ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA

EN ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA [IVD] For in vitro diagnostic use PRODUCT INSERT [REF] 5152A B2GP1 IgA Antibody ELISA 96 Determinations [REF] 5152G B2GP1 IgG Antibody ELISA 96 Determinations [REF] 5152M B2GP1 IgM Antibody ELISA 96 Determinations INTENDED USE An enzyme linked immunoassay (ELISA) for the qualitative or semi-quantitative detection of IgA, IgG or IgM antibodies to Beta 2 Glycoprotein 1 (B2GP1) in human serum as an aid in diagnosis of autoimmune thrombosis in patients with Systemic Lupus Erythematosus (SLE) or lupus like disorders in conjunction with other laboratory and clinical findings. SUMMARY AND EXPLANATION Antiphospholipid antibodies are a heterogeneous group of autoantibodies against negatively charged phospholipids. 1 They are detected primarily by the anti-cardiolipin antibody (ACA) test, the biological false positive test for syphilis or the lupus anticoagulant test. These three tests detect related, but not necessarily identical antibodies. Thus, more than one of these tests may be necessary to identify antiphospholipid antibodies. Of the various tests for the detection of antiphospholipid antibodies, the anti-cardiolipin antibody test performed by ELISA is the most sensitive. 2 The presence of anti-cardiolipin antibodies helps to identify patients at risk of venous and/or arterial thrombosis often accompanied by thrombocytopenia, a syndrome referred to as antiphospholipid syndrome. 1-12 It most commonly occurs in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) or lupus-like diseases where the criteria for SLE are not fulfilled. 5-7 High levels of anti-cardiolipin antibodies occur in thrombosis, fetal loss, thrombocytopenia and several other disorders. 1-15 Anti-cardiolipin antibodies are routinely detected by ELISA, using cardiolipin as the antigen. Recent observations have indicated that 50kD serum factor is necessary for ACA to bind to cardiolipin. This co-factor was later identified as beta 2 glycoprotein 1 (B2GP1) or synonymously apolipoprotein H. 16-18 Though the function of B2GP1 remains unclear, it is certain that the presence of B2GP1 facilitates the binding of the ACA to cardiolipin. Anti-cardiolipin antibodies, especially at low levels are found in a variety of clinical disorders unrelated to anti-phospholipid syndrome. ACA present in sera of patients with SLE and other autoimmune disorders are immunologically distinct from sera of patients with syphilis. The use of B2GP1 protein as a replacement for cardiolipin antigen on the solid matrix helps to make this distinction. Furthermore, anti-b2gp1 antibodies are very specific for anti-phospholipid syndrome. 1

EN PRINCIPLES OF PROCEDURE The test is performed as a solid phase immunoassay (ELISA) in B2GP1 coated microwells. Controls, Calibrators and patient serum samples are incubated in the antigen coated microwells to allow antibodies present in the serum to bind. Unbound antibody and other serum proteins are removed by washing the microwells. Antibodies bound to the microwells are detected by adding an enzyme labeled anti-human IgG or IgM conjugate to the microwells. These enzyme conjugated antibodies bind specifically to the human immunoglobulin of the appropriate class. Unbound enzyme-labeled conjugate is removed by washing. Specific enzyme substrate (TMB) is then added to the wells and the presence of antibodies is detected by a color change produced by the conversion of the TMB substrate. The reaction is stopped and the intensity of color change, which is proportional to the concentration of antibody, is read by a spectrophotometer at 450 nm. Results are expressed in enzyme units per milliliter (EU/ml). REAGENTS Storage and Preparation Store all reagents at 2 8 C. Do not freeze. Do not use if reagent is not clear or if a precipitate is present. All reagents must be brought to room temperature (20 25 C) prior to use. Reconstitute the wash buffer to 1 liter with distilled or deionized water. When stored at 2 8 C, the reconstituted wash buffer is stable until the kit expiration date. Coated microwell strips are for one time use only. Precautions All human derived components used have been tested for HBsAg, HCV, HIV-1 and 2 and HTLV-I and found negative by FDA required tests. However, human blood derivatives and patient specimens should be considered potentially infectious. Follow good laboratory practices in storing, dispensing and disposing of these materials. 19 Stop Solution is a dilute sulfuric acid solution. Sulfuric acid (H 2SO 4) is poisonous and corrosive. Do not ingest and avoid contact with skin and eyes. Avoid exposure to bases, metals or other compounds that may react with acids. TMB Enzyme Substrate contains an irritant that may be harmful if inhaled, ingested or absorbed through the skin. Do not ingest and avoid contact with skin and eyes. Instructions should be followed exactly as they appear in this kit insert to ensure valid results. Do not interchange kit components with those from other sources. Follow good laboratory practices to minimize microbial and cross contamination of reagents when handling. Do not use kit components beyond expiration date on the labels. Materials provided ImmuLisa B2GP1 IgA Antibody ELISA ImmuLisa B2GP1 IgG Antibody ELISA ImmuLisa B2GP1 IgM Antibody ELISA 2 [REF] 5152A [REF] 5152G [REF] 5152M Kits contains sufficient reagents to perform 96 determinations. 12 x 8 [MICROPLATE B2GP1] Microplate with individual breakaway microwells. Coated with B2GP1 antigen. Ready for use. 1 x 1.75 ml [CONTROL + B2GP1-A] Ready to use Positive Control (red cap) for [REF] 5152A. Contains human serum positive for B2GP1 IgA antibodies. The expected concentration range in EU/ml is printed on the label.

EN 1 x 1.75 ml [CONTROL + B2GP1-G] Ready to use Positive Control (red cap) for [REF] 5152G. Contains human serum positive for B2GP1 IgG antibodies. The expected concentration range in EU/ml is printed on the label. 1 x 1.75 ml [CONTROL + B2GP1-M] Ready to use Positive Control (red cap) for [REF] 5152M. Contains human serum positive for B2GP1 IgM antibodies. The expected concentration range in EU/ml is printed on the label. 1 x 1.75 ml [CONTROL -] Ready to use Negative Control (white cap). Contains human serum. 5 x 1.75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-A] [CALIBRATOR B B2GP1-A] [CALIBRATOR C B2GP1-A] [CALIBRATOR D B2GP1-A] [CALIBRATOR E B2GP1-A] 5 x 1.75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-G] [CALIBRATOR B B2GP1-G] [CALIBRATOR C B2GP1-G] [CALIBRATOR D B2GP1-G] [CALIBRATOR E B2GP1-G] 5 x 1.75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-M] [CALIBRATOR B B2GP1-M] [CALIBRATOR C B2GP1-M] [CALIBRATOR D B2GP1-M] [CALIBRATOR E B2GP1-M] Ready to use set of 5 Calibrators for [REF] 5152M. Calibrator A (green cap) 160 EU/ml, Calibrator B (violet cap) 80 EU/ml, Calibrator C (blue cap) 40 EU/ml, Calibrator D (yellow cap) 20 EU/ml and Calibrator E (orange cap) 1 EU/ml. Derived from human serum containing B2GP1 IgA antibodies. Concentrations in EU/ml are printed on the labels. Ready to use set of 5 Calibrators for [REF] 5152G. Calibrator A (green cap) 160 EU/ml, Calibrator B (violet cap) 80 EU/ml, Calibrator C (blue cap) 40 EU/ml, Calibrator D (yellow cap) 20 EU/ml and Calibrator E (orange cap) 1 EU/ml. Derived from human serum containing B2GP1 IgG antibodies. Concentrations in EU/ml are printed on the labels. Ready to use set of 5 Calibrators for [REF] 5152M. Calibrator A (green cap) 160 EU/ml, Calibrator B (violet cap) 80 EU/ml, Calibrator C (blue cap) 40 EU/ml, Calibrator D (yellow cap) 20 EU/ml and Calibrator E (orange cap) 1 EU/ml. Derived from human serum containing B2GP1 IgM antibodies. Concentrations in EU/ml are printed on the labels. 1 x 15 ml [IgA-CONJ HRP] HRP goat anti-human IgA Conjugate for [REF] 5152A. Ready for use. Color coded clear. 1 x 15 ml [IgG-CONJ HRP] HRP goat anti-human IgG Conjugate for [REF] 5152G. Ready for use. Color coded pink. 1 x 15 ml [IgM-CONJ HRP] HRP goat anti-human IgM Conjugate for [REF] 5152M. Ready for use. Color coded clear. 1 x 60 ml [DIL Serum Diluent. Ready for use. Color coded purple. 1 x 15 ml [SUBSTRATE TMB] TMB enzyme substrate. Ready for use. Protect from light. 1 x 15 ml [STOP H2SO4] Stop Solution. Ready for use. 2 x vials [BUF WASH] Powder Wash Buffer. Reconstitute to one liter each. 1 x Protocol Sheets 3

EN Optional Components 1 x 60ml [BUF WASH] Liquid concentrated Wash Buffer. Reconstitute to one liter. Symbols used on labels [LOT] Lot number [REF] Catalog number [IVD] In vitro diagnostic use e Use by t Storage temperature! Read instructions before use s Number of tests Manufacturer Materials Required But Not Provided Deionized or distilled water Squeeze bottle to hold diluted wash buffer Pipettes capable of delivering 5 µl to 1000 µl Disposable pipette tips Clean test tubes 12 x 75 mm and test tube rack Timer Absorbent paper towels Microplate reader capable of reading absorbance values at 450 nm. If dual wavelength microplate reader is available, the reference filter should be set at 600 650 nm Automatic microplate washer capable of dispensing 200 µl SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING Only serum specimens should be used in this procedure. Grossly hemolyzed, lipemic or microbially contaminated specimens may interfere with the performance of the test and should not be used. Store specimens at 2 8 C for no longer than one week. For longer storage, serum specimens should be frozen. Avoid repeated freezing and thawing of samples. PROCEDURE Procedural Notes Carefully read the product insert before starting the assay. Let patient specimens and test reagents equilibrate to room temperature before starting with the test procedure. Return all unused specimens and reagents to refrigerator immediately after use. Remove required microwell strips from the pouch and carefully reseal the pouch to prevent condensation in the unused wells. Return pouch immediately to refrigerator. All dilutions of the patient samples should be prepared prior to starting with the assay. 4

EN Good washing technique is critical. If washing is performed manually, adequate washing is accomplished by directing a forceful stream of wash buffer with a wide tip wash bottle across the entire microplate. An automated microplate washer is recommended. Use a multichannel pipette capable of delivering 8 or 12 wells simultaneously. This speeds the process and provides more uniform incubation times. For all steps, careful control of timing is important. The start of all incubation periods begins with the completion of reagent addition. Addition of all samples and reagents should be performed at the same rate and in the same sequence. Test Method Step 1 Step 2 Step 3 Let all reagents and specimens equilibrate to room temperature. Label protocol sheet to indicate sample placement in the wells. It is good laboratory practice to run samples in duplicate. For a qualitative determination use Calibrator D (vial with yellow cap) only. or For a semi-quantitative determination use Calibrators A through E as depicted in the sample layout below. Qualitative Semi-Quantitative A Blank S5 Etc. A Blank S1 Etc. B -Control S6 B -Control S2 C +Control S7 C +Control S3 D Cal D S8 D Cal A S4 E S1 S9 E Cal B S5 F S2 S10 F Cal C S6 G S3 S11 G Cal D S7 H S4 S12 H Cal E S8 1 2 3 1 2 3 Step 4 Step 5 Step 6 Step 7 Prepare a 1:101 dilution of the patient samples by mixing 5 µl of the patient sera with 500ul of Serum Diluent. Remove the required microwells from pouch and return unused strips in the sealed pouch to refrigerator. Securely place the microwells into the extra provided holder. Pipette 100 µl of Ready to use Calibrators, Positive and Negative controls and diluted patient samples (1:101) to the appropriate microwells as per protocol sheet. Note: Include one well which contains 100 µl of the Serum Diluent as a reagent blank. Zero the ELISA reader against the reagent blank. Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature. 5

EN Step 8 Step 9 Step 10 Wash 4x with wash buffer. For manual washing, fill each microwell with reconstituted wash buffer. Discard the fluid by inverting and tapping out the contents of each well or by aspirating the liquid from each well. To blot at the end of the last wash, invert strips and tap the wells vigorously on absorbent paper towels. For automatic washers, program the washer as per manufacturer s instructions. Pipette 100 µl of Conjugate into microwells. Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature. Step 11 Wash all microwells as in Step 8. Step 12 Step 13 Step 14 Step 15 Quality Control Pipette 100 µl of Enzyme Substrate into each microwell in the same order and timing as for the Conjugate. Incubate 30 minutes (± 5 min) at room temperature. Pipette 100 µl of Stop Solution into each microwell using the same order and timing as for the addition of the Enzyme Substrate. Read absorbance values within 30 minutes of adding Stop Solution. Read absorbance of each microwell at 450 nm using a single or at 450/630nm using a dual wavelength microplate reader against the reagent blank set at zero absorbance. Calibrators, Positive and Negative Controls and a reagent blank must be run with each assay to verify the integrity and accuracy of the test. The absorbance reading of the reagent blank should be <0.3. Calibrator A should have an absorbance reading of not less than 1.0, otherwise the test must be repeated. The Negative Control must be <10 EU/ml. If the test is run in duplicate, the mean of the two readings should be taken for determining EU/ml. When performing qualitative determinations, the optical density of Calibrator D must be greater than that of the Negative Control and less than the absorbance of the Positive Control. For semi-quantitative determinations, the Positive Control must give values in the range stated on the vial. RESULTS Calculations The concentrations of the patient samples can be determined by either of two methods: 1. QUALITATIVE DETERMINATION Abs. of Test Sample ---------------------------- X EU/ml of Calibrator D = EU/ml Test Sample Abs. of Calibrator D It is recommended that qualitative results be reported as positive or negative. Sample results greater than or equal to Calibrator D are considered positive. 2. SEMI-QUANTITATIVE DETERMINATION Plot the absorbance of Calibrator A through E against their respective concentrations on linear-log graph paper. Plot the concentrations in U/ml on the X-axis against the absorbance on the Y-axis and draw a point-to-point curve fit. Determine the concentrations of the patient samples from the curve according to corresponding absorbance values. Alternately, a four parameter curve may be used to plot the standard curve. 6

EN It is recommended that semi-quantitative results be reported as positive, negative, or indeterminate with EU/ml unit values. Indeterminate/borderline results should be retested and evaluated along with other laboratory methods, as indicated in Limitations of Procedure. Interpretation Interpretation values were determined by testing normal blood donors and nonantiphospholipid syndrome disease control specimens (IgA=220, IgG n=150, IgM n=152). The mean of these subjects plus 2.5 SD for IgA and 3 SD was established as the assay cutoff in each case and assigned an arbitrary value of 20 EU/ml. The following information serves only as a guide in the interpretation of the laboratory results. Each laboratory must determine its own normal values. B2GP1 Ab value Interpretation <20 EU/ml Negative 20 25 EU/ml Borderline/Indeterminate >25 EU/ml Positive Calibrator The Ready to Use Calibrators are included to provide semi-quantitation and must be used with each run. Patient samples containing high antibody levels may give absorbance values greater than that of Calibrator A. For determining accurate semiquantitative values, such specimens should be further diluted so they fall within the range of the calibrator curve when retested. For determining EU/ml values, multiply the units obtained by the dilution factor. LIMITATIONS OF PROCEDURE The ImmuLisa B2GP1 Antibody test should not be performed on grossly hemolyzed, microbially contaminated or lipemic samples. This method should be used for testing human serum samples only. Furthermore, a diagnosis cannot be made on the basis of anti-b2gp1 results alone. The results of other laboratory tests and clinical findings must be considered. When a negative anti-b2gp1 test occurs in the presence of clinical indications, a lupus anticoagulant test or other additional testing is recommended. EXPECTED VALUES AND SUMMARY OF CLINICAL STUDIES The incidence of B2GP1 antibodies in SLE with thrombosis and pregnancy is summarized in the following table: Incidence of ACA and Anti ß2-GP1 Antibodies in SLE 17 SLE ACA B2GP1 Ab IgG % IgM % IgA % IgG % IgM % IgA % with thrombosis 24 14 10 27 14 2 no thrombosis 8 5 2 10 3 4 In pregnancy with recurrent fetal loss 20 0 11 27 0 44 no fetal loss 11 7 3 14 7 13 7

EN Sets of clinical samples were tested on the ImmuLisa B2GP1 IgG and IgM Antibody ELISAs Results demonstrating incidence in the populations are provided below: B2GP1 IgA B2GP1 IgG B2GP1 IgM Patient Group # / # pos / % # / # pos / % # / # pos / % SLE subject ACA Positive 63 / 61 / 96.8% 73 / 68 / 93.2% 74 / 66 / 89.2% SLE subject ACA Negative 31 / 1 / 3% 31 / 3 / 9.7% 31 / 0 / 0% Syphilis 36 / 0 / 0% 36 / 0 / 0% 36 / 0 / 0% Rheumatoid Arthritis 20 /1 / 5% 20 / 2 / 10% 20 / 0 / 0% Other AI Diseases 40 / 2 / 5% 40 / 0 / 0% 40 / 3 / 7.5% Normals 100 / 1 / 1% 100 / 1 / 1% 100 / 0 / 0% PERFORMANCE CHARACTERISTICS The utility of the ImmuLisa B2GP1 IgA, IgG and IgM Antibody ELISAs for the detection of B2GP1 IgA, IgG and IgM antibodies were evaluated by testing well-characterized serum specimens from cardiolipin antibody positive systemic lupus erythematosus (SLE) subjects alongside disease controls and normal human sera. These specimens were also tested on commercially available test kits. Only specimens in the linear range of the assay were included in the method comparison. These results are summarized below. A. ImmuLisa B2GP1 IgA, IgG and IgM Antibody ELISAs were tested in comparison with other B2GP1 IgG and IgM Antibody kits: Other B2GP1 IgA Ab ELISA Positive Negative Total IMMCO Positive 48 0 48 B2GP1 Ab Negative 13 40 53 IgA ELISA Total 61 40 101 Positive Percent Agreement: 78.7% (95% CI 66.0% 87.7%) Negative Percent Agreement: 100% (95% CI 89.1% 100%) Overall Percent Agreement: 87.1% (95% CI 78.6% 92.7%) Disease associated subjects: 63 Disease controls: 38 Healthy normal subjects: 80 Other B2GP1 IgG Ab ELISA Positive Negative Total IMMCO Positive 55 3 58 B2GP1 Ab Negative 4 103 107 IgG ELISA Total 59 106 165 Positive Percent Agreement: 93.2% (95% CI 82.7% 97.8%) Negative Percent Agreement: 97.2% (95% CI 91.3% 99.3%) Overall Percent Agreement: 95.8% (95% CI 91.1% 98.1%) Disease associated subjects: 70 Disease controls: 24 Healthy normal subjects: 71 8

EN Other B2GP1 IgM Ab ELISA Positive Negative Total IMMCO Positive 76 0 76 B2GP1 Ab Negative 5 74 79 IgM ELISA Total 81 74 155 Positive Percent Agreement: 93.8% (95% CI 79.0% 94.8%) Negative Percent Agreement: 100% (95% CI 93.9% 100%) Overall Percent Agreement: 96.8% (95% CI 89.2% 97.5%) Cardiolipin antibody positive SLE subjects: 76 Disease controls: 21 Healthy normal subjects: 58 B. Cross Reactivity: A total of 50 potentially cross-reactive specimens from individuals with other autoimmune disorders or positive for other autoantibodies were tested for B2GP1 antibodies using the ImmuLisa B2GP1 IgG and IgM Antibody ELISAs. Condition n IgA Positive IgG Positive IgM Positive Antinuclear Ab (ANA) + 10 0 0 1 Hashimoto s Disease 20 0 0 0 Rheumatoid Arthritis 20 1 2 0 Total 50 1 (2%) 2 (4%) 1 (2%) Precision Precision was tested with multiple specimens selected throughout the range of the assay. Three assay runs were performed on different days to determine results between days. An additional run of ten replicates was performed to determine repeatability. Results are summarized below. Within run B2GP1 IgA Total Imprecision Between days (Repeatability) Mean SD SD SD Sample (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 6.8 0.655 9.6% 0.669 9.8% 0.6 8.5% 2 15.3 1.014 6.6% 1.054 6.9% 0.7 4.5% 3 25.1 1.702 6.8% 1.701 6.8% 1.7 6.5% 4 56.9 2.079 3.7% 1.939 3.4% 0.9 1.6% 5 99.8 4.288 4.3% 3.770 3.7% 2.6 2.7% 6 146.2 8.548 5.8% 7.053 4.8% 7.6 5.7% 9

EN 10 Within run B2GP1 IgG Total Imprecision Between days (Repeatability) Mean SD SD SD Sample (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 15.63 0.649 4.2% 0.575 3.6% 0.546 3.6% 2 19.67 1.248 6.3% 1.576 8.0% 0.941 4.8% 3 24.19 1.262 5.2% 1.245 5.1% 1.292 5.4% 4 35.29 1.057 3.0% 1.291 3.7% 0.592 1.7% 5 96.76 2.431 2.5% 2.233 2.3% 2.557 2.6% 6 147.08 3.043 2.1% 3.496 2.4% 1.720 1.2% Within run B2GP1 IgM Total Imprecision Between days (Repeatability) Mean SD SD SD Sample (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 16.42 0.660 4.0% 0.667 4.1% 0.681 4.1% 2 23.08 1.121 4.9% 1.497 6.5% 0.719 3.1% 3 25.22 0.890 3.5% 1.032 4.1% 0.688 2.7% 4 46.53 1.816 3.9% 1.714 3.7% 1.984 4.3% 5 173.82 4.276 2.5% 4.944 2.8% 3.827 2.2% 6 277.47 5.371 1.9% 5.876 2.1% 5.001 1.8% Linearity and Recovery Linearity and recovery were tested by diluting positive specimens through the assay range in equidistant dilutions and comparing actual vs. expected results. The linear range of the IgA assay was determined to be 3.8 160 EU/ml. The linear range of the IgG assay was determined to be 2.2 160 EU/ml. The linear range of the IgM assay was determined to be 5.3 160 EU/ml. Results are summarized below: Sample IgA 1 3.8 17.8 IgA 2 11.0 63.9 Test Range (EU/ml Slope Y Intercept R 2 % Recovery IgA 3 59.0 222.7 IgG 1 3.3 165.1 IgG 2 3.2 76.7 IgG 3 4.1 140.9 IgM 1 5.4 87.5 IgM 2 22.9 151.2 IgM 3 6.2 44.4 1.06 (0.878 1.236) 1.05 (0.966 1.136) 0.95 (0.826 1.065) 1.015 (0.921 1.109) 1.003 (0.922 1.085) 1.032 (0.931 1.133) 1.016 (0.934 1.097) 0.993 (0.945 1.041) 0.993 (0.952 1.034) -0.78 (-2.833 1.364) -0.8 (-4.156 2.616) 12.02 (-5.68 29.67) 7.233 (-1.708 16.175) 2.949 (-0.630 6.527) 4.125 (-3.874 12.125) 2.27 (-1.89 6.43) -0.650 (-5.313 4.014) 0.880 (-0.240 2.000) 0.97 88 112 0.99 95 107 0.98 95 111 0.99 82.3 100 0.99 82.6 100 0.99 86.2 100 0.99 88.8 100 1.00 85.8 109.8 1.00 92.3 98.5

EN Limit of Detection The limits of detection (LoD) for these assays were determined to be 5.3 EU/ml for IgA, 2.2 EU/ml for IgG and 5.3 EU/ml for IgM based on 60 replicates of the blank and 10 replicates each of 6 low-level (NHS) samples. Reproducibility Ten assays of samples in the low negative range, in the moderate positive range for each B2GP1 isotype and approximately +/- 20% of the assay cutoffs for each B2GP1 isotype were performed to determine qualitative reproducibility. Assay results for these specimens produced 100% qualitative agreement. Interference Interference was studied by mixing sera with known B2GP1 levels for each isotype with potentially interfering serum samples and studying deviation from expected results. No significant interference was demonstrated for the following substances at the levels indicated: Hemoglobin (2 g/l), Bilirubin (342 μmol/l), Rheumatoid Factor (100 EU/ml), Triglycerides (37 mmol/l), and Cholesterol (13 mmol/l). 11

EL ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA [IVD] Για in vitro διαγνωστική χρήση ΕΝΘΕΤΟ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ [REF] 5152A B2GP1 IgA Antibody ELISA 96 Προσδιορισμοί [REF] 5152G B2GP1 IgG Antibody ELISA 96 Προσδιορισμοί [REF] 5152M B2GP1 IgM Antibody ELISA 96 Προσδιορισμοί ΣΚΟΠΟΥΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Ανοσοενζυμική δοκιμασία (ELISA) για την ποιοτική ή ημιποσοτική ανίχνευση αντισωμάτων IgA, IgG ή IgM σε Βήτα 2 Γλυκοπρωτεΐνη 1 (B2GP1) σε ανθρώπινο ορό ως βοήθημα στη διάγνωση αυτοάνοσης θρόμβωσης σε ασθενείς με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (SLE) ή διαταραχές τύπου-λύκου σε συνδυασμό με άλλα εργαστηριακά και κλινικά ευρήματα. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ Τα αντιφωσφολιπιδικά αντισώματα είναι μια ετερογενής ομάδα αυτοαντισωμάτων έναντι αρνητικά φορτισμένων φωσφολιπιδίων. 1 Ανιχνεύονται πρωτίστως από την δοκιμασία αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων (ACA), η ψευδώς-θετική δοκιμασία για σύφιλη ή η δοκιμασία αντιπηκτικού λύκου. Αυτές οι τρεις δοκιμασίες ανιχνεύουν σχετικά, αλλά όχι απαραίτητα όμοια αντισώματα. Έτσι, περισσότερες από μία από αυτές της δοκιμασίες μπορεί να είναι απαραίτητες για την εξακρίβωση αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων. Από τις διάφορες δοκιμές για την ανίχνευση των αντιφωσφολιπιδικών αντισωμάτων, η δοκιμή αντισώματος καρδιολιπίνης που εκτελέστηκε από την μέθοδο ELISA είναι η πιο ευαίσθητη. 2 Η παρουσία αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων βοηθά στην εξακρίβωση ασθενών με κίνδυνο φλεβικής και/ή αρτηριακής θρόμβωσης που συχνά συνοδεύεται από θρομβοπενία, σύνδρομο που αναφέρεται ως αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο. 1-12 Πιο συχνά παρατηρείται σε ασθενείς με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (SLE) ή νόσους τύπου λύκου όπου τα κριτήρια για SLE δεν πληρούνται. 5-7 Υψηλά επίπεδα αντικαρδιολιπινικών αντισωμάτων παρατηρούνται στη θρόμβωση, την απώλεια εμβρύου, τη θρομβοπενία και αρκετές άλλες διαταραχές. 1-15 Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα συνήθως ανιχνεύονται από την μέθοδο ELISA, χρησιμοποιώντας καρδιολιπίνη ως αντίγονο. Πρόσφατες παρατηρήσεις έχουν δείξει ότι παράγοντας ορού 50kD είανι απαραίτητος για να δεσμευθούν τα ACA στην καρδιολιπίνη. Αυτός ο συμπαράγοντας εξακριβώθηκε στη συνέχεια ως βήτα 2 γλυκοπρωτεΐνη 1 (B2GP1) ή σνώνυμα αλιποπρωτεΐνη H. 16-18 Αν και η λειτουργία της B2GP1 παραμένει ασαφής, είναι σίγουρο ότι η παρουσία της B2GP1 διευκολύνει τη δέσμευση των ACA στην καρδιολιπίνη. Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα, ειδικά σε χαμηλά επίπεδα διαπιστώνονται σε μια ποικιλία κλινικών διαταραχών που δεν σχετίζονται με το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο. ACA παρόντα σε ορό ασθενών με Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (SLE) και άλλες αυτοάνοσες διαταραχές είναι ανοσολογικά διακριτά από ορούς ασθενών με σύφιλη. Η χρήση της πρωτεΐνης B2GP1 ως υποκατάστατο για το καρδιολιπινικό αντιγόνο στην στερεά μήτρα βοηθά να πραγματοποιείται αυτή η διάκριση. Επιπλέον, τα αντισώματα αντι-b2gp1 είναι πολύ συγκεκριμένα για το αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο. 12

EL ΑΡΧΕΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία εκτελείται ως στερεά φάση ανοσοβιολογικής δοκιμασίας (ELISA) σε βυθίσματα επενδεδυμένα με B2GP1. Έλεγχος, βαθμονομητής και δείγματα ορού ασθενών επωάζονται στα επενδεδυμένα βυθίσματα αντιγόνου επιτρέποντας σε συγκεκριμένα αντισώματα παρόντα στον ορό για να δεσμεύουν το αντιγόνο. Το αδέσμευτο αντίσωμα και άλλες πρωτεΐνες ορού αφαιρούνται με την πλύση των βυθισμάτων. Αντισώματα δεσμευμένα στα βυθίσματα ανιχνεύονται με την προσθήκη σύζευξης ανθρώπινης αντί-ανοσοσφαιρίνης IgG ή IgM με ενζυμική σήμανση στα βυθίσματα. Αυτά τα συζευγμένα με ένζυμο αντισώματα δεσμεύονται ειδικά στην ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη της αντίστοιχης τάξης. Η αδέσμευτη σύζευξη με ενζυμική σήμανση απομακρύνεται με την πλύση. Συγκεκριμένο υπόστρωμα ενζύμου (TMB) προστίθεται στη συνέχεια στις κοιλότητες και η παρουσία αντισωμάτων ανιχνεύεται με χρωματική αλλαγή που παράγεται από την μετατροπή του υποστρώματος TMB. Η αντίδραση διακόπτεται και η ακεραιότητα της χρωματικής αλλαγής, η οποία είναι ανάλογη με την πυκνότητα του αντισώματος, διαβάζεται με ένα φασματοφωτόμετρο στα 450 nm. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σε ενζυμικές μονάδες ανά χιλιοστόλιτρο (EU/mI). ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Αποθήκευση και Προετοιμασία Αποθηκεύστε όλα τα αντιδραστήρια στους 2 8 C. Μην καταψύχετε. Μην χρησιμοποιείτε αν το αντιδραστήριο δεν είναι διαυγές ή υπάρχει ίζημα παρόν. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου (20 25 C) πριν τη χρήση. Ανασυνθέστε το διάλυμα πλύσης στο 1 λίτρο με απεσταγμένο ή απιοντισμένο νερό. Όταν αποθηκεύεται στους 2 8 C, το ανασυσταθέν διάλυμα πλύσης παραμένει σταθερό έως την ημερομηνία λήξης του κιτ. Οι λωρίδες επενδεδυμένων βυθισμάτων προορίζονται για χρήση μιας μόνο φοράς. Προφυλάξεις Όλα τα συστατικά που χρησιμοποιήθηκαν, τα προερχόμενα από τον άνθρωπο, έχουν δοκιμαστεί για HBsAg, HCV, HIV-1 και 2 και HTLV-I και βρέθηκαν αρνητικά από δοκιμασίες που απαιτούνται από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA). Ωστόσο, παράγωγα ανθρώπινου αίματος και δείγματα ασθενών θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Τηρείτε τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές για την αποθήκευση, χορήγηση και διάθεση αυτών των υλικών. 19 Το Διάλυμα Παύσης είναι διάλυμα αραιωμένου θειικού οξέως. Το θειικό οξύ (H 2SO 4) είναι δηλητηριώδες και διαβρωτικό. Μην το φάτε και αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια. Αποφύγετε τη έκθεση σε βάσεις, μέταλλα ή άλλες ενώσεις που μπορεί να αντιδρούν με οξέα. Το Υπόστρωμα Ενζύμου TMB περιέχει μια ερεθιστική ουσία που μπορεί να είναι επιβλαβής αν την εισπνεύσετε, την φάτε ή απορροφηθεί μέσω του δέρματος. Μην το φάτε και αποφύγετε την επαφή με το δέρμα και τα μάτια. Οι οδηγίες θα πρέπει να τηρούνται ακριβώς όπως εμφανίζονται στο ένθετο του παρόντος κιτ για να διασφαλιστούν έγκυρα αποτελέσματα. Μην εναλλάσσετε στοιχεία του κιτ με εκείνα από άλλες πηγές. Τηρήστε τις ορθές εργαστηριακές πρακτικές για να ελαχιστοποιήσετε μικροβιακή και αλληλο-μόλυνση αντιδραστηρίων κατά τον χειρισμό. Μην χρησιμοποιείτε στοιχεία του κιτ μετά την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στις ετικέτες. Υλικά που παρασχέθηκαν ImmuLisa B2GP1 IgA Antibody ELISA ImmuLisa B2GP1 IgG Antibody ELISA ImmuLisa B2GP1 IgM Antibody ELISA [REF] 5152A [REF] 5152G [REF] 5152M 13

EL Το κιτ περιέχει επαρκή αντιδραστήρια για την εκτέλεση 96 προσδιορισμών. 12 x 8 [MICROPLATE B2GP1] Μικροπλάκα με ατομικά βυθίσματα εκκίνησης (breakaway microwells). Επενδεδυμένη με αντιγόνο B2GP1. Έτοιμη προς χρήση. 1 x 1,75 ml CONTROL + B2GP1-A] Έτοιμος προς χρήση Θετικός Έλεγχος (Positive Control) (κόκκινο πώμα) για [REF] 5152A. Περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώμματα B2GP1 IgA. Το εύρος αναμενόμενης πυκνότητας σε EU/ml αναγράφεται στην ετικέτα. 1 x 1,75 ml [CONTROL + B2GP1-G] Έτοιμος προς χρήση Θετικός Έλεγχος (Positive Control) (κόκκινο πώμα) για [REF] 5152G. Περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώμματα B2GP1 IgG. Το εύρος αναμενόμενης πυκνότητας σε EU/ml αναγράφεται στην ετικέτα. 1 x 1,75 ml [CONTROL + B2GP1-M] Έτοιμος προς χρήση Θετικός Έλεγχος (Positive Control) (κόκκινο πώμα) για [REF] 5152M. Περιέχει ανθρώπινο ορό θετικό για αντισώματα B2GP1 IgM. Το εύρος αναμενόμενης πυκνότητας σε EU/ml εμφανίζεται στην ετικέτα. 1 x 1,75 ml [CONTROL -] Έτοιμος προς χρήση Αρνητικός Έλεγχος (Negative Control) (λευκό πώμα). Περιέχει ανθρώπινο ορό. 5 x 1,75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-A] [CALIBRATOR B B2GP1-A] [CALIBRATOR C B2GP1-A] [CALIBRATOR D B2GP1-A] [CALIBRATOR E B2GP1-A] 5 x 1,75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-G] [CALIBRATOR B B2GP1-G] [CALIBRATOR C B2GP1-G] [CALIBRATOR D B2GP1-G] [CALIBRATOR E B2GP1-G] 5 x 1,75 ml [CALIBRATOR A B2GP1-M] [CALIBRATOR B B2GP1-M] [CALIBRATOR C B2GP1-M] [CALIBRATOR D B2GP1-M] [CALIBRATOR E B2GP1-M] Έτοιμο προς χρήση σετ 5 Βαθμονομητών για [REF] 5152M. Βαθμονομητής A (πράσινο πώμα) 160 EU/ml, Βαθμονομητής B (ιώδες πώμα) 80 EU/ml, Βαθμονομητής Γ (μπλε πώμα) 40 EU/ml, Βαθμονομητής Δ (κίτρινο πώμα) 20 EU/ml και Βαθμονομητής Ε (πορτοκαλί πώμα) 1 EU/ml. Προερχόμενα από ανθρώπινο ορό που περιέχει αντισώματα B2GP1 IgA. Οι συγκεντρώσεις σε EU/ml αναγράφονται στις ετικέτες. Έτοιμο προς χρήση σετ 5 Βαθμονομητών για [REF] 5152G. Βαθμονομητής Α (πράσινο πώμα) 160 EU/ml, Βαθμονομητής Β (μωβ πώμα) 80 EU/ml, Βαθμονομητής Γ (μπλε πώμα) 40 EU/ml, Βαθμονομητής Δ (κίτρινο πώμα) 20 EU/ml και Βαθμονομητής Ε (πορτοκαλί πώμα) 1 EU/ml. Προερχόμενα από ανθρώπινο ορό που περιέχει αντισώματα B2GP1 IgG. Συγκεντρώσεις σε EU/ml αναγράφονται στις ετικέτες. Έτοιμο προς χρήση σετ 5 Βαθμονομητών για [REF] 5152M. Βαθμονομητής Α (πράσινο πώμα) 160 EU/ml, Βαθμονομητής Β (μωβ πώμα) 80 EU/ml, Βαθμονομητής Γ (μπλε πώμα) 40 EU/ml, Βαθμονομητής Δ (κίτρινο πώμα) 20 EU/ml και Βαθμονομητής Ε (πορτοκαλί πώμα) 1 EU/ml. Προερχόμενα από ανθρώπινο ορό που περιέχει αντισώματα B2GP1 IgM. Συγκεντρώσεις σε EU/ml αναγράφονται στις ετικέτες. 1 x 15 ml [IgA-CONJ HRP] Σύζευξη ορού ανθρώπινης αντι-ανοσοσφαιρίνης G από υπεροξειδάση από ραφανίδα για [REF] 5152A. Έτοιμη προς χρήση. Κωδικοποιημένο με διάφανο χρώμα. 14

EL 1 x 15 ml [IgG-CONJ HRP] Σύζευξη ορού ανθρώπινης αντι-ανοσοσφαιρίνης IgG από υπεροξειδάση από ραφανίδα. (HRP goat anti-human IgG Conjugate) για [REF] 5152G. Έτοιμη προς χρήση. Κωδικοποιημένη με ροζ χρώμα. 1 x 15 ml [IgM-CONJ HRP] Σύζευξη ορού ανθρώπινης αντι-ανοσοσφαιρίνης IgM από υπεροξειδάση από ραφανίδα. (HRP goat anti-human IgG Conjugate) για [REF] 5152M. Έτοιμη προς χρήση. Κωδικοποιημένη με μωβ χρώμα. 1 x 60 ml [DIL Αραιωτικό ορού (Serum Diluent). Έτοιμο προς χρήση. Κωδικοποιημένο με μωβ χρώμα. 1 x 15 ml [SUBSTRATE TMB] Ενζυμο-υπόστρωμα τετραμεθυλοβενζιδίνης (TMB enzyme substrate). Έτοιμο προς χρήση. Προστατέψτε από το φως. 1 x 15 ml [STOP H2SO4] Διάλυμα παύσης (Stop Solution). Έτοιμο προς χρήση. 2 x vials [BUF WASH] Διάλυμα Πλύσης σε μορφή Σκόνης (Powder Wash Buffer). Ανασυνθέστε στο ένα λίτρο έκαστο. 1 x Φύλλα Πρωτοκόλλου Προαιρετικά Συστατικά 1 x 60 ml [BUF WASH] Υγρό Συμπυκνωμένο Διάλυμα Πλύσης. Ανασυνθέστε στο ένα λίτρο. Σύμβολα που χρησιμοποιούνται σε ετικέτες [LOT] [REF] Αριθμός παρτίδας Αριθμός καταλόγου [IVD] In vitro διαγνωστική χρήση e Χρήση από t Θερμοκρασία αποθήκευσης! Διαβάστε οδηγίες πριν τη χρήση s Αριθμός δοκιμών Κατασκευαστής Υλικά Που Απαιτούνται Αλλά Δεν Παρέχονται Απιοντισμένο ή απεσταγμένο νερό Εύκαμπτο πλαστικό μπουκάλι για το αραιωμένο διάλυμα πλύσης Πιπέτες ικανές να απελευθερώνουν 5 µl έως 1.000 µl Ρύγχη πιπετών (pipette tips) μιας χρήσεως Καθαροί δοκιμαστικοί σωλήνες 12 x 75 mm και στηρίγματα δοκιμαστικών σωλήνων Χρονομέτρης Απορροφητικές χάρτινες χειροπετσέτες 15

EL Αναγνώστης μικροπλάκας ικανός για την ανάγνωση τιμών απορροφητικότητας στα 450 nm. Εάν είναι διαθέσιμος αναγνώστης μικροπλάκας διπλού μήκους κύματος, το φίλτρο αναφοράς θα πρέπει να οριστεί στα 600-650 nm Αυτόματο πλυντήριο μικροπλάκας ικανό να διανέμει 200 µl ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΧΕΙΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Μόνον δείγματα ορού θα πρέπει να χρησιμοποιούνται σ αυτήν τη διαδικασία. Aιμολυμένα, λιπαιμικά ή βακτηριδιακά επιμολυσμένα δείγματα μπορούν να παρεμβληθούν στην εκτέλεση της δοκιμασίας και δεν θα πρέπει να χρησιμοποιούνται. Τα δείγματα δεν θα πρέπει να φυλάσσονται γα παραπάνω από μία εβδομάδα στους 2 8 C. Για αποθήκευση μεγαλύτερης διάρκειας, τα δείγματα ορού θα πρέπει να καταψύχονται. Να αποφεύγετε επανειλημμένη απόψυξη και νέα ψύξη των δειγμάτων. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Διαδικαστικές Σημειώσεις Διαβάστε προσεκτικά το ένθετο προϊόντος πριν ξεκινήσετε τη δοκιμασία. Αφήστε τα δείγματα ασθενών και τα αντιδραστήρια δοκιμασίας να εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν την έναρξη της διαδικασίας δοκιμασίας. Βάζετε πίσω όλα τα δείγματα και τα αντιδραστήρια που δεν χρησιμοποιήσατε στο ψυγείο αμέσως μετά τη χρήση. Αφαιρείτε τις απαιτούμενες λωρίδες βυθισμάτων από τη σακούλα και προσεκτικά σφραγίζετε ξανά τη σακούλα για να αποφύγετε υγροποίηση στα μη χρησιμοποιηθέντα βυθίσματα. Βάζετε τη σακούλα πίσω στο ψυγείο αμέσως. Όλα τα διαλύματα των δειγμάτων του ασθενούς θα πρέπει να προετοιμάζονται πριν την έναρξη της δοκιμασίας. Η τεχνική καλής πλύσης είναι πολύ σημαντική. Αν η πλύση εκτελείται με το χέρι, η σωστή πλύση επιτυγχάνεται κατευθύνοντας δυνατή ροή διαλύματος πλύσης με φιάλη πλύσης με ανοιχτό στόμιο σε ολόκληρη τη μικροπλάκα. Συνιστάται αυτόματη συσκευή πλύσης μικροπλάκας. Χρησιμοποιείτε πολυκάναλη πιπέτα ικανή να απελευθερώνει 8 ή 12 κοιλότητες ταυτόχρονα. Αυτό επιταχύνει τη διαδικασία και παρέχει χρόνους πιο ομοιόμορφης επώασης. Σε όλα τα βήματα, ο προσεκτικός έλεγχος χρονισμού είναι σημαντικός. Η έναρξη όλων των περιόδων επώασης γίνεται με την ολοκλήρωση της προσθήκης αντιδραστηρίου. Προσθήκη όλων των δειγμάτων και αντιδραστηρίων θα πρέπει να εκτελείται με τον ίδιο ρυθμό και την ίδια ακολουθία. Μέθοδος Δοκιμής Βήμα 1 Βήμα 2 Βήμα 3 Αφήνετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα να εξισορροπήσουν σε θερμοκρασία δωματίου. Τοποθετείτε ετικέτα στο φύλλο πρωτοκόλλου για να υποδηλώσετε την τοποθέτηση δείγματος στις κοιλότητες. Αποτελεί ορθή εργαστηριακή πρακτική να εκτελείτε τα δείγματα εις διπλούν. Για ποιοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήστε μόνο Βαθμονομητή Δ (φιαλίδιο με κίτρινο πώμα). ή Για ημι-ποσοτικό προσδιορισμό χρησιμοποιήστε Βαθμονομητές Α έως E, όπως απεικονίζεται στην παρακάτω διάταξη δείγματος. 16

EL Ποιοτικός Ημι-Ποσοτικός A Κενός S5 Κ.λπ. A Κενός S1 Κ.λπ. B -Control S6 B -Control S2 C +Control S7 C +Control S3 D Cal D S8 D Cal A S4 E S1 S9 E Cal B S5 F S2 S10 F Cal C S6 G S3 S11 G Cal D S7 H S4 S12 H Cal E S8 1 2 3 1 2 3 Βήμα 4 Προετοιμάζετε διάλυμα 1:101 από τα δείγματα ασθενών αναμειγνύοντας 5 µl των ορών των ασθενών με 500 µl Ορού Αραίωσης. Βήμα 5 Βήμα 6 Βήμα 7 Βήμα 8 Βήμα 9 Βήμα 10 Αφαιρείτε τα απαιτούμενα βυθίσματα από το σάκο και βάζετε πίσω τις λωρίδες που δεν έχετε χρησιμοποιήσει στη σφραγισμένη σακούλα στο ψυγείο. Τοποθετείτε ασφαλώς τα βυθίσματα στην επιπλέον βάση που παρέχεται. Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl τους Έτοιμους προς χρήση Βαθμονομητές, τους Θετικούς και Αρνητικούς ελέγχους και τα αραιωμένα δείγματα ασθενών (1:101) στα κατάλληλα βυθίσματα σύμφωνα με το φύλλο πρωτοκόλλου. Σημείωση: Συμπεριλαμβάνετε μία κοιλότητα που περιέχει 100 µl Ορού Αραίωσης ως κενό αντιδραστήριο. Μηδενίζετε την συσκευή ανάγνωσης ELISA έναντι του κενού αντιδραστηρίου. Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου. Πλένετε 4 φορές με διάλυμα πλύσης. Για πλύσιμο με το χέρι, γεμίζετε κάθε βύθισμα με ανασυσταθέν διάλυμα πλύσης. Πετάξτε το υγρό αναστρέφοντας και κτυπώντας ελαφρά ώστε να βγουν τα περιεχόμενα κάθε κοιλότητας ή αναρροφώντας το υγρό από κάθε κοιλότητα. Για να κάνετε αποτύπωση στο τέλος της τελευταίας πλύσης, αναστρέψτε τις λωρίδες και κτυπήστε τοις κοιλότητες έντονα πάνω σε απορροφητικές χάρτινες χειροπετσέτες. Για αυτόματες συσκευές πλυσίματος, προγραμματίστε την συσκευή πλύσης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Βάζετε με την πιπέτα 100 µl της σύζευξης σε βυθίσματα. Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου. Βήμα 11 Πλένετε όλα τα βυθίσματα, όπως περιγράφεται στο Βήμα 8. Βήμα 12 Βήμα 13 Βήμα 14 Βήμα 15 Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl Ενζυμικού Υποστρώματος σε κάθε βύθισμα με την ίδια σειρά και χρονισμό όπως για τη Σύζευξη. Επωάζετε για 30 λεπτά (± 5 λεπτά) σε θερμοκρασία δωματίου. Διανέμετε με την πιπέτα 100 µl Διαλύματος Παύσης σε κάθε βύθισμα χρησιμοποιώντας την ίδια σειρά και χρονισμό όπως για την προσθήκη του Ενζυμικού Υποστρώματος. Διαβάζετε τις τιμές απορροφητικότητας εντός 30 λεπτών από την προσθήκη του Διαλύματος Παύσης. Διαβάστε την απορροφητικότητα κάθε βυθίσματος σε 450 nm χρησιμοποιώντας μονού ή στα 450/630 nm χρησιμοποιώντας διπλού μήκους κύματος συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας έναντι του σετ κενού αντιδραστηρίου σε μηδενική απορροφητικότητα. 17

EL Ποιοτικός Έλεγχος Οι Βαθμονομητές, ο Θετικός και Αρνητικός Έλεγχος και ένα κενό αντιδραστήριο πρέπει να εκτελούνται με κάθε δοκιμασία για την εξακρίβωση της ακεραιότητας και ακρίβειας της δοκιμασίας. Η ένδειξη απορροφητικότητας του κενού αντιδραστηρίου θα πρέπει να είναι μικρότερη του 0,3. Ο Βαθμονομητής Α θα πρέπει να έχει ένδειξη απορροφητικότητας όχι μικρότερη του 1,0, άλλως η δοκιμασία θα πρέπει να επαναληφθεί. Ο Αρνητικός Έλεγχος πρέπει να είναι μικρότερος από 10 EU/ml. Εάν η δοκιμασία διεξάγεται εις διπλούν, ο μέσος όρος των δύο ενδείξεων θα πρέπει να λαμβάνεται για τον προσδιορισμό EU/ml. Κατά την εκτέλεση των ποιοτικών προσδιορισμών, η οπτική πυκνότητα του Βαθμονομητή Δ πρέπει να είναι μεγαλύτερη από εκείνην του Αρνητικού Ελέγχου και μικρότερη από την απορροφητικότητα του Θετικού Ελέγχου. Για ημι-ποσοτικούς προσδιορισμούς ο Θετικός Έλεγχος πρέπει να δίνει τιμές εντός του φάσματος που δηλώνεται στο φιαλίδιο. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Υπολογισμοί Οι πυκνότητες των δειγμάτων των ασθενών μπορούν να προσδιοριστούν με μία από τις δύο μεθόδους: 1. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Απορ. του Δείγματος Δοκιμασίας ------------------------------------------------ X EU/ml Βαθμονομητή Δ = EU/ml Δείγμα Δοκιμασίας Απορ. Βαθμονομητή Δ Συνιστάται τα ποιοτικά αποτελέσματα να αναφέρονται ως θετικά ή αρνητικά. Τα αποτελέσματα δειγμάτων που είναι μεγαλύτερα από ή ίσα με τον Βαθμονομητή Δ θεωρούνται θετικά. 2. ΗΜΙ-ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ Αποτυπώστε την απορροφητικότητα των Βαθμονομητών Α έως Ε έναντι των αντίστοιχων συγκεντρώσεων σε χαρτί γραφημάτων γραμμικού αρχείου καταγραφής (linear-log graph paper). Αποτυπώστε τις συγκεντρώσεις σε U/ml στον X-άξονα έναντι της απορροφητικότητας στον Y-άξονα και σχεδιάστε μια καμπύλη προσαρμογής από σημείο σε σημείο. Καθορίστε τις συγκεντρώσεις των δειγμάτων ασθενών από την καμπύλη σύμφωνα με τις αντίστοιχες τιμές απορροφητικότητας. Εναλλακτικά, μια καμπύλη τεσσάρων παραμέτρων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αποτύπωση της πρότυπης καμπύλης. Συνιστάται τα ημι-ποσοτικά αποτελέσματα να αναφέρονται ως θετικά, αρνητικά, ή απροσδιόριστα με τιμές μονάδας EU/ml. Τα απροσδιόριστα/οριακά αποτελέσματα θα πρέπει να επανελέγχονται και αξιολογούνται μαζί με άλλες εργαστηριακές μεθόδους, όπως δηλώνεται στους Περιορισμούς Διαδικασίας. Ερμηνεία Οι τιμές ερμηνείας προσδιορίστηκαν με δοκιμή απλών δοτών αίματος και δείγματα ελέγχου νόσου μη-αντιφωσφολιπιδικού συνδρόμου (IgA=220, IgG n=150, IgM n=152). Ο μέσος όρος αυτών των υποκειμένων συν 2,5 SD για IgA και 3 SD για IgG and IgM καθιερώθηκε ως το έσχατο όριο της δοκιμασίας και καθόρισε την αυθαίρετη τιμή των 20 EU/ml. Οι ακόλουθες πληροφορίες εξυπηρετούν μόνον ως οδηγός στην ερμηνεία των εργαστηριακών αποτελεσμάτων. Κάθε εργαστήριο πρέπει να καθορίζει τις δικές του φυσιολογικές τιμές. 18

EL Τιμή B2GP1 Ab Ερμηνεία <20 EU/ml Αρνητικό 20 25 EU/ml Απροσδιόριστο (Οριακό) >25 EU/ml Θετικό Βαθμονομητής Οι Έτοιμοι προς Χρήση Βαθμονομητές συμπεριλαμβάνονται για να παρέχουν ημιποσοτικό προσδιορισμό και πρέπει να χρησιμοποιούνται σε κάθε εκτέλεση. Δείγματα ασθενών που περιέχουν υψηλά επίπεδα αντισωμάτων μπορούν να δώσουν τιμές απορροφητικότητας μεγαλύτερες από εκείνη του Βαθμονομητή Α. Για τον προσδιορισμό ακριβών ημι-ποσοτικών τιμών, αυτά τα δείγματα θα πρέπει να αραιώνονται περαιτέρω ώστε να εμπίπτουν εντός του εύρους της καμπύλης του βαθμονομητή όταν επανεξετάζονται. Για τον προσδιορισμό τιμών EU/ml, πολλαπλασιάστε τις μονάδες που αποκτήθηκαν με τον διαλύτη. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Η δοκιμασία ImmuLisa B2GP1 Antibody δεν θα πρέπει να εκτελείται σε αιμολυμένα, βακτηριδιακά επιμολυσμένα ή λιπαιμικά δείγματα. Η μέθοδος αυτή θα πρέπει να χρησιμοποιείται για τον έλεγχο δειγμάτων ανθρώπινου ορού μόνον. Περαιτέρω, δεν μπορεί να γίνει διάγνωση επί τη βάσει μόνο των αποτελεσμάτων αντι- B2GP1. Πρέπει να εξετάζονται τα αποτελέσματα άλλων εργαστηριακών δοκιμών και κλινικών ευρημάτων. Όταν παρατηρείται μια αρνητική δοκιμή αντι-b2gp1 παρουσία κλινικών ενδείξεων, δοκιμή αντιπηκτικού λύκου ή άλλη επιπρόσθετη δοκιμή συνιστάται. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ ΚΑΙ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΛΙΝΙΚΩΝ ΜΕΛΕΤΩΝ Η συχνότητα εμφάνισης αντισωμάτων B2GP1 σε Συστηματικό Ερυθηματώδη Λύκο (SLE) με θρόμβωση και εγκυμοσύνη συνοψίζεται στον παρακάτω κείμενο: Περιστατικά ACA και Αντι ß2-GP1 Αντισωμάτων σε SLE 17 ACA B2GP1 Ab IgG % IgM % IgA % IgG % IgM % IgA % Συστ. Ερυθημ. Λύκος με θρόμβωση 24 14 10 27 14 2 Σε εγκυμοσύνη χωρίς θρόμβωση 8 5 2 10 3 4 με υποτροπ. απώλεια εμβρύου χωρίς απώλεια εμβρύου 20 0 11 27 0 44 11 7 3 14 7 13 19

EL Σετ κλινικών δειγμάτων δοκιμάστηκαν στα Αποτελέσματα των Μεθόδων ImmuLisa B2GP1 IgG και IgM Antibody ELISA επιδεικνύοντας συχνότητα εμφάνισης στους πληθυσμούς παρέχονται παρακάτω: B2GP1 IgA B2GP1 IgG B2GP1 IgM Ομάδα Ασθενών # / # θετ. / % # / # θετ. / % # / # θετ. / % Υποκείμενο SLE Θετικό σε ACA 63 / 61 / 96,8% 73 / 68 / 93,2% 74 / 66 / 89,2% Υποκείμενο SLE Αρνητικό σε ACA 31 / 1 / 3% 31 / 3 / 9,7% 31 / 0 / 0% Σύφιλη 36 / 0 / 0% 36 / 0 / 0% 36 / 0 / 0% Ρευματοειδής Αρθρίτιδα 20 /1 / 5% 20 / 2 / 10% 20 / 0 / 0% Άλλες Αυτοάνοσες Ασθένειες 40 / 2 / 5% 40 / 0 / 0% 40 / 3 / 7,5% Φυσιολογικοί 100 / 1 / 1% 100 / 1 / 1% 100 / 0 / 0% ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ Η χρησιμότητα των ImmuLisa B2GP1 IgA, IgG και IgM Antibody ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων B2GP1 IgA, IgG και IgM αξιολογήθηκε με δοκιμή καλώς χαρακτηρισμένων δειγμάτων από υποκείμενα Συστηματικού Ερυθηματώδους Λύκου θετικά σε αντισώματα καρδιολιπίνης μαζί με ελέγχους νόσων και φυσιολογικούς ανθρώπινους ορούς. Αυτά τα δείγματα δοκιμάστηκαν επίσης σε εμπορικά διαθέσιμα κιτ. Μόνον δείγματα στο γραμμικό φάσμα της δοκιμασίας συμπεριελήφθησαν στην σύγκριση της μεθόδου. Αυτά τα αποτελέσματα συνοψίζονται κατωτέρω. A. Τα ImmuLisa B2GP1 IgA, IgG και IgM Antibody ELISA δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με άλλα κιτ B2GP1 IgG και IgM Antibody: Άλλο B2GP1 IgA Ab ELISA Θετικό Αρνητικό Σύνολο IMMCO Θετικό 48 0 48 B2GP1 Ab Αρνητικό 13 40 53 IgA ELISA Σύνολο 61 40 101 Συμφωνία Θετικού Ποσοστού: 78,7% (95% CI 66,0% 87,7%) Συμφωνία Αρνητικού Ποσοστού: 100% (95% CI 89,1% 100%) Συμφωνία Γενικού Ποσοστού: 87,1% (95% CI 78,6% 92,7%) Υποκείμενα συνδεδεμένα με ασθένεια: 63 Έλεγχοι Νόσων: 38 Υγιή Συνήθη Υποκείμενα: 80 Άλλο B2GP1 IgG Ab ELISA Θετικό Αρνητικό Σύνολο IMMCO Θετικό 55 3 58 B2GP1 Ab Αρνητικό 4 103 107 IgG ELISA Σύνολο 59 106 165 Συμφωνία Θετικού Ποσοστού: 93,2% (95% CI 82,7% 97,8%) Συμφωνία Αρνητικού Ποσοστού: 97,2% (95% CI 91,3% 99,3%) Συμφωνία Γενικού Ποσοστού: 95,8% (95% CI 91,1% 98,1%) Υποκείμενα SLE θετικά σε αντισώματα καρδιολιπίνης: 70 Έλεγχοι Νόσων: 24 Υγιή Συνήθη Υποκείμενα: 71 20

EL Άλλο B2GP1 IgM Ab ELISA Θετικό Αρνητικό Σύνολο IMMCO Θετικό 76 0 76 B2GP1 Ab Αρνητικό 5 74 79 IgM ELISA Σύνολο 81 74 155 Συμφωνία Θετικού Ποσοστού: 93,8% (95% CI 79,0% 94,8%) Συμφωνία Αρνητικού Ποσοστού: 100% (95% CI 93,9% 100%) Συμφωνία Γενικού Ποσοστού: 96,8% (95% CI 89,2% 97,5%) Υποκείμενα SLE θετικά σε αντισώματα καρδιολιπίνης: 76 Έλεγχοι Νόσων: 21 Υγιή Συνήθη Υποκείμενα: 58 B. Διασταυρωτή Αντιδραστικότητα: Ένα σύνολο από 50 δείγματα με πιθανή διασταυρούμενη αντίδραση από άτομα με άλλες αυτάνοσες διαταραχές ή θετικά για άλλα αυτοαντισώματα εξετάστηκαν για αντισώματα ENA χρησιμοποιώντας τα συστήματα ImmuLisa B2GP1 IgG και IgM Antibody ELISA. Πάθηση n IgA Θετικό IgG Θετικό IgM Θετικό Αντιπυρηνικά αντισώματα (ANA) + 10 0 0 1 Νόσος του Hashimoto 20 0 0 0 Ρευματοειδής Αρθρίτιδα 20 1 2 0 Σύνολο 50 1 (2%) 2 (4%) 1 (2%) Ακρίβεια Η ακρίβεια δοκιμάστηκε με πολλαπλά δείγματα που επιλέχθηκαν από όλο το φάσμα της δοκιμασίας. Πραγματοποιήθηκαν τρεις εκτελέσεις δοκιμασιών σε διαφορετικές μέρες για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα μεταξύ των ημερών. Μια επιπρόσθετη εκτέλεση δέκα πανομοιότυπων πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η επαναληψιμότητα. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω. Εντός προσδιορισμού B2GP1 IgA Ολική Ανακρίβεια Μεταξύ ημερών (Επαναληψιμότητα)) Μέσος όρος SD SD SD Δείγμα (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 6,8 0,655 9,6% 0,669 9,8% 0,6 8,5% 2 15,3 1,014 6,6% 1,054 6,9% 0,7 4,5% 3 25,1 1,702 6,8% 1,701 6,8% 1,7 6,5% 4 56,9 2,079 3,7% 1,939 3,4% 0,9 1,6% 5 99,8 4,288 4,3% 3,770 3,7% 2,6 2,7% 6 146,2 8,548 5,8% 7,053 4,8% 7,6 5,7% 21

EL Εντός προσδιορισμού B2GP1 IgG Ολική Ανακρίβεια Μεταξύ ημερών (Επαναληψιμότητα) Μέσος όρος SD SD SD Δείγμα (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 15,63 0,649 4,2% 0,575 3,6% 0,546 3,6% 2 19,67 1,248 6,3% 1,576 8,0% 0,941 4,8% 3 24,19 1,262 5,2% 1,245 5,1% 1,292 5,4% 4 35,29 1,057 3,0% 1,291 3,7% 0,592 1,7% 5 96,76 2,431 2,5% 2,233 2,3% 2,557 2,6% 6 147,08 3,043 2,1% 3,496 2,4% 1,720 1,2% Εντός προσδιορισμού B2GP1 IgM Ολική Ανακρίβεια Μεταξύ ημερών (Επαναληψιμότητα) Μέσος όρος SD SD SD Δείγμα (EU/ml) (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% (EU/ml) CV% 1 16,42 0,660 4,0% 0,667 4,1% 0,681 4,1% 2 23,08 1,121 4,9% 1,497 6,5% 0,719 3,1% 3 25,22 0,890 3,5% 1,032 4,1% 0,688 2,7% 4 46,53 1,816 3,9% 1,714 3,7% 1,984 4,3% 5 173,82 4,276 2,5% 4,944 2,8% 3,827 2,2% 6 277,47 5,371 1,9% 5,876 2,1% 5,001 1,8% Γραμμικότητα και Ανάκαμψη Η γραμμικότητα και η ανάκαμψη δοκιμάστηκαν αραιώνοντας θετικά δείγματα σε όλο το εύρος της δοκιμασίας σε ισαπέχουσες αραιώσεις και συγκρίνοντας πραγματικές έναντι αναμενόμενων τιμών. Το γραμμικό εύρος της δοκιμασίας IgA καθορίστηκε να είναι 3,8 160 EU/ml. Το γραμμικό εύρος της δοκιμασίας IgG καθορίστηκε να είναι 2,2 160 EU/ml. Το γραμμικό εύρος της δοκιμασίας IgM καθορίστηκε να είναι 5,3 160 EU/ml. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται παρακάτω: Δείγμα Εύρος δοκιμής (EU/ml Κλίση Σημείο τομής Y R 2 % Ανάκαμψη IgA 1 3.8 17.8 IgA 2 11.0 63.9 IgA 3 59.0 222.7 IgG 1 3,3 165,1 IgG 2 3,2 76,7 IgG 3 4,1 140,9 IgM 1 5,4 87,5 IgM 2 22,9 151,2 IgM 3 6,2 44,4 1.06 (0.878 1.236) 1.05 (0.966 1.136) 0.95 (0.826 1.065) 1,015 (0,921 1,109) 1,003 (0,922 1,085) 1,032 (0,931 1,133) 1,016 (0,934 1,097) 0,993 (0,945 1,041) 0,993 (0,952 1,034) 22-0.78 (-2.833 1.364) -0.8 (-4.156 2.616) 12.02 (-5.68 29.67) 7,233 (-1,708 16,175) 2,949 (-0,630 6,527) 4,125 (-3,874 12,125) 2,27 (-1,89 6,43) -0,650 (-5,313 4,014) 0,880 (-0,240 2,000) 0,97 88 112 0,99 95 107 0,98 95 111 0,99 82,3 100 0,99 82,6 100 0,99 86,2 100 0,99 88,8 100 1,00 85,8 109,8 1,00 92,3 98,5

EL Όριο Ανίχνευσης Τα όρια ανίχνευσης (LoD) για αυτές τις δοκιμασίες καθορίστηκαν να είναι 5.3 EU/ml για IgA, 2,2 EU/ml για IgG και 5,3 EU/ml για IgM επί τη βάσει 60 πανομοιότυπων κενού και 10 πανομοιότυπων καθένα από of 6 δείγματα χαμηλού επιπέδου (NHS). Αναπαραγωγιμότητα Δέκα δοκιμασίες δειγμάτων στο χαμηλό αρνητικό εύρος, στο μέτριο θετικό εύρος για κάθε ισότυπο B2GP1 και περίπου +/- 20% των σημείων διαχωρισμού για κάθε ισότυπο B2GP1 εκτελέστηκαν για να προσδιορίσουν ποσοτική αναπαραγωγιμότητα. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας γι αυτά τα δείγματα παρήγαν 100% ποιοτική συμφωνία. Παρέμβαση Η παρέμβαση μελετήθηκε με την ανάμειξη ορών με γνωστά επίπεδα B2GP1 για κάθε ισότυπο με δείγματα ορού πιθανώς παρεμβαλλόμενα και με την μελέτη απόκλισης από τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Καμία σημαντική παρέμβαση δεν εκδηλώθηκε για τις ακόλουθες ουσίες στα επίπεδα που δηλώνονται: Αιμοσφαιρίνη (2 g/l), Χολερυθρίνη (342 μmol/l),ρευματοειδής Παράγοντας (100 EU/ml), Τριγλυκερίδια (37 mmol/l), και Χοληστερόλη (13 mmol/l). 23

ES ImmuLisa Enhanced B2GP1 ELISA Beta 2 Glycoprotein 1 Antibody ELISA [IVD] Para utilización de diagnóstico in vitro ETIQUETA DEL PRODUCTO [REF] 5152A B2GP1 IgA Antibody ELISA 96 Determinaciones [REF] 5152G B2GP1 IgG Antibody ELISA 96 Determinaciones [REF] 5152M B2GP1 IgM Antibody ELISA 96 Determinaciones UTILIZACIÓN PREVISTA Un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) para la detección cualitativa o semicuantitativa de anticuerpos lga, IgG o IgM anti-beta 2 Glicoproteína 1 (B2GP1) en el suero humano para ayudar al diagnóstico de trombosis autoinmune en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) o afecciones similares al lupus junto con otras conclusiones clínicas y de laboratorio. RESUMEN Y EXPLICACIÓN Los anticuerpos antifosfolípidos son un grupo heterogéneo de anticuerpos contra fosfolípidos con carga negativa. 1 Se detectan principalmente a través del análisis de anticuerpos anticardiolípicos (ACA), el análisis falso positivo biológico para sífilis o el análisis de anticoagulante lúpico. Estos tres análisis detectan anticuerpos relacionados, aunque no necesariamente idénticos. Así, en ocasiones es necesario realizar más de uno de estos análisis para identificar los anticuerpos antifosfolípidos. De los diversos análisis para detección de anticuerpos antifosfolípidos, el análisis de anticuerpos anticardiolipina realizado por ELISA es el más sensible. 2 La presencia de anticuerpos anticardiolipina ayuda a identificar a aquellos pacientes que tienen riesgo de sufrir una trombosis venosa o arterial a menudo acompañada de trombocitopenia, un síndrome al que llamamos síndrome antifosfolípido. 1-12 Se da con más frecuencia en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) o afecciones similares al lupus en las que no se cumplen los criterios para el LES. 5-7 Se dan unos niveles altos de anticuerpos anticardiolipina en la trombosis, la pérdida fetal, la trombocitopenia y otras afecciones. 1-15 Los anticuerpos anticardiolipina suelen detectarse con los ensayos ELISA, utilizando como antígeno la cardiolipina. Observaciones recientes indican que es necesario un factor del suero de 50kD para que los ACA se unan a la cardiolipina. Este cofactor fue identificado más adelante como Beta 2 Glicoproteína 1 (B2GP1) o asimismo apolipoproteína H. 16-18 Aunque la función de la B2GP1 sigue sin estar clara, es obvio que la presencia de B2GP1 facilita la unión de los ACA a la cardiolipina. Los anticuerpos anticardiolipina, especialmente en baja cantidad, se encuentran en variedad de afecciones clínicas no relacionadas con el síndrome antifosfolípido. Los ACA presentes en el suero de pacientes con LES y otras afecciones autoinmunes son inmunológicamente distintos a los del suero de pacientes con sífilis. La utilización de la proteína B2GP1 como sustituta del antígeno de cardiolipina en la matriz sólida ayuda a realizar esa distinción. Además, los anticuerpos anti-b2gp1 son muy específicos del síndrome antifosfolípido. 24