Εμαγωγή DNA (DNA Extraction) Εξγαζηεξηαθή Άζθεζε ζην πιαίζην ηνπ καζήκαηνο Εμειηθηηθή Οηθνινγία

Transcript

1 Εμαγωγή DNA (DNA Extraction) Εξγαζηεξηαθή Άζθεζε ζην πιαίζην ηνπ καζήκαηνο Εμειηθηηθή Οηθνινγία

2 Εμαγωγή DNA (DNA Extraction) DNA extraction: δηαδηθαζία απνκόλσζεο ηνπ γελσκηθνύ πιηθνύ ελόο βηνινγηθνύ δείγκαηνο. Σηόρνο: ν δηαρσξηζκόο ηνπ DNA από άιια θπηηαξηθά ζπζηαηηθά θαη καθξνκόξηα. Πξώηε θνξά: Friedrich Miescher 1869

3 Εθαξκνγέο Έξεπλα: αιιεινύρηζε, θισλνπνίεζε γνληδίσλ θ.α. Ιαηξηθή: γελεηηθή πξνδηάζεζε, κηθξνβηνινγία θ.α. Δγθιεκαηνινγία: αλαγλώξηζε ππόπησλ, ηεζη παηξόηεηαο θιπ

4 Πεγέο Οηηδήπνηε δσληαλό ή λεθξό (θξέζθν ή ζπληεξεκέλν) Κνηλέο πεγέο: Αίκα Μπτθόο ηζηόο Κόθθαιν Σηνκαηηθά θύηηαξα (bucal swabs) Κύηηαξα θαιιηέξγεηαο Ακληνθύηηαξα Σάιην, νύξα θαη άιια ζσκαηηθά πγξά Φώκα - Νεξό (ειεύζεξν DNA) Σπληεξεκέλα δείγκαηα: Μνπζεηαθά δείγκαηα (πρ αιθνόιε) Παγσκέλα δείγκαηα Δληαθηαζκέλα δείγκαηα Αξραηνινγηθά δείγκαηα Απνμεξακέλα δείγκαηα

5 Πξωηόθνιια θαη ηερληθέο Δπηινγή Πξσηνθόιινπ: Πνηόηεηα θαη Μνξηαθό Βάξνο DNA Δπηζπκεηή «θαζαξόηεηα» ηνπ DNA Κόζηνο Βαζηθά Βήκαηα: 1. Γηάξξεμε θαη ιύζε ησλ θπηηάξσλ 2. Απνκάθξπλζε πξσηετλώλ θαη άιισλ καθξνκνξίσλ 3. Αλάθηεζε ηνπ DNA

6 1. Λύζε θπηηάξωλ Φξήζε απνξξππαληηθνύ Πξσηετλάζε (θαη πξναηξεηηθά RNAάζε)

7 2. Δηαρωξηζκόο DNA από άιια βηνκόξηα Τν DNA πξέπεη λα δηαρσξηζηεί από ηηο πξσηεΐλεο (πρ ηζηόλεο) θαη άιια θπηηαξηθά ππνιείκκαηα Γύν θύξηεο κέζνδνη: Φξήζε Αιάησλ πςειήο ζπγθέληξσζεο Φαηλόιε: Φισξνθόξκην

8 Φαηλόιε: Χιωξνθόξκην Φαηλόιε: Απνδηαηάζεη ηηο πξσηεΐλεο θαη ηηο δηαιπηνπνηεί Απνηέιεζκα: Γεκηνπξγία δύν θάζεσλ ζην δηάιπκα Υδαηηθή Φάζε (άλσ): DNA Οξγαληθή Φάζε (θάησ): πξσηεΐλεο

9 Άιαηα Σε πςειή ζπγθέληξσζε αιάησλ, νη πξσηεΐλεο απνμεξαίλνληαη, ράλνπλ ηε δηαιπηόηεηά ηνπο θαη θαηαθξεκλίδνληαη. Sodium chloride, potassium acetate or ammonium acetate Φπγνθέληξηζε: Οη πξσηεΐλεο θαζηδάλνπλ ζε κνξθή πειέηαο Τν ππεξθείκελν πεξηέρεη ην DNA

10 3. Καηαθξήκληζε ηνπ DNA κε αιθνόι α) Φξέζθα δείγκαηα: αηζαλόιε ζηελ πάλσ θάζε ζπκππθλσκέλν DNA ζηελ θάησ θάζε ιήςε ηλώλ DNA κε πάιηλε ξάβδν β) ζπληεξεκέλα (ύζηεξα από θπγνθέληξηζε): DNA σο ίδεκα (πειέηα) Τέινο Δπαλαδηάιπζε ηνπ DNA ζε ππεξθάζαξν λεξό ή ξπζκηζηηθό δηάιπκα

11

12 1. Πξαγκαηνπνηείηαη μήξαλζε ηνπ ηζηνύ ζηνπο 37 ν C γηα ώξεο πεξίπνπ 2. Λεηνηξηβνύκε ηνλ ηζηό Πξωηόθνιιν 3. Πξνζζέηνπκε 700κl δηαιύκαηνο εμαγσγήο (lysis ή extraction buffer: 0,1M EDTA, 0.05M Tris-HCl ph=8.0, 0.35M NaCl), ην νπνίν εκπνδίδεη ηε δξάζε ησλ λνπθιεαζώλ θαη 87 κl SDS 10%, ην νπνίν δηαιύεη ηα θύηηαξα θαη απειεπζεξώλεη ηε ρξσκαηίλε 4. Δπσάδνπκε ζε πδαηόινπηξν ζηνπο 55 ν C γηα 15 ιεπηά 5. Πξνζζέηνπκε 10κl πξσηετλάζε Κ (10mg/ml), ε νπνία δηαζπά ηηο πξσηεΐλεο θαη αλαδεύνπκε ήπηα 6. Δπσάδνπκε ζε πδαηόινπηξν, ζηνπο 55 ν C γηα 3-4 ώξεο

13 Πξωηόθνιιν 7. Πξνζζέηνπκε 200κl θνξεζκέλνπ δηαιύκαηνο NaCl (C >6M) 8. Αλαθαηεύνπκε επίκνλα (Vortex) γηα 15 ιεπηά 9. Φπγνθεληξνύκε ζε κέγηζηε ηαρύηεηα (13.000rpm) γηα 30 ιεπηά 10. Αθαηξνύκε ην ππεξθείκελν δηάιπκα (όγθνπ πεξίπνπ 1ml) θαη ην ηνπνζεηνύκε ζε θαηλνύξγην πιαζηηθό ζσιελάθη όγθνπ 2ml 11. Πξνζζέηνπκε ίζν όγθν ρισξνθνξκίνπ (CHCl 3 ) θαη αλαδεύνπκε ειαθξά κε ην ρέξη 12. Φπγνθεληξνύκε γηα 10 ιεπηά ζηηο ζηξνθέο

14 Πξωηόθνιιν 13. Παίξλνπκε ην ππεξθείκελν θαη ην κεηαθέξνπκε ζε έλα λέν πιαζηηθό ζσιελάθη όγθνπ 2ml 14. Πξνζζέηνπκε 1ml παγσκέλεο ηζνπξνπαλόιεο 15. Δπσάδνπκε ζηνπο 20 ν C γηα ηνπιάρηζηνλ 1 ώξα 16. Φπγνθεληξνύκε γηα 10 ιεπηά ζηηο ζηξνθέο 17. Απνκαθξύλνπκε ηελ ηζνπξνπαλόιε (ππεξθείκελν) 18. Ξεπιέλνπκε ηελ πειέηα κε 0.5ml παγσκέλεο αηζαλόιεο 70% 19. Φπγνθεληξνύκε γηα 5 ιεπηά ζηηο ζηξνθέο

15 Πξωηόθνιιν 20. Απνκαθξύλνπκε ηελ αηζαλόιε θαη ζηεγλώλνπκε ηελ πειέηα ηνπ DNA ζε ζεξκνθξαζία δσκαηίνπ γηα ώξεο (είηε ζηνπο 37 ν C γηα ιίγεο ώξεο) 21. Δπαλαδηαιύνπκε ην DNA ζε κl ΤΔ (0.01 Μ Tris- HCl, ph 7.5, M EDTA) ή ddh2o θαη ηνπνζεηνύκε ην δηάιπκα ζηνπο 37 ν C γηα 4-5 ώξεο.

16 Ηιεθηξνθόξεζε ζε πήθηωκα (gel) αγαξόδεο

17 Μνξηαθή θπινγέλεζε θαη θπινγεωγξαθία ηνπ είδνπο Podarcis cretensis στην Κρήτη.

18 Οη κειέηεο κνξηαθήο ζπζηεκαηηθήο θαη θπινγεσγξαθίαο πεξηιακβάλνπλ ηα αθόινπζα ζηάδηα: 1. Καζνξηζκό ηνπ πξνβιήκαηνο 2. Πξαγκαηνπνίεζε κηα πηινηηθήο κειέηεο 3. Καζνξηζκό ηεο ζηξαηεγηθήο δεηγκαηνιεςίαο (ζπιινγή δεηγκάησλ) 4. Σπιινγή δεηγκάησλ 5. Αλάιπζε δεηγκάησλ θαη παξαγσγή δεδνκέλσλ 6. Αλάιπζε δεδνκέλσλ θαη εξκελεία απνηειεζκάησλ

19 Podarcis (Wagler, 1830) (Arnold 1973) Podarcis (Squamata: Lacertidae) ----->ν γνξγνπόδαξνο Η θπξίαξρε νκάδα εξπεηώλ ζηε λόηηα Δπξώπε Πνιύ θαιά κειεηεκέλε νκάδα Πεξίπινθή θαη αζηαζήο ζπζηεκαηηθή 21 αλαγλσξηζκέλα είδε (Speybroeck et al. 2010)

20 Κύξηεο Φπινγελεηηθέο Οκάδεο (Harris & Arnold 1999) (IUCN 2014) Ννηηνδπηηθή Μεζνγεηαθή Οκάδα P. bocagei P. carbonelli P. hispanicus P. liolepis P. vaucheri Οκάδα Γπηηθώλ Νεζηώλ ηεο Μεζνγείνπ P. filfolensis P. lilfordi P. pityusensis P. tiliguerta Ιηαιηθή Οκάδα P. muralis P. raffonei P. siculus P. waglerianus Βαιθαληθή Οκάδα P. cretensis P. erhardii P. gaigeae P. levendis P. melisellensis P. milensis P. peloponnesiacus P. tauricus

21 Καηαλνκέο ειιεληθώλ εηδώλ ηνπ γέλνπο - κε ελδεκηθά Podarcis muralis Podarcis erhardii Podarcis tauricus

22 Καηαλνκέο ειιεληθώλ εηδώλ ηνπ γέλνπο - ελδεκηθά Podarcis peloponnesiacus Podarcis milensis Podarcis gaigeae Podarcis levendis Podarcis cretensis

23 Podarcis cretensis

24 Σηόρνο ηνπ εξγαζηεξίνπ Γηεξεύλεζε ησλ θπινγελεηηθώλ ζρέζεσλ ησλ πιεζπζκώλ ηνπο είδνπο Podarcis cretensis ηεο Κξήηεο Έιεγρνο κέζσ ηεο θπινγέλεζεο ηεο ππάξρνπζαο ηαμηλνκηθήο ηνπο θαηάζηαζεο Δμήγεζε ηεο ζύγρξνλεο θαηαλνκήο ηνπο ζην ρώξν ηεο Κξήηεο

25