ΒΙΟ116 ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ

Πανεπιστήµιο Κρήτης Σχολή Θετικών Επιστηµών Τµήµα Βιολογίας ΤΕΤΡΑ ΙΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΥ ΜΑΘΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟ116 ΜΕΘΟ ΟΙ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Υπεύθυνος µαθήµατος: Τάσος Οικονόµου Υπεύθυνες Εκτέλεσης Ασκήσεων: Μαρία Μαρκάκη (ΕΤΕΠ), Έλενα Κουιµτζόγλου (ΕΤΕΠ) ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΑΜ: ΑΡΙΘ. ΘΕΣΗΣ: Ηράκλειο 2004

2 ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΑΣΚΗΣΕΩΝ Ασκηση 1 Ασηπτικές συνθήκες στη Μικροβιολογία/Οπτική παρατήρηση µικροοργανισµών Ασκηση 2 Υγρά και στερεά θρεπτικά µέσα (Παρασκευή/αποστείρωση)/ Θερµοκρασιακό εύρος ανάπτυξης βακτηρίων. Ασκηση 3 Μικροσκοπική Παρατήρηση Μικροοργανισµών/Xρώσεις. Ασκηση 4 Αντιβιοτικά/Μηχανισµοί αντίστασης Ασκηση 5 Ποσοτική µέτρηση βακτηριακών κυττάρων µε τη µέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων/ Ανάπτυξη βακτηρίων σε υγρή καλλιέργεια. Καµπύλες ανάπτυξης Ασκηση 6 Χηµικά συστατικά του αίµατος των θηλαστικών Τιτλοδότηση του αίµατος και του πλάσµατος. Άσκηση 7 Χωρισµός βιοµορίων µικρού µοριακού βάρους. Χρωµατογραφία λεπτής στοιβάδας: Αµινοξέα, σάκχαρα, λιπίδια. Άσκηση 8 Μη µετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαµίδης Άσκηση 9 Κινητική ενζύµων Ενζυµική χρώση Χρήση φωτόµετρου για την κινητική του ενζύµου. Άσκηση 10 Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών Μέθοδοι Lowry και Bradford. ΣΕΠΤΕΜΒΡΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΠΡΑΚΤΙΚΩΝ ΑΣΚΗΣΕΩΝ Εβδοµάδα 1 Εβδοµάδα 2 Εβδοµάδα 3 Εβδοµάδα 4 ΟΚΤΩΒΡΗΣ ΝΟΕΜΒΡΗΣ ΕΚΕΜΒΡΗΣ

3 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ (1-5) ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ Κεντρικός κορµός ενός εργαστηρίου Εισαγωγής στη Μικροβιολογία. Σκοπός των Εργαστηριακών Ασκήσεων της Μικροβιολογίας είναι να εξοικειωθείτε µε τα παρακάτω: 1. Ασφάλεια στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας. 2. Xρήση βασικών οργάνων (µικροσκόπιο, φασµατοφωτόµετρο κλπ). 3. Γενικές Μικροβιολογικές µέθοδοι χειρισµού µικροοργανισµών (Ασηπτικές συνθήκες, για τη µεταφορά και καλλιέργεια µικροβίων. Χρήση γυάλινης Πιπέττας και µικροπιπέττας. Χρώσεις. Επιστρώσεις τριβλίων). Εισαγωγή στη Βακτηριακή Γενετική. 4. Ποσοτική ανάλυση µικροοργανισµών (αραιώσεις και µέτρηση βακτηριακών αποικιών). Επιπρόσθετα οι φοιτητές πρέπει να εξοικειωθούν µε άλλες βασικές διαδικασίες όπως: τεκµηρίωση των εργαστηριακών αποτελεσµάτων, παρουσίαση δεδοµενων µε γραφικές παραστάσεις, κριτική ανάλυση και γραπτή επικοινωνία των αποτελεσµάτων και ικανότητα στοιχειώδους χαρακτηρισµού µικροοργανισµών. Μέσα από τις εργαστηριακές ασκήσεις θέλουµε να τονίσουµε τη διερευνητική φύση της Μικροβιολογίας. Η οργάνωση των εργαστηριακών ασκήσεων του ΒΙΟ111 εγινε σύµφωνα µε τις οδηγίες της Αµερικανικής Εταιρείας Μικροβιολογίας (ASM; δες την ιστοσελίδα http://www.asmusa.org/edusrc/edu32a.htm#think) Γενικές πληροφορίες, κανόνες συµπεριφοράς και ασφάλεια στο εργαστήριο Μικροβιολογίας 1. Φοράτε πάντα µέσα στην αίθουσα των ασκήσεων την εργαστηριακή σας ποδιά και βγάζετέ την όταν µετακινείστε σε άλλους χώρους! Οι µικροοργανισµοί µεταφέρονται µε τα ρούχα σας παντού! 2. Προσοχή κατά την ώρα των ασκήσεων! Στο εργαστήριο βρίσκονται διάφορα επικίνδυνα χηµικά, ανοιχτές φλόγες από τα γκαζάκια κλπ. 3. Οχι φαγητό-οχι ποτά-οχι κάπνισµα. Είναι οι καλύτεροι τρόποι για να µεταφέρετε πιθανά παθογόνους µικροοργανισµούς στο σώµα σας! 4. Προσοχή στον τρόπο που χειρίζεστε τις γυάλινες πιπέττες! Μην ασκείτε πίεση πάνω τους. εν είναι απίθανο να σπάσουν και να σας τραυµατίσουν. 5. Σε ένα βιολογικό εργαστήριο οι µικροοργανισµοί που χρησιµοποιείτε µπορεί νάναι παθογόνοι ή να είναι γενετικά µεταλλαγµένοι. Μην πετάτε τριβλία και βακτηριακές καλλιέργειες στους κοινούς κάδους απορριµάτων αλλά χρησιµοποιήστε τους ειδικούς σάκκους. Αποστείρωση υλικών. 6. Εχετε µαζί σας µαρκαδόρους (υαλογράφους) για να σηµειώνετε πάνω σε τρυβλία. Κάθε οµάδα θα πρέπει να έχει και αναπτήρα για να ανάβει τα γκαζάκια.

4 Ασκηση 1 Ασηπτικές συνθήκες στη Μικροβιολογία/Οπτική παρατήρηση µικροοργανισµών Σκοπός της άσκησης είναι να εξοικειωθείτε µε την ιδέα ότι οι µικροοργανισµοί είναι τόσο µικροί που ξεφεύγουν από την αντίληψη που έχουµε µέσω των αισθήσεων µας για τον φυσικό κόσµο γύρω µας. Eχουµε όµως αναπτύξει µία σειρά από εργαλεία που µας επιτρέπουν να βλέπουµε τους οργανισµούς αυτούς Α. Οπτική παρατήρηση µικροοργανισµών Ι. Ονοµατολογία και χώροι της ζωής. Σχήµα α ΙΟΙ Πορφυρά βακτήρια Χλωροπλάστες Κυανοβακτήρια εινόκοκκο ι Θερµοτόγκα ΒΑΚΤΗΡΙΑ Gram + Μιτοχόνδριο Πράσινα µη Θειοβακτήρια ΑΡΧΑΙΑ ΕΥKΑΡΥΩΤΙΚΟIΙ Aquifex LUCA ΙΙ. Το τριβλίο Petri. Παρατήρηση βακτηριακών αποικιών, αποικιών ζακχαροµύκητα. Σύγκριση µορφολογίας, υφής χρώµατος κλπ. αα Μικροοργανισµός ΧΩΡΟΣ- DOMAIN θ (oc) Θρεπτικό Μέσο ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 1 Psychrobacter imobilis 2 Bacillus stearothermophilus 3 Xanthomonas badrii 4 Klebsiella pneumoniae 5 Escherichia coli 6 Nocardia corallina 7 Agrobacterium tumefaciens 8 Pseudomonas syringae 9 Saccharomyces cereviciae 10 Arthrobacter luteus 11 Streptomyces albus 12 Thermus aquaticus Σχήµα β. Aποικίες τoυ κατά Gram θετικού βακτηρίου Streptomyces coelicolor όπως αυτές αναπτύσσονται στην επιφάνεια ενός τριβλίου µε άγαρ και θρεπτικό µέσο.

5 Β. Τα βακτήρια είναι παντού I. µόλυνση τριβλίων µε µικροοργανισµούς του σώµατος, π.χ. δάχτυλα χεριών +/- σαπούνι, +/- αιθανόλη, ΕΚΤΕΛΕΣΗ: Σχήµα γ άχτυλο 1 - + ΑΙΘΑΝΟΛΗ - + ΣΑΠΟΥΝΙ άχτυλο 2 ΙΙ. έκθεση τριβλίων που περιέχουν διαφορετικά θρεπτικά µέσα στον αέρα του περιβάλλοντος. Θρεπτικά µέσα: ( Ασκηση 2) LB, YEP, Minimal M9 ΖΩΓΡΑΦΙΣΕ τις παρατηρήσεις σου (διαφορετικές µορφολογίες αποικιών κλπ) που παρατηρείτε Μια αποικία αποτελείται από εντελώς όµοια κύτταρα στιβαγµένα το ένα δίπλα στο άλλο. Ένα µικροβιακό κύτταρο (πάνω σε στερεό θρεπτικό µέσο) δίνει χιλιάδες έως εκατοµµύρια απογόνους σχηµατίζοντας µια αποικία (διαµέτρου µερικών χιλιοστών του µέτρου). Σχήµα δ 1. 2. 3. ΘΕΣΗ ΤΡΙΒΛΙΟΥ ΤΡΙΒΛΙΟΥ:. ΘΕΣΗ ΤΡΙΒΛΙΟΥ ΤΡΙΒΛΙΟΥ:. ΘΕΣΗ ΤΡΙΒΛΙΟΥ ΤΡΙΒΛΙΟΥ:. Γ. Επίστρωση (streaking) κυττάρων E.coli (από στερεή καλλιέργεια) σε τριβλία (Petri dish) µε θρεπτικό µέσο LB χρησιµοποιώντας µικτοβιολογικό κρίκο (µεταλλική θηλιά σύρµατος νικελίου, λούπα-loop). Θα σας δοθεί στερεή αρχική καλλιέργεια. Για διατήρηση ασηπτικών συνθηκών στη Μικροβιολογία είναι απαραίτητη η χρήση του λύχνου Bunsen. Έτσι, δηµιουργείται στοιχειωδώς αποστειρωµένος χώρος στον πάγκο εργασίας και έχουµε γρήγορη αποστείρωση ορισµένων συσκευών, εργαλείων (πιπέτες, τρυβλία, σωλήνες κλπ) και παρεµπόδιση της µόλυνσης των θρεπτικών µέσων από µικροοργανισµούς του περιβάλλοντος. ΕΚΤΕΛΕΣΗ:

6 Παρακολουθήστε την επίδειξη που θα σας γίνει στο εργαστήριο και ακολουθήστε το παρακάτω σχέδιο τριών διαδοχικών σταδίων. ΠΡΟΣΟΧΗ!!! Μεταξύ κάθε σταδίου ο µικροβιολογικός κρίκος (λούπα) πρέπει να αποστειρώνεται σε φωτιά.. Επίστρωση κυττάρων E.coli (από υδατικό εναιώρηµα) σε τριβλία µε θρεπτικό µέσο LB χρησιµοποιώντας γυάλινη κεκαµµένη ράβδο (δες σχήµα ε). Ασηπτικές συνθήκες στη Μικροβιολογία. ΕΚΤΕΛΕΣΗ: Εναποθέστε µία σταγόνα 100µl από ένα εναιώρηµα αραίωσης 10-6 (θα σας δοθεί).

7 Ε. Χρήση φίλτρων για αποστείρωση. Σχήµα στ. Ηλεκτρονική µικρογραφία της επιφάνειας µκροβιολογικών φίλτρων Το µικρότερο βακτήριο έχει µήκος ~0.2µm και το µεγαλύτερο (Thiomargarita mamibiensis) 1mm. Οι ιοί έχουν µήκος από 20nm-200nm. Η Ε.coli έχει διάµετρο ~0.8µm και µήκος ~1-2µm. ΣΤ. Χρήση θάλαµου επώασης (incubator) σταθερής θερµοκρασίας (Σχήµα η) για καλλιέργειες πάνω σε στερεά θρεπτικά µέσα. Για υγρές καλλιέργειες χρήση επωαστήρα ανάδευσης µε διατήρηση θερµοκρασίας µέσω αέρα (shaking) ή νερού (shaking waterbath). Σχήµα η ΑΛΛΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ Ιστοσελίδες στο ιαδίκτυο: -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 9.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ -ΒΙΟ111>ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΙΕΥΘΥΝΣΕΙΣ ΣΤΟ ΙΑ ΙΚΤΥΟ> 2,3,4 -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 1,2,3,4,8 CD-ROM (Υπολογιστικό Κέντρο-Αίθουσα Υποστήριξης) -Ingraham, Schaechter and Neidhardt, (1997) An Electronic Companion to Beginning Microbiology -Mark L. Wheelis (1996) Microbiology for Majors Electronic Companion ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

8 ΑΝΑΡΩΤΙΕΜΑΙ, ΑΡΑ ΥΠΑΡΧΩ Τι διάµετρο θα πρέπει νάχουν τα φίλτρα που χρησιµοποιoύµε για να συγκρατήσουνε α. όλα τα πιθανά βακτήρια ενός εναιωρήµατος; και β. όλους τους ιούς;

9 Ασκηση 2 Υγρά και στερεά θρεπτικά µέσα (Παρασκευή/αποστείρωση) και Θερµοκρασιακό εύρος ανάπτυξης βακτηρίων. Σκοπός της άσκησης είναι η εξοικείωση µε την παρασκευή και αποστείρωση θρεπτικών µέσων και εµβολιασµό βακτηρίων σε αυτά (υγρά-στερεά). Βεβαίως, κάτω από ασηπτικές συνθήκες απαραίτητες για τη δηµιουργία καθαρών καλλιεργειών βακτηρίων. Παρατήρηση της επίδρασης της θερµοκρασίας στην ανάπτυξη των βακτηρίων. Α. Βακτηριακά θρεπτικά µέσα: παρασκευή, αποστείρωση, χρήση. α. Υγρά και στερεά θρεπτικά µέσα καλλιέργειας. Παρασκευή υγρού και στερεού πλούσιου (rich) θρεπτικού µέσου LB (Luria-Bertani Broth). Υλικά Εκχύλισµα Ζύµης (Yeast Extract) Πηγή νουκλεοτιδίων, βιταµινών,αυξητικών παραγόντων Τρυπτόνη (Tryptone) Προϊόν πέψης πρωτείνης-πηγή αµινοξέων Ποσότητες για Υγρό LB (για 50ml) Ποσότητες για Στερεό LB (για 200 ml) Ποσότητες για Στερεό LB (για 400 ml) 0.25 gr 1 gr 2 gr 0.5 gr 2 gr 4 gr NaCl 0.25 gr 1 gr 2 gr H2O 50 ml 200 ml 400 ml Aγαρ Προέρχεται από τα φύκη (Agar agar), σύνθετος υδατάνθρακας που αποτελείται από γλυκόζη και δεν έχει θρεπτική αξία. Υγροποιείται στους 100 ο C και στερεοποιείται στους 40 ο C - 3 gr 6 gr Το µέσο πρέπει να ρυθµιστεί σε τελικό ph=7.2 Θα ετοιµαστούν: Ι. Κωνικές φλάσκες (Εrlmeyer) 1 φλάσκα 50-100ml µε υγρό θρεπτικό µέσο LB ΙΙ. Τριβλία (~20ml/τριβλίο-5 τριβλία ανά φοιτητή-τρια). ΙΙΙ. Επικλινή (~5-7ml/σωλήνα-1 ως 2 σωλήνες ανά φοιτητή-τρια) Επικλινής (Slant) ΑΓΑ Ρ Τρόποι αποστείρωσης: α) Θερµός αέρας 160 ο C 180 ο C για 3 ώρες π.χ. γυαλικά β) Θερµότητα και υγρασία, 100 ο C και ρεύµα ατµού π.χ. γάλα γ) Αυτόκαυστο-χύτρα ταχύτητας: ατµός υπό πίεση-θερµοκρασία 120 ο C π.χ. υλικά καλλιεργειών δ) Φιλτράρισµα (µεµβράνη νιτροκυτταρίνης)

10 ΕΚΤΕΛΕΣΗ: θα χρήσιµοποιήσετε: Ζυγούς-µαγνητικούς αναδευτήρες-pηµετρο ή pη-µετρικό χαρτί- αυτόκαυστο ή χύτρα ταχύτητας για αποστείρωση. ΧΡΗΣΗ ΧΥΤΡΑΣ ΤΑΧΥΤΗΤΑΣ ΓΙΑ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗ 1. Προσθέτω Η 2 0 στη χύτρα (µέχρι ύψους περίπου 2 cm) 2. Τοποθετώ τα προς αποστείρωση είδη µέσα στη χύτρα. 3. Κλείνω το καπάκι ερµητικά. 4. Ανοίγω το ηλεκτρικό µάτι στο 3. 5. Περιµένω µέχρι να βγεί ατµός από το επιστόµιο στο καπάκι και γυρίζω το ηλεκτρικό µάτι στο 2. 6. Mετράω χρόνο 15-20 min. 7. Κλείνω το µάτι και περιµένω να πέσει η πίεση. 8. Ανοίγω τη βαλβίδα και µετά το καπάκι. ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΤΟ ΧΕΙΡΙΣΜΟ ΤΩΝ ΟΧΕΙΩΝ ΜΕ ΤΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΜΕΣΑ ΟΤΑΝ ΑΥΤΑ ΕΙΝΑΙ ΑΚΟΜΗ ΖΕΣΤΑ! ΚΙΝ ΥΝΟΣ ΕΓΚΑΥΜΑΤΟΣ!!!!!!!!! ΜΠΟΡΕΙΤΕ ΕΥΚΟΛΑ ΝΑ ΚΡΥΩΣΕΤΕ ΤΑ ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΣΑΣ ΜΕ ΑΦΘΟΝΟ ΤΡΕΧΟΥΜΕΝΟ ΝΕΡΟ ΒΡΥΣΗΣ Ο κάθε οργανισµός κατά τη διάρκεια της εξέλιξης έχει προσαρµοστεί σε βέλτιστη ανάπτυξη κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες ιοντικής ισχύος ph, θερµοκρασίας, πίεσης, οξυγόνου, βαρέων µετάλλων κλπ. Έτσι, για παράδειγµα, ανάλογα µε το βέλτιστο ph για την ανάπτυξη κάθε οργανισµού, οι οργανισµοί διακρίνονται σε α) οξεόφιλους (ph < 3), β) ουδετερόφιλους (ph 6-8) και γ) αλκαλιόφιλούς (ph > 10). Ανάλογα µε τη βέλτιστη θερµοκρασία ανάπτυξης τα βακτήρια χαρακτηρίζονται σε ψυχρόφιλα (0-20 ο C), µεσόφιλα (30-37 ο C) και θερµόφιλα (50-60 ο C). Β. Θερµοκρασιακό εύρος ανάπτυξης βακτηρίων Στην άσκηση αυτή θα µελετήσουµε την περίπτωση της θερµοκρασίας στην ανάπτυξη διαφόρων βακτρίων. α. Σας δίνονται τριβλία Petri µε στερεές καλλιέργειες από 8 από τα παρακάτω βακτήρια: Αυτές οι καλλιέργειες θα σας δωθούν σε τριβλία µε µόνη ένδειξη έναν αριθµό από 1 ως 8. β. Χωρίστε 4 τριβλία LB σε 8 τοµείς µε το µαρκαδόρο σας, αριθµήστε τους τοµείς και σηµειώστε τον αριθµό της θέσης σας! Επιστρώστε µε τη λούπα σας ένα µικρό αριθµό κυττάρων από τα βακτήρια σε κάθε ένα τοµέα (δες παρακάτω σχήµα). Μικροοργανισµός Αριθµός Παρατηρήσεις/Αιτιολόγιση Psychrobacter imobilis Bacillus stearothermophilus Xanthomonas badrii Klebsiella pneumoniae Escherichia coli, Nocardia corallina Agrobacterium tumefaciens Pseudomonas syringae Saccharomyces cereviciae Arthrobacter luteus Streptomyces albus γ. Επωάστε το κάθε ένα τριβλίο σε διαφορετική θερµοκρασία (8 ο C, 28 o C, 37 o C και 65 o C). 8 o C 28 o C 37 o C 65 o C 7 6 8 5. 1 ΑΡΙΘΜ ΘΕΣΗΣ 4 2 3 7 6 8 5. 1 ΑΡΙΘΜ ΘΕΣΗΣ 4 2 3 7 6 8 1 8 1 ΑΡΙΘΜ ΘΕΣΗΣ 5. 4 2 3 7 6 ΑΡΙΘΜ ΘΕΣΗΣ. 5 4 2 3

11 Oταν οι καλλιέργειες σας αναπτυχθούν θα µοιάζουν κάπως έτσι: Στην επόµενη άσκηση και σύµφωνα µε τα στοιχεία που θα έχετε από την ανάπτυξη των βακτηρίων σας στις διάφορες θερµοκρασίες µπορείτε να βρείτε ποιό βακτήριο αντιστοιχεί σε κάθε αριθµό? Εχετε αρκετά στοιχεία για να ταυτοποιήσετε όλα τα βακτήρια της άσκησης? ικαιολογήστε τις απαντήσεις σας στον παραπάνω πίνακα. Επιπρόσθετα κατά τη διαρκεια της σηµερινης ασκησης θα κανετε και τα εξής α. Παρατήρηση τη µορφολογίας των αποικιών των µικροοργανισµών που αναπτύχθηκαν στα τριβλία της Ασκησης 1. β. Επίστρωση µε λούπα ξανά (µέχρι να µπορούν όλες/οι να αποµονώνουνε µοναδικές αποικίες-κλώνους). γ. Μόλυνση υγρών καλλιεργειών (µικρές καλλιέργειες σε σωλήνες) από µοναδική αποικία τριβλίου και ανάπτυξη σε κινούµενο επωαστήρα (shaking incubator) ΑΛΛΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ Ιστοσελίδες στο ιαδίκτυο: -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 9.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ -ΒΙΟ111>ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΙΕΥΘΥΝΣΕΙΣ ΣΤΟ ΙΑ ΙΚΤΥΟ> 2 CD-ROM (Υπολογιστικό Κέντρο-Αίθουσα Υποστήριξης) -Ingraham, Schaechter and Neidhardt, (1997) An Electronic Companion to Beginning Microbiology -Mark L. Wheelis (1996) Microbiology for Majors Electronic Companion ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

12 Ασκηση 3 Μικροσκοπική παρατήρηση µιρκοοργανισµών Σκοπός της άσκησης είναι η Παρασκευή και η παρατήρηση παρασκευασµάτων ζωντανών κυττάρων βακτηρίων και σακχαροµήκυτα µε τη χρήση µικροσκοπίου και επίσης η παρατήρηση µονίµων παρασκευασµάτων διαφόρων κυττάρων βακτηρίων. ιάβασµα Brock- Η αόρατη δύναµη Α.Μικροσκοπική παρατήρηση ζωντανών κυττάρων βακτηρίων και σακχαροµύκητα. I. Πάρτε µικρή ποσότητα κυττάρων µε τη βοήθεια µικροβιολογικού κρίκου (λούπα) και διαλύστε τα σε 1ml H2O µέσα σε ένα πλαστικό σωληνάκι Eppendorf. II. Μεταφέρετε 20µl από αυτό το εναιώρηµα πάνω στην αντικειµενοφόρο. ΙΙΙ. Σκεπάστε µε καλυπτρίδα και παρατηρήστε στο Μικροσκόπιο χρησιµοποιώντας µέχρι και τον 100Χ φακό µε κεδρέλαιο. αα Μικροοργανισµός ΧΩΡΟΣ-DOMAIN ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 1 Psychrobacter imobilis ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ-ΟΙΚΟΝΟΜΙΚΗ- ΑΛΛΗ ΣΗΜΑΣΙΑ 2 Bacillus stearothermophilus 3 Xanthomonas badrii 4 Klebsiella pneumoniae 5 Escherichia coli 6 Nocardia corallina 7 Agrobacterium tumefaciens 8 Pseudomonas syringae 9 Saccharomyces cereviciae 10 Arthrobacter luteus 11 Streptomyces albus 12 Thermus aquaticus

13 Β.Μικροσκοπική παρατήρηση µόνιµων παρασκευασµάτων κυττάρων µικροοργανισµών Θα σας δωθούν έτοιµα µόνιµα παρασκευάσµατα (σε αντικειµενοφόρους) διάφορων βακτηρίων και ευκαρυωτικών µικροοργανισµών. Παρατηρείστε στο µικροσκόπιο χρησιµοποιώντας µέχρι και τον 100Χ φακό µε κεδρέλαιο. αα Ονοµασία παρασκευάσµατος ΧΩΡΟΣ- DOMAIN ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 1 Bacterial types ώστε ένα παράδειγµα ενός µικροοργανισµού 2 Bacterial types (Gram stain) ώστε ένα παράδειγµα ενός µικροοργανισµού 3 Plasmodium falciparum Με ποιά ασθένεια συνδέεται ο οργανισµός 4 Yoghurt (Lactobacillus bulgaris και Streptococcus lactis) Ποιους οργανισµούς περιµένετε να περιέχει 5 Spirrilum volutans Πώς διαφέρει µορφολογικά από το E. Coli; Μπορείτε να βρείτε από τον Brock ένα ανθρώπινο παθογόνο µε αντίστοιχη κυτταρική µορφολογία 6 Mixed coccus Πόσες διαφορετικές κυτταρικές µορφολογίες παρατηρείτε; 7 Unstained coccus Πώς θα χρώσει τους οργανισµούς αυτούς η τεχνική Gram 8 Unstained bacillus Τι υποκυτταρικά οργανίδια περιµένετε να βρείτε 9 Clostridium botulinum Με ποια ασθένεια συνδέεται ο οργανισµός 10 Clostridium tetanii Με ποια ασθένεια συνδέεται ο οργανισµός 11 Bacterial capsules Ποια η χηµική σύσταση των καψιδίων αυτών 12 Salmonella Με ποια ασθένεια συνδέεται ο οργανισµός 13 Bacterial flagella combination Σε τι χρησιµεύουν τα εξαρτήµατα αυτά και από που τροφοδοτούνται µε ενέργεια 14 Escherichia coli Αναφέρατε συνοπτικά 5 περιπτώσεις χρήσης

14 -συνεισφοράς του µικροοργανισµού αυτού 15 Bacterial Spores 16 Bacterial Nucleoplasm 17 Mixed Cocus Gram Stained 18 Oral Smear 19 Bacterial, Yeast and Blood ΑΛΛΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ Ιστοσελίδες στο ιαδίκτυο: -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 9.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ -ΒΙΟ111>ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΙΕΥΘΥΝΣΕΙΣ ΣΤΟ ΙΑ ΙΚΤΥΟ> 1,2,3 -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 1,2,3,4,5,7 CD-ROM (Υπολογιστικό Κέντρο-Αίθουσα Υποστήριξης) -Ingraham, Schaechter and Neidhardt, (1997) An Electronic Companion to Beginning Microbiology -Mark L. Wheelis (1996) Microbiology for Majors Electronic Companion ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

15 Ασκηση 4 Αντιβιοτικά/Μηχανισµοί δράσης και αντίστασης Σκοπός της άσκησης αυτής είναι η παρατήρηση της ευαισθησίας διαφόρων µικροβίων σε διάφορα αντιβιοτικά (µε διάφορες συγκεντρώσεις) ιάβασµα Brock: Microbial growth and its control α. Ζώνες παρεµπόδισης (inhibition zones ή halo) βακτηριακής ανάπτυξης 1. Επιστρώστε µε τη γυάλινη ράβδο 100λ από δύο διαφορετικές καλλιέργειες (χωρίς αραίωση) από τα παρακάτω βακτήρια (επιλέξτε όποια θέλετε εσείς) σε 2 τριβλία µε LB. αα Μικροοργανισµός θ (oc) Θρεπτικό Μέσο 1 Psychrobacter imobilis LB 2 Arthrobacter luteus LB 3 Xanthomonas badrii LB 4 Klebsiella pneumoniae LB 5 Escherichia coli, LB 6 Nocardia corallina LB 7 Agrobacterium tumefaciens LB 8 Pseudomonas syringae LB ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ 2. Tοποθετήστε χάρτινους δίσκους εµποτισµένους µε διάφορα αντιβιοτικά πάνω στην επιφάνεια του θρεπτικού µέσου χρησιµοποιώντας αποστειρωµένη λαβίδα (δες διάταξη στο Σχήµα α). Σχήµα α ΙΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Ery Rif Ery Rif Kan Kan Van Αρ. Βακτ. Θ ο C Str Van Αρ. Βακτ. θ ο C Str C m Nal Am p C m Nal Am p Τρυβλίο 1 Τρυβλίο 2 Μετά από ανάπτυξη 2 ηµερών µελετήστε τα χαρακτηριστικά των ζωνών αναστολής γύρω από κάθε εµποτισµένο χάρτινο δίσκο. Σηµειώστε τις παρατηρήσεις σας στον παρακάτω πίνακα. Συµβολίστε την πλήρη αναστολή (άλλως µεγάλης διαµέτρου µε +++ ), τη µερικής έκτασης µε ++, την ελάχιστης έκτασης µε + και την έλλειψη αναστολής µε -. Κατόπιν υπολογίστε µε ένα υποδεκάµετρο το ακριβές µήκος της διαµέτρου της ζώνης αναστολής. Οι ζωνες αναστολής θα φαίνονται στα τριβλία σας όπως σ αυτό της φωτογραφίας

16 Τριβλίο ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟ Rif Kan Str Amp Nal Cm Van Ery 1 ΑΝAΣΤΟΛΗ (+ ή -) 1 d Zων.Aν.(mm) 2 ΑΝAΣΤΟΛΗ (+ ή -) 2 d Zων.Aν.(mm) β. Επίδραση της συγκέντρωσης ενός αντιβιοτικού στη βακτηριακή ανάπτυξη (παρατηρώντας το σχηµατισµό ζωνών παρεµπόδισης ανάπτυξης-zones of inhibition) 1. Επιστρώστε µε τη γυάλινη ράβδο 100ml από βακτηριακή καλλιέργεια ενός από τα 8 βακτήρια του παραπάνω πίνακα σε τριβλία µε LB. Κάθε ένας/µία θα στρώσει ένα τριβλίο µε ένα (οποιοδήποτε) µόνο από τα 8 βακτήρια. 2. Tοποθετήστε χάρτινους δίσκους από διηθητικό χαρτί πάνω στην επιφάνεια του θρεπτικού µέσου (δες σχήµα παρακάτω) χρησιµοποιώντας αποστειρωµένη λαβίδα. Αποστειρώνετε πριν από κάθε χρήση όπως και µε την κεκαµµένη ράβδο χρησιµοποιώντας αιθανόλη. 3. Εµποτίστε κάθε δίσκο µε 5 ml από διάλυµατα αυξανόµενης συγκέντρωσης αντιβιοτικού και έναν δίσκο (µε ρόλο µάρτυρα) µόνο µε αποστειρωµένο νερό. Κάθε ένας θα χρησιµοποιήσει ένα µόνο από τα παρακάτω αντιβιοτικά. Αίθου θέσεις ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟ ΙΣΚ. 1* ΙΣΚ. 2* ΙΣΚ. 3* ΙΣΚ. 4* ΙΣΚ. 5* ΙΣΚ. 6* σα Γ 1-11 Πενικιλλίνη (ή 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 50µg/ml 100µg/ml Αµπικιλλίνη) Γ 12-22 Τετρακυκλίνη 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 25µg/ml 50µg/ml 23-37 Καναµυκίνη 1µg/ml 2.5µg/ml 5µg/ml 10µg/ml 100µg/ml 200µg/ml * ες Σχήµα β στην επόµενη σελίδα. Μετά από ανάπτυξη 2 ηµερών µελετήστε τα χαρακτηριστικά των ζωνών αναστολής γύρω από κάθε εµποτισµένο χάρτινο δίσκο. Σηµειώστε τις παρατηρήσεις σας στον παρακάτω πίνακα. Συµβολίστε την πλήρη αναστολή (άλλως µεγάλης διαµέτρου µε +++ ), τη µερικής έκτασης µε ++, την ελάχιστης έκτασης µε + και την έλλειψη αναστολής µε -. Κατόπιν υπολογίστε µε ένα υποδεκάµετρο το ακριβές µήκος της διαµέτρου της ζώνης αναστολής.

17 Τριβλίο ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟΥ (µg/ml) 1 2.5 1 ΑΝAΣΤΟΛΗ (+ ή -) d Zων.Aν.(mm) 2 ΑΝAΣΤΟΛΗ (+ ή -) d Zων.Aν.(mm) Σχεδιάστε ένα απλό γράφηµα παρουσιάζοντας τις διαµέτρους των ζωνών αναστολής (άξονας Ψ) σε συνάρτηση µε τη συγκέντρωση του αντιβιοτικού (άξονας Χ). 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 γ. Επίστρωση µε λούπα ξανά (µέχρι να µπορούν όλοι οι φοιτητές να αποµονώνουνε µοναδικές αποικίες-κλώνους). ANTIBIOTIKO Chloramphenicol Χλωραµφαινικόλη Streptomycin Στρεπτοµυκίνη Kanamycin Καναµυκίνη Tetracycline Τετρακυκλίνη Penicillin Πενικιλλίνη Vancomycin Βανκοµυκίνη ΡΑΣΗ (δρα πάνω στην 50S υποµονάδα/δρά πάνω στα 70S αλλά όχι στην 80S υποµονάδα /παρεµποδίζει τη δράση πεπτιδυλµεταφεράσης [peptidyltransferase]) (δρα πάνω στην 30S υποµονάδα/το πρώτο αποτελεσµατικό φάρµακο ενάντια στη φυµατίωση/βακτηριοκτόνο/ παρεµοδίζει την έναρξη και την επιµήκυνση της µετάφρασης/µάλλον παρεµποδίζει της θέσεις Α και Ρ/προξενεί λάθος διάβασµα από το ριβόσωµα [misreading]) δες Brock (δρα πάνω στην 30S υποµονάδα/βακτηριοστατικό/δρά πάνω και στο 70S και στα 80S ριβοσώµατα αλλά τα 70S είναι πιιο ευαίσθητα/επιλεκτική προσρόφιση στο βακτηριακό κυτταρικό τοίχωµα/ iπαρεµποδίζει την πρόσδεση των aminoacyltrna στη θέση A/προσδένεται κοντά στην πρωτείνη S7 κοντά στη διάφαση µε την 50S υποµονάδα/δεσµεύει χηλικά Mg++ και Ca++/ αντίσταση προέρχεται από εξειδικευµένες προωτείνες που την αντλούν προς τα έξω χρησιµοποιώντας ενέργεια από το pmf) (παρεποδίζει το σχηµατισµό του κυτταρικού τοιχώµατος- στόχος η τρανσπεπτιδάση [transpeptidase]-παρεµποδίζει το σχηµατισµό χηµικών συνδέσµων στα πολυµερή των ακετυλµουραµικού και ακετυλγλουκοσαµίνης) (µεγάλος αριθµός από αντιβιοτικά συγγενή προς την πενικιλλίνη, π.χ. αµπικιλλίνη και που περιέχουν το δακτύλιο β-λακτάµης έχουν παρασκευαστεί τα τελευταία 40 χρόνια και βρίσκοναι τώρα στην 5η γενιά εξέλιξης) (παρεµποδίζει τη βιοσύνθεση της πεπτιδογλυκάνης στα Gram+ βακτήρια/ δρα πριν τα βιοσυνθετικά ενδιάµεσα που µεταφέρονται από τη βακτοπρενόλη εγκαταλείψουν τη µεµβράνη)

18 Erythromycin (δρα πάνω στην 50S υποµονάδα/ δρά πάνω στα 70S αλλά όχι στα Ερυθροµυκίνη 80S υποµονάδα/δεσµεύεται στη ριβοσωµική πρωτείνη L1/επάγει την πρόωρη ελευθέρωση των peptidyl-trna από τα ριβοσώµατα) Rifamycin Ριφαµυκίνη Nalidixic acid Ναλιδιξικό οξύ δες Brock δες Brock ΑΝΑΡΩΤΙΕΜΑΙ, ΑΡΑ ΥΠΑΡΧΩ Που δρουν (κυτταρικά) οι πενικιλλίνες? Μπορείτε να σκεφτείτε αν το τµήµα εξέλιξης της SmithKlineBeecham έχει λόγους να προτιµά νέα αντιβιοτικά µε τόπο δράσης αντίστοιχο των β-λακταµών έναντι αντιβιοτικών που ανστέλλουν κάποια ενδοκυτταρική λειτουργία? Βρήκατε διαφορετικές µεταλλάξεις που προσδίδουν ανθεκτικότητα στην ερυθροµυκίνη, την στρεπτοµυκίνη και την τερακυκλίνη. Που περιµένετε να βρίσκεται η γενετική πληροφορία που είναι υπεύθυνη? Στο χρωµόσωµα ή σε πλασµίδιο και γιατί? Αποµονώνετε µεταλλαγµένα βακτηριακά στελέχη που είναι ανθεκτικά στo Ναλιδιξικό οξύ (Nalidixic acid). Ποιά πρωτείνη περιµένετε να έχει µετάλλαχθεί και ποιά λειτουργία επιτελεί αυτή η πρωτείνη? Που περιµένετε να βρίσκεται η γενετική πληροφορία που είναι υπεύθυνη? Στο χρωµόσωµα ή σε πλασµίδιο? Πόσους διαφορετικούς µηχανισµούς αντίστασης στα αντιβιοτικά µπορείτε να φανταστείτε; Εξηγείστε. ΑΛΛΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ CD-ROM (Υπολογιστικό Κέντρο-Αίθουσα Υποστήριξης) -Ingraham, Schaechter and Neidhardt, (1997) An Electronic Companion to Beginning Microbiology -Mark L. Wheelis (1996) Microbiology for Majors Electronic Companion ΣΗΜΕ ΙΩΣΕΙΣ

19 Ασκηση 5 Ποσοτική µέτρηση βακτηριακών κυττάρων µε τη µέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων. Ανάπτυξη βακτηριων σε υγρή καλλιέργεια. Καµπύλες ανάπτυξης Σκοπός της άσκησης αυτής είναι α)η εξοικείωση µε τις διαδοχικές αραιώσεις και τη µέτρηση του αριθµού βακτηρίων στην αρχική καλλιέργεια β) η χρήση φασµατοφωτοµέτρου για την παρατήρηση ανάπτυξης βακτηρίων σε υγρή καλλιέργεια ιάβασµα: Brock Από το κεφ. Growth and its control. Effect of environmental factors on growth καιtemperature ιάβασµα: Brock Από το κεφ. Growth and its control.measurement of growth Α. Ποσοτική µέτρηση βακτηριακών κυττάρων µε τη µέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων. Υλικά - Αποστειρωµένοι σωλήνες Eppendorf - Καλλιέργεια E.coli σε υγρό LB - Μικροπιπέττες Gilson (1000ml, 200ml kai 20ml) - Πλαστικές "µύτες"(tips) - Γυάλινα δοχεία µε Αιθανόλη - Κεκαµµένες γυάλινες ράβδοι - Αποστειρωµένο H2O ΕΚΤΕΛΕΣΗ: α. Ξεκινώντας από µία υγρή καλλιέργεια E.coli (δηλαδή αραίωσης 10 0 =1) θα ετοιµάσετε σε σωλήνες Eppendorf τις παρακάτω διαδοχικές αραιώσεις: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 και 10-6 της αρχικής καλλιέργειας προσθέτοντας την κατάλληλη ποσότητα νερού κάθε φορά. Συνολικός τελικός όγκος του αραιωµένου εναιωρήµατος= 1ml. Bακτηριακό Τελική Αραίωση Εναιώρηµα 10 0 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Ογκος καλλιέργειας 10 0 1000µl 100µl Ογκος καλλιέργειας 10-1 100µl Ογκος καλλιέργειας 10-2 100µl Ογκος καλλιέργειας 10-3 100µl Ογκος καλλιέργειας 10-4 100µl Ογκος καλλιέργειας 10-5 100µl Προστιθέµενος Ογκος H2Ο 0µl 900µl 900µl 900µl 900µl 900µl 900µl Αριθµός αποικιών/τριβλίο ΑΝΑΡΩΤΙΕΜΑΙ, ΑΡΑ ΥΠΑΡΧΩ Μπορείτε µε άλλους συνδυασµούς αρχικών συγκεντρώσεων να πετύχετε τις παραπάνω τελικές αραιώσεις; β. Μεταφέρετε µε τη µικροπιπέττα σας 100µl από τις αραιώσεις 10-2, 10-4 και 10-6 σε τριβλία µε LB. γ. Επιστρώστε το υγρό µε κυκλικές οµοοιογενείς κινήσεις σε όλη την επιφάνεια του θρεπτικού µέσου χρησιµοποιώντας τη γυάλινη κεκαµµένη ράβδο. Πριν από κάθε επίστρωση αποστειρώνετε τη ράβδο βουτώντας την στην αιθανόλη και καίγοντας στη φλόγα.

20 Βακτηριακό εναιώρηµα δ. Επωάστε στους 37οC για 12 ώρες. Τα τριβλία µε τις αναπτυγµένες αποικίες θα διατηρηθούν στους 4οC, µέχρι το επόµενο εργαστήριο. ε. Μέτρηση των αποικιών που αναπτύχθηκαν σε κάθε πιάτο και υπολογισµός του αριθµού των βακτηριακών κυττάρων που υπήρχαν σε 1ml της αρχικής καλλιέργειας (στην επόµενη άσκηση). Πόσα βακτήρια βρισκόταν µέσα σε 1ml της αρχικής καλλιέργειας? Β. Ανάπτυξη βακτηριων σε υγρή καλλιέργεια. Καµπύλες ανάπτυξης Ανάπτυξη βακτηρίων σε υγρή καλλιέργεια Καµπύλες ανάπτυξης και µέτρηση οπτικής πυκνότητας σε φασµατοφωτόµετρο και αριθµού βακτηριακών κυττάρων. Χρόνος γενεάς. ιάβασµα: BROCK 7th ed. Chap 9, Growth and its control, 9.1 Cell Growth, 9.2 Population growth, 9.3 Measurement of growth Ενας απλός τρόπος για να παρακολουθήσουµε την ανάπτυξη ενός πλυθυσµού βακτηρίων είναι να µετρήσουµε την αλλαγή της οπτικής πυκνότητας της καλλιέργειας µε ένα φασµατοφωτόµετρο. Καθώς αυξάνεται ο αριθµός των κυττάρων αυξάνεται και η θολότητα (turbidity) της καλλιέργειας και συνεπακόλουθα η διάχυση µιάς δέσµης φωτός που περνά διαµέσου της καλλιέργειας. H αλλαγή µπορεί εποµένως να µετρηθεί ποσοτικά σαν αλλαγή της οπτικής πυκνότητας (optical density) του εναιωρήµατος. Ο χρόνος που απαιτείται για το διπλασιασµό του αρχικού αριθµού των κυττάρων ονοµάζεται χρόνος γενεάς (generation time). Ρυθµός ανάπτυξης (growth rate) ορίζεται ως η αλλαγή της κυτταρικής µάζας στη µονάδα του χρόνου. Στο στάδιο εκείνο της ανάπτυξης που ο αριθµός των κυττάρων διπλασιάζεται στη µονάδα του χρόνου έχουµε εκθετική ανάπτυξη. Μετά από n αριθµούς κυτταρικών διαιρέσεων θα έχετε ένα τελικό αριθµό κυττάρων Ντελικό που θα καθορίζεται από τη σχέση: Ντελικό= Ναρχικό x 2 n H κινητική αύξησης ενός βακτηριακού πληθυσµού είναι εκθετική, δηλαδή: N = N ο 2µt, όπου Nο είναι ο αρχικός αριθµός κυττάρων, N ο αριθµός κυττάρων σε χρόνο t, και µ ο αριθµός διπλασιασµών του πληθυσµού ανά µονάδα χρόνου (t D = 1/µ είναι η διάρκεια µιάς γενιάς). Aυτή η κινητική επιτυγχάνεται µόνο εφόσον όλα τα θρεπτικά συστατικά είναι σε πλήρη επάρκεια. Mε την αύξηση ενός βακτηριακού πληθυσµού, κάποιο συστατικό (συνήθως το οξυγόνο) γίνεται περιοριστικό ή κάποιο τοξικό µεταβολικό προϊόν συσσωρεύεται σε σηµείο που επιβραδύνει την περαιτέρω κυτταρική αύξηση. Tελικά η καλλιέργεια φτάνει σε κορεσµό, όπου τα κύτταρα παύουν να διαιρούνται, αλλά παραµένουν ζωντανά. Για αγρίου τύπου E. coli ο ρυθµός αύξησης (µ) είναι 2.8 διαιρέσεις ανά ώρα κάτω από ιδανικές συνθήκες. Στην πράξη η πυκνότητα µιάς βακτηριακής καλλιέργειας µετριέται µε βάση την οπτική της πυκνότητα σε µήκος κύµατος 550 nm (η απορροφητικότητα αυτή είναι αποτέλεσµα της διάχυσης του φωτός από τα βακτήρια - στην ουσία µετριέται η θολότητα του αιωρήµατος). Xονδρικά 1 OD 550 = 8 x 10 8 κύτταρα/ml, αλλά η ακριβής σχέση διαφέρει από στέλεχος σε στέλεχος. Συνήθως παρουσιάζουµε γραφική παράσταση του logod σε σχέση µε τον χρονο, η οποία είναι ευθεία για την φάση της καλλιέργειας που η αύξηση είναι εκθετική - την αποκαλούµενη λογαριθµική φάση (εκθετική θα ήταν σωστότερο). H ευθεία φτάνει σε πλάτωµα όταν τα βακτήρια σταµατήσουν να διαιρούνται - στατική φάση. Eπί πλέον, µόλις εµβολιαστεί µία

21 καλλιέργεια, τα κύτταρα µπορεί να καθυστερήσουν να φτάσουν στην λογαριθµική φάση - φάση υστέρησης. Aυτή η φάση είναι πιό εµφανής όταν τα βακτήρια µεταφέρονται σε διαφορετικής σύστασης µέσο, στο οποίο πρέπει να προσαρµόσουν τις κυτταρικές τους λειτουργίες. ΠΕΙΡΑΜΑ α. Σας δίνεται αρχική καλλιέργεια από κύτταρα E.coli β. Θα χωριστείτε σε πέντε οµάδες και η κάθε µία θα πάρει µία από τις παρακάτω αραιώσεις αυτής της αρχικής καλλιέργειας (20-30ml, η αραίωση γίνεται µε LB): Οµάδα Α: 1/200 Οµάδα Β: 1/100 Οµάδα Γ: 1/50 Οµάδα : 1/10 γ. Επωάστε τις καλλιέργειες σας και µετρήσετε την οπτική πυκνότητα 1ml δείγµατος κάθε φορά στο φωτόµετρο (στα 550nm, δηλαδή OD550) χρησιµοποιώντας 1ml αµόλυντου υγρού LB σαν µάρτυρα. δ. Επιπροσθετα, από κάθε σηµείο µέτρησης αφαιρέστε µία ποσότητα της καλλιέργειας και αφού κάνετε αραιώσεις 10-4 και 10-6, επιστρώστε µε τη γυάλινη κεκαµµένη ράβδο σε πιάτα µε LB θρεπτικό µέσο. Στην επόµενη άσκηση θα µετρήσετε πόσες αποικίες µεγαλώσανε σε κάθε αραίωση και θα υπολογίσετε έτσι των πραγµατικό αριθµό κυττάρων σε κάθε στάδιο της καµπύλης. ε. Με τις πειραµατικές τιµές κάνετε µία γραφική παράσταση σε απλό µιλιµετρέ χαρτί. Στον άξονα των Χ τοποθετείστε την αλλαγή του χρόνου ενώ στον άξονα των Ψ την αλλαγή της οπτικής πυκνότητας (στο αριστερό µέρος) και του πραγµατικού αριθµού των κυττάρων (στο δεξί µέρος) Αραίωση αρχικής καλλιέργειας: Αριθµός κυττάρων t (min) OD550-4 -6 cfu/ml * 0 30 60 90 120 150 180 *Colony Forming Units/ml ΑΛΛΑ ΒΟΗΘΗΜΑΤΑ Ιστοσελίδες στο ιαδίκτυο: -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 9.ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΣΤΗ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ -ΒΙΟ111>ΧΡΗΣΙΜΕΣ ΙΕΥΘΥΝΣΕΙΣ ΣΤΟ ΙΑ ΙΚΤΥΟ> 1,2,5 -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 1,2,3,6,7 -ΒΙΟ111>ΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ/ΤΑΙΝΙΕΣ> 6.KΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ>δες video µε ανάπτυξη βακτηρίων CD-ROM (Υπολογιστικό Κέντρο-Αίθουσα Υποστήριξης) -Ingraham, Schaechter and Neidhardt, (1997) An Electronic Companion to Beginning Microbiology -Mark L. Wheelis (1996) Microbiology for Majors Electronic Companion ΣΗΜΕΙΩΣΕΙΣ

22 Ε ΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΑΣΚΗΣΕΙΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ (6-10) ΓΕΝΙΚΕΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ Κεντρικός κορµός ενός εργαστηρίου Εισαγωγής στη Βιοχηµεία. Σκοπός των Εργαστηριακών Ασκήσεων της Βιοχηµείας είναι να εξοικειωθείτε µε τα παρακάτω: 1. Ασφάλεια στο Εργαστήριο Βιοχηµείας. 2. Xρήση βασικών οργάνων (phµετρο, φασµατοφωτόµετρο, συσκευή ηλεκτροφόρησης κλπ). 3. Γενικές Βιοχηµικές Τεχνικές. Επιπρόσθετα οι φοιτητές πρέπει να εξοικειωθούν µε άλλες βασικές διαδικασίες όπως: τεκµηρίωση των εργαστηριακών αποτελεσµάτων, παρουσίαση δεδοµενων µε γραφικές παραστάσεις, κριτική ανάλυση και γραπτή επικοινωνία των αποτελεσµάτων. Γενικές πληροφορίες, κανόνες συµπεριφοράς και ασφάλεια στο εργαστήριο Βιοχηµείας 1. Φοράτε πάντα µέσα στην αίθουσα των ασκήσεων την εργαστηριακή σας ποδιά και βγάζετέ την όταν µετακινείστε σε άλλους χώρους! Κάποιο επικίνδυνο αντιδραστήριο µπορεί να πέσει στα ρούχα σας και να τα καταστρέψει. 2. Προσοχή κατά την ώρα των ασκήσεων! Στο εργαστήριο βρίσκονται διάφορα επικίνδυνα χηµικά, τα οποία δεν επιτρέπεται να δοκιµάζονται, να τα µυρίζεστε ή να τα πιάνετε µε γυµνά χέρια. 3. Οχι φαγητό-οχι ποτά-οχι κάπνισµα. Είναι οι καλύτεροι τρόποι για να µεταφέρετε πιθανά παθογόνους µικροοργανισµούς στο σώµα σας! 4. Προσοχή στον τρόπο που χειρίζεστε τα διάφορα όργανα του εργαστηρίου. Αν χαλάσουν δεν είναι πάντα εύκολη η διόρθωση ή η αντικατάστασή τους. 5. Σε ένα βιοχηµικό εργαστήριο χρησιµοποιούνται βιολογικά συστήµατα ως πρώτες ύλες, εποµένως χρειάζεται προσοχή. Να φοράτε γάντια όταν χρειάζεται και να πετάτε τα χρησι- µοποιηµένα δείγµατα σε χλωρίνη και όχι κατευθείαν στο νεροχύτη ή στους κάδους. 6. Να µην κάνετε αυθαιρεσίες, αλλά να ρωτάτε τον υπεύθυνο εργαστηρίου. 7. Να κρατάτε υαλογράφους µαρκαδόρους, ώστε να µπορείτε να σηµειώνετε αν θέλετε κάτι πάνω σε δοκιµαστικούς σωλήνες κλπ