Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ - ΓΗΡΑΝΣΗ

Ιωάννης Π. Τρουγκάκος Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Βιοφυσικής Τμήμα Βιολογίας, Παν/μιο Αθηνών ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ - ΓΗΡΑΝΣΗ

Σημεία ελέγχου του Κυτταρικού κύκλου (check points) ιπλασιάστηκε όλο το DNA? Είναι το περιβάλλον ευνοϊκό? Είναι το μέγεθος του κυττάρου ικανοποιητικό? Βλάβη στο DNA (G 2 ) Πρόφαση: Υψηλά Επίπεδα MPF G 2 Μη διπλασιασμένο DNA (S) M ΕΛΕΓΚΤΗΣ S Είναι όλα τα χρωμοσώματα ευθυγραμμισμένα στην άτρακτο? Μη φυσιολογική Μιτωτική άτρακτος (Μ) G 1 ΕΚΚΙΝΗΣΗ (R) Βλάβη στο DNA (G 1 ) Η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου εξαρτάται από πολλαπλά σημεία ελέγχου (check points) τόσο κατά τη μεσόφαση όσο και κατά τη μίτωση. Στα σημεία αυτά ελέγχονται μια σειρά από παραμέτρους που σχετίζονται με τη δραστηριότητα που λαμβάνει χώρα σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου όπως για παράδειγμα η παρουσία μιτογόνων, ή βλαβών στο DNA στο σημείο G 1 S, η ακεραιότητα του διπλασιασμένου DNA μετά το τέλος της S φάσης, ή η σωστή διαμόρφωση της μιτωτικής ατράκτου κατά τη μίτωση. Ο εντοπισμός βλαβών από τον ελεγκτή οδηγεί σε αναστολή εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Είναι το μέγεθος του κύτταρου αρκετά μεγάλο? Είναι το περιβάλλον ευνοϊκό? Μπορεί το DNA να διπλασιαστεί με ασφάλεια?

Μοριακός μηχανισμός (βασίζεται σε ενεργότητα πρωτεϊνικής κινάσης) που ελέγχει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου Ολοένζυμο Συμπλέγματος Κινάσης Εξαρτώμενης από κυκλίνη Cdk-Cyc Σύνδεση Cdk με διαφορετικές Cycs Καταλυτικη υπομονάδα (Κινάση εξαρτώμενη από κυκλίνη-cdk) Ρυθμιστική υπομονάδα (Κυκλίνη-Cyc) Φωσφορυλίωση διαφορετικών πρωτεϊνών Βασίζεται κατά κύριο λόγο σε μια οικογένεια κινασών (ετεροδιμερή) που αποτελούνται από μια ρυθμιστική υπομονάδα (κυκλίνη-cyc) και μια καταλυτική υπομονάδα (κυκλινοεξαρτώμενη κινάση-cdk). Η ενεργοποιημένη μορφή της κινάσης μπορεί να φωσφορυλιώσει (και να ενεργοποιήσει) διάφορα υποστρώματα. Στους μύκητες η ίδια Cdk μπορεί να συνδεθεί με διάφορες Cyc.

Παράλληλα, κατά την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μεγάλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα είναι δυνατόν να μαρκάρουν είτε κάποιους ειδικούς αναστολείς των διαφόρων γεγονότων του κυτταρικού κύκλου είτε τιςίδιεςτιςκυκλίνες(εναλακτικός μηχανισμός ρύθμισης της ενεργότητας των Cyc-Cdk συμπλόκων) προωθόντας έτσι την αποδόμηση τους στο πρωτεόσωμα. Όταν η συγκέντρωση της Cyc είναι χαμηλή η Cdk λόγω απώλειας της Cyc είναι ανενεργή και ενεργοποιείται μόνο όταν η συγκέντρωση της Cyc υπερβεί κάποια όρια. NH 2 NH 2 APC Πρωτεόσωμα Πρωτεόλυση COOH COOH Ρύθμιση σχετικής συγκέντρωσης κυκλινών μέσω αποδόσης στο πρωτεάσωμα Κουτί καταστροφής Ενεργότητα MPF Συγκέντρωση κυκλινών Σχετική συγκέντρωση κυκλινών και ενεργότητας MPF στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου G 1 S G 2 M

Cdk1-Cycs Α,B S Cdk2-CycA Μικρή ενεργότητα κινάσης M G 2 3-4 hrs 1hr 6-8 hrs 6-12 hrs Σημείο Περιορισμού G 1 Cdk2-CycΕ G 0 Cdks 4, 6- (5?) Cycs D1,2,3 E2F 4,5 Μεγάλη ενεργότητα κινάσης E2F 1,2,3 Ενεργότητα των συμπλόκωνκυκλινώνκαι κυλινο-εξαρτώμενων κινασών (τόξα) κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα θηλαστικών (τα οποία είναι δυνατόν να βρίσκονταν σε φάση G 0 και έχουν διεγερθεί μέσω μιτογόνων να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο). Το πλάτος των γραμμών (τόξα) απεικονίζει χονδρικά την ενεργότητα των συμπλόκων Cdk-Cyc που αναφέρονται σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου. Τα σκιασμένα βέλη στη φάση G 1 υποδεικνύουν την ενεργοποίηση των μελών της οικογένειας του μεταγραφικού παράγοντα E2F από το αντίστοιχο Cdk-Cyc σύμπλοκο.

Γενικά η προώθηση του κυτταρικού κύκλου πέρα από το σημείο ελέγχου R (restriction point) εξαρτάται από την ενεργότητα των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες απαιτούνται για την μεταγραφή αρκετών γονιδίων όπως είναι οι Cyc-Α,-Ε και Cdk2-, ενώ επιπλέον οι E2F ενεργοποιούνκαιταίδιατουςταγονίδια (αυτοενεργοποίηση). Η μεταγραφική ενεργότητα των E2F παραγόντων αναστέλεται είτε από τη πρόσδεση της πρωτεϊνης του ρετινοβλαστώματος (prb) είτε από την πρόσδεση δύο σχετίζομενων πρωτεϊνών των p107 και p130.

Κινάση Wee1 Tyr 15 Cdk1 Cyc-A,B ΑΝΕΝΕΡΓΗ Cdk1 Cyc-A,B Κινάση CAK Φωσφορυλίωση κινάσης Φωσφορυλίωση κινάσης Σύνδεση Κυκλίνης- Κινάσης Ενεργοποίηση Cdk1 Cyc-A,B Cdk1 Cyc-A,B Thr 161 ΑΝΕΝΕΡΓΗ Φωσφατάση Cdc25 Απο-φωσφορυλίωση κινάσης Αυτο-φωσφορυλίωση κυκλίνης Αποδόμησηση κυκλίνης Αποφωσφορυλίωση κινάσης Σύνθεση Κυκλίνης Rb πρόσδεση υποστρώματος Cdk1 Cyc-A,B ΕΝΕΡΓΗ Cdk1 Cyc-A,B MFP APC Η ενεργότητα της κινάσης της φάσης της μίτωσης (MPK ή MPF) (σύμπλοκο CycA ή B-Cdk1) ρυθμίζεται στα θηλαστικά (όπως και στον σακχαρομύκητα) μέσω φωσφορυλιώσεων (κινάσες Wee1, CAK) και αποφωσφορυριώσεων (φωσφατάση Cdc25) της Cdk1 και πρωτεϊνικής αποδόμησης των κυκλινών Α, Β κατά το τέλος της μίτωσης. Οι κινάσες που ενεργοποιούν το σύμπλοκο είναι αντίστοιχες με αυτές που έχουν βρεθεί στους μύκητες. Τα αμινοξέα που φωσφορυλιώνονται στην Cdk2 είναι η Tyr 15 και η Thr 161. Ο σχετικό χρονισμός για κάθε γεγονός δεν είναι ακόμη απόλυτα γνωστός.

Μοριακά γεγονότα που απαιτούνται για την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο μετάπτωσης G 1 S μετά από ενεργοποίηση εισόδου στον κυτταρικό κύκλο παρουσία μιτογόνων G 2 M PP-1 S E2F G 1 E2F Απο-φωσφορυλίωση του prb πρόσδεση στον E2F Όμοια σε G 0 κύτταρα Rb ή p107, p130 E2F ΜΙΤΟΓΟΝΑ Κυκλίνη D Cdk4/6 Κυκλίνη E Cdk2 Φωσφορυλίωση του prb Αποδέσμευση του E2F Τα μιτογόνα μέσω διακριτών μονοπατιών μεταγωγής σήματος ενεργοποιούν τα σύμπλοκα κυκλινών-κινασών CycD-Cdk4, CycD-Cdk6 και CycΕ-Cdk2 τα οποία με τη σειρά τους φωσφορυλιώνουν την πρωτεϊνη prb που έχει προσδέσει τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας E2F (ή τις πρωτεϊνες p107, p130 που επίσης προσδένουν τους E2F παράγοντες) Η φωσφορυλίωση της prb έχει σαν αποτέλεσμα την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων E2F που ενεργοποιούν στησυνέχειαταίδιατουςταγονίδια (αυτορύθμιση), τις κυκλίνες και τις κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες που εμπλέκονται στη φωσφορυλίωση του prb αλλά και μια σειρά άλλων γονιδίων που συμμετέχουν στο διπλασιασμό του DNA επιτρέποντας έτσι την προώθηση του κυτταρικού κύκλου στο σημείο G 1 S. Η αποφωσφορυλίωση του E2F (από τη φωσφατάση PP-1) κατά το τέλος της μίτωσης έχει σαν αποτέλεσμα την αναστολή της κυτταρικής αύξησης μέχρι να παρουσιαστεί και πάλι το κατάλληλο ερέθισμα (παρουσία μιτογόνων).

Δομής της πρωτεΐνης p53 Θέση ενεργοποίησης μεταγραφής Περιοχή πρόσδεσης στο DNA εξαρτώμενη από την ακολουθία στόχο Περιοχή πρόσδεσης στο DNA μη-εξαρτώμενη από την ακολουθία Ν I II III IV V C Πρόσδεση MDM2 Πρόσδεση E6, E1b Πρόσδεση SV40T Θέση τετραμερισμού Mdm2 αποδόμηση p53 αναστολή έκφρασης p21

Δομής της πρωτεΐνης p53

Ρύθμισης της σταθερότητας και τοπολογίας της πρωτεΐνης p53 p53 Mdm2 αποδόμηση του p53 από το 26S πρωτεόσωμα Mdm2 p53 p53 Mdm2 Mdm2 πυρήνας Mdm2 p19 Mdm2 p19 Mdm2 p19 πυρηνίσκος

Η ανακοπή του κυτταρικού κύκλου σε κάποιο από τα σημεία ελέγχου συνδέεται με τη σύνθεση των CdkIs η οποία ενεργοποιείται ειδκά μέσω ειδικών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που εντοπίζουν τις εν λόγω βλάβες. Βλάβη στο DNA ATM p53 Cyclin G άγνωστη λειτουργία p53 GADD45 IGF-BP3 Bax απόπτωση p21 MDM2 προσδένεται στο PCNA επιδιόρθωση DNA σινιάλα από μιτογόνους αναπτυξιακούς παράγοντες Cdk-Cyc, PCNA p14 ARF ATM Τα πιο πολλά τέτοια μονοπάτια μεταγωγής σήματος ελέγχονται από την πρωτεΐνη p53 (τον «φύλακα του γονιδιώματοσ»)

Το μονοπάτι σηματοδότησης του p53

Ρύθμιση σηματοδοτικών μονοπατιών από το p53 και φαινοτυπικό αποτέλεσμα p53 PCNA ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ κυτταρικού Κύκλου -S Ανεξάρτητα του prb

Η καταστολή της ενεργότητας των συμπλόκων Cyc-Cdk (ενεργότητα κινάσης) και κατ επέκταση η περαιτέρω ρύθμιση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου επιτυγχάνεται μέσω αρνητικών ρυθμιστών στους οποίους περιλαμβάνονται ομάδες πρωτεϊνών μικρού (συνήθως) μοριακού βάρους που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι ειδκοί αυτοί αναστολείς δρούν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω πρόσδεσης τους στη Cyc), είτε παρεμποδίζοντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk. Οι CdkIs αποτελούνμέροςτωνμηχανισμώνανάδρασηςτωνκυττάρωνπουελέγχουντακατάσταση των γεγονότων που λαμβάνουν χώρα κατά τον κυτταρικό, κύκλο όπως η αντιγραφή του DNA ή η συμπύκνωση των χρωμοσωμάτων. Η ανάλυση της πληροφορία αυτής στη συνέχεια καθορίζει αν ο κυτταρικός κύκλος θα συνεχιστεί. Κατά αυτήν την έννοια τα σημεία G 1 S και G 2 M είναι ζωτικής σημασίας όσον αφορά τους πρωταρχικούς ελέγχους των μηχανισμών ανάδρασης και αφορούν τη δέσμευση (που λαμβάνει χώρα κατά τη φάση G 1 ) για τον διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων και τη δέσμευση (που συμβαίνει στο τέλος της φάσης G 2 ) για την είσοδο στη μίτωση (δευτερεύων σημείο ελέγχου). Αν ένα κύτταρο εκτεθεί σε παράγοντες που προκαλουν βλάβες στο DNA το πέρασμα από το σημείο G 1 -S καθυστερεί μέχρι να διορθωθεί η βλάβη, ενώ αν διαπιστωθεί μη σωστός σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου ο κύκλος διακόπτεται κατά την ανάφαση.

Επαγωγέας Αναστολή ενεργότητας κινασών Aναστολέας Cdk (CdkI) ΑΝΑΣΤΟΛΗ της ενεργότητας κινάσης ΑΝΑΣΤΟΛΗ κυτταρικού κύκλου Η επιτυγχάνεται μέσω καταστολής της ενεργότητας κινάσης των συμπλόκων Cyc-Cdk. Μεταξύ των αρνητικών ρυθμιστών περιλαμβάνεται μια ομάδα από μικρού μοριακού βάρους πρωτεΐνες που ονομάζονται αναστολείς Cdk (CdkI, Cdk Inhibitors). Οι αναστολείς αυτοί δρουν είτε μπλοκάροντας την ενεργοποίηση της Cdk κινάσης (λόγω φυσικής τους αλληλεπίδρασης με την Cyc), είτε μπλοκάροντας την πρόσβαση του υποστρώματος στόχου ή του ATP στο σύμπλοκο Cyc-Cdk.

Οι CdkIs ομαδοποιούνται σε δύο οικογένειες: (1) Την οικογένεια ΙΝΚ4 (inhibitors of kinase 4) που αποτελείται από τέσσερα μέλη και ειδικότερα τις πρωτεϊνες p16 Ink4a, p15 Ink4b, p18 Ink4c και p19 Ink4d. (ή p14 ARF το ανθρώπινο ομόλογο γονίδιο) που αναστέλουν ειδικά τα σύμπλοκα CycD-Cdk4, CycD-Cdk6. (2) Την οικογένεια Cip/Kip που αποτελείται από τρία μέλη. Την p21 Cip1, την p27 Kip1 και την p57 Kip2. Οι πρωτεΐνες αυτές αναστέλουν ισχυρά τα σύμπλοκα των Cdk2-CycE και Cdk2-CycA κινασών ενώ παρότι έχει βρεθεί ότι τα σύμπλοκα CycD-Cdk όχι μόνο δεν επηρεάζονται αλλά και απαιτούν τις Cip/Kip πρωτεϊνες για σωστή αυτοσυγκρότηση δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι κάτω από συγκεκρίμενες συνθήκες οι Cip/Kip πρωτεϊνες μπορούν να αναστείλουν την ενεργότητα και των Cdk4-6/CycD.

G 1 και S Φάσεις του Κυτταρικού κύκλου

G 2 και M ΦάσειςτουΚυτταρικούκύκλου

Συσσώρευση Κυτταρικών διαιρέσεων INK4A/ARF Συσσώρευση Κυτταρικών διαιρέσεων (p14 ARF ) p19 ARF p16 INK4A Bmi-1 Mdm2? Cdks4/6 Cdk2 Cyclin D Cyclins E/A Bmi-1 Τα μονοπάτια σηματοδότησης του p53 και Rb Shc ΑΤΜ Απόπτωση Μειωμένη πολλαπλασιαστική ικανότητα Raf, Mek Onco-Ras p53 p21? PCNA PI 3 K prb σιγή E2F Αναστολή Κυτταρικού Κύκλου-Γήρανση? PIP 3 -μείωση PTEN p27 kip1

Τα μονοπάτια σηματοδότησης του p53 και Rb