Μικροβιολογία Τροφίμων Παπαδοπούλου Όλγα

Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Μικροβιολογία Τροφίμων Παπαδοπούλου Όλγα olga_papadopoulou@aua.gr

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟ ΜΕΡΟΣ Σε ένα μικροβιολογικό εργαστήριο χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές, συσκευές και υλικά έτσι ώστε να είναι δυνατή η απομόνωση, καλλιέργεια και ταυτοποίηση των μικροοργανισμών. Επειδή ο προσδιορισμός των βιολογικών και βιοχημικών ιδιοτήτων των μικροοργανισμών απαιτεί καθαρές καλλιέργειες, οι μέθοδοι και τα υλικά που εφαρμόζονται στη μελέτη των μικροβίων θα πρέπει να διατηρούν την καθαρότητα της υπό εξέταση καλλιέργειας και να εμποδίζουν την επιμόλυνση. Όλα τα υλικά που χρησιμοποιούνται αποστειρώνονται ενώ κάθε μικροβιολογική ανάλυση ή μεταχείριση θα πρέπει να διεξάγεται κάτω από ασηπτικές συνθήκες. Αυτό επιτυγχάνεται με την χρήση του λύχνου Bunsen. Ο χώρος όπου λαμβάνει χώρα κάθε μικροβιολογική τεχνική μπορεί να είναι ο μικροβιολογικός πάγκος ή ο θάλαμος νηματικής ροής (laminar flow). Η αρχή λειτουργίας αυτού του θαλάμου είναι ότι καθοδικά ρεύματα αέρα μέσα δεν επιτρέπουν την έξοδο μικροοργανισμών προς το περιβάλλον κι αντίστροφα.

Πριν από κάθε μικροβιολογική ανάλυση θα πρέπει να λαμβάνονται υπ όψη τα εξής: Φοράμε πάντα εργαστηριακή ποδιά. Καθαρίζουμε προσεκτικά τον χώρο όπου θα δουλέψουμε με 70% αιθανόλη. Χρησιμοποιούμε αποστειρωμένα γάντια ή πλένουμε τα χέρια μας προσεκτικά. Ανάβουμε τον λύχνο Bunsen.

ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΘΡΕΠΤΙΚΩΝ ΥΛΙΚΩΝ Οι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται όταν οι συνθήκες που επικρατούν γύρω από το μικροπεριβάλλον τους (υπόστρωμα) είναι ιδανικές για τον πολλαπλασιασμό τους Η απομόνωση, διατήρηση και πολλαπλασιασμός των μικροοργανισμών επιτυγχάνεται σε θρεπτικά υποστρώματα τα οποία ονομάζουμε αλλιώς σαν θρεπτικό υλικό υλικά (medium - media) Τα θρεπτικά υλικά μπορεί να είναι φυσικά ή συνθετικά Ένας από τους κύριους παράγοντες που επηρεάζει ή καθορίζει τον πολλαπλασιασμό των μικροοργανισμών είναι και τα θρεπτικά συστατικά του υποστρώματος Το υπόστρωμα που θα αναπτυχθούν οι μικροοργανισμοί θα πρέπει να περιέχει όλα τα θρεπτικά συστατικά τα οποία τους είναι απαραίτητα για τον πολλαπλασιασμό τους και δεν μπορούν τα ίδια να συνθέσουν

Κατηγορίες θρεπτικών υποστρωμάτων - Ι Υγρά υποστρώματα Broth media Στερεά υποστρώματα Solid media Για την παρασκευή των στερεών υποστρωμάτων θα πρέπει να προστεθεί ένας πηκτικός παράγοντας που ονομάζεται άγαρ Το άγαρ παρουσιάζει τις παρακάτω ιδιότητες: 1. Είναι ουδέτερο συστατικό και δεν επιδρά στη φυσιολογία του μικροοργανισμού 2. Δεν υδρολύεται από τους μικροοργανισμούς 3. Χρησιμοποιείται σε περιεκτικότητα 1,2-1,5%. Μεγαλύτερη περιεκτικότητα παρεμποδίζει την ανάπτυξη λόγω μείωσης της τιμής της ενεργότητας ύδατος 4. Ρευστοποιείται σε βραστό νερό, ενώ σε θερμοκρασία 40 C ή χαμηλότερα στερεοποιείται 5. Παραμένει ρευστό σε θερμοκρασία >40-45 C. 6. Όταν χρησιμοποιείται για εμβολιασμό θα πρέπει να έχει θερμοκρασία 45-47 C για να μην θανατωθούν οι μικροοργανισμοί

Κατηγορίες θρεπτικών υποστρωμάτων - ΙII Εξειδικευμένα υποστρώματα Τα εξειδικευμένα υποστρώματα χρησιμοποιούνται για την απομόνωση και απαρίθμηση ορισμένων κατηγοριών μικροοργανισμών. ΔΗΛΑΔΗ η σύνθεσή τους δρα παρεμποδιστικά στην ανάπτυξη των άλλων μικροοργανισμών. Αυτό επιτυγχάνεται με: τη διόρθωση του ph στο υπόστρωμα την προσθήκη αντιβιοτικών που αναστέλλουν τη δράση των ανεπιθύμητων μικροοργανισμών την προσθήκη ουσιών που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση διαφορετικών αποικιών μεταξύ τους

Παράδειγμα επιλεκτικού υποστρώματος ph Διορθωμένο Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται 8 Carnobacterium spp. MRS agar 7 Στρεπτόκοκκοι <5.7 Οξυανθεκτικά γαλακτικά βακτήρια <5.7 Ζύμες Διόρθωση του ph έχει σαν αποτέλεσμα την απομόνωση συγκεκριμένων ομάδων και ειδών

Παράδειγμα εξειδικευμένων υποστρωμάτων - Επιλεκτικά Υλικό Ουσία Μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται Μορφολογία αποικιών Baird-Parker Agar Base Egg-yolk emulsion S. Aureus Μαύρες αποικίες με δακτύλιο Micrococci Μαύρες αποικίες χωρίς δακτύλιο Violet Red Bile Glucose Agar Crystal violet Bile salts Enterobacteriace ae Μώβ αποικίες με δακτύλιο Tributyrin Agar Base Glycerol tributyrate Λιπολυτικοί Αποικίες με δακτύλιο Προσθήκη ουσιών που επιτρέπουν την διαφοροποίηση διαφορετικών αποικιών μεταξύ τους

Παράδειγμα εξειδικευμένων υποστρωμάτων - Εκλεκτικά Υλικό Αντιβιοτικό Μικρ/σμοί που αναπτύσσονται Pseudomonas agar base STAA agar base Cetrimide Fusidin Cephaloridine Streptomycin sulphate Thallous acetate Cycloxeximide Ψευδομονάδες Brochothrix thermosphacta Rose Bengal agar base Chloramphenicol Ζύμες/Μύκητες Προσθήκη αντιβιοτικών, που αναστέλλουν την δράση των μη επιθυμητών μικροοργανισμών

Αποστείρωση Αποστείρωση είναι η διαδικασία καταστροφής όλων των μορφών μικροβιακής ζωής σε ένα υλικό ή αντικείμενο, συμπεριλαμβανομένων και των ανθεκτικών μορφών (ενδοσπόρια) Με θέρμανση Υγρή αποστείρωση Ξηρή αποστείρωση Αποστείρωση Με διήθηση Με ακτινοβολιά

Τεχνικές μέτρησης του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα Μέθοδος δεκαδικών αραιώσεων Τρόφιμο (25g) Ομογενοποίηση 225 ml Ringer Είναι μέθοδος που χρησιμοποιείται ευρέως παρά τα μειονεκτήματα που παρουσιάζει όπως: Έχει μεγάλες απαιτήσεις σε υλικά και ανθρώπινο δυναμικό (labour intensive method) Οι πολλές αραιώσεις αυξάνουν τον κίνδυνο επιμόλυνσης από μικροοργανισμούς του αέρα (airborne microorganisms) παρά τις ασηπτικές συνθήκες που εφαρμόζονται Τα στατιστικά σφάλματα μπορεί να είναι μεγάλα, για το λόγο αυτό απαιτούνται 3-5 επαναλήψεις της πειραματικής διαδικασίας

Επειδή, κάθε καλλιέργεια μικροοργανισμών ή τρόφιμο μπορεί να περιέχει από χίλια έως εκατοντάδες εκατομμύρια βακτηριακά κύτταρα ανά όγκο, ο προσδιορισμός του μικροβιακού φορτίου χρειάζεται μία διαδικασία διαχωρισμού των βακτηρίων, ώστε όταν καλλιεργηθούν σε ένα στερεό θρεπτικό υλικό, να σχηματίζουν μεμονωμένες και ευκρινείς αποικίες. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων.

Ο εμβολιασμός του βακτηριακού εναιωρήματος στο θρεπτικό υπόστρωμα γίνεται με δύο ποσοτικές τεχνικές Τεχνική επιφανειακής επίστρωσης (spread plating) Τεχνική ενσωμάτωσης (pour plating) Αφορά στην εξάπλωση γνωστού όγκου (0,1 ml) βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υλικό. Εφαρμόζεται στους αερόβιους μικροοργανισμούς. Αφορά στην εξάπλωση γνωστού όγκου (1 ml) βακτηριακού εναιωρήματος σε τρυβλίο χωρίς θρεπτικό υπόστρωμα. Ακολουθεί προσθήκη του υποστρώματος που περιέχει άγαρ σε υγρή μορφή σε θερμοκρασία 42-45 C και στερεοποίηση του υποστρώματος. Εφαρμόζεται σε μικροαερόφιλους και προαιρετικά αναερόβιους μικροοργανισμούς.

Ταυτοποίηση βακτηρίων Bacteria Gram staining Gram Positive Bacteria Gram Negative Shape Round (Cocci) Rods (Bacilli) Bacteria Round (Cocci) Rods (Bacilli) Biochemical Test Genetic Test Identification scheme

Τεχνική επιφανειακής επίστρωσης (spread plating) Τεχνική ενσωμάτωσης (pour plating) PCA: Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα CFC: Ψευδομονάδες STAA: Brochothrix thermosphacta RBC: Ζύμες/Μύκητες Επώαση: 25 C για 48-72 ώρες MRS: Γαλακτικά βακτήρια (25 C για 48-72 ώρες) VRBGA: Εντεροβακτήρια (37 C για 24 ώρες)

1 min 1 min Spread plates Petrifilms

Απομόνωση βακτηρίων

Διαφοροποίηση κυττάρων Gram + Gram -

Δοκιμή της καταλάσης Αποτέλεσμα Αφρισμός: θετική αντίδραση Θετικοί ως προς την καταλάση είναι οι αερόβιοι μικροοργανισμοί

Oxidase Test

Pseudomonas sp. Gram - catalase + oxidase + Serratia sp. Gram - catalase + oxidase - Γαλακτοβάκιλλος Gram + catalase - (*) Brochothrix spp. Gram + catalase + oxidase (*) δεν αποτελεί διαγνωστικό κριτήριο για τα γαλακτικά βακτήρια

Α. Κλασσικές μέθοδοι Μέθοδος τρυβλίων (standard plate count) Διαδοχικές αραιώσεις (Ringer solution, Buffered Peptone Water, Maximum Recovery Diluent) Επιλεκτικά υποστρώματα (XLD, Palcam, Oxford, CFC, Rose Bengal Chloramphenicol agar, Violet Red Bile Glucose agar) Επιφανειακή εξάπλωση (spread plating) Ενσωμάτωση (pour plating)

Η τεχνική της σταγόνας (Drop plate) (Μέθοδος Miles and Misra) 23

Μέθοδος του περισσότερο πιθανού αριθμού Most Probable Number (MPN) Χρησιμοποιείται κυρίως για την απαρίθμηση χαμηλών πληθυσμών σε υγρά τρόφιμα (π.χ. χυμοί, νερό, κλπ) Μετρά μόνο τα ζωντανά κύτταρα Προϋποθέσεις: 1. Τα βακτήρια είναι ομοιόμορφα κατανεμημένα στο τρόφιμο (ομοιογενές τρόφιμο) 2. Τα βακτήρια δε σχηματίζουν συσσωματώματα

B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (I) Ανάγκη για: Ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων Ανάλυση μεγάλης ποσότητας δειγμάτων ταυτόχρονα Απλότητα Αυτοματισμός Χαμηλό κόστος Αξιοποίηση μη εξειδικευμένου ανθρώπινου δυναμικού

Σύγχρονες Μέθοδοι Μέτρησης Μικροβιακού Φορτίου Διακρίνονται σε: Βιοχημικές μεθόδους Βιοφθορισμός, Μέτρηση καταλάσης, Δοκιμή Limulus Βιοφυσικές μεθόδους Οπτική πυκνότητα, Μέθοδος ηλεκτρικής αγωγιμότητας, Direct Epifluorescence Technique (DEFT)

B. Σύγχρονες (Ταχείες) μέθοδοι (ΙΙΙ) (α) Βιοχημικές μέθοδοι Βιοφθορισμός L=Luciferin; Oxy-L=oxy-luciferin; AMP=adenosine monophosphate; PP=phosphate groups Κατώφλι ανίχνευσης ATP: 10 2-10 3 fg ATP/ml που αντιστοιχεί σε 10 2-10 3 βακτηριακά κύτταρα fg: femtogram=10-15 g

LAL test Μειονέκτημα της μεθόδου είναι ότι η μέθοδος εφαρμόζεται μόνο στα Gram- βακτήρια γιατί τα Gram + δεν έχουν LPS Πλεονέκτημα αποτελεί η θερμική σταθερότητα της ενδοτοξίνης που επιτρέπει τον προσδιορισμό της ακόμα και σε θερμικά επεξεργασμένα τρόφιμα

L o g ( c f u / m Οπτική πυκνότητα 1 0 2 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 L a g t im e L o o ) g ( N L o g ) ( N A B S A B S= 0. 0 5 t A B S T i m e ( h ) 1. 5 1. 0 0. 5 0 A b s o r b a n c e ( 5 4

Μέθοδος ηλεκτρικής αγωγιμότητας Καμπύλη συσχέτισης αγωγιμότητας με χρόνο Ο χρόνος που απαιτείται για να αναπτυχθεί πληθυσμός 10 6-10 7 κύτταρα/ml ώστε να παρατηρήσουμε μετρήσιμη αλλαγή στην αγωγιμότητα λέγεται χρόνος ανίχνευσης (detection time)

Direct Epifluorescence Filter Technique (DEFT) Η μέθοδος χρησιμοποιεί φθορίζουσες χρωστικές οι οποίες «βάφουν» το DNA ή το RNA των κυττάρων. Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία. Η κυριότερη χρωστική είναι το πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης (acridine orange) το οποίο όταν «βάφει» το DNA δίνει πράσινο χρώμα, ενώ όταν «βάφει» το RNA δίνει πορτοκαλί χρώμα. Άλλες χρωστικές που χρησιμοποιούνται είναι το Ethidium bromide και το propidium iodide. Οι δύο χρωστικές «βάφουν» τα νουκλεικά οξέα. DNA RNA

ΘΕΩΡΙΑ

Είδη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα Ο ΚΑΛΟΣ (τεχνολογική χλωρίδα) Ο ΚΑΚΟΣ (παθογόνοι μικροοργανισμοί)...και Ο ΑΣΧΗΜΟΣ (Αλλοιoγόνοι μικροοργανισμοί)

Log N Στατική φάση ειδικός ρυθμός ανάπτυξης μ Εκθετική φάση Φάση θανάτου Φάση προσαρμογής Χρόνος Τυπική σιγμοειδής καμπύλη ανάπτυξης μικροοργανισμού

Τέσσερις είναι οι κατηγορίες των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα ενδογενείς παράγοντες εξωγενείς παράγοντες σχέσεις μεταξύ των μικροοργανισμών στα τρόφιμα (imlicit factors) παράγοντες της παραγωγικής διαδικασίας

Παράγοντες που επηρεάζουν την αύξηση των μικροοργανισμών στα τρόφιμα Εξωτερικοί θερμοκρασία Ατμόσφαιρα (κενό, παρουσία άλλων αερίων) a w μικροβιακός πληθυσμός Εσωτερικοί δομή E h σύσταση ph μερική πίεση σχετική υγρασία

Επίδραση του ph στην μικροβιακή αύξηση Το ph στο εσωτερικό των κυττάρων είναι περίπου 7,0 με εξαίρεση π.χ. τα κύτταρα των ζυμών όπου η τιμή του ph είναι 5.8 Οι κυτταρικές μεμβράνες είναι αδιαπέρατες στα ιόντα Η+ και ΟΗ-, ενώ ταυτόχρονα έχουν μηχανισμούς για την αποβολή των ιόντων Η+ Οι μικροοργανισμοί χαρακτηρίζονται από διαφορετικές τιμές ph για ανάπτυξη: optimum maximum minimum Βακτήρια 6.0-8.0 9.0 4.5 Μύκητες 3.5-4.0 8.0-11.0 1.5-3.5 Ζύμες 4.5-6.0 8.0-8.5 1.5-3.5 Εξαίρεση στα βακτήρια είναι τα οξυγαλακτικά και οξικά βακτήρια που αναπτύσσονται σε άριστη τιμή ph 5,0-6,0

Μηχανισμός δράσης των οξέων στο κύτταρο πλασματική μεμβράνη Δράση ασθενούς οξέος (αδιάστατη μορφή)

ΑΣΚΗΣΗ Σε ένα τρόφιμο με σχετικό χαμηλό ph (π.χ. 4.5) για να παρεμποδίσετε έναν παθογόνο μικροοργανισμό μπορείτε να χρησιμοποιήσετε λεμόνι ή ξύδι. Ποιο από τα δύο θα επιλέξετε; Ποσοστό αδιάστατου οξέως (α%): 1 a% = 1+ 10 ph pk a Λεμόνι (κιτρικό οξύ) pka = 3.14 Αδιάστατο 4% Ξύδι (οξικό οξύ) pka = 4.75 Αδιάστατο 64%

Τι είναι η Ενεργότητα Νερού (a w ) Μια από τις πιο παλιές μεθόδους συντήρησης των τροφίμων είναι η ξήρανση Η συντήρηση των τροφίμων με ξήρανση είναι άμεσο επακόλουθο της απομάκρυνσης ή δέσμευσης της υγρασίας χωρίς την οποία οι μικροοργανισμοί δεν μπορούν να αναπτυχθούν Η διαθεσιμότητα του νερού για μικροβιακή αύξηση χαρακτηρίζεται από τον όρο «ενεργότητα ύδατος» (water activity)

Χαρακτηριστικές τιμές a w για τους μικροοργανισμούς Η ενεργότητα ύδατος των νωπών τροφίμων είναι > 0,99 Τα περισσότερα αλλοιωγόνα βακτήρια δεν αυξάνονται σε τιμές < 0,91 Οι μύκητες μπορεί να αυξηθούν σε ενεργότητα ύδατος μέχρι 0,80 Το παθογόνο βακτήριο Staphylococcus aureus αυξάνεται και μέχρι 0,86 Το βακτήριο Clostridium botulinum δεν αυξάνεται κάτω από 0,94 Οι ζύμες και οι μύκητες αναπτύσσονται σε μεγαλύτερο εύρος ενεργότητας νερού σε σχέση με τα βακτήρια Σε ορισμένη θερμοκρασία, η ικανότητα των μικροοργανισμών για αύξηση μειώνεται όσο μειώνεται η ενεργότητα ύδατος Η περιοχή της ενεργότητας ύδατος στην οποία σημειώνεται αύξηση είναι ευρύτερη όσο η θερμοκρασία είναι ιδανική για αύξηση Η παρουσία θρεπτικών συστατικών αυξάνει το εύρος της ενεργότητας ύδατος που επιβιώνουν οι μικροοργανισμοί

Ελάχιστες τιμές a w για την αύξηση ομάδων μικροοργανισμών Ομάδα μικροοργανισμών ------------------------------------------------ Gram αρνητικά βακτήρια 0.97 Gram θετικά βακτήρια 0.90 Ζύμες 0.88 Μύκητες 0.80 Αλόφιλα βακτήρια 0.75 Ξηρόφιλοι μύκητες 0.61 α w

Τι είναι το δυναμικό οξειδοαναγωγής (Eh) Όταν ηλεκτρόνια μεταφέρονται από ένα συστατικό σε ένα άλλο, δημιουργείται διαφορά δυναμικού ανάμεσα στα δύο συστατικά. Αυτή η διαφορά μπορεί να μετρηθεί με ένα κατάλληλο όργανο και εκφράζεται σε millivolts (mv) Οι αερόβιοι μικροοργανισμοί απαιτούν θετικές τιμές Eh (οξειδωτικές) για αύξηση, ενώ οι αναερόβιοι απαιτούν αρνητικές τιμές Eh (αναγωγικές). Ανάμεσα στις ουσίες των τροφίμων οι οποίες βοηθούν να διατηρούνται αναγωγικές συνθήκες είναι ομάδες -SH σε κρέατα, και ασκορβικό οξύ και ανάγοντα σάκχαρα σε φρούτα και λαχανικά.

Η σχέση των μικροοργανισμών με το O 2 & Eh, επιτρέπει την παρακάτω κατάταξη Αερόβιοι: οι μικροοργανισμοί (πχ. Pseudomonas spp.) αυτοί χρειάζονται O 2 άρα αναπτύσσονται σε τρόφιμα με υψηλό Eh (+300 mv έως +500 mv). Αναερόβιοι: μικροοργανισμοί (πχ. Clostridium spp.), αναπτύσσονται σε τρόφιμα με πολύ χαμηλό Eh (πχ σε κονσέρβες, ή τρόφιμα συσκευασμένα σε κενό) (-250 mv έως +100 mv) Προαιρετικά αναερόβιοι: οι μικροοργανισμοί που αναπτύσσονται είτε παρουσία είτε απουσία Ο 2 πχ. Lactobacillaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae (+100 mv έως +300 mv).

Οι μικροοργανισμοί χρειάζονται: Πηγή ενέργειας Θρεπτικά συστατικά - Κύρια πηγή είναι οι απλοί υδατάνθρακες (π.χ. γλυκόζη) - Λίγοι μικροοργανισμοί μπορούν να αποδομήσουν σύνθετους υδατάνθρακες (π.χ. άμυλο, κυτταρίνη) - Πιο δύσκολα αποδομούν λίπη Πηγή αζώτου: κυρίως αμινοξέα, πεπτίδια, νουκλεοτίδια, πρωτεΐνες Πηγή βιταμινών: Βιταμίνες συμπλόκου Β (π.χ. θειαμίνη). Τα Gram + βακτήρια δεν έχουν την ικανότητα σύνθεσης αυτών των βιταμινών σε αντίθεση με τα Gram και τους μύκητες. Επίσης, τα φρούτα έχουν χαμηλότερη περιεκτικότητα σε βιταμίνη Β σε σχέση με το κρέας. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το χαμηλότερο ph των φρούτων συμβάλει την αλλοίωσή τους από μύκητες και όχι από βακτήρια. Μύκητες < Ζύμες < αρνητικά κατά Gram < θετικά κατά Gram

Βιολογικές δομές φυσικά εμπόδια (δέρμα, κέλυφος, φλοιός) Αντιμικροβιακά συστατικά ζωικής προέλευσης (λυσοζύμη, λακτοφερίνη, λακτοπεροξιδάση) Αντιμικροβιακά συστατικά φυτικής προέλευσης (αιθέρια ελαια, φυτοαλεξίνες, αλκαλοειδή, φαινόλες)

ΕΞΩΓΕΝΕΙΣ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΤΩΝ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΑΥΞΗΣΗ Ατμόσφαιρα (κενό, παρουσία άλλων αερίων) θερμοκρασία ΤΡΟΦΙΜΟ σχετική υγρασία

Ρυθμός αύξησης Θερμοκρασία Ελάχιστη θερμοκρασία αύξησης Άριστη θερμοκρασία αύξησης x x x x x x x x x x x x x Μέγιστη θερμοκρασία αύξησης x x x x Θερμοκρασία ο C Η ελάχιστη, άριστη και μέγιστη θερμοκρασία αύξησης χαρακτηρίζονται ως θεμελιώδεις (cardinal) θερμοκρασίες Π.χ. Ο μικροοργανισμός E. coli έχει ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης 8 C, άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης 37 C και μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης 45 C.

Θεμελιώδεις θερμοκρασίες για μικροβιακή αύξηση Θερμοκρασία ( C) Κατηγορία Ελάχιστη Άριστη Μέγιστη Θερμόφιλοι 40-45 55-75 60-90 Μεσόφιλοι 5-15 30-40 40-47 Ψυχρόφιλοι -5 έως +5 12-15 15-20 Ψυχρότροφοι -5 έως +6 25-30 30-35

Συσκευασία (Packaging) Κάθε μορφή συσκευασίας αλλάζει το περιβάλλον στο οποίο εκτίθενται τα βακτήρια, με κύρια αλλαγή την τροποποίηση της αέριας ατμόσφαιρας. Τα υλικά συσκευασίας είvαι συvηθώς διαπερατά ως έvα βαθμό στα αέρια. Η αέρια σύσταση στo εσωτερικό τoυ περιεκτή καθoρίζεται τόσο από τηv ικαvότητα τoυ τροφίμου και τωv αερόβιωv μικρooργαvισμώv vα καταλώvoυv τo oξυγόvo και vα παράγoυv διoξείδιo τoυ άvθρακα όσο και από τηv περατότητα τoυ υλικoύ στα αέρια

Παρουσία και συγκέντρωση αερίων στο περιβάλλον (gaseous atmospheres) Συσκευασία σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα Η συσκευασία σε τροποποιημένη ατμόσφαιρα ορίζεται ο εγκλεισμός του τροφίμου σε πλαστικά συσκευασίας (μεμβράνες) στο εσωτερικό των οποίων η αέρια σύσταση έχει τροποποιηθεί με σκοπό (1) τη μείωση της αναπνευστικής δραστηριότητας, (2) την μείωση της μικροβιακής αύξησης και (3) την επιβράδυνση της ενζυμικής αλλοίωσης, με αποτέλεσμα την αύξηση της διάρκειας ζωής του τροφίμου (Young et al. 1988). Συσκευασία σε κενό (vacuum packing) Συσκευασία με έγχυση αερίου μίγματος (gas-flush packing)

Συσκευασία σε μείγματα αερίων Οξυγόνο (O 2 ) Ευνοεί την αύξηση των αερόβιων βακτηρίων και παρεμποδίζει την αύξηση των αναερόβιων βακτηρίων Η παρουσία οξυγόνου προκαλεί οξείδωση των λιπαρών ουσιών Διοξείδιο του άνθρακα (CO 2 ) Επιφέρει χημικές αλλαγές στο μικροβιακό κύτταρο και στο περιβάλλον του Παρουσιάζει μεγάλη διαλυτότητα στο νερό και στα λιπίδια 25% CO 2 προτείνεται για τον έλεγχο της αύξησης βακτηρίων και μυκήτων Αποτελεσματικό στον έλεγχο της αύξησης των αερόβιων και των αρνητικών κατά Gram ψυχρότροφων βακτηρίων Υψηλές συγκεντρώσεις CO 2 δημιουργούν μεταλλική και όξινη γεύση και ανεπιθύμητες οσμές

Παράγοντες που επηρεάζουν την αντιμικροβιακή δράση του CO 2 1.Είδος μικροοργανισμού Gram περισσότερο ευαίσθητα από Gram + Δεν επηρεάζει την αύξηση των γαλακτικών βακτηρίων και Brochothrix thermospacta 20% παρεμποδίζει την αύξηση Pseudomonas spp. και Acinetobacter/Moraxella στο κρέας 2. Χρόνος εφαρμογής Αυξάνει τη διάρκεια της φάσης προσαρμογής και μειώνει το ρυθμό αύξησης Η ανασταλτική δράση μειώνεται καθώς τα βακτήρια εισέρχονται στη εκθετική φάση αύξησης Η εφαρμογή του θα πρέπει να γίνεται όσο το δυνατό γρηγορότερα

Παράγοντες που επηρεάζουν την αντιμικροβιακή δράση του CO 2 3. Συγκέντρωση αερίων Η ανασταλτική δράση αυξάνει γραμμικά μέχρι την αύξηση της συγκέντρωσης σε 20% Υψηλές συγκεντρώσεις προκαλούν μείωση του ph και αποχρωματισμό στο κρέας 4. Θερμοκρασία συντήρησης Η ανασταλτική δράση αυξάνει με τη μείωση της θερμοκρασίας λόγω αυξημένης διαλυτότητας του αερίου στο τρόφιμο

Συσκευασία σε μείγματα αερίων Άζωτο (N 2 ) Αδρανές και άοσμο αέριο με χαμηλή διαλυτότητα στο νερό και στα λιπίδια Καθυστερεί την οξείδωση των λιπαρών ουσιών και την αύξηση των αερόβιων μικροοργανισμών Αποτρέπει την κατάρρευση της συσκευασίας όταν χρησιμοποιείται μεγάλη συγκέντρωση διοξειδίου του άνθρακα Μονοξείδιο του άνθρακα (CO) Τοξικό αέριο η χρήση του οποίου δεν επιτρέπεται σε πολλές χώρες Μειώνει το φαινόμενο της τάγγισης των λιπιδίων Συνδέεται με τη μυοσφαιρίνη και σχηματίζει καρβοξυμυοσφαιρίνη που είναι σταθερή στην οξείδωση (περισσότερο από την οξυμυοσφαιρίνη) και προσδίδει λαμπερό ερυθρό χρώμα στο κρέας

Αλληλεπίδραση μεταξύ των μικροοργανισμών Φυσικό περιβάλλον (Habitat) : Ορίζει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του περιβάλλοντος το οποίο μπορεί να υποστηρίξει τις φυσιολογικές δραστηριότητες για την ανάπτυξη ενός είδους ή μιας ομάδας ειδών. Βιοθέση ή Θώκος (Niche) : ορίζεται το σύνολο των άριστων συνθηκών του περιβάλλοντος υπό τις οποίες μπορεί να αναπτυχθεί ένα είδος ή μια ομάδα ειδών. Κυριότητα (Domain) : Ορίζεται η περιοχή όπου ο μικροοργανισμός έχει την επίδρασή του στο χώρο και το χρόνο.

Αλληλεπίδραση μεταξύ των μικροοργανισμών 1. Ουδετερότητα 2. Αντιβίωση 3. Ομοσιτισμός 4. Ανταγωνισμός 5. Αμοιβαιότητα 6. Θήρευση ή παρασιτισμός

Θεωρία των εμποδίων

Θεωρία των εμποδίων Η τεχνολογία των εμποδίων αποτελεί μια πολύ σημαντική προσέγγιση για την ήπια συντήρηση των τροφίμων, καθώς λόγω της συνδυαστικής ή πολλές φορές συνεργιστικής επίδρασή τους, μπορούν να εφαρμοστούν σε χαμηλότερη ένταση από αυτή που θα χρειάζονταν εάν ένα μόνο εμπόδιο χρησιμοποιούνταν ως παράγοντας συντήρησης. Σήμερα, η τεχνολογία των εμποδίων χρησιμοποιείται επιτυχώς όχι μόνο για τη βελτίωση της μικροβιολογικής ασφάλειας και σταθερότητας, αλλά και για τη βελτίωση των οργανοληπτικών, διαθρεπτικών και οικονομικών ιδιοτήτων διαφόρων τροφίμων

Φυσικά εμπόδια Εμπόδια μικροβιακής προέλευσης Φυσικοχημικά εμπόδια

Φυσικά εμπόδια Φυσικοχημικά εμπόδια High Temperature: Sterilization, Pasteurization and Blanching Low temperature : Chilling and Freezing Ultraviolet radiation Ionizing radiation Electromagnetic energy ( Microwave energy, Radio frequency energy, Oscillating magnetic field pulses and High electric field pulses) Ultra high pressure Packaging film (Plastic, multi layer, active coating and edible coating) Modified atmospheric packaging (Gas packaging, Vacuum packaging, Moderate vacuum and active packaging) Aseptic packaging food microstructure Low water activity (aw) Low ph & redox potential (Eh) Salt Nitrite Nitrate Carbon dioxide Oxygen Ozone Organic acids Lactic acid Lactate Acetic acid Acetate Ascorbic acid Sulphate Smoking Phosphates Phenols Chelators Surface treatment agents Ethanol Propyle glycol Spices & Herbs Lactoperoxidas & Lysozyme

Αντιμικροβιακοί παράγοντες - Εμπόδια Φυσικά εμπόδια Φυσικοχημικά εμπόδια Θερμοκρασία (ψύξη/κατάψυξη) Αποστείρωση Παστερίωση Ακτινοβολία Συκευασία (α) Τροπ/νες ατμόσφαιρες (β) Υπό κενό Φυτικής προέλευσης Φαινολικά Αιθέρια έλαια Φυτοαλεξίνες Μικροβιακής προέλευσης Ανταγωνιστική χλωρίδα Καλλιέργειες εκκινητές Βακτηριοσίνες Χημικής προέλευσης Συντηρητικά Ε200 -Ε239 Οργανικά οξέα ph Aλάτι a w Xειλικές ενώσεις (EDTA) Ισορροπία ιόντων Μείωση νερού Καταστροφή κυττάρων Παρεμπόδιση της αναπνοής ή της ζύμωσης Κυτταρικές μεμβράνες Μερική ή ολική λύση κυττάρων Ανταγωνισμός Παραγωγή τοξικών προϊόντων Κυτταρικές μεμβράνες Ενζυμα Κυτταρικός μεταβολισμός Αναπαραγωγή Ανταλλαγή ενέργειας και ύλης

Καλλιέργειες εκκίνησης Η χρήση επιλεγμένων καλλιεργειών βακτηρίων για την επεξεργασία γαλακτοκομικών προϊόντων, ζυμούμενων τροφίμων (πίκλες, ελιές, μπύρα, κρασί), κλπ. Οι μικροοργανισμοί αυτοί είναι συνήθως οξυγαλακτικά βακτήρια τα οποία: Μειώνουν την τιμή τουph Δρουν σαν ανταγωνιστικοί μικροοργανισμοί Παράγουν αντιμικροβιακές ουσίες (βακτηριοσίνες) Ως μοναδικό εμπόδιο: Δεν είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθεί ως μοναδικό εμπόδιο. Συνήθως συνδυάζεται με άλλα εμπόδια (π.χ. ψύξη)

Βακτηριοσίνες Οι βακτηριοσίνες είναι πρωτεΐνες ή σύμπλοκα πρωτεϊνών βακτηριακής προέλευσης που επιδεικνύουν αντιμικροβιακή δράση κατά στελεχών που σχετίζονται στενά με τους μικροοργανισμούς που τις παράγουν. Είναι πρωτεϊνικής φύσεως ουσίες, βιολογικά ενεργές Η δράση τους είναι βακτηριοκτόνος Έχουν περιορισμένο φάσμα δράσης, συνήθως ενάντια σε συγγενή είδη και γένη μικροοργανισμών Προσκολλώνται σε ειδικές θέσεις-δέκτες του μικροβιακού κυττάρου Παρουσιάζουν ευαισθησία σε πρωτεολυτικά ένζυμα Παρουσιάζουν αντοχή στη θέρμανση (80, 100, και 121 C για ορισμένο χρόνο) Η δράση των βακτηριοσινών περιορίζεται σε θετικά κατά Gram μικροβιακά στελέχη και δεν έχει παρουσιαστεί μέχρι τώρα δράση σε αρνητικά κατά Gram βακτήρια.

Βακτηριοσίνες Τρόπος δράσης Ο μηχανισμός δράσης των βακτηριοσινών πραγματοποιείται σε δύο φάσεις: 1. Αρχικά έχουμε προσρόφηση των βακτηριοσινών σε εξειδικευμένους υποδοχείς στο κυτταρικό τοίχωμα των ευαίσθητων στελεχών (αντιστρεπτή φάση). Στο στάδιο αυτό οι βακτηριοσίνες είναι ευαίσθητες στα πρωτεολυτικά ένζυμα. Η ανοσία ανθεκτικών στελεχών έναντι των βακτηριοσινών οφείλεται στην παραγωγή πρωτεϊνών ανοσίας (πρωτεολυτικών ενζύμων) 2. Η δεύτερη και μη αντιστρεπτή φάση περιλαμβάνει αλλοιώσεις στα ευαίσθητα κύτταρα που είναι χαρακτηριστικές για κάθε βακτηριοσίνη

Βακτηριοσίνες Στέλεχος Βακτηριοσίνη Φάσμα δράσης Lactococcus lactis ssp. lactis Nisin Gram (+) Lactobacillus plantarum Plantaricin B Lb. plantarum Leuconostoc mesenteroides P. damnosus Lactobacillus plantarum Plantaricin C LAB Enterococcus spp. Staphylococcus spp. Clostridium spp. Streptomyces natalensis Natamycin Ζύμες - Μύκητες

Φυσικά αντιμικροβιακά συστήματα Φαινολικές ουσίες (Phenols) Αιθέρια έλαια από καρυκεύματα και βότανα Φυτοαλεξίνες

Μηχανισμός δράσης 1. Επίδραση στην κυτταρική μεμβράνη με αποτέλεσμα την αύξηση της περατότητας και την απώλεια κυτταρικών συστατικών 2. Αδρανοποίηση ενζύμων 3. Καταστροφή ή λειτουργική αδρανοποίηση του γενετικού υλικού Gram - > Gram +

Πληθυσμός (log cfu/ml) 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Χρόνος ζύμωσης (ημέρες) Στην παραπάνω γραφική παράσταση που προέκυψε από την παρακολούθηση της ζύμωσης επιτραπέζιας ελιάς (αλάτι 6%, ενώ στη διάρκεια της ζύμωσης η ογκομετρούμενη οξύτητα αυξάνεται από 0,1 σε 1,2 g γαλακτικού οξέως/100 ml άλμης) παρουσιάζεται η εξέλιξη των γαλακτικών βακτηρίων, των ζυμών και των Εντεροβακτηρίων. Η ζύμωση διήρκεσε 55 ημέρες ενώ ο πληθυσμός κάποιων από τους παραπάνω μικροοργανισμούς έφτασε κάποια στιγμή σε 7,5 log cfu/ml. (α) Αν ο σκοπός μας ήταν να ελέγξουμε τον πληθυσμό των Εντεροβακτηρίων και των ζυμών, να αντιστοιχίσετε τα σύμβολα της γραφικής παράστασης με τους μικροοργανισμούς που μελετήσαμε. (β) Περιγράψτε αναλυτικά την γραφική παράσταση και εξηγείστε το λόγο (π.χ. δράση αλατιού, δράση οξύτητας, κλπ) που οι μικροοργανισμοί που συμβολίζονται με τρίγωνο και κύκλο, παραμένουν στο αρχικό πληθυσμό ή μειώνονται.

Τιμές pka των κυριότερων οξέων και ποσοστό (%) αδιάστατου οξέος σε σχέση με το ph Συντηρητικό pka ph 3.5 4.5 5.0 Οξικό 4.75 95% 63% 35% Κιτρικό 3.14 30% 4.1% 1.3% Γαλακτικό 3,86 15% 1.7% 0.5% Τρυγικό 2.98 23% 2.9% 0.9% Βενζοϊκό 4.19 83% 33% 13% Προπιονικό 4.87 96% 70% 43% Σορβικό 4.75 95% 65% 37%