ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Ι) ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ. της. Συνέπεια βακτηρίων αύξησή τους Η. της. αναπαραγωγής είναι η πληθυσμιακή. απλή. διαίρεση διχοτόμηση.

Transcript

1 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Ευγενία Μπεζιρτζόγλου Καθηγήτρια Μικροβιολογίας Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης Συνέπεια βακτηρίων αύξησή τους Η Ι) ΑΝΑΠΑΡΑΓΩΓΗ διαίρεση διχοτόμηση. της αναπαραγωγής είναι η πληθυσμιακή γίνεται με απλή Πριν τη διχοτόμηση λαμβάνει χώρα ο διπλασιασμός της πυρηνικής ουσίας και διπλασιασμός της μάζας των κυττάρων. 1

2 ΙΙ) ΔΙΑΤΡΟΦΗ Βακτήρια που διατηρήθηκαν με λυοφιλισμό, όταν καλλιεργηθούν σε θρεπτικό υλικό, αναπτύσσονται. Θρεπτικά συστατικά Για τη σύνθεση των κυτταρικών πολυμερών είναι απαραίτητη η παρουσία ενώσεων άνθρακος, και ως πηγή ενέργειας, η ηλιακή ενέργεια, οργανικές ή ανόργανες ενώσεις. Ή ακόμα, η ίδια ουσία μπορεί να αποτελέσει πηγή άνθρακος και ενέργειας π.χ. γλυκόζη. 2

3 Θερμοκρασία επωάσεως: Η μέση άριστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη βακτηρίων είναι 37 0 C. Διακρίνουμε 3 κατηγορίες βακτηρίων ανάλογα με τη θερμοκρασία ανάπτυξής τους: Βακτήρια ψυχρόφιλα στους C. ορισμένες Pseudomonas Βακτήρια μεσόφιλα στους 20 0 C 40 0 C. κυρίως σαπρόφυτα και παθογόνα Βακτήρια θερμόφιλα στους 50 0 C 75 0 C. διάφορα Bacillaeae 3

4 Αριθμός βακτηρίων Θερμόφιλα Μεσόφιλα Ψυχρόφιλα ph Αναλόγως του αναπτύσσονται, βακτήρια σε: αλκαλόφιλα και οξύφιλα. ph στο χωρίζουμε οποίο τα 4

5 Τα περισσότερα βακτήρια αναπτύσσονται σε ph 8 5. Π.χ To Vibrio cholerrae απαιτεί ph αλκαλικό για την ανάπτυξή του. ο Lactobacillus, όξινο. αντίθετα απαιτεί Σαν buffer για τη ρύθμιση του ph, χρησιμοποιούμε όξινες ουσίες, όπως τα Κ 2 ΗΡΟ 4 και ΚΗ 2 ΡΟ 4, που αποτελούν συγχρόνως και πηγή φωσφόρου. Βασικές ουσίες για τη ρύθμιση του ph, που χρησιμοποιούνται ευρέως είναι άλατα ασβεστίου, όπως η κιμωλία και το μάρμαρο. 5

6 Οσμωτική πίεση Τα βακτήρια αδιαφορούν για τις ιονικές συγκεντρώσεις, γιατί το κυτταρικό τοίχωμα τα προφυλάσσει από δυσμενείς επιδράσεις. Π.χ. Βακτήρια που αναπτύσσονται σε υπεραλατισμένα θρεπτικά υλικά είναι: Staphylococcus CHAPMAN). B.halophilus που νεκρή θάλασσα). (στο θρεπτικό απομονώθηκε υλικό στη Παράγοντες αναπτύξεως βακτηρίων σε ειδικές ανάγκες: Αναλόγως με τις ανάγκες έχουμε μικροοργανισμών: ειδικές δύο Αυξότροποι Πρωτότροφοι τροφικές είδη 6

7 Πρωτότροφοι: Που δεν έχουν ανάγκη παραγόντων αναπτύξεως. ειδικών Αυξότροποι: Που απαιτούν ειδικούς παράγοντες αναπτύξεως. ". Π.χ. Το E.coli αναπτύσσεται σε υλικό με πηγή άνθρακος, πηγή αζώτου και ανόργανα άλατα. Ο Proteus δεν αναπτύσσεται σε αυτό το υλικό, αν δεν προσθέσουμε "νικοτιναμίδη Το E.coli έχει επίσης "νικοτιναμίδης" αλλά τη μόνο του. ανάγκη συνθέτει 7

8 Αν πάλι, βάλουμε τον P vulgaris στο ανωτέρω υλικό χωρίς νικοτιναμίδη και προσθέσουμε E.coli ο P vulgaris αναπτύσσεται γιατί το E.coli παράγει νικοτιναμίδη. Το Lactobacillus έχει ανάγκη 18 αμινοξέων για να αναπτυχθεί. Η διαφορά μεταξύ αυτοτρόφων και αυξοτρόφων στελεχών έγκειται στην ελλειμματική βιοσυνθετική ικανότητα των τελευταίων προς μία ή περισσότερες οργανικές ουσίες που είναι απαραίτητες για τη λειτουργία του κυττάρου. 8

9 Τα αυξότροφα στελέχη κυρίως μεταξύ των βακτηρίων. απαντώνται παθογόνων Τα Gram(+) βακτήρια έχουν μεγάλες τροφικές απαιτήσεις, ενώ τα Gram(-) μικρές. Ως παράγοντες ανάπτυξης χαρακτηρίζονται κυρίως: Τα αμινοξέα (στη σύνθεση πρωτεϊνών) Οι πουρίνες και πυριμιδίνες (στα νουκλεικά οξέα) Οι βιταμίνες (σαν κοένζυμα) Οι ουσίες αυτές δρουν σε πολύ μικρές ποσότητες. 9

10 Π.χ mg/ltm βιταμίνες 10 mg/ltm (πουρίνες) 25 mg/ltm (αμινοξέα) Μεγαλύτερη ποσότητα γιατί χρησιμεύουν ως δομικά υλικά ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού είναι ανάλογη με τη συγκέντρωσή του συγκεκριμένου παράγοντα, όπως φαίνεται απ την ακόλουθη καμπύλη αναφοράς. Η Ανάπτυξη Ζώνη Συγκέντρωση του παράγοντα 10

11 Δοσολογούμε τον συγκεκριμένο παράγοντα σε στερεό υλικό και συγκρίνουμε με την καμπύλη αναφοράς. Π.χ. Δοσολογία της Β12 με Lactobacillus leichmanii. Ουσίες δομικά ανάλογες δεν δύνανται να χρησιμοποιηθούν, ενίοτε δε παίζουν ρόλο αναστολέως. Οι ουσίες αυτές λέγονται "αντιμεταβoλίτες" Συντροφισμός Δορυφορισμός : Οι ανάγκες ως προς έναν παράγοντα από ένα μικροβιακό είδος μπορούν κάποτε να ικανοποιηθούν από την παρουσία άλλου είδους που συνθέτει τον παράγοντα. Το φαινόμενο αυτό λέγεται «συντροφισμός» και εμφαίνεται από «δορυφορικές αποικίες» σε στερεό δορυφορικό υλικό με τα δύο μικροβιακά είδη. 11

12 Π.χ. Corynebacterium Streptococcus Ο Streptococcus παράγει νικοτιναμίδιο που είναι απαραίτητο στο Corynebacterium. Το ίδιο φαινόμενο παρατηρείται επίσης με τον Staphylococcus που παράγει νικοτιναμίδιο απαραίτητο για την ανάπτυξη του Haemophilus influenzae. 12

13 Ουσίες που αποτελούν ειδικό παράγοντα αναπτύξεως ορισμένων βακτηρίων ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Αιματίνη Νικοτιναμίδιο ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ H. Influenzae Staphylococcus (Δορυφορισμός) H. Influenzae Streptococcus (Δορυφορισμός) Corynebacterium ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Θειαμίνη (Βιτ. Β1) Ριβοφλαβίνη (Βιτ. Β2) ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ L.fermentii Cl.botolinum Cl.tetani Lactobacillus Streptococcus Prorionibacterium Clostridium Βιτ. Β6 6 (Πυριδοξάλη( Πυριδοξαμίνη Πυριδοξίνη) Lactobacillus Str.faecaolis Clostridium Ζυμομύκητες 13

14 ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Βιτ. Β12 Φυλλικό οξύ Παρα-αμινοβενζοϊκό αμινοβενζοϊκό οξύ (=Ρ.Α.Β.Α.).) ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ L.leichmanii Str.faecalis Εντερόκοκκοι Lactobacillus Cl.acetobutilicum Cl.tetanomorphum Asetobacter syboxydans ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Παντοθενικό οξύ Βιοτίνη Ασκορβικό οξύ (Βιτ.C) ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Streptococcus A Brucella Shigella Proteus L.casei L.plantarum L.arabinosus Leishamania Trypanosoma 14

15 ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Χολίνη Ελαϊκό οξύ και ακόρεστα λιπαρά οξέα Βιτ. Κ Μυκοβακτίνη Αιματίνη ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ Pneumococcus Cl. tetani Cl.diphtariae B.melaninogenicus Mycobacterium H. influenzae ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Νικοτιναμίδιο Ριβοφλαβίνη (Βιτ. Β2) ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ L.fermentii Cl.botolinum Cl.tetani Staphylococcus (Δορυφορισμός) H. influenzae Streptococcus (Δορυφορισμός) Corynebacterium 15

16 ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ Θειαμίνη (Βιτ. Β1) Ριβοφλαβίνη (Βιτ. Β2) ΑΥΤΟΤΡΟΦΑ ΣΤΕΛΕΧΗ L.fermentii Cl.botolinum Cl.tetani Lactobacillus Streptococcus Prorionibacterium Clostridium III ) ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΣΕ ΥΓΡΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΛΙΚΑ 16

17 ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΠΤΥΞΕΩΣ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Log Ζώντων μικροβίων Χρόνος επώασης 17

18 Η βακτηριακή ανάπτυξη μελετάται με τον εμβολιασμό σε ένα υγρό θρεπτικό υλικό και την καταμέτρηση του βακτηριακού αριθμού σε τακτά χρονικά διαστήματα. Έτσι, προκύπτει η καμπύλη ανάπτυξης με τις χαρακτηριστικές 4 φάσεις. Η βακτηριακή ανάπτυξη μελετάται με τον εμβολιασμό σε ένα υγρό θρεπτικό υλικό και την καταμέτρηση του βακτηριακού αριθμού σε τακτά χρονικά διαστήματα. Έτσι, προκύπτει η καμπύλη ανάπτυξης με τις χαρακτηριστικές 4 φάσεις: 18

19 Έτσι, προκύπτει η καμπύλη ανάπτυξης με τις χαρακτηριστικές 4 φάσεις: Φάση προσαρμογής Ηλικία βακτηρίων Προσαρμογή βακτηρίων Λογαριθμική φάση ανάπτυξης Θερμοκρασία Θρεπτικό υλικό Μικροβιακό είδος Στάσιμη φάση Φάση θανάτου Συνεχείς-Ασυνεχείς Καλλιέργιες Αποκλίσεις από το πρότυπο ανάπτυξης μπορούμε να επιτύχουμε με την μέθοδο της συνεχούς καλλιέργειας σε ειδικούς βιοαντιδραστήρες οι οποίοι διατηρούν την καλλιέργεια στην log φάση ανάπτυξης. Με αντίστοιχους τρόπους μπορούμε να επιτύχουμε συγχρονισμό της καλλιέργειας (σύγχρονη ανάπτυξη). 19

20 Μέθοδοι μέτρησης βακτηρίων Απαρίθμηση σε πλάκες Petroff-Hauser Μετρητές σωματιδίων Coulter Απαριθμητές κυττάρων laser Μέθοδος Macklany-Donan (ή μέθοδος πλέον πιθανού αριθμού) Απαρίθμηση ζώντων κυττάρων σε θρεπτικό υπόστρωμα Μέτρηση οπτικής πυκνότητας σε φωτόμετρο Μέτρηση κυτταρικής μάζας Μέτρηση νουκλεϊνικών οξέων Μέτρηση υποστρώματος ή προϊόντων μεταβολισμού Εκτίμηση συγκέντρωσης ATP 20