωµα κ.λ.π. Γέν-ωµα (γίνοµαι + -ωµα) Μεταγράφηµα (transcriptome) Πρωτέ-ωµα (πρωτεΐνη + -ωµα) Μεταβόλ-ηµα (µεταβολίτης + -ωµα) κ.λ.π. Το µεταγράφηµα, το πρωτέωµα, το µεταβόληµα κ.λ.π. είναι δυναµικά και µεταβάλλονται κάθε στιγµή σαν αποτέλεσµα της αλληλεπίδρασης των βιολογικών συστηµάτων µε το περιβάλλον τους, λόγω της επίδρασης εξωγενών παραγόντων ή παθολογικών καταστάσεων.

3 Genomics vs. Proteomics Same genome......different proteomes

4 Proteome (protein + genome) Total protein complement of a genome. Πρωτέ-ωµα (πρωτεΐνη + -ωµα = σύνολο) Πρωτεωµική-Proteomics Αναφέρεται στο σύνολο των τεχνολογιών της µελέτης των πρωτεϊνών, των µετα-µεταφραστικών τους αλλαγών και των αλληλεπιδράσεων τους µε απώτερο στόχο την κατανόηση πολύπλοκων βιολογικών φαινοµένων.

5 The Human Proteome The human genome comprises about genes The proteome of an individual at a given time point may comprise about gene products The proteome of an individual during the entire life may comprise about gene products The proteome of all human species may comprise up to about gene products

6 Πρωτεωµική Ανάλυση πολύπλοκων µιγµάτων πρωτεϊνών Ταυτοποίηση και το χαρακτηρισµό των πρωτεϊνών/ πρωτεωµικού περιεχοµένου Τη διαφορική ανάλυση των πρωτεϊνών σε µεγάλο αριθµό δειγµάτων Ποσοτική µέτρηση των πρωτεϊνών ενός δείγµατος Την ανάλυση και επεξεργασία των αποτελεσµάτων-βιοπληροφορική

7 Η πρωτεωµική συµπληρώνει τα δεδοµένα από την ανάλυση του γωνιδιώµατος ποιές πρωτεϊνες παράγονται και πού σε τι ποσότητες κάτω από ποιές συνθήκες πως τα επίπεδα των πρωτεϊνών στα βιολογικά υλικά µεταβάλονται σαν αποτέλεσµα παθολογικών καταστάσεων

8 2D gel electrophoresis (gel dependent) Proteomic Analysis Protein Separation Gel free methods Protein Identification Mass Spectrometry MALDI-TOF-TOF LC-MS/MS Tandem MS (Qq-TOF) SELDI N-terminal Sequencing Amino Acid Composition Analysis Bioinformatics

9 Workflow in Proteomics 2D GEL DEPENDENT METHODS Sample Preparation (protein extraction, fractionation) Two-dimensional Electrophoresis (isoelectric focusing, SDS-PAGE) Spot excision (manually, automatically) In-gel Digestion Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS, Ion Trap, Qq-TOF) Protein Identification (changes, modifications) Data Storage

10 Αρχές ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων Ηλεκτρικό φορτίο (Ιsoelectric point) Το µοριακό βάρος (MW) (i) Διαχωρισµό των πρωτεϊνών µε βάση το φορτίο τουςισοηλεκτρική εστίαση (isoelectric focusing). (ii) Διαχωρισµό των εστιασµένων πρωτεϊνών µε βάση το µοριακό τους βάρος.

11 Proteins carry positively and negatively charged side groups and are amphoteric molecules. The protein charge depends on the ph of the solution. The proteins extracted in a denaturing solution (sample buffer) SAMPLE BUFFER [Urea (7M), Thiourea (2M), CHAPS (4%), DTE (10mM), Protease and Phosphatase inhibitors]

12 Workflow in Proteomics SAMPLE PREPARATION BIOLOGICAL MATERIALS Solid materials (cells, tissues, biopsies etc) Biological fluids (plasma, serum, urines, amniotic fluid etc) Homogenization (pressure, sonication, liquid nitrogen etc) High protein conc. (plasma, serum) Low protein conc. (urines, amniotic fluid) Subcellular fractionation SAMPLE BUFFER [Urea (7M), Thiourea (2M), CHAPS (4%), DTE (10mM), Protease and Phosphatase inhibitors] Sample concentration (ultra filtration, precipitation) Protein extraction Protein Fractionation Protein Dialysis

13 Ισοηλεκτική εστίαση - πρώτη διάσταση (Isoelectric focusing, IEF) Η ΙΗΕ είναι µία διαδικασία εξισορόπησης, κατά τη διάρκεια της οποίας κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου υψηλού δυναµικού, οι πρωτεΐνες κινούνται ανάλογα µε το ηλεκτρικό τους φορτίο κατά µήκος ενός διαφορικού ph, ως το σηµείο που αποφορτίζονται και ακινητοποιούνται (ισοηλεκτρικό σηµείο).

14

15 ph

16 Steps in the preparation of 2D electrophoresis Second Dimension Preparation of gels of the desired acrylamide concentration Reduction and alkylation of proteins on IPG strip (equilibration of strip with reducing and alkylating agents) Application of the strip on the acrylamide gel

17

18 Steps in the preparation of 2D electrophoresis Manipulation of the gel Protein fixing and staining (fixation of proteins within the gel and staining with silver or Coomassie blue etc) Strip Acidic region Basic region High MW proteins Acryl. Gel Low MW proteins

19

20 Spot excision

21 Workflow in Proteomics Sample Preparation (protein extraction, fractionation) Two-dimensional Electrophoresis (isoelectric focusing, SDS-PAGE) Spot excision (manually, automatically) In-gel Digestion Enzymatic cleavage (trypsin, chemotrypsin etc) Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS, Ion Trap, Qq-TOF) Peptides Protein Identification (changes, modifications) Data Storage

22 MALDI TOF-TOF MS-MS

23 MALDI ToF MS

24 Spectrum derived from MALDI-MS analysis of a tryptic digest protein spot Intens. [a.u.] x A24_45% _23_5_05 R efl 50x\0_A24\1\1S R ef R aw m/z

25 Πεπτιδικό αποτύπωµα

26

27 Peak Identification [Abs. Int. * 1000] m/z Peptide Mass Fingerprint (PMF) Protein Identification

28

29

30 ph 1 st Dimension IsoElectric Focusing (IEF) Gradient Strips broad range ph narrow range ph 5 6 very narrow range Increased Resolution and Detection of More Spots with the Use of Narrow ph IPG Strips

31 Human Amniotic Fluid analysis on IPG stips 3-10 and 4-7 ph (1 mg total protein) 4 pi 7 3 pi 18cm 18cm 10

32 High abundant protein depletion (-98%) Enrichment of low abundance proteins

33 Plasma before Albumin and IgG Removal A S P Plasma after High Abundance Protein Removal with beads A S S P

34

35 Πλεονεκτήµατα της ηλεκτροφόρησης δυο διαστάσεων Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση εκατοντάδων άγνωστων πρωτεϊνικών µορίων. Εφαρµόζεται σε όλα τα είδη βιολογικών δειγµάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση µετα-µεταγραφικών µεταβολών. Επιτρέπει την µέτρηση της ποσότητας και της µεταβολής στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών. Μειονεκτήµατα Ανιχνεύει κυρίως τις υδρόφιλες πρωτεΐνες µε pi 3-10 και µοριακό βάρος kda. Ανιχνεύει κυρίως της σχετικά υψηλής αφθονίας πρωτεΐνες.

36 GEL FREE METHODS Shotgun proteomics, Bottom-UP and Top-Down LC/MS/MS and Multi-dimensional Protein Identification Technology (MudPIT) Protein microarrays

37 GEL FREE METHODS Principles of LC MS/MS

38 Mass spectrometer Nano LC Orbitrap

39 Principles of LC MS/MS

40

41

42

43 Πρωτεϊνικές Μικροσυστοιχίες (Protein microarrays)

44 Πρωτεϊνικές Μικροσυστοιχίες (Protein microarrays)

45 Πλεονεκτήµατα των gel-free µεθόδων Επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση εκατοντάδων άγνωστων πρωτεϊνικών µορίων. Εφαρµόζεται σε όλα τα είδη βιολογικών δειγµάτων. Επιτρέπει την ανίχνευση µετα-µεταγραφικών µεταβολών. Μειονεκτήµατα Δυσκολία στη µέτρηση της ποσότητας και της µεταβολής στα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών. Τεράστιος όγκος αποτελεσµάτων.

46 ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ Αναφέρεται στην µελέτη της δράσης οποιασδήποτε διαταραχής σε επίπεδο οργανισµού, ιστού ή κυττάρου που έχει σαν αποτέλεσµα µεταβολή στην πρωτεϊνική έκφραση. Λεπτοµερής ανάλυση του πρωτεϊνικού περιεχόµενου των προς µελέτη δειγµάτων και σύγκρισή τους µε στόχο την ταυτοποίηση των πρωτεϊνών που µεταβάλλονται στο ένα δείγµα σε σχέση µε το άλλο. ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ ΠΡΩΤΕΩΜΙΚΗ Προσεγγίσεις Ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων Μεθόδους ανεξάρτητες ηλεκτροφόρησης

47 Διαφορική πρωτεωµική (Differential Proteomics) Ανίχνευση βιολογικών δεικτών Normal Plasma kda Hepatocellular carcinoma in hepatitis C-related cirrhosis kda pi 10 3 pi 10 2D gels stained with coomasie blue

48 Differential Proteomics DiGE method Control Treated Samples were stained with Cy3 or Cy5 fluorescent dye, mixed and co-separated with 2Delectrophoresis Cy3 Label Cy5 Cy3 Mix 2-D co-separation Imaging Cy5 Cy3 + Cy5

49 General idea of gel free labeling methods Sample 1 Sample 2 Labeling Labeling Stable isotope labeling methods Mixing Enzymatic digestion (Trypsin) Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT) Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) LC/MS/MS In the LC, labeled and unlabeled peptides co-eluted Relative abundance Normal ( 12 C) Disease ( 13 C) m/z

50 Stable isotope labeling methods - Isotope-Coded Affinity Tagging (ICAT) - Hydrogen vs deuterium (8 Da separation) - 13 C vs 12 C (9 Da separation) - Isotope Tagging for Relative and Absolute protein Quantitation (itraq) - Four isobaric reagents - Compare quantity of reporter molecule in MS/MS - Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC) - Cell growth in stable isotope-enriched media ( 13 C Glucose, 15 N Ammonium, 2 H Water)