1 Εργαστηριακή Άσκηση στο πλαίσιο του μαθήματος Εξελικτική Οικολογία Πρωτόκολλο εξαγωγής ολικού γενωμικού DNA και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1. Πραγματοποιείται ξήρανση του ιστού στους 37 ο C για 15-24 ώρες περίπου 2. Λειοτριβούμε τον ιστό 3. Προσθέτουμε 700μl διαλύματος εξαγωγής (lysis ή extraction buffer: 0,1M EDTA, 0.05M Tris-HCl ph=8.0, 0.35M NaCl), το οποίο εμποδίζει τη δράση των νουκλεασών και 87 μl SDS 10%, το οποίο διαλύει τα κύτταρα και απελευθερώνει τη χρωματίνη. 4. Επωάζουμε σε υδατόλουτρο στους 55 ο C για 15 λεπτά 5. Προσθέτουμε 10μl πρωτεϊνάση Κ (10mg/ml), η οποία διασπά τις πρωτεΐνες και αναδεύουμε ήπια 6. Επωάζουμε σε υδατόλουτρο, στους 55 ο C για 3-4 ώρες 7. Προσθέτουμε 200μl κορεσμένου διαλύματος NaCl (C >6M) 8. Ανακατεύουμε επίμονα (Vortex) για 15 λεπτά 9. Φυγοκεντρούμε σε μέγιστη ταχύτητα (13.000rpm) για 30 λεπτά 10. Αφαιρούμε το υπερκείμενο διάλυμα (όγκου περίπου 1ml) και το τοποθετούμε σε καινούργιο πλαστικό σωληνάκι όγκου 2ml 11. Προσθέτουμε ίσο όγκο χλωροφορμίου (CHCl 3 ) και αναδεύουμε ελαφρά με το χέρι 12. Φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά στις 13.000 στροφές 13. Παίρνουμε το υπερκείμενο και το μεταφέρουμε σε ένα νέο πλαστικό σωληνάκι όγκου 2ml 14. Προσθέτουμε 1ml παγωμένης ισοπροπανόλης 15. Επωάζουμε στους 20 ο C για τουλάχιστον 1 ώρα 16. Φυγοκεντρούμε για 10 λεπτά στις 13.000 στροφές 17. Απομακρύνουμε την ισοπροπανόλη (υπερκείμενο) 18. Ξεπλένουμε την πελέτα με 0.5ml παγωμένης αιθανόλης 70% 19. Φυγοκεντρούμε για 5 λεπτά στις 13.000 στροφές
2 20. Απομακρύνουμε την αιθανόλη και στεγνώνουμε την πελέτα του DNA σε θερμοκρασία δωματίου για 15-20 ώρες (είτε στους 37οC για λίγες ώρες) 21. Επαναδιαλύουμε το DNA σε 50-100μl ΤΕ (0.01 Μ Tris-HCl, ph 7.5, 0.001 M EDTA) ή ddh2o και τοποθετούμε το διάλυμα στους 37οC για 4-5 ώρες. Προετοιμασία πηκτώματος αγαρόζης (1%) 1. Κλείστε τις άκρες ενός καθαρού, στεγνού πλαστικού πιάτου (plate) με ταινία και τοποθετήστε τα χτενάκια (comb). 2. Προετοιμάστε την απαραίτητη ποσότητα διαλύματος ηλεκτροφόρησης που χρειάζεστε (εδώ 1X TBE) για την δημιουργία του πηκτώματος.. 3. Προσθέστε 1g αγαρόζης σε ένα γυάλινο δοχείο και 100ml 1X TBE (το διάλυμα δεν θα πρέπει να καταλαμβάνει περισσότερο από το 50% του όγκου του δοχείου) 4. Θερμάνετε το δοχείο σε ένα φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί η αγαρόζη 5. Κρυώστε το διάλυμα (~60 o C) και προσθέστε βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr 10mg/ml stock solution) σε τελική συγκέντρωση 0.5μg/ml και ανακατέψτε ελαφρώς. Προσοχή: Το EtBr είναι πολύ τοξικό. Τα γάντια είναι άκρως απαραίτητα. 6. Ρίξτε το διάλυμα της ζεστής αγαρόζης στο πιάτο του βήματος 1. Ελέγξτε αν υπάρχουν φυσαλίδες κάτω ή μεταξύ των δοντιών του χτενιού. 7. Όταν το πήκτωμα είναι έτοιμο (30-45 min σε θερμοκρασία δωματίου), αφαιρέστε με προσοχή τα χτενάκια και τις ταινίες και τοποθετήστε το πιάτο στη μικρή δεξαμενή ηλεκτροφόρησης (tank). 8. Προσθέστε την απαραίτητη ποσότητα διαλύματος ηλεκτροφόρησης ώστε να καλύψει το πήκτωμα. 9. Αναμείξτε το δείγμα του DNA με την απαραίτητη ποσότητα χρωστικής (gel-loading buffer) και νερού (τελικό όγκος 10λ). Φορτώστε αργά το δείγμα στα πηγαδάκια (slots) του βυθισμένου πηκτώματος. 10. Κλείστε το καπάκι της δεξαμενής και εφαρμόστε ηλεκτρικό πεδίο, έτσι ώστε το DNA να κινηθεί προς την άνοδο (red lead). Εάν τα ηλεκτρόδια τοποθετηθούν σωστά, θα δείτε φουσκάλες στα ηλεκτρόδια της ανόδου και της καθόδου (λόγω ηλεκτρόλυσης) και μέσα σε λίγα λεπτά η χρωστική θα αρχίσει να κινείται από τα πηγαδάκια μέσα στο πήκτωμα. Τρέξτε το πήκτωμα για 30-60min. 11. Κλείστε το ηλεκτρικό ρεύμα, αφαιρέστε τα ηλεκτρόδια και το gel από τη δεξαμενή. Ελέγξτε το gel σε υπεριώδη ακτινοβολία και φωτογραφήστε το. Προσοχή: Η υπεριώδης ακτινοβολία είναι πολύ επικίνδυνη, ειδικά για τα μάτια.
Figure 3: Agarose gel electrophoresis. 1. agarose gel (s): slots of the gel (wells), 2., 3. loading DNA-loading buffer mix, 4. start electrophoresis, 5. migration of DNA-loading buffer mix, 6. end of migration 3
4 Τίτλος: Μοριακή φυλογένεση και φυλογεωγραφία του είδους Podarcis cretensis στην Κρήτη. Οι μελέτες μοριακής συστηματικής και φυλογεωγραφίας περιλαμβάνουν τα ακόλουθα στάδια: 1. Καθορισμό του προβλήματος 2. Πραγματοποίηση μια πιλοτικής μελέτης 3. Καθορισμό της στρατηγικής δειγματοληψίας (συλλογή δειγμάτων) 4. Συλλογή δειγμάτων 5. Ανάλυση δειγμάτων και παραγωγή δεδομένων 6. Ανάλυση δεδομένων και ερμηνεία αποτελεσμάτων Λίγα λόγια για το υπό μελέτη ζώο Ανήκει στην οικογένεια Lacertidae, την υποοικογένεια Lacertinae. Οικογένεια Lacertidae: Αποτελείται από τις αληθινές σαύρες (true lizards), οι οποίες διακρίνονται βάση δύο μορφολογικών χαρακτήρων: 1) τις συμμετρικές φολίδες στο κεφάλι και 2) τις κοιλιακές φολίδες που είναι μεγαλύτερες από τις ραχιαίες. Η οικογένεια Lacertidae περιλαμβάνει 24 γένη με περίπου 259 είδη (Fu 1998), που εξαπλώνονται στο μεγαλύτερο τμήμα της Ευρώπης, στην Ασία και στην Αφρική (εικ. 1.3). Στο χώρο της Ευρώπης, τα Lacertidae αποτελούν την επικρατέστερη ομάδα ερπετών αφού περιλαμβάνει περίπου το 75% των ειδών της ευρωπαϊκής ερπετοπανίδας, ενώ είναι αρκετά εντυπωσιακό το γεγονός ότι είναι πιθανό να βρεθούν πάνω από 7 είδη σε μία περιοχή (Arnold & Burton 1985, Arnold 1987). Υποοικογένεια Lacertinae: Η οικογένεια Lacertidae χωρίζεται στις δύο υποοικογένειες Gallotinae και Lacertinae. Η πρώτη αποτελείται από δύο μόνο γένη, ενώ η δεύτερη περιλαμβάνει όλα τα υπόλοιπα, τα οποία σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες ανέρχονται σε 32. Γένος Podarcis: Το γένος Podarcis (Wagler, 1830) έχει πάρει το όνομα του από την ελληνική λέξη «ποδάρκις» που σημαίνει ταχύπους, γοργοπόδαρος. Το γένος αυτό θεωρούνταν μέχρι πρόσφατα υπογένος του γένους Lacerta και η ηλικία του υπολογίζεται
5 στα 18-20 εκατομμύρια χρόνια (Böhme & Corti 1993). Όμως, η μορφολογική και βιοχημική συνάφεια καθώς και οι έντονες οικολογικές και βιογεωγραφικές ομοιότητες που εμφανίζουν μεταξύ τους τα διάφορα είδη, οδήγησαν τον Arnold (1973) στο διαχωρισμό τους από τα υπόλοιπα είδη του γένους Lacerta. Το γένος Podarcis περιλαμβάνει σήμερα 20 αναγνωρισμένα είδη (Poulakakis et al. 2005, Lymberakis et al. 2008) που εξαπλώνονται στο χώρο της Νότιας Ευρώπης, αποτελώντας την κυρίαρχη ομάδα ερπετών στο χώρο αυτό (εικόνα 1). Εικόνα 1: Κατανομή του γένους Podarcis. Η διακεκομμένη γραμμή υποδηλώνει τα ανατολικά όρια του γένους (Arnold 1973). Σε γενικές γραμμές, η συστηματική των Podarcis είναι αρκετά πολύπλοκη και ασταθής, επειδή τα είδη από τη μια έχουν παρόμοια μορφολογία και από την άλλη εμφανίζουν αξιοσημείωτη ενδοειδική ποικιλότητα (Arnold & Burton 1978). Στην Ελλάδα εξαπλώνονται 8 είδη του γένους Podarcis από τα οποία 5 είναι ενδημικά της Ελλάδας (P. peloponnesiaca της Πελοποννήσου, P. milensis της Μήλου, P. gaigeae της Σκύρου, P. cretensis της Κρήτης και P. levendis της νησίδας Πορί) και 1 είναι ενδημικό της νότιας βαλκανικής χερσονήσου (P. erhardii). Τα άλλα είδη είναι τα P. muralis και P. taurica, από τα οποία το πρώτο εξαπλώνεται σε όλη την ηπειρωτική Ελλάδα και απουσιάζει πλήρως από τα νησιά, και το δεύτερο σε όλη την ηπειρωτική Ελλάδα, στα νησιά του Ιονίου πελάγους, πλην της Λευκάδας, και στη Θασοπούλα. Σκοπός του εργαστηρίου
6 Η μοριακή εξέλιξη είναι ένας νέος επιστημονικός κλάδος γνώσης, ο οποίος στερείται για την ώρα την πλειονότητα της βασικής πληροφορίας και στον οποίο οι νέες ανακαλύψεις λύνουν ορισμένα προβλήματα, αλλά σχεδόν πάντα την ίδια στιγμή δημιουργούν καινούρια. Η εφαρμογή λοιπόν των σχετικά νέων αρχών της μοριακής εξέλιξης σε επίπεδο φυλογένεσης και φυλογεωγραφίας των ειδών θα ρίξει άπλετο φως στην εξελικτική ιστορία των οργανισμών του πλανήτη μας και θα βοηθήσει στην αποκρυπτογράφηση του δέντρου της ζωής, πολλά σημεία του οποίου είναι είτε ασαφή είτε πλήρως άγνωστα. Αυτό βέβαια δεν μπορεί ούτε πρόκειται να γίνει από έναν και μόνο επιστήμονα ούτε σε μια και μόνο εργασία. Κάθε επιστήμονας του χώρου της μοριακής εξέλιξης θα προσθέτει ένα μικρό λιθαράκι στην αποσαφήνιση των διαφόρων προβλημάτων στο χώρο της φυλογενετικής και της εξελικτικής βιολογίας, ώστε σε σύντομο σχετικά χρονικό διάστημα, δεδομένης της ταχύτητας παραγωγής δεδομένων σήμερα να οδηγηθούμε σε ένα ολοκληρωμένο δέντρο, το δέντρο της ζωής. Αυτός είναι και ο στόχος αυτής της διατριβής. Η προσθήκη δηλαδή ενός ακόμη μικρού λιθαριού στην προσπάθεια επίλυσης των φυλογενετικών ερωτημάτων με τη μελέτη και την αποσαφήνιση, μέσω μοριακών τεχνικών και δεδομένων, των φυλογενετικών διεργασιών που έχουν οδηγήσει στη σημερινή ταξινομική και βιογεωγραφική κατάσταση τις σαύρες του γένους Podarcis (Sauria, Lacertidae) στη βαλκανική χερσόνησο. Στη παρούσα εργασία εξετάζονται για πρώτη φορά στην Ελλάδα οι φυλογενετικές σχέσεις των πληθυσμών τους είδους Podarcis cretensis (Sauria, Lacertidae) της Κρήτης. Συγκεκριμένα αναζητούνται οι μεταξύ τους σχέσεις ώστε να ελεγχθεί μέσω της φυλογένεσης η υπάρχουσα ταξινομική τους κατάσταση, να εξηγηθεί η σύγχρονη κατανομή τους στο χώρο της Κρήτης και σε συνδυασμό με τη σχετικά καλή γνώση της παλαιογεωγραφίας του ελληνικού χώρου και της εφαρμογής ενός εξελικτικού ρολογιού να ανασυσταθεί μια πιθανή εξελικτική ιστορία για τα συγκεκριμένα είδη. Podarcis cretensis (Wettstein, 1952)
7 Αρσενικό άτομο P. cretensis από τη βορειοδυτική Κρήτη (Lymberakis et al. 2008). Σχετική βιβλιογραφία Arnold EN 1973. Relationships of the Palaearctic Lizards assigned to the genera Lacerta, Algyroides and Psammodromus (Reptilia: Lacertidae). Bulletin of the British Museum Natural History, 25, 291-366. Arnold EN 1987. Resource partition among lacertid lizards in southern Europe. J. Zool., 1, 739-782. Arnold EN & Burton JA 1978. A field guide to the reptiles and amphibians of Britain and Europe, Collins, London. Böhme W & Corti C 1993. Zoogeography of the lacertid lizards of the western Mediterranean basin. In: Lacertids of the Mediterranean region (E. D. Valakos, W. Böhme, V. Pérez-Mellado, P. Maragou, Eds.), pp. 17-33, Hellenic Zoological Society, Athens. Fu J 1998. Towards the phylogeny of the family Lacertidae-Why 4708 base pairs of mtdna sequences cannot draw the picture. Biol. J. Linn. Soc., 71, 203-217. Lymberakis P, Poulakakis N, Kaliontzopotilou A, Valakos E, Mylonas M 2008. Two new species of Podarcis (Squamata; Lacertidae) from Greece. Systematics and Biodiversity 6, 307-318. Poulakakis N, Lymberakis P, Valakos E, Zouros E, Mylonas M 2005. Phylogenetic relationships and biogeography of Podarcis species from the Balkan Peninsula, by Bayesian and maximum likelihood analyses of mitochondrial DNA sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution 37, 845-857.