Μικροβιολογία Τροφίμων

Transcript

1 Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών Τμήμα Επιστήμης Τροφίμων και Διατροφής του Ανθρώπου Εργαστήριο Μικροβιολογίας & Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Μικροβιολογία Τροφίμων Παπαδοπούλου Όλγα

2

3

4

5 In a study, a beef sample (ph 6.0) was found to initially contain ca bacterial cells/g, with relative levels of Pseudomonas spp. 1%, Acinetobacter and Morexella 11%, Brochothrix thermosphacta 13%, and others (Micrococcus, Staphylococcus, Enterobacteriaceae, lactic acid bacteria, etc.) 75%. Following aerobic storage at 2 C for 12 d, the population reached 6 X 10 7 cells/g, with the relative levels of Pseudomonas spp. 99% and all others 1%. Many of the bacterial species present initially could grow at the storage condition of the meat, but Pseudomonas spp. had the shortest generation time. As a result, initially even they constituted only 1% of the total population; after 12 d, they became predominant (99%). If the same meat sample were stored at 2 C anaerobically (such as in vacuum package) until the population had reached 10 7 /g, the predominant bacteria would have been, with most probability, facultative anaerobic Lactobacillus or Leuconostoc, or both, because of their growth advantages.

6 Οικολογικές έννοιες στη Μικροβιολογία Τροφίμων

7 Μελέτη της αλληλεπίδρασης των μικροοργανισμών τόσο μεταξύ τους όσο και με το περιβάλλον τους Σε τρόφιμα μικροβιακής επίδρασης (π.χ. ζυμούμενα τρόφιμα) ή σε αποδομούμενα τρόφιμα (αλλοιωμένα-αλλοιώσεις) οι προκαλούμενες μεταβολές σπάνια οφείλονται σε ένα μόνο μικροοργανισμό. Συνήθως, οι μεταβολές αυτές προκαλούνται από ομάδες μικροοργανισμών. Ομάδες από άτομα του ιδίου είδους (species) ή γονότυπου (genotype) σε μια ορισμένη περιοχή (π.χ. μια οποιαδήποτε περιοχή σε ένα οποιοδήποτε τρόφιμο) ονομάζονται πληθυσμοί (populations). Οι πληθυσμοί αυτοί δεν υπάρχουν μόνοι τους αλλά συχνά ως μια συνάθροιση διαφορετικών πληθυσμών. Αυτή η συνάθροιση αναφέρεται επίσης ως μικροβιακές κοινότητες (communities), κοινοπραξίες (consortia), συντεχνίες (guilds) ή συνεταιρισμοί (associations). Όλοι αυτοί οι όροι χρησιμοποιούνται ως συνώνυμο της συνάθροισης.

8 Μελέτη της αλληλεπίδρασης των μικροοργανισμών τόσο μεταξύ τους όσο και με το περιβάλλον τους Community: Ένα δίκτυο από συνεταιρισμό μικροοργανισμών Associations: Μια ομάδα μικροοργανισμών που φυσιολογικά αλληλεπιδρούν δια μέσου μιας περιοδικής ή συνεχούς φυσικής επαφής. Consortia, symbioses biofilms & bioaggregates: είναι παραδείγματα μικροβιακού συνεταιρισμού. Σε ευρύτερη έννοια, ο συνεταιρισμός μπορεί να αναφέρεται επίσης σε ομάδες σε κάθε επίπεδο βιολογικής οργάνωσης (μόρια, μακρομόρια, κύτταρα, οργανισμούς, κοινότητες, και οικοσυστήματα). Consortia: Ένας συνεταιρισμός στον οποίο τα μέλη βρίσκονται σε φυσική επαφή. Η διαστημική διευθέτηση των μικροοργανισμών είναι καλά ορισμένη και εύκολα αναγνωρίσιμη με το μικροσκόπιο. Guild: Ένας πλυθυσμός μεταβολικά συγγενών μικροοργανισμών

9 Αλληλεπίδραση μεταξύ των μικροοργανισμών Φυσικό περιβάλλον (Habitat) : Ορίζει τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του περιβάλλοντος το οποίο μπορεί να υποστηρίξει τις φυσιολογικές δραστηριότητες για την ανάπτυξη ενός είδους ή μιας ομάδας ειδών. Βιοθέση ή Θώκος (Niche) : ορίζεται το σύνολο των άριστων συνθηκών του περιβάλλοντος υπό τις οποίες μπορεί να αναπτυχθεί ένα είδος ή μια ομάδα ειδών. Κυριότητα (Domain) : Ορίζεται η περιοχή όπου ο μικροοργανισμός έχει την επίδρασή του στο χώρο και το χρόνο.

10

11

12 Αλληλεπίδραση μεταξύ των μικροοργανισμών 1. Ουδετερότητα 2. Αντιβίωση 3. Ομοσιτισμός 4. Ανταγωνισμός 5. Αμοιβαιότητα 6. Θήρευση ή παρασιτισμός

13

14 Αντιβίωση

15

16 Δειγματοληψία τροφίμου 2 ο Εργαστήριο

17

18 Δειγματοληψία τροφίμου 2 ο Εργαστήριο O συνολικός αριθμός μικροοργανισμών ικανών να σχηματίσουν αποικίες (colony forming units) Η απαρίθμηση του ακριβούς αριθμού των μικροοργανισμών στα τρόφιμα καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τη λήψη αντιπροσωπευτικού δείγματος του τροφίμου Τεχνικές μέτρησης του μικροβιακού πληθυσμού στα τρόφιμα Μέθοδος δεκαδικών αραιώσεων Ο εμβολιασμός του βακτηριακού εναιωρήματος στο θρεπτικό υπόστρωμα γίνεται με δύο ποσοτικές τεχνικές Τεχνική επιφανειακής επίστρωσης (spread plating) Τεχνική ενσωμάτωσης (pour plating) 0.1 ml (100μl) 1 ml (1000μl)

19

20 Η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων βασίζεται στην παραδοχή ότι ένα βακτηριακό κύτταρο ή μία ομάδα κυττάρων δημιουργεί μια αποικία. Έτσι, ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονται αντιπροσωπεύει τον πραγματικό μικροβιακό πληθυσμό. Κατά τη μικροβιολογική ανάλυση, στην περίπτωση όπου το δείγμα είναι στερεό, θα πρέπει πρώτα να ομογενοποιηθεί με τη βοήθεια ενός υγρού μέσου, ώστε να σχηματιστεί εναιώρημα, στον όγκο του οποίου θα είναι πρακτικά ομοιόμορφη η κατανομή των μικροοργανισμών. Στη μέθοδο των δεκαδικών αραιώσεων η μεταφορά του δείγματος από την προηγούμενη αραίωση στην μικρότερη γίνεται με πιπέτα όγκου 100 μl Η τεχνική της επιφανειακής επίστρωσης αφορά στην εξάπλωση γνωστού όγκου (100 μl) βακτηριακού εναιωρήματος σε στερεό θρεπτικό υλικό και εφαρμόζεται στους αερόβιους και προαιρετικά αερόβιους μικροοργανισμούς. Η τεχνική της ενσωμάτωσης εφαρμόζεται στους μικροαερόφιλους και υποχρεωτικά αναερόβιους μικροοργανισμούς.

21 Στη μέθοδο των δεκαδικών αραιώσεων η μεταφορά του δείγματος από την μεγαλύτερη αραίωση στην μικρότερη γίνεται με πιπέτα (pipette) όγκου 100 μl. Η συσκευή ομογενοποίησης (Stomacher) χρησιμοποιείται για την ομοιόμορφη διασπορά των μικροοργανισμών ενός υγρού δείγματος που έχει διαλυθεί σε ένα αραιωτικό διάλυμα. Στον παρακάτω πίνακα σημειώστε τη τεχνική που εφαρμόζουμε ανάλογα με το μικροοργανισμό που θέλουμε να απαριθμήσουμε: Μικροοργανισμός (1) Επιφανειακή επίστρωση, (2) Ενσωμάτωση Ολική μεσόφιλη χλωρίδα Ζύμες/μύκητες Εντεροβακτήρια Ψευδομονάδες Γαλακτικά βακτήρια Brochothrix thermosphacta

22 Μικροβιακή αλλοίωση τροφίμων (εκτός ύλης)

23

24

25 Κώδικας Τροφίμων και Ποτών Άρθρο 2, παρ. 3: Ως τρόφιμα νοούνται όλα τα στερεά ή υγρά προϊόντα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως τροφή από τον άνθρωπο. Ως τρόφιμα ζωικής προέλευσης θεωρούνται τα κρέας, πουλερικά, ιχθυηρά και τα προϊόντα τους, τα αυγά, το γάλα, τα γαλακτοκομικά προϊόντα, το μέλι. Ως τρόφιμα φυτικής προέλευσης θεωρούνται τα λαχανικά, τα έλαια, τα δημητριακά και τα ζαχαρούχα προϊόντα. Κύριες πηγές μικροοργανισμών στα τρόφιμά είναι: Έδαφος και νερό Αέρας και σκόνη Φυτά και φυτικά προϊόντα Εντερικός σωλήνας ανθρώπων και ζώων Χειριστές τροφίμων Σκεύη και πάγκοι επεξεργασίας τροφίμων Ζωοτροφές Δέρμα των ζώων

26 Μικροβιακή αλλοίωση τροφίμων Τα τρόφιμα που τρώμε είναι σπάνια στείρα μικροοργανισμών. Φέρουν τη μικροβιακή χλωρίδα που η σύνθεση της είναι πολύ διαφορετική από το ένα τρόφιμο στο άλλο. Οι παρόντες μικροοργανισμοί προέρχονται είτε από τη φυσική μικροχλωρίδα της πρώτης ύλης είτε εισάγονται κατά τη διάρκεια της συγκομιδής, της σφαγής, της επεξεργασίας, της αποθήκευσης και της διανομής των τροφίμων. Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα τρόφιμα καταναλώνονται χωρίς καμία συνέπεια. Σε άλλες περιπτώσεις, οι μικροοργανισμοί φανερώνουν την παρουσία τους με τους ακόλουθους τρόπους: (α) με την πρόκληση της αλλοίωσης των τροφίμων, (β) με την πρόκληση της τροφογενούς λοίμωξης ή (γ) μπορούν να μετασχηματίσουν τα τρόφιμα με έναν ευεργετικό τρόπο, που καλείται ζύμωση τροφίμων.

27 Είδη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes

28 Food spoilage can be considered as any change which renders a product unacceptable for human consumption; it may arise from insect damage, physical damage (bruising, freezing, drying, etc.), indigenous enzyme activity in animal or plant tissues, and chemical changes (usually involving oxygen). Therefore, spoilage is a complex phenomenon, involving physical, chemical, microbiological, and biochemical changes.

29 Είδη των μικροοργανισμών στα τρόφιμα Αλλοίωση Μεταβολή των ποιοτικών χαρακτηριστικών του τροφίμου σε βαθμό που το καθιστά μη αποδεκτό από τον καταναλωτή Παραδείγματα αλλοίωσης: ορατή επιφανειακή ανάπτυξη μικροοργανισμών, αποικοδόμηση δομικών συστατικών οδηγεί σε απώλεια της δομής, τα πιο συχνά είναι μεταβολικά προϊόντα: αέρια, χρωστικές, πολυσακκχαρίτες, οσμές και γεύσεις.

30 ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η αλλοίωση των τροφίμων είναι ένα οικολογικό φαινόμενο και μπορεί να ορισθεί σαν οποιαδήποτε μεταβολή η οποία καθιστά ένα τρόφιμο μη αποδεκτό για κατανάλωση. Η αλλοίωση των τροφίμων μπορεί να προκληθεί από έντομα, από φυσική βλάβη διαφόρων ειδών, όπως χτυπήματα και ψύξη, και από τη δράση ενζύμων ή μικροοργανισμών.

31 ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Η μικροβιακή αλλοίωση των τροφίμων μπορεί να πάρει ποικίλες μορφές, αλλά σε όλες τις περιπτώσεις είναι αποτέλεσμα της ανάπτυξης και μεταβολικής δραστηριότητας των μικροοργανισμών, η οποία τελικά γίνεται αντιληπτή μέσω των μεταβολών στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά των τροφίμων. Γενικά, η αλλοίωση των τροφίμων οφείλεται στη δραστηριότητα ενός σύνθετου μικροβιακού πληθυσμού (microbial association, consortium), η εκδήλωση δε της αλλοίωσης (παραγωγή ανεπιθύμητων ενδείξεων από οσμές, γλοιώδεις ουσίες, αλλαγές στο χρώμα, άρωμα και γεύση) και ο χρόνος που απαιτείται για την εμφάνισή της εξαρτάται από εκείνους τους οικολογικούς παράγοντες που υπάρχουν κατά την επεξεργασία, συντήρηση και διανομή του προϊόντος.

32 Μικροβιολογική δραστηριότητα Οργανοληπτική εκδήλωση Αποικοδόμηση συστατικών του τροφίμου Παραγωγή δυσάρεστων οσμών Παραγωγή εξωκυτταρικού πολυσακχαριτικού υλικού Σχηματισμός γλοιώδους επιφάνειας Ανάπτυξη βακτηρίων, ζυμών και μυκήτων Μεγάλες ορατές αποικίες Παραγωγή διοξειδίου του άνθρακα από υδατάνθρακες ή αμινοξέα Παραγωγή αερίου Παραγωγή χρωστικών που διαχέονται Αποχρωματισμός

33

34 Zanzibar USA Δεν είναι εύκολο να ορίσουμε την αλλοίωση 34 pains Tibet

35

36

37

38

39 ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ (SPOILAGE) Σχηματισμός γλοιώδους ουσίας στην επιφάνεια (slime) Παραγωγή δυσάρεστων οσμών (off-flavours) Αποχρωματισμός Μακροσκοπική παρατήρηση αποικιών

40

41

42 ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ο αρχικός μικροβιακός πληθυσμός των νωπών τροφίμων αποτελείται από την φυσική μικροχλωρίδα και την περιβαλλοντική μόλυνση που προέρχεται από τον χειρισμό τους. Ενώ το σύνολο του μικροβιακού πληθυσμού συγκροτείται από διάφορους μικροοργανισμούς (microbial association), η συσχέτιση του συνολικού αριθμού αυτών και της αλλοίωσης καθίσταται αδύνατη, αφού ως επί το πλείστο οι ουσίες που οδηγούν στη οργανοληπτική απόρριψη του προϊόντος παράγονται πιθανόν από ένα μέρος της συνολικής μικροχλωρίδας το οποίο είναι ικανό να αναπτυχθεί και να φτάσει σε σχετικά μεγάλους πληθυσμούς. Ο όρος «ειδικοί αλλοιoγόνοι οργανισμοί» (specific spoilage organisms, SSO) έχει υιοθετηθεί για τον χαρακτηρισμό του κλάσματος της συνολικής μικροχλωρίδας που είναι υπεύθυνο για την αλλοίωση.

43 ΑΛΛΟΙΩΣΗ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Ο ακριβής μηχανισμός σύμφωνα με τον οποίο μια ομάδα μικροβίων κυριαρχεί σε σχέση με μια άλλη δεν έχει γίνει ακόμα απόλυτα κατανοητός. Είναι γενικώς παραδεκτό, ότι έστω και μικρές αλλαγές στην επεξεργασία ή/και την συσκευασία των προϊόντων είναι ικανές να προκαλέσουν μεταβολή στη σύνθεση και στο ρυθμό ανάπτυξης των SSO και κατά συνέπεια, μια τελείως διαφορετική διαδικασία αλλοίωσης. Αυτό μπορεί να συμβεί ακόμα και σε ίδιου τύπου προϊόντα ανάλογα με την γεωγραφική προέλευση του προϊόντος και άλλους απροσδιόριστους παράγοντες οι οποίοι επιδρούν στην ανάπτυξη και μεταβολική δράση των αλλοιογόνων μικροοργανισμών.

44 Βακτήρια Μικροβιακή αλλοίωση Ζύμες 44 Μύκητες

45 ΑΡΧΕΣ ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗΣ ΑΛΛΟΙΩΣΗΣ Μια απλή μορφή αλλοίωσης είναι η περίπτωση όπου η ανάπτυξη των μικροοργανισμών έχει ως αποτέλεσμα ορατές οργανοληπτικές μεταβολές (μύκητες, παραγωγή χρωστικών ουσιών, εμφανείς βακτηριακές αποικίες κ.α.). Υπάρχει μια άμεση συσχέτιση μεταξύ του συνολικού αριθμού των μικροοργανισμών και του βαθμού αλλοίωσης. Η αλλοίωση είναι αποτέλεσμα μεταβολών στην οσμή και γεύση των τροφίμων. Οι μεταβολές αυτές προέρχονται από την παραγωγή ουσιών (χημικοί δείκτες ποιότητας, chemical spoilage index-csi) οι οποίες είναι αποτέλεσμα της μεταβολικής δράσης των βακτηρίων. Στην περίπτωση αυτή, δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του συνολικού αριθμού των βακτηρίων και της αλλοίωσης αφού συνήθως οι ουσίες που οδηγούν στη οργανοληπτική απόρριψη (CSI) παράγονται μόνο από ένα μέρος της συνολικής μικροχλωρίδας, τους ειδικούς αλλοιογόνους οργανισμούς. Είναι πολύ δύσκολο να προσδιοριστεί ποια από τα βακτήρια που απαντώνται σε ένα αλλοιωμένο προϊόν είναι αυτά που έχουν προκαλέσει την αλλοίωση.

46 Γενική εικόνα αλλαγών στον ολικό μικροβιακό πληθυσμό (ΟΜΧ), ειδικών αλλοιογόνων μικροοργανισμών (SSO) και δείκτες χημικής αλλοίωσης κατά τη διάρκεια αλλοίωσης των τροφίμων.

47 Η αλλοίωση ενός τροφίμου, κυρίως κατά τα πρώτα σημάδια της εμφάνισής της, χαρακτηρίζεται από τα υποκειμενικά κριτήρια του καταναλωτή όσον αφορά στα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του προϊόντος. Συγκεκριμένα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά, όπως υφή, εμφάνιση και γεύση, αποτελούν κριτήρια για να θεωρηθεί ένα τρόφιμο ως αλλοιωμένο Ένα αλλοιωμένο τρόφιμο δεν σημαίνει απαραίτητα ότι είναι μη ασφαλές τρόφιμο που θα οδηγήσει σε τροφική δηλητηρίαση. Όμως, η αλλοίωση των τροφίμων είναι εξαιρετικής σημασίας λόγω της σπατάλης των τροφίμων, των οικονομικών απωλειών και της έλλειψης εμπιστοσύνης που προκαλείται στους καταναλωτές, καθώς είναι γνωστό ότι το ¼ της παγκόσμιας παραγωγής τροφίμων χάνεται εξαιτίας της μικροβιακής δραστηριότητας