ΑΣΚΗΣΗ ΝΑΝΟΒΙΟΥΛΙΚΩΝ Νο 6: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΑΠΟ ΔΕΡΜΑ ΧΟΙΡΟΥ, ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

ΑΣΚΗΣΗ ΝΑΝΟΒΙΟΥΛΙΚΩΝ Νο 6: ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΑΠΟ ΔΕΡΜΑ ΧΟΙΡΟΥ, ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Ι: ΕΙΣΑΓΩΓΗ Όπως έχουμε δει στο μάθημα των Φυσικών Βιουλικών, το κολλαγόνο είναι η πιο άφθονη πρωτεΐνη των θηλαστικών (αποτελεί το ¼ της συνολικής πρωτεΐνης του οργανισμού). Είναι βασικό συστατικό του δέρματος, των τενόντων-χόνδρων-αγγείων, καθώς και σύνθετων βιολογικών υλικών (οστών και δοντιών). Το κολλαγόνο είναι μια ινώδης πρωτεΐνη που αποτελείται από τρεις αλυσίδες - κάθε αλυσίδα έχει περίπου 1000 αμινοξέα. Η αλληλουχία των αμινοξέων είναι ασυνήθιστη: κάθε τρίτο αμινοξύ είναι γλυκίνη και το ποσοστό προλίνης είναι πολύ υψηλό. Επιπλέον, περιέχει δύο πολύ σπάνια αμινοξέα, υδροξυπρολίνη και υδροξυλυσίνη. Η τυπική αλληλουχία μιας αλυσίδας κολλαγόνου είναι λοιπόν η εξής: Gly-X-Y, όπου X= πολύ συχνά προλίνη και Υ= πολύ συχνά υδροξυπρολίνη. Η δομική μονάδα του κολλαγόνου είναι μια τριπλή έλικα, όπου οι τρεις αλυσίδες σχηματίζουν ένα υπερελικωμένο καλώδιο, με 3.3 αμινοξέα ανά στροφή και βήμα της έλικας 9.6 Å. Αυτή η δομική μονάδα με μήκος 3000 Å και διάμετρο 15 Å ονομάζεται τροποκολλαγόνο. Η δομή σταθεροποιείται με δεσμούς υδρογόνου ανάμεσα στις τρείς αλυσίδες οι οποίοι είναι κάθετοι στον άξονα της ίνας. Οι δομικές μονάδες του τροποκολλαγόνου αυτοοργανώνονται σε υψηλότερα ιεραρχικά επίπεδα σχηματίζοντας παράλληλες δέσμες ανά πέντε σειρές, όπου τα μόρια τροποκολλαγόνου είναι μετατοπισμένα κατά 680 Å, αφήνοντας κενά 400 Å μεταξύ μορίων στην ίδια σειρά. Οι ίνες ισχυροποιούνται περαιτέρω με ομοιοπολικές διασυνδέσεις μεταξύ τους. Αυτή η δομή και η μοριακή αρχιτεκτονική προσδίδουν πχ. στο δέρμα, την μηχανική του ανθεκτικότητα και ελαστικότητα. Στην εισαγωγική διάλεξη θα γίνει υπενθύμιση των εννοιών δομής και λειτουργίας του κολλαγόνου. Το κολλαγόνο είναι από τα πιο σημαντικά βιουλικά, με μεγάλο αριθμό εφαρμογών στην βιοιατρική και την ιστοτεχνολογία. Μερικά παραδείγματα εφαρμογών που κυκλοφορούν εμπορικά είναι τα εξής: επουλωτικοί επίδεσμοι για πληγές, εγκαύματα και έλκη (Fibracol ), αιμοστατικοί σπόγγοι (Superstat ), ενέσιμες μορφές για αισθητικές εφαρμογές (Zyderm ), και σπόγγοι κολλαγόνου σαν ικριώματα για ανάπλαση οστών (Infuse ). Για να εμπεδώσουμε το κολλαγόνο σαν βιουλικό, είναι σημαντικό να το καταλάβουμε σαν πρωτεΐνη. Σε αυτή την άσκηση θα μελετήσουμε τον καθαρισμό κολλαγόνου από δέρμα χοίρου και τον βιοχημικό του χαρακτηρισμό με την μέθοδο της ηλεκτροφόρησης. 1

Ι: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΙΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ Για να απομονώσουμε μια πρωτεΐνη σε καθαρή μορφή, θα χρειαστεί να ξεκινήσουμε από μια βιολογική πηγή, είτε έναν βιολογικό ιστό, είτε από μια καλλιέργεια κυττάρων. Στην πηγή αυτή, η πρωτεΐνη μας μπορεί να αντιπροσωπεύει και λιγότερο από 1% του αρχικού υλικού. Αφού λοιπόν ομογενοποιήσουμε τον ιστό, θα χρειαστεί να την διαχωρίσουμε από τις άλλες πρωτεΐνες ακλουθώντας διαφορετικά στάδια καθαρισμού. Μπορούμε να διαχωρίσουμε μια πρωτεΐνη από τις άλλες πρωτεΐνες με βάση χαρακτηριστικά όπως η διαλυτότητα, το μέγεθος, το φορτίο, και η δεσμευτική συγγένεια με άλλα μόρια. Από τις πρώτες μεθόδους που εφαρμόζονται στο αρχικό μίγμα είναι η εξαλάτωση. Η εξαλάτωση βασίζεται στην εξής αρχή: σε ένα υδατικό διάλυμα χαμηλής ιοντικής ισχύος, τα ιοντικά και πολικά αμινοξέα που βρίσκονται στην επιφάνεια της πρωτεΐνης ενυδατώνονται με μόρια νερού, και η παρουσία ελεύθερων ιόντων συνεισφέρει στην διαλυτότητα και σταθεροποίηση της πρωτεΐνης. Όσο αυξάνεται η συγκέντρωση του άλατος, τα ιόντα χρησιμοποιούν όλο και περισσότερα μόρια νερού για την ενυδάτωση τους, αφήνοντας έτσι όλο και λιγότερα διαθέσιμα για την πρωτεΐνη. Έτσι η διαλυτότητα της πρωτεΐνης ελαττώνεται προοδευτικά, με αποτέλεσμα την κατακρήμνιση της σε μορφή ιζήματος. Κάθε πρωτεΐνη καταβυθίζεται σε διαφορετική συγκέντρωση άλατος, και συνεπώς αυτό μας επιτρέπει να χρησιμοποιήσουμε την εξαλάτωση σαν μέθοδο κλασμάτωσης των πρωτεϊνών Αυτή η διαδικασία συνήθως δεν προκαλεί μετουσίωση της πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα να είναι αντιστρεπτή: μόλις ελαττώσουμε την συγκέντρωση του άλατος, η πρωτεΐνη επαναδιαλύεται.. Για να απομακρύνουμε κατόπιν το άλας που έχει απομείνει, χρησιμοποιούμε την τεχνική της διαπίδυσης δια μέσου μιας ημιπερατής μεμβράνης, όπως είναι μια μεμβράνη κυτταρίνης με πόρους. Τα μόρια με διάμετρο μεγαλύτερη από τους πόρους της μεμβράνης θα συγκρατηθούν μέσα στον σάκο διαπίδυσης, ενώ τα μικρά μόρια θα διαχυθούν δια μέσω των πόρων στον διαλύτη που περιβάλλει τον σάκο. 2

-ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗΣ Η μέθοδος που χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το μέγεθος τους είναι η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis). Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός κάθε φορτισμένου μορίου που μεταναστεύει μέσα σε μια μήτρα στερεού υλικού υπό την επήρεια ενός ηλεκτρικού πεδίου εξαρτάται από τις διαστάσεις του: όσο μεγαλύτερο το μόριο τόσο πιο αργά θα κινηθεί, ενώ αντίθετα όσο πιο μικρό είναι, τόσο πιο γρήγορα. Οι πρωτεΐνες ποικίλλουν σε μέγεθος, σχήμα και φορτίο. Για να μπορέσουμε λοιπόν να τις διαχωρίσουμε μόνο σύμφωνα με την μάζα τους, θα πρέπει να ελαχιστοποιήσουμε την επήρεια του φορτίου και του σχήματος τους. Αυτό επιτυγχάνεται με το SDS. To SDS είναι ένα ανιονικό απορρυπαντικό το οποίο «αποδιπλώνει» τις πρωτεΐνες, αποδομώντας την τεταρτοταγή, τριτοταγή και δευτεροταγή δομή τους. Ταυτόχρονα, τις επικαλύπτει με αρνητικά φορτία. Έτσι, μπορούμε να δεχτούμε ότι οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες έχουν την μορφή εκτεταμένων ράβδων των οποίων το μήκος είναι ανάλογο της μάζας τους. Επιπλέον μπορούμε να δεχτούμε ότι το φορτίο ανά μονάδα μάζας του συμπλόκου πρωτεΐνης/sds είναι σταθερό (περίπου 1,4 gr/gr SDS). Έτσι, κάτω από αυτές τις συνθήκες, η κινητικότητα της πρωτεΐνης εξαρτάται μόνο από την μάζα της. SH SDS, HOCH 2 CH 2 SH, SH S S heating 3

Η σχέση μεταξύ της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας, μ (όπως εκφράζεται από την απόσταση την οποία διήνυσε κατά την διάρκεια της ηλεκτροφόρησης), μιας πρωτεΐνης και του λογαρίθμου της μοριακής της μάζας είναι γραμμική, όπως φαίνεται από το παρακάτω σχεδιάγραμμα: Η πηκτή ακρυλαμιδίου παρασκευάζεται από το κύριο συστατικό της (ακρυλαμίδιο) και έναν διασυνδέτη, N, N -methylene-bisacrylamide. Για να ξεκινήσουμε τον πολυμερισμό, χρησιμοποιούμε έναν εκκινητή ελευθέρων ριζών, το υπερθειικό αμμώνιο (APS) και έναν καταλύτη, το N, N, N, N -tetramethylethylenediamine (TEMED). Το μίγμα πολυμερίζεται απουσία οξυγόνου, σχηματίζοντας αλυσίδες συνδεδεμένες μεταξύ τους με γέφυρες μεθυλενίου, σχηματίζοντας έτσι ένα τρισδιάστατο πλέγμα. Μεταβάλλοντας την ολική συγκέντρωση του ακρυλαμιδίου και τις σχετικές αναλογίες ακρυλαμιδίου-bisακρυλαμιδίου, μπορούμε να σχηματίσουμε πηκτές με διαφορετικό βαθμό πολυμερισμού. 4

Πειραματικά, θα χρησιμοποιήσουμε το λεγόμενο «ασυνεχές σύστημα» ηλεκτροφόρησης. Δηλαδή, θα σχηματίσουμε δυο διαφορετικές πηκτές ακρυλαμιδίου ανάμεσα σε δυο γυάλινες πλάκες: μια στο κάτω μέρος και μια στο επάνω. Το κάτω μέρος ονομάζεται resolving gel (δηλ. «πηκτή διαχωρισμού» και το επάνω μέρος stacking gel (δηλ. «πηκτή συσσώρευσης»). Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται ουσιαστικά στο κάτω μέρος, δηλ. το resolving gel, στο οποίο το ποσοστό ακρυλαμιδίου ποικίλλει ανάλογα με το μέγεθος των πρωτεϊνών που θέλουμε να διαχωρίσουμε. Η σύσταση του resolving gel έχει ως εξής: - acrylamide x % - ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) Tris-HCl γλυκίνης 0,375M ph 8,8; SDS 0,1 % -APS 0,075% - TEMED 0,05% Η σύσταση του stacking gel έχει ως εξής: -acrylamide 4,5 % - ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) Tris-HCl γλυκινης 0,125 M ph 6,8; -SDS 0,1 % -APS 0,1 % - TEMED 0,1 % Ο ρόλος του stacking gel είναι να «συγκεντρώσει» τον όγκο των δειγμάτων των πρωτεϊνών τα οποία εναποθέτουμε, ώστε να επιτύχουμε καλύτερο διαχωρισμό στο resolving gel. Αυτό επιτυγχάνεται με τον εξής μηχανισμό: Στο ηλεκτρικό πεδίο, τα ιόντα χλωρίου είναι αρνητικά φορτισμένα και μικρά, οπότε θα κινούνται γρήγορα και θα προπορεύονται. Θα ακολουθήσουν τα μόρια των πρωτεϊνών που έχουν μετουσιωθεί με SDS, και στο τέλος θα ακολουθήσουν τα μόρια γλυκίνης, τα οποία έχουν ελάχιστο αρνητικό φορτίο σε ph 6,8, με αποτέλεσμα να κινούνται πολύ αργά. Έτσι, τα μόρια των πρωτεϊνών γίνονται «σάντουιτς» ανάμεσα στα ιόντα χλωρίου και τα ιόντα γλυκίνης, με αποτέλεσμα να συγκεντρώνονται σε λεπτές γραμμές. Επειδή η πηκτή του πολυακρυλαμιδίου στο stacking gel έχει μεγάλους πόρους, επιτρέπει την διέλευση πρωτεϊνών όλων των μεγεθών. Έτσι, τα μόρια όλων των πρωτεϊνών «ευθυγραμμίζονται» πριν φτάσουν στο resolving gel. Εκεί πλέον, στο ph 8.8, τα ιόντα γλυκίνης είναι και αυτά αρνητικά φορτισμένα και κινούνται με την ίδια ταχύτητα με τα ιόντα χλωρίου, και οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται ανάλογα με την μάζα τους. 5

- _ Stacking Ιόν γλυκίνης Separating Ιόν χλωρίου Πρωτεΐνες + ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΔΕΡΜΑ ΧΟΙΡΟΥ ΔΟΜΙΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΟΛΛΑΓΟΝΟΥ ΑΠΟ 1. Εκχύλιση κολλαγόνου τύπου Ι από δέρμα χοίρου σε όξινες συνθήκες, καταβύθιση με άλας, καθαρισμός με διαπίδυση. Θα σας δοθεί εναιώρημα κολλαγόνου από 5 γραμμάρια δέρματος το οποίο έχει εκχυλιστεί με 0, 5 Μ οξικό οξύ για τουλάχιστον 48 ώρες. Το δέρμα προέρχεται από νεαρό χοίρο, για τον εξής λόγο: στα μεγάλης ηλικίας ζώα, οι ίνες τροποκολλαγόνου ενισχύονται σε σημαντικό βαθμό με ομοιοπολικές διασυνδέσεις, όπως αναφέραμε στην εισαγωγή. Στα νεαρά ζώα, αυτές οι διασυνδέσεις δεν έχουν ακόμη πραγματοποιηθεί σε σημαντικό ποσοστό, με αποτέλεσμα να μπορούμε να εκχυλίσουμε μόρια τροποκολλαγόνου σε όξινες συνθήκες. Τα μόρια πρέπει να παραμένουν σε όξινες συνθήκες για να διατηρηθούν σε διαλυτή μορφή. Καθαρά διαλύματα τέτοιου κολλαγόνου είναι κατάλληλα για εφαρμογές στην αισθητική, την ελεγχόμενη 6

αποδέσμευση φαρμάκων και την ιστοτεχνολογία. (εννοείται ότι στις ενέσιμες μορφές το ph πρέπει να γίνει ουδέτερο αμέσως πριν την χρήση). - Απομάκρυνση του αδιάλυτου υλικού α) Κατανείμετε το περιεχόμενο της φιάλης Erlenmeyer που θα σας δοθεί σε ανάλογους σωλήνες φυγόκεντρου. Ξεπλύνετε με οξικό οξύ 0, 5 Μ την φιάλη και προσθέστε το ξέπλυμα στους σωλήνες. Ζυγίστε και εξισορροπήστε το βάρος των σωλήνων. β) Φυγοκεντρήστε για 15 λεπτά στις 10000 rpm. Εν τω μεταξύ, πλύνετε την φιάλη και το μαγνητάκι ανάδευσης με νερό και σαπούνι και ξεπλύνετε με αποσταγμένο νερό και ζυγίστε την φιάλη. γ) Αποχύστε το υπερκείμενο της φυγοκέντρησης στην φιάλη και ξαναζυγίστε την. Υπολογίστε τον όγκο του υπερκειμένου, υποθέτοντας ότι η πυκνότητα του δεν διαφέρει πολύ από αυτήν του νερού. δ) Κάντε τη πρώτη δειγματοληψία για το πρωτόκολλο καθαρισμού: πιπετάρετε από το στάδιο γ 100 μl και μεταφέρετε το σε ένα σωλήνα Eppendorff του 1.5 ml, σημειώνοντας με μαρκαδόρο «ΣΤΑΔΙΟ 1» καθώς και τα αρχικά σας και την ημερομηνία. -Καταβύθιση με άλας α) Χρησιμοποιήστε τον όγκο του υπερκειμένου για να υπολογίσετε πόσο στερεό NaCl χρειάζεται να προσθέσετε για να φράσετε σε τελική συγκέντρωση άλατος 1 Μ. Ζυγίστε την απαιτούμενη ποσότητα. β ) Προσθέστε το καθαρό μαγνητάκι στην φιάλη και αρχίστε να αναδεύετε, προσθέτοντας προοδευτικά το άλας με μια σπάτουλα. Παρατηρήστε προσεκτικά τις αλλαγές στο διάλυμα. γ ) Συνεχίστε την ανάδευση για 15 λεπτά αφού προσθέσετε όλη την ποσότητα. Σε αυτό το διάστημα, πετάξτε το ίζημα από τους σωλήνες φυγοκέντρησης στο νεροχύτη και καθαρίστε τους με νερό και σαπούνι. δ) Μεταφέρετε όλο το δείγμα σε ανάλογους σωλήνες φυγοκέντρησης, εξισορροπήστε, και φυγοκεντρήστε για 15 λεπτά στις 10000 rpm. Εν τω μεταξύ, καθαρίστε πάλι το μαγνητάκι και την φιάλη Erlenmeyer. ε ) Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης πιπετάρετε 100 μl από το υπερκείμενο, και μεταφέρετε το σε ένα σωλήνα Eppendorff του 1.5 ml, σημειώνοντας με μαρκαδόρο «ΣΤΑΔΙΟ 2» καθώς και τα αρχικά σας και την ημερομηνία. 7

ζ ) Αποχύστε και πετάξτε το υπερκείμενο από το προηγούμενο στάδιο. Επαναδιαλύστε το ίζημα με 5 ml 0,010 M HCl σε κάθε σωλήνα. η) Όταν το ίζημα επαναδιαλυθεί, πάρτε δείγμα 100 μl από το υπερκείμενο, και μεταφέρετε το σε ένα σωλήνα Eppendorff του 1.5 ml, σημειώνοντας με μαρκαδόρο «ΣΤΑΔΙΟ 3» καθώς και τα αρχικά σας και την ημερομηνία. -Διαπίδυση Θα χρησιμοποιήσετε την τεχνική της διαπίδυσης για να αφαιρέσετε την περίσσεια άλατος από την επαναδιάλυση του κολλαγόνου στο προηγούμενο στάδιο. Για αυτό τον σκοπό θα χρησιμοποιήσετε σάκο διαπίδυσης από κυτταρίνη με μέγεθος πόρων που να επιτρέπει την έξοδο μορίων με μοριακό βάρος μικρότερο από 6000-8000 kda, ενώ θα κατακρατεί τα μόρια με μεγαλύτερο μοριακό βάρος. Το κατώφλι αυτό το ονομάζουμε MWCO (Molecular weight cut off). Θα σας γίνει επίδειξη από τον διδάσκοντα για το πως ακριβώς γεμίζουμε έναν σάκο διαπίδυσης. -Αφού γεμίσετε τον σάκο διαπίδυσης, τοποθετήστε τον σε ένα ποτήρι ζέσεως η ένα ογκομετρικό κύλινδρο 1000 ml, όπου θα βάλετε 990 ml απιονισμένου νερού και 10 ml υδροχλωρικού οξέως 1 Μ (για τελική συγκέντρωση 0, 010 Μ HCl). -Τοποθετήστε ένα μαγνητάκι στο ποτήρι ζέσεως, καλύψτε το ποτήρι με πλαστική μεμβράνη και αφήστε το να αναδεύεται σε μέτρια με χαμηλή ταχύτητα στον μαγνητικό αναδευτήρα Το διάλυμα της διαπίδυσης πρέπει κανονικά να αλλαχτεί τρεις φορές. Κατόπιν, μεταφέρτε το περιεχόμενο του σάκου σε ένα σωλήνα φυγοκέντρησης και απομακρύνατε τυχόν αδιάλυτα υπολείμματα με φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα 10000 rpm. Μεταφέρετε το υπερκείμενο σε κωνικό σωλήνα 50 ml και αποθηκεύστε το στην κατάψυξη. Τέλος αυτού του σταδίου: Τοποθετήστε τα δείγματα των διαφόρων σταδίων που πήρατε στο ψυγείο. 2. Ανάλυση των σταδίων καθαρισμού κολλαγόνου με την μέθοδο της ηλεκτροφόρησης 2.1 Προετοιμασία των πηκτών : ΠΡΟΣΟΧΗ: ΓΑΝΤΙΑ ΚΑΙ ΓΥΑΛΙΑ ΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΑΠΑΡΑΙΤΗΤΑ Θα σας δοθούν τα εξής διαλύματα: - ένα μίγμα ακρυλαμιδίου (30%) και bis- ακρυλαμιδίου (0,8%) - Tris-HCl 1.5 M, ph 8.8, 0.4% SDS (για το resolving gel) 8

- Tris-HCl 0.5 M, ph 6.8, 0.4% SDS (για το stacking gel) -Υπερθειικό αμμώνιο (APS) 10% -TEMED -Εγκαταστήστε τις γυάλινες πλάκες στο στήριγμα τους και ετοιμάστε το μείγμα του resolving gel σε μια κωνική φιάλη των 25 η 50 ml σύμφωνα με τις εξής αναλογίες: -μίγμα ακρυλαμιδίου (30%) και bis- ακρυλαμιδίου (0,8%) 5 ml (τελικό ποσοστό: 7.5%) -νερό 10 ml -resolving gel buffer 5 ml -APS 10%, 100 μικρολίτρα -TEMED 10 μικρολίτρα Αποχύστε το μίγμα ανάμεσα στις δυο πλάκες μέχρι σε απόσταση περίπου 1 εκατοστό κάτω από την μικρή πλάκα. Με μια πιπέτα Pasteur καλύψτε απαλά την επιφάνεια με απεσταγμένο νερό και αφήστε να πολυμεριστεί. (περίπου 20 λεπτά). Μόλις πολυμεριστεί ετοιμάστε το μείγμα του stacking gel σύμφωνα με τις εξής αναλογίες -μίγμα ακρυλαμιδίου (30%) και bis- ακρυλαμιδίου (0,8%) 1 ml -νερό 6.5 ml -stacking gel buffer 2.5 ml -APS 10%, 50 μικρολίτρα -TEMED 10 μικρολίτρα και συμπληρώστε μέχρι επάνω. Τοποθετήστε την πλαστική χτένα και περιμένετε άλλα 20 λεπτά μέχρι να πολυμεριστεί. Όσο οι πηκτές σας πολυμερίζονται, ρυθμίστε το θερμαινόμενο block στους 100 ο C και ετοιμάστε τα δείγματα σας ως εξής: - Σε κάθε σωλήνα Eppendorff από τα δείγματα που έχετε πάρει από τα διάφορα στάδια καθαρισμού. τοποθετήστε 50 μικρολίτρα από το λεγόμενο buffer δείγματος 3Χ (δηλ. συγκεντρωμένο τρεις φορές) to οποίο περιέχει τα εξής συστατικά (οι συγκεντρώσεις είναι οι τελικές, δηλ. 1Χ): -0, 062 Μ Tris-HCl, ph 6.8 9

-2% SDS -5% βήτα-μερκαπτοαιθανόλη -10% γλυκερίνη (χρησιμεύει για να αυξάνει την πυκνότητα/ιξώδες των δειγμάτων για την ευκολότερη εναπόθεση τους στην πηκτή) -κυανούν της βρωμοφαινόλης (ανιονική χρωστική μικρού μοριακού βάρους που επιτρέπει την οπτική παρακολούθηση του μετώπου της ηλεκτροφόρησης) Τοποθετήστε τα στο θερμαινόμενο block για 3 λεπτά, βγάλετε τα και αφήστε τα αν κρυώσουν. 2.2 Συναρμολόγηση συσκευής και διαδικασία ηλεκτροφόρησης Με την βοήθεια του διδάσκοντα θα τοποθετήσετε τις γυάλινες πλάκες που περιέχουν την πηκτή στην συσκευή της ηλεκτροφόρησης. Γεμίστε πρώτα την επάνω δεξαμενή (της καθόδου) με buffer ηλεκτροφόρησης το οποίο έχει την εξής σύσταση: -2.5 mμ Tris -19,2 mm γλυκίνη -0,1 % SDS Ελέγξτε για τυχόν διαρροές. Γεμίστε κατόπιν την επάνω δεξαμενή (της καθόδου) με buffer ηλεκτροφόρησης. Στην συνέχεια αφαιρέσατε την πλαστική χτένα και τοποθετήστε στα «πηγαδάκια» τα οποία δημιουργούνται 20 μικρολίτρα από τα δείγματα σας με την πιπέτα Pipetman. Σημειώστε στο τετράδιο σας ποιο δείγμα αντιστοιχεί σε κάθε πηγαδάκι. Σε ένα από τα πηγαδάκια θα τοποθετήσετε 10 μικρολίτρα από μίγμα πρωτεϊνών αναφοράς διαφόρων μοριακών βαρών το οποίο θα σας δοθεί. Στην συνέχεια με την βοήθεια πάντα του διδάσκοντα θα συνδέσετε τα ηλεκτρόδια και θα ξεκινήσετε την ηλεκτροφόρηση σε σταθερή τάση 150 Volts. Παρατηρήστε το φαινόμενο του «stacking» το οποίο αναλύσαμε προηγουμένως, δηλ. την σταδιακή «συμπύκνωση» των δειγμάτων σε μια λεπτή μπλε γραμμή. Σταματήστε την ηλεκτροφόρηση όταν η μπλε γραμμή που αντιστοιχεί στο κυανούν της βρωμοφαινόλης φτάσει σε απόσταση περίπου μισού εκατοστού από το τέλος της πηκτής. -2.3 Αφαίρεση πηκτής και χρώση Με τη βοήθεια του διδάσκοντα αφαιρέστε την πηκτή ανάμεσα από τις πλάκες και τοποθετήστε την σε ένα πλαστικό δοχείο όπου περίπου 100 ml από διάλυμα χρωματισμού το οποίο περιέχει: 10

-2, 5 gr κυανούν του Coommassie, Coommassie blue (χρωστική που συνδέεται με τις πρωτεΐνες με μη ομοιοπολικούς (κυρίως ιονικούς και van der Waals δεσμούς) δίνοντας μπλε χρώση. Με αυτή την χρώση μπορεί να ανιχνευτεί έως 0.1 μικρογραμμάριο πρωτεΐνης). -100 ml οξικό οξύ -500 ml μεθανόλη. Μετά από 15 λεπτά αποχύστε το σε φιάλη ανακύκλωσης και αντικαταστήστε το με διάλυμα αποχρωματισμού που περιέχει 5% μεθανόλη και 10% οξικό οξύ. -2.4 Ξήρανση της πηκτής Αποχύστε το διάλυμα αποχρωματισμού, ξεπλύνετε δυο φορές με νερό, και τοποθετήστε την πηκτή για περίπου δέκα λεπτά σε διάλυμα 4% γλυκερίνης και 20% αιθανόλης. Κατόπιν τοποθετήστε το ανάμεσα σε δυο φύλλα σελοφάν στο ειδικό πλαίσιο (θα σας γίνει επίδειξη από τον διδάσκοντα) και αφήστε το να ξεραθεί. ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ-ΑΣΚΗΣΕΙΣ 1) Συμπληρώστε τα επόμενα στάδια στο διάγραμμα καθαρισμού που ακολουθήσατε ΕΚΧΥΛΙΣΗ Με 0,5 M οξικό οξύ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗ Ίζημα Υπερκείμενο Δείγμα Σταδίου 1 2) Συγκρίνετε τα διάφορα στάδια καθαρισμού και βγάλετε τα συμπεράσματα σας. 11

3) Συμπληρώστε τον επόμενο πίνακα με τον ρόλο του κάθε αντιδραστηρίου στην ηλεκτροφόρηση ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟ Στο Buffer δείγματος SDS Γλυκερίνη κυανούν της βρωμοφαινόλης βήτα-μερκαπτοαιθανόλη Tris-HCl ΡΟΛΟΣ Μετουσιώνει τις πρωτεΐνες και τις καλύπτει με αρνητικά φορτία Στο buffer ηλεκτροφόρησης SDS Tris-HCl Γλυκίνη Στην πηκτή πολυακρυλαμιδίου Ακρυλαμίδιο Bis- Ακρυλαμίδιο TEMED Υπερθειικό αμμώνιο (APS) SDS Tris-HCl Στο διάλυμα χρωματισμού Coommassie blue Οξικό οξύ Μεθανόλη Στο διάλυμα ξήρανσης Γλυκερίνη 4) Εξηγήστε ποιος είναι ο ρόλος της «πηκτής συσσώρευσης» στην ηλεκτροφόρηση και με ποιο μηχανισμό επιτυγχάνεται 12

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ -Lubert Stryer et al.,, Βιοχημεία, τόμος Ι, κεφάλαιο 4, Ελληνική μετάφραση, Πέμπτη έκδοση, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, 2004 -C. Branden and J. Tooze, "Εισαγωγή στην δομή των πρωτεϊνών», κεφάλαιο 14.2, Ακαδημαϊκές Εκδόσεις Garland. Ελληνική έκδοση: Ακαδημαϊκές Εκδόσεις Μπάσδρα, 2006 - http://proteopedia.org/wiki/index.php/collagen -Wujing Xian, «A laboratory course in Biomaterials chapter 3, Taylor and Francis, 2009 -Gallop, PM. and Seifter S., Preparation and properties of soluble collagens, Methods in Enzymology, 6: 635-641 (1963) 13