Άσκηση 8: Κυτταρική διαίρεση Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι η κατανόηση των μηχανισμών πυρηνικής διαίρεσης στο ζωικό και στο φυτικό κύτταρο. Στο εισαγωγικό μέρος παρουσιάζεται η μίτωση και η μείωση ως μέρος του κυτταρικού κύκλου και περιγράφονται η δομή, η μορφολογία και η κίνηση των χρωμοσωμάτων. Ακολούθως, γίνεται αναφορά στα στάδια της μίτωσης και στις μορφολογικές τροποποιήσεις που είναι ορατές με το μικροσκόπιο. Στο πρακτικό μέρος περιγράφεται η πειραματική διαδικασία για την παρατήρηση μιτωτικών χρωμοσωμάτων σε μόνιμα παρασκευάσματα, αλλά και σε νωπά από ακρορρίζια κρεμμυδιού που κατεργάζονται κατάλληλα και βάφονται με χρωστική Feulgen. Επιπλέον, δίνονται πληροφορίες για τη μελέτη του καρυότυπου του ανθρώπου και αντιπροσωπευτικών φυτικών ειδών, για την παρατήρηση πολυταινικών χρωμοσωμάτων, καθώς και για τις αναπαραγωγικές διεργασίες στο φύκος Spirogyra (μονογονική-αμφιγονική αναπαραγωγή) που παρατηρείται μικροσκοπικά στο πλαίσιο της άσκησης. Στο τέλος της άσκησης ο φοιτητής καλείται να απαντήσει σε ερωτήσεις αυτοαξιολόγησης. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος I), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-306-7, ο φοιτητής θα πρέπει να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 12: Ο κυτταρικός κύκλος, και στο Κεφάλαιο 13: Μείωση και φυλετικοί βιολογικοί κύκλοι. 1. Εισαγωγικό μέρος Στους μονοκύτταρους οργανισμούς, με την κυτταρική διαίρεση επιτυγχάνεται η αύξηση του ολικού αριθμού των ατόμων ενός πληθυσμού. Στους πολυκύτταρους οργανισμούς, με την κυτταρική διαίρεση αυξάνεται ο αριθμός των κυττάρων του οργανισμού και αντικαθίστανται τα κατεστραμμένα κύτταρα. Με βάση την αρχή ότι «τα κύτταρα προέρχονται μόνο από προϋπάρχοντα κύτταρα και ότι ο μόνος τρόπος για να γίνουν περισσότερα είναι η διαίρεση των προϋπαρχόντων κυττάρων» (Rudolf Virchow, 1858) όλοι οι οργανισμοί, από τους μονοκύτταρους μέχρι τα πολυκύτταρα θηλαστικά, είναι προϊόντα επανειλημμένων κύκλων κυτταρικής αύξησης και διαίρεσης. Δηλαδή, η κυτταρική διαίρεση συνιστά και τη βάση αναπαραγωγής των οργανισμών, τόσο αυτών που αναπαράγονται μονογονικά όσο και εκείνων που αναπαράγονται αμφιγονικά (διαμέσου της δημιουργίας των γαμετών). Κατά τη διαίρεση των κυττάρων, ο πυρήνας διαιρείται είτε για να διατηρήσει το γενετικό υλικό, είτε για να το μειώσει στο μισό σε οργανισμούς που αναπαράγονται φυλετικά. Ο πρώτος τρόπος διαίρεσης του πυρήνα καλείται μίτωση και έχει ως αποτέλεσμα τη σταθερότητα των οργανισμών. Ο δεύτερος τρόπος καλείται μείωση και έχει ως αποτέλεσμα την παραλλακτικότητα και τη γενετική ποικιλότητα των οργανισμών. Και στους δύο τρόπους διαίρεσης του πυρήνα, υπάρχει αντίστοιχα ένας μηχανισμός ακριβείας, που κάνει τη χρωματίνη να σχηματίζει τα μορφολογικώς καθορισμένα χρωμοσώματα (χαρακτηριστικά για κάθε είδος οργανισμού) ώστε να γίνει ευκολότερη και ακριβέστερη η διαίρεση του γενετικού υλικού. 1.1. Η μίτωση και η μείωση ως μέρος του κυτταρικού κύκλου Ένας τρόπος για να κατανοήσουμε τη μίτωση και τη μείωση είναι να θεωρήσουμε τις διεργασίες αυτές ως μέρος του κύκλου ζωής ενός κυττάρου. Κάθε φορά που ένα κύτταρο διαιρείται μιτωτικά (ή μειωτικά) περνά από μια σειρά διαδοχικών φάσεων κατά τις οποίες συμβαίνουν διάφορα γεγονότα. Η χρονική περίοδος από το τέλος μιας κυτταρικής διαίρεσης μέχρι το τέλος της επόμενης συμβολίζεται σαν μια κυκλική πορεία εναλλασσόμενων φάσεων της ζωής του κυττάρου που καλείται κυτταρικός κύκλος (Εικ.8.1). Όπως περιγράφηκε αναλυτικά την Άσκηση 7 (βλέπε εισαγωγικό μέρος της Άσκησης 7), ο κυτταρικός κύκλος περιλαμβάνει τη μεσόφαση και την περίοδο της κυτταρικής διαίρεσης (μίτωση ή μείωση). Προκειμένου το κύτταρο να διαιρεθεί πρέπει προηγουμένως να διπλασιάσει το γενετικό του υλικό, καθώς και τα υποκυτταρικά του οργανίδια. Η σύνθεση του DNA γίνεται στη φάση S της μεσόφασης, στο τέλος της οποίας τα κύτταρα έχουν αντιγράψει όλο το γενετικό υλικό και έτσι έχουν διπλάσιο ποσό DNA από ό,τι το αρχικό κύτταρο και φυσικά δύο σειρές γενετικής πληροφορίας. Η φάση S χρησιμεύει ως σημάδι για τον καθορισμό - 103 -
των άλλων φάσεων της μεσόφασης. Συνήθως, από τη στιγμή που θα «γεννηθεί» το κύτταρο μέχρι να αρχίσει η αντιγραφή του DNA, περνά ένα ορισμένο χρονικό διάστημα (φάση G 1 ), ενώ από τη στιγμή που θα γίνει η αντιγραφή του DNA μέχρι να αρχίσει η διαίρεση του κυττάρου περνά ένα ακόμη χρονικό διάστημα (φάση G 2 ), στο τέλος της οποίας αρχίζει η περίοδος της πυρηνικής διαίρεσης, γνωστής ως φάση Μ (μίτωση ή μείωση). Ας σημειωθεί ξανά ότι η χρονική διάρκεια των φάσεων του κυτταρικού κύκλου διαφέρει στα διάφορα είδη κυττάρων, ενώ οι διαφορές είναι ασήμαντες σε κύτταρα του ιδίου τύπου. Επιπλέον, σε αντίθεση με τις άλλες φάσεις, η διάρκεια της φάσης G 1 επηρεάζεται από φυσιολογικούς ή περιβαλλοντικούς παράγοντες (βλέπε Άσκηση 7) και μπορεί να διαφέρει σημαντικά μεταξύ διαφόρων κυτταρικών τύπων, αλλά και μέσα στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Εικόνα 8.1 Ο κυτταρικός κύκλος. Τη διαδικασία διαίρεσης του πυρήνα (καρυοκίνηση) ακολουθεί, κατά κανόνα αμέσως, η κυτταροκίνηση, δηλαδή η διαδικασία διαίρεσης του κυτταροπλάσματος. Με την ολοκλήρωση της μίτωσης και της κυτταροκίνησης, το κύτταρο παύει να υφίσταται ως μεμονωμένη οντότητα και δίνει τη θέση του σε δύο νέα θυγατρικά κύτταρα, γενετικά ισοδύναμα με το γονικό (Εικ.8.1). 1.2. Γενετικό αποτέλεσμα της μίτωσης και της μείωσης Ένας άλλος τρόπος για να κατανοήσουμε τη βιολογική σημασία και τις διαφορές της μίτωσης και της μείωσης είναι με βάση το τελικό γενετικό αποτέλεσμα. Σκοπός της μίτωσης είναι ο ακριβοδίκαιος διαχωρισμός των χρωμοσωμάτων και ο σχηματισμός δύο νέων θυγατρικών κυττάρων. Στη μίτωση, οι δημιουργούμενοι νέοι πυρήνες είναι δύο και έχουν το ίδιο ποσοτικά και ποιοτικά γενετικό υλικό με τον αρχικό διαιρούμενο πυρήνα. Με άλλα λόγια, τα κύτταρα που προκύπτουν μετά από μιτωτική διαίρεση ενός κυττάρου, είτε αυτό είναι απλοειδές (μία σειρά χρωμοσωμάτων) είτε διπλοειδές (δύο σειρές χρωμοσωμάτων), είναι γενετικά ισοδύναμα με το γονικό κύτταρο. Αντίθετα, τα κύτταρα που προκύπτουν από μειωτική διαίρεση είναι τόσο ποσοτικά όσο και ποιοτικά γενετικά ανόμοια από τα γονικά κύτταρα. Έτσι, όταν ένας διπλοειδής πυρήνας διαιρείται μειωτικά προκύπτουν τέσσερεις απλοειδείς πυρήνες, που ο καθένας έχει το μισό γενετικό υλικό από τον αρχικό πυρήνα. Η κατανόηση των μηχανισμών της μιτωτικής και της μειωτικής διαίρεσης απαιτεί τη γνώση της δομής και του τρόπου κίνησης των χρωμοσωμάτων. - 104 -
1.3. Δομή, μορφολογία και κίνηση χρωμοσωμάτων Τα χρωμοσώματα αποτελούνται από DNA, RNA και πρωτεΐνες. Μικροσκοπική παρατήρηση του πυρήνα ενός κυττάρου που βρίσκεται στο στάδιο της μεσόφασης, φανερώνει ότι κατά τη χρονική αυτή περίοδο τα χρωμοσώματα δεν είναι διακριτά, αλλά έχουν μορφή διάχυτων λεπτών ινιδίων (χρωματίνη). Τέτοιοι πυρήνες καλούνται μεσοφασικοί πυρήνες (βλέπε παρακάτω Εικ. 8.5). Ωστόσο, σε μοριακό επίπεδο, το γενετικό υλικό βρίσκεται πακεταρισμένο σε καλά οργανωμένες υπερμοριακές δομές. Κατά τη μίτωση και τη μείωση τα χρωμοσώματα αποκτούν μορφολογικά διακριτή εμφάνιση καθώς μεταπίπτουν σταδιακά από τη διάχυτη μορφή των λεπτών ινιδίων σε συμπαγείς και αναγνωρίσιμες μικροσκοπικά μονάδες. Η μετάπτωση αυτή είναι αποτέλεσμα υψηλού βαθμού συμπύκνωσης και υπερελίκωσης των ινιδίων χρωματίνης (βλέπε και Άσκηση 10). Όλα τα ευκαρυωτικά διπλοειδή κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G 1 της μεσόφασης έχουν τα γονίδιά τους εις διπλούν. Καθένα από τα δύο γονίδια ενός ζεύγους γονιδίων αποτελεί τμήμα ξεχωριστού κομματιού DNA, τα οποία οργανώνονται ως δύο διαφορετικά χρωμοσώματα που καλούνται ομόλογα χρωμοσώματα (Εικ. 8.2). Δηλαδή, τα διπλοειδή κύτταρα φέρουν δύο σειρές χρωμοσωμάτων: η μία προέρχεται από τη μητέρα και η άλλη από τον πατέρα. Το ίδιο γονίδιο μπορεί να έχει διαφορετική μορφή στα δύο ομόλογα χρωμοσώματα (π.χ. Α και α), οπότε αναφερόμαστε σε αλληλόμορφα του ίδιου γονιδίου. Άρα, οι δύο σειρές χρωμοσωμάτων δεν είναι γενετικά ταυτόσημες, γι αυτό και καλούνται ομόλογα χρωμοσώματα. Κάθε ομόλογο χρωμόσωμα αποτελείται από ένα δίκλωνο μόριο DNA που κατά τη διάρκεια της φάσης S του κυτταρικού κύκλου αντιγράφεται κατά τον ημισυντηρητικό τρόπο. Επομένως, μετά το διπλασιασμό του DNA το κύτταρο έχει πλέον τέσσερα αντίγραφα του ίδιου γονιδίου, τοποθετημένα στα ομόλογα χρωμοσώματα, κάθε ένα από τα οποία αποτελείται από δύο αδελφές χρωματίδες που συγκρατούνται ενωμένες στην περιοχή του κεντρομεριδίου (Εικ. 8.2). Εικόνα 8.2 Μορφολογία μιτωτικού χρωμοσώματος. Η θέση του κεντρομεριδίου πάνω στο χρωμόσωμα ορίζει και το χαρακτηριστικό σχήμα του χρωμοσώματος (Εικ. 8.3). Με βάση αυτή τη θέση, τα χρωμοσώματα κατατάσσονται σε μετακεντρικά (εκείνα που έχουν δύο ίσους βραχίονες, έχουν δηλαδή το κεντρομερίδιο περίπου στη μέση), σε υπομετακεντρικά (εκείνα που έχουν άνισους βραχίονες), σε ακροκεντρικά (εκείνα που έχουν το κεντρομερίδιο πολύ κοντά στην άκρη και ο ένας βραχίονας έχει πολύ μικρό μέγεθος σε σύγκριση με τον άλλο) και σε τελοκεντρικά. - 105 -
Τα χρωμοσώματα εκτός από το κεντρομερίδιο (πρωτογενής περίσφιξη) έχουν μερικές φορές και δευτερογενείς περισφίξεις, μία ή περισσότερες. Όταν οι δευτερογενείς περισφίξεις αποχωρίζουν ένα μικρό σφαιρικό τμήμα χρωμοσώματος αυτό καλείται δορυφόρος και τα αντίστοιχα χρωμοσώματα δορυφορικά. Εικόνα 8.3 Μορφολογία μιτωτικού χρωμοσώματος. Στην περιοχή του κεντρομεριδίου συγκροτείται κατά την πρόφαση ένα σημαντικό πρωτεϊνικό σύμπλοκο, ο κινητοχώρος, στον οποίο προσδένονται οι μικροσωληνίσκοι της πυρηνικής ατράκτου (Εικ. 8.2 και 8.4). Η άτρακτος, που αρχίζει να σχηματίζεται κατά το στάδιο της πρόφασης της μιτωτικής και της μειωτικής διαίρεσης, συγκροτείται από μικροσωληνίσκους που οργανώνονται σε ειδικά κέντρα οργάνωσης μικροσωληνίσκων. Στο ζωικό κύτταρο, το κέντρο οργάνωσης των μικροσωληνίσκων είναι το κεντροσωμάτιο (το οποίο περιλαμβάνει δύο κεντριόλια, κάθε ένα από τα οποία αποτελείται από ένα σύνολο μικροσωληνίσκων) που έχει ήδη διπλασιαστεί κατά τη μεσόφαση. Από κάθε κεντροσωμάτιο προβάλλουν ακτινωτά μικροσωληνίσκοι δημιουργώντας μια δομή γνωστή ως αστρόσφαιρα ή αστέρας. Καθώς τα δύο κεντροσωμάτια μετακινούνται προς τους αντίθετους πόλους του κυττάρου, οι μικροσωληνίσκοι που εκπορεύονται πληθαίνουν, επιμηκύνονται, προσανατολίζονται προς όλες τις κατευθύνσεις και σταθεροποιούνται με διάφορους τρόπους, για να σχηματίσουν τελικά την άτρακτο. Ορισμένοι μικροσωληνίσκοι συναντούν τους μικροσωληνίσκους του άλλου πόλου (πολικοί μικροσωληνίσκοι), ενώ άλλοι εκτείνονται από τα κεντροσωμάτια μέχρι τους κινητοχώρους και χρησιμεύουν για την κίνηση των χρωμοσωμάτων (Εικ. 8.4). Στα φυτικά κύτταρα η άτρακτος δεν οργανώνεται από κεντροσωμάτια, αφού δεν διαθέτουν τέτοια, αλλά από μια περιοχή ανάλογη της κεντροσωματικής. Εικόνα 8.4 Η πυρηνική άτρακτος. Διαγραμματική απεικόνιση της ατράκτου (αριστερά) και φωτογραφία από μικροσκόπιο φθορισμού (δεξιά) όπου διακρίνονται οι μικροσωληνίσκοι (με πράσινο χρώμα). - 106 -
1.4. Μίτωση: Μηχανισμός πυρηνικής διαίρεσης Κατά τη μίτωση συμβαίνουν μορφολογικές τροποποιήσεις που είναι ορατές στο φωτονικό μικροσκόπιο. Με βάση τις μορφολογικές διαφορές των χρωμοσωμάτων, που βασίζονται κυρίως στην εμφάνιση και στη συμπεριφορά τους, η μίτωση διακρίνεται για καθαρά διδακτικούς λόγους σε τέσσερεις κύριες φάσεις που αναφέρονται ως πρόφαση, μετάφαση, ανάφαση και τελόφαση (Εικ. 8.5 και 8.6). Στην πραγματικότητα η μίτωση είναι μια συνεχής διαδικασία, η διάρκεια της οποίας ποικίλει στους διάφορους οργανισμούς. Για τα περισσότερα κύτταρα η διάρκεια της μίτωσης κυμαίνεται μεταξύ 1 και 4 ωρών. Στη συνέχεια περιγράφονται με συντομία οι κύριες φάσεις της μιτωτικής διαίρεσης, καθώς και ο μεσοφασικός πυρήνας: Μεσόφαση: Ο μεσοφασικός πυρήνας (που προηγείται μιας νέας διαίρεσης) χαρακτηρίζεται κυρίως από το διπλασιασμό του DNA. Στη φάση αυτή τα χρωμοσώματα δεν είναι διακριτά. Το γενετικό υλικό βρίσκεται με τη μορφή διάχυτων ινιδίων και ονομάζεται χρωματίνη (Εικ. 8.5). Πρόφαση: Χαρακτηρίζεται από τη συσπείρωση των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων, τα οποία σταδιακά βραχύνονται και παχύνονται δημιουργώντας σχηματισμούς ορατούς στο φωτονικό μικροσκόπιο (Εικ. 8.5). Καθώς προχωρά η πρόφαση, εξαφανίζονται σταδιακά οι πυρηνίσκοι και διαλύεται η πυρηνική μεμβράνη. Συγχρόνως, αρχίζει να σχηματίζεται η πυρηνική άτρακτος. Μετάφαση: Ως μετάφαση χαρακτηρίζεται εκείνη η χρονική περίοδος κατά την οποία τα χρωμοσώματα έχουν όλα ευθυγραμμισθεί στον ισημερινό του κυττάρου (Εικ. 8.5) και περιμένουν το σήμα για την έναρξη της κίνησής τους προς τους πόλους (ανάφαση). Τα χρωμοσώματα διακρίνονται ήδη χωρισμένα στις δύο αδελφές χρωματίδες που είναι ενωμένες μόνο στο κεντρομέρος τους. Ανάφαση: Χαρακτηριστικό της φάσης αυτής είναι η κίνηση των αδελφών χρωματίδων προς τους αντίθετους πόλους του κυττάρου (Εικ. 8.5). Η ανάφαση είναι η μικρότερη χρονικά φάση της μίτωσης, διαρκεί μόνο λίγα λεπτά της ώρας και τελειώνει μόλις τα θυγατρικά χρωμοσώματα φθάσουν στους πόλους της ατράκτου. Τελόφαση: Αρχίζει με τη συγκέντρωση όλων των θυγατρικών χρωμοσωμάτων στους πόλους. Στη φάση αυτή τα χρωμοσώματα αποσυσπειρώνονται βαθμιαία και παίρνουν τη χαρακτηριστική μορφή των ινιδίων χρωματίνης της μεσόφασης (Εικ. 8.5). Συγχρόνως, η άτρακτος αποσυναρμολογείται, επανεμφανίζεται ο πυρηνίσκος στην ίδια ακριβώς περιοχή του DNA και δημιουργείται πάλι η πυρηνική μεμβράνη. Εικόνα 8.5 Μικροσκοπική απεικόνιση φυτικών κυττάρων στο στάδιο της μεσόφασης και σε διάφορα στάδια της μίτωσης. - 107 -
Εικόνα 8.6 Διαδραστική απεικόνιση της μιτωτικής διαίρεσης σε ένα ζωικό κύτταρο. Με το τέλος της πυρηνικής διαίρεσης δημιουργούνται δύο γενετικά πανομοιότυποι πυρήνες που μοιράζονται, ωστόσο, το ίδιο κυτταρόπλασμα. Συνεπώς, για να ολοκληρωθεί η μίτωση πρέπει να διαιρεθεί και το κυτταρόπλασμα, ώστε να σχηματιστούν δύο αυτοτελή κύτταρα. Αυτό γίνεται με τη διαδικασία της κυτταροπλασματικής διαίρεσης (κυτταροκίνηση) κατά την οποία διανέμεται το κυτταρόπλασμα στα δύο θυγατρικά κύτταρα. Στα φυτικά κύτταρα, με το τέλος της τελόφασης εμφανίζεται στο ισημερινό επίπεδο του κυττάρου ο φραγμοπλάστης που θα σχηματίσει το νέο κυτταρικό τοίχωμα από το κέντρο προς την περιφέρεια. Τα ζωικά κύτταρα στερούνται κυτταρικού τοιχώματος και η διαίρεσή τους ολοκληρώνεται με σύσφιξη της κυτταροπλασματικής μεμβράνης (εμφάνιση της αύλακας διαίρεσης) (Εικ. 8.6). 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές μικροσκόπια, υδατόλουτρο (60 ο C). 2.1.2. Υλικά αναπτυσσόμενα ακρορρίζια κρεμμυδιού (Allium cepa), ποτήρια ζέσεως, λαβίδες, νυστέρι, αντικειμενοφόροι πλάκες, καλυπτρίδες, μόνιμα παρασκευάσματα ακρορριζίων. 2.1.3. Διαλύματα διάλυμα κολχικίνης 0.1%, μονιμοποιητικό Carnoy (3:1 μεθανόλη:οξικό οξύ), 1Ν υδροχλωρικό οξύ (HCl), 45% οξικό οξύ (CH 3 COOH), χρωστική Feulgen. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η χρωστική Feulgen (διάλυμα λευκοβασικής φουξίνης) γίνεται με τον παρακάτω τρόπο: Σε 200 ml αποσταγμένου βραστού νερού διαλύουμε 1g βασικής φουξίνης. Αναδεύουμε συνεχώς μέχρι να κατέβει η θερμοκρασία στους 50 ο C. Μετά, αφού διηθήσουμε το διάλυμα, προσθέτουμε 30 ml 1Ν HCl και 3g μεταθειϊκό κάλι (K 2 S 2 O 5 ). Βάζουμε το διάλυμα στο σκοτάδι για 24 ώρες, περίπου, και μετά το αποχρωματίζουμε με ζωικό (ή φυτικό) άνθρακα και το διηθούμε. - 108 -
2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1α. Κυτταρική διαίρεση στο φυτικό κύτταρο: Παρατήρηση μιτώσεων σε μόνιμα παρασκευάσματα Τα έντονα αναπτυσσόμενα ακρορρίζια, όπως και άλλοι μεριστοματικοί ιστοί, έχουν συνήθως υψηλά ποσοστά κυττάρων που διαιρούνται, γι αυτό και αποτελούν καλό υλικό για παρατήρηση μιτώσεων (Εικ. 8.7). Εικόνα 8.7 Μικροσκοπική παρατήρηση (100Χ) ακρορριζίων κρεμμυδιού και λεπτομέρεια (400Χ) κυττάρων σε διάφορα στάδια μίτωσης (1= πρόφαση, 2,3 = μετάφαση, 4,5 = ανάφαση). Στην άσκηση αυτή θα παρατηρήσετε μόνιμα παρασκευάσματα ακρροριζίων κρεμμυδιού (Allium cepa) και υάκινθου (Hyacinthus sp.), με σκοπό να αναγνωρίσετε και να μελετήσετε τις διάφορες φάσεις τις μιτωτικής διαίρεσης. Σχεδιάστε στο χώρο παρακάτω αντιπροσωπευτικούς πυρήνες με όλες τις φάσεις της μίτωσης. Πρόφαση Μετάφαση - 109 -
Ανάφαση Τελόφαση 2.2.1β. Κυτταρική διαίρεση στο φυτικό κύτταρο: Παρατήρηση μιτώσεων σε νωπό υλικό Θα φτιάξετε παρασκευάσματα από ακρορρίζια κρεμμυδιού με σκοπό να διακρίνετε μιτώσεις και να εντοπίσετε τα χρωμοσώματα. Τα χρωμοσώματα είναι σχετικά ευμεγέθη, λίγα και επομένως εύκολο να παρατηρηθούν. Πειραματική διαδικασία 1. Κατά το πρώτο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας γίνεται η λήψη των ακρορριζίων του κρεμμυδιού (5-10 mm μήκους), το οποίο αφέθηκε να βγάλει ρίζες στο νερό μία έως δύο εβδομάδες πριν από τη διεξαγωγή της άσκησης (Εικ. 8.8). Με διάφορα αντιδραστήρια γίνεται η προκατεργασία των ακρορριζίων. Αυτά είναι κυρίως η κολχικίνη, η υδροξυκινολίνη (ή μίγμα των δύο), το βρωμοναφθαλένιο κ.λπ. Στην άσκηση αυτή τα ακρορρίζια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα 0.1% κολχικίνης για 3 ώρες. 2. Στη συνέχεια, έγινε στερέωση του υλικού σε μίγμα απόλυτης αλκοόλης-οξικού οξέος, αναλογίας 3:1 (διάλυμα Carnoy). Τα ακρορρίζια παρέμειναν στο μονιμοποιητικό αυτό διάλυμα στους 4 ο C για 24 ώρες, περίπου (Εικ. 8.9). ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα δύο παραπάνω στάδια πραγματοποιούνται την προηγούμενη της διεξαγωγής της άσκησης από τον υπεύθυνο του εργαστηρίου. Εικόνα 8.8 Ανάπτυξη ακρορριζίων στο κρεμμύδι. - 110 -
3. Μεταφέρετε 3-4 ακρορρίζια, που θα σας δοθούν από τον υπεύθυνο, σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει αραιό διάλυμα HCl. Επωάστε σε θερμοκρασία 60 ο C για 5 min (Εικ. 8.9). Το HCl μαλακώνει τον ιστό και υδρολύει μερικώς το DNA των χρωμοσωμάτων. Ο χρόνος και η θερμοκρασία της υδρόλυσης είναι καθοριστικός για την επιτυχία της χρώσης που ακολουθεί, γι αυτό βεβαιωθείτε ότι τηρείτε τις οδηγίες που σας δίνονται. 4. Αδειάστε με προσοχή το HCl οξύ και προσθέστε περίπου 1 ml χρωστική Feulgen. Επωάστε για τουλάχιστον 30 min σε θερμοκρασία δωματίου. ΠΡΟΣΟΧΗ: Η χρωστική Feulgen παρότι άχρωμη, μόλις έλθει σε επαφή με το δέρμα ή τα ρούχα παίρνει ένα έντονο ροζ χρώμα. Χειριστείτε την προσεκτικά! 5. Μεταφέρετε ένα ακρορρίζιο σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα. Με τη βοήθεια του νυστεριού κόψτε και κρατήστε 1-2 mm από την άκρη του ακρορριζίου που θα πρέπει να είναι έντονα βαμμένη μοβ. Πετάξτε τον υπόλοιπο ιστό. 6. Τοποθετήστε μια μικρή σταγόνα από 45% οξικό οξύ πάνω από το υλικό και με προσοχή καλύψτε το παρασκεύασμα με μία καλυπτρίδα (Εικ. 8.9). 7. Αφήστε την αντικειμενοφόρο στον πάγκο και πιέστε την καλυπτρίδα κάθετα με την άκρη ενός μολυβιού, ή χτυπώντας απαλά με την πίσω άκρη του νυστεριού σας (Εικ. 8.9). Εργαστείτε γρήγορα προσέχοντας ώστε να μην γλιστρήσει ή σπάσει η καλυπτρίδα. Βεβαιωθείτε, ωστόσο, ότι ασκήσατε αρκετή πίεση ώστε να διαμεριστούν σωστά τα κύτταρα προκειμένου να έχετε ένα καλό παρασκεύασμα. Ενδεχόμενα, εάν ο ιστός είναι πολύ σκληρός, να χρειαστεί αρκετή πίεση. 8. Παρατηρήστε το παρασκεύασμα χρησιμοποιώντας αρχικά μικρή μεγέθυνση, ώστε να εντοπίσετε τα χρωμοσώματα. Προσπαθήστε, επίσης, να διακρίνετε διαφορετικά στάδια της μιτωτικής διαίρεσης. Εάν τα κύτταρα δεν έχουν διαμεριστεί ικανοποιητικά, επαναλάβετε τη διαδικασία σύνθλιψης του ιστού ή χρησιμοποιήστε ένα καινούργιο ακρορρίζιο. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Η χρωστική Feulgen θα ατονεί όσο περνάει ο χρόνος (~2 ώρες) εάν το παρασκεύασμα δεν μονιμοποιηθεί. Κάτι τέτοιο όμως δεν είναι απαραίτητο να γίνει στο πλαίσιο της άσκησης. Εικόνα 8.9 Διαδικασία που ακολουθείται για την παρατήρηση μιτωτικά διαιρούμενων κυττάρων. - 111 -
2.2.2. Μελέτη καρυότυπου και χρωμοσωμάτων Ο αριθμός και η μορφολογία των χρωμοσωμάτων σε κάθε είδος ζωντανού οργανισμού χαρακτηρίζεται από σταθερότητα ώστε να αναγνωρίζεται σαν ένα είδος βιολογικής ταυτότητας. Το σύνολο των χρωμοσωμάτων με τη συγκεκριμένη μορφολογία τους αποτελεί τον καρυότυπο του οργανισμού. Ο καρυότυπος των οργανισμών είναι συνήθως διπλοειδής (2n) στα σωματικά κύτταρα, με εξαίρεση ορισμένους κατώτερους οργανισμούς που μπορεί να είναι απλοειδής (n). Απλοειδής είναι ο αριθμός των χρωμοσωμάτων στα αναπαραγωγικά κύτταρα των οργανισμών που πολλαπλασιάζονται φυλετικά (γαμέτες). Το σύνολο των χρωμοσωμάτων της απλοειδούς σειράς καλείται χρωμοσωματικός αριθμός. Η ταξινόμηση των χρωμοσωμάτων σε μία σειρά, από το μεγαλύτερο χρωμόσωμα προς το μικρότερο, καλείται καρυόγραμμα (η απλά καρυότυπος), ενώ η διαγραμματική τους απεικόνιση καλείται ιδιόγραμμα. 2.2.2α. Μελέτη καρυότυπου φυτικών κυττάρων Στην Εικόνα 8.10 βλέπετε τα χρωμοσώματα δύο φυτικών ειδών: της Crepis hellenica με 2n=6 χρωμοσώματα (Α) και της Crepis incana με 2n=8 χρωμοσώματα (Β). Εικόνα 8.10 Τα χρωμοσώματα της Crepis hellenica (Α), και της Crepis incana (Β). Κάντε την αναγνώριση των ομολόγων χρωμοσωμάτων σημειώνοντας με αριθμούς επάνω στις εικόνες. Γράψτε το είδος κάθε ζεύγους χρωμοσωμάτων και φτιάξτε παρακάτω το ιδιόγραμμα κάθε καρυότυπου. Crepis hellenica Crepis incana - 112 -
2.2.2β. Μελέτη καρυότυπου του ανθρώπου Στην Εικόνα 8.11 βλέπετε τα χρωμοσώματα του ανθρώπου (2n=46) τα οποία στο ένθετο παρουσιάζονται ταξινομημένα σε ζευγάρια ανάλογα με το μέγεθος και τη μορφολογία τους (καρυότυπος). Σε κάθε ζεύγος χρωμοσωμάτων, ένα έχει μητρική και ένα έχει πατρική προέλευση. Το 23 ο ζευγάρι είναι το Χ και Υ χρωμόσωμα που καθορίζουν το φύλο (φυλετικά χρωμοσώματα). Ο συγκεκριμένος καρυότυπος ανήκει σε ένα θηλυκό άτομο (δύο Χ χρωμοσώματα). Από τον καρυότυπο μπορούμε να παρατηρήσουμε οτιδήποτε έχει σχέση με τον αριθμό και το είδος των χρωμοσωμάτων, καθώς και με χρωμοσωμικές ανωμαλίες που είναι ορατές με το μικροσκόπιο. Εικόνα 8.11 Τα χρωμοσώματα του ανθρώπου και ο καρυότυπος (θηλυκού ατόμου) όπως προκύπτει μετά την τοποθέτηση των χρωμοσωμάτων ανάλογα με το μέγεθος και το σχήμα τους. Στην άσκηση θα παρατηρήσετε τα ανθρώπινα χρωμοσώματα σε μόνιμο παρασκεύασμα από καλλιέργεια λευκοκυττάρων του αίματος (Εικ. 8.12). Χρησιμοποιώντας τη μεγαλύτερη δυνατή μεγέθυνση (1000Χ), παρατηρήστε ότι κάθε χρωμόσωμα αποτελείται από δύο αδελφές χρωματίδες ενωμένες στην περιοχή του κεντρομεριδίου και ότι τα χρωμοσώματα διαφέρουν σε μέγεθος και μορφή ανάλογα με τη θέση του κεντρομεριδίου. Αναγνωρίστε από ένα τουλάχιστον μετακεντρικό, υπομετακεντρικό, ακροκεντρικό και τελοκεντρικό χρωμόσωμα. Εικόνα 8.12 Ανθρώπινα χρωμοσώματα σε παρασκεύασμα από καλλιέργεια λευκοκυττάρων του αίματος. - 113 -
2.2.2γ. Παρατήρηση γιγάντιων χρωμοσωμάτων Σε ορισμένα κύτταρα ενός οργανισμού, όπως για παράδειγμα στα κύτταρα των σιελογόνων αδένων των προνυμφών των δίπτερων εντόμων (Drosophila, Chironomus κ.λπ.), είναι δυνατόν να συμβούν επανειλημμένοι διπλασιασμοί του γενετικού υλικού χωρίς να ακολουθήσει μιτωτική διαίρεση. Με τον τρόπο αυτό δημιουργούνται γιγάντια χρωμοσώματα, γνωστά ως πολυταινικά χρωμοσώματα. Τα κύτταρα, δηλαδή, που έχουν πολυταινικά χρωμοσώματα έχουν χάσει την ικανότητα της διαίρεσης. Μόνο το DNA συνεχίζει να αντιγράφεται και τα αντίγραφα παραμένουν ενωμένα μεταξύ τους. Υπολογίζεται ότι στους σιελογόνους αδένες της Drosophila το DNA αντιγράφεται 10 φορές και δημιουργεί 1024 αντίγραφα. Αν βάψουμε τα πολυταινικά χρωμοσώματα με Feulgen και τα παρατηρήσουμε στο φωτονικό μικροσκόπιο θα διαπιστώσουμε έντονα βαμμένες και λιγότερο βαμμένες περιοχές με τη μορφή ζωνώσεων (Εικ. 8.13). Οι έντονα βαμμένες περιοχές καλούνται χρωμομέρη. Θα παρατηρήσετε πολυταινικά χρωμοσώματα σε μόνιμο παρασκεύασμα από σιελογόνους αδένες της προνύμφης του εντόμου Chironomus. Εικόνα 8.13 Πολυταινικά χρωμοσώματα στους σιελογόνους αδένες της προνύμφης του εντόμου Chironomus. 2.2.3. Παρατήρηση του φύκους Spirogyra: μονογονική-αμφιγονική αναπαραγωγή Κατά τη μονογονική αναπαραγωγή το νέο ή τα νέα άτομα προέρχονται από ένα μόνο γονέα. Ο τρόπος αυτός αναπαραγωγής, που στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς επιτελείται με απλή μιτωτική διαίρεση του γονικού κυττάρου, συναντάται αποκλειστικά σε κατώτερους οργανισμούς. Αντίθετα, κατά την αμφιγονική αναπαραγωγή το νέο άτομο είναι προϊόν γονιμοποίησης, δηλαδή συνένωσης δύο εξειδικευμένων κυττάρων (γαμετών) που προέρχονται από γονείς διαφορετικού φύλου μετά από μειωτική διαίρεση. Στην άσκηση θα παρατηρήσετε σε μόνιμο παρασκεύασμα το φύκος Spirogyra, έναν ευκαρυωτικό απλοειδή (n) οργανισμό που ζει στα ήσυχα γλυκά νερά. Σπουδαιότερο μορφολογικό χαρακτηριστικό του φύκους αυτού είναι οι σπειροειδείς χλωροπλάστες του, με τα πυρηνοειδή όπου αποθηκεύεται άμυλο (Εικ. 8.14). Η Spirogyra αναπαράγεται συνήθως μονογονικά με εγκάρσια διχοτόμηση των κυττάρων της, τα οποία παραμένουν ενωμένα αποτελώντας μία αποικία. Με τον τρόπο αυτό φτιάχνονται νήματα από απλοειδή κύτταρα, μήκους έως και μισό μέτρο, τα οποία είναι (+) ή ( ) μορφής. Όταν οι περιβαλλοντικές συνθήκες γίνονται μη ευνοϊκές για την ανάπτυξη του φύκους, τότε αρχίζει η αμφιγονική αναπαραγωγή. Ειδικότερα, δύο γειτονικά νήματα, ένα (+) και ένα ( ) μορφής, αρχίζουν να συνδέονται κύτταρο προς κύτταρο μέσω συζευτικών σωλήνων (Εικ. 8.14). Το περιεχόμενο των κυττάρων του ενός νήματος περνάει τότε στα κύτταρα του άλλου, με αποτέλεσμα την επακόλουθη σύντηξη των πυρήνων (καρυογαμία) και τον σχηματισμό ζυγωτών. Αυτοί θα εξελιχθούν σε ζυγοσπόρια, δηλαδή σε ανθεκτικές μορφές κυττάρων με παχιά τοιχώματα και μικρή - 114 -
περιεκτικότητα σε νερό. Όταν οι συνθήκες ξαναγίνουν ευνοϊκές, τα ζυγοσπόρια θα βλαστήσουν σχηματίζοντας καινούργια απλοειδή νήματα, καθώς αμέσως μετά την καρυογαμία οι ζυγωτοί διαιρούνται μειωτικά. Εικόνα 8.14 Ο κύκλος ζωής της Spirogyra. Στην επάνω δεξιά φωτογραφία βλέπετε το φύκος με τον χαρακτηριστικό σπειροειδή χλωροπλάστη (400Χ), ενώ στην κάτω δεξιά εικόνα λεπτομέρεια δύο νημάτων όπου διακρίνεται ή σύζευξη των κυττάρων. 2.3. Ερωτήσεις - Παρατηρήσεις Στο εργαστήριο μελετήσατε τον μηχανισμό πυρηνικής διαίρεσης κατά τη μίτωση. Μελετήστε προσεχτικά στο σπίτι τον μηχανισμό πυρηνικής διαίρεσης κατά τη διαδικασία της μείωσης προκειμένου να κατανοήσετε τις ομοιότητες και τις διαφορές στους δύο τύπους κυτταρικής διαίρεσης. Απαντήστε στις ακόλουθες ερωτήσεις: 1. Δώστε δύο τουλάχιστον παραδείγματα διαφοροποιημένων κυττάρων που πιστεύετε ότι έχουν χάσει την ικανότητα να διαιρούνται. 2. Καθώς το κύτταρο μεγαλώνει αυξάνεται ο όγκος και η επιφάνειά του αλλά όχι σε ανάλογο βαθμό (εάν, για παράδειγμα, διπλασιαστεί η διάμετρος του κυττάρου, τότε η επιφάνεια τετραπλασιάζεται και ο όγκος οκταπλασιάζεται). Με την κυτταρική διαίρεση αποκαθίσταται η σχέση όγκου-επιφάνειας. Γιατί πιστεύετε ότι κάτι τέτοιο είναι χρήσιμο και αναγκαίο για το κύτταρο; 3. Ο πολυμερισμός των μικροσωληνίσκων αναστέλλεται ισχυρά από διάφορες ενώσεις (φάρμακα), όπως η κολχικίνη. Οι ενώσεις αυτές καλούνται αντιμιτογόνες ενώσεις. Δικαιολογήστε τον χαρακτηρισμό αυτό. - 115 -
4. Αναφέρατε δύο διαφορές μεταξύ φυτικών και ζωικών κυττάρων κατά τη μίτωση. 5. Κατά την πρόφαση Ι της μειωτικής διαίρεσης παρατηρούνται δύο σημαντικά φαινόμενα. Ποιά είναι αυτά και ποιός πιστεύετε ότι είναι ο ρόλος τους στην εξελικτική πορεία των οργανισμών; 6. Με το τέλος της τελόφασης Ι της μειωτικής διαίρεσης τα δύο θυγατρικά κύτταρα που προκύπτουν έχουν: α) απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων αλλά διπλοειδή αριθμό γονιδίων, β) διπλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων και διπλοειδή αριθμό γονιδίων, γ) διπλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων αλλά απλοειδή αριθμό γονιδίων, δ) απλοειδή αριθμό χρωμοσωμάτων και απλοειδή αριθμό γονιδίων. 7. Η αμφιγονία πλεονεκτεί έναντι της μονογονίας στο διαρκώς μεταβαλλόμενο περιβάλλον. Σχολιάστε την άποψη αυτή. 8. Εξηγήστε τους όρους: α) μεσόφαση, β) αλληλόμορφα γονίδια, γ) κυτταροπλασματική διαίρεση, δ) κινητοχώρος, ε) καρυότυπος, στ) γαμέτης, ζ) ομόλογα χρωμοσώματα 9. Σε ποιά/ές φάσεις του κυτταρικού κύκλου παρατηρείται: α) πρωτεϊνοσύνθεση, β) αντιγραφή DNA, γ) παραγωγή RNA, δ) παραγωγή ιστονών, ε) συγκρότηση νουκλεοσωμάτων 10. Στην Εικόνα 8.15 αναγνωρίστε τη φάση της μίτωσης που βρίσκεται καθένα από τα αριθμημένα κύτταρα. Δικαιολογήστε την απάντησή σας. Εικόνα 8.15 Μικροσκοπική απεικόνιση κυττάρων σ ένα ακρορρίζιο κρεμμυδιού. - 116 -
Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία. Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, Ηράκλειο Κρήτης. ISBN: 978-960-524-305-0. 2. Καλιάφας, Α., & Κατσώρης, Π. (1991). Γενική Βιολογία: Από τη θεωρία στο πείραμα. Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα. - 117 -