Τίτλος Μαθήματος: Γενική Μικροβιολογία Ενότητα: ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ Διδάσκων: Καθηγητής Ιωάννης Σαββαΐδης Τμήμα: Χημείας
ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Διατροφή των Βακτηρiων Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών εξαρτάται από την παρουσία νερού. Οι ουσίες από τις οποίες οι μικροοργανισμοί συνθέτουν το κυτταρικό υλικό και παίρνουν την ενέργεια τους είναι διαλυμένες στο νερό. Διάφοροι μικροοργανισμοί έχουν διαφορετικές απαιτήσεις για θρεπτικά υλικά καλλιέργειας και για αυτό το λόγο έχουν παρασκευαστεί πολυάριθμα θρεπτικά υλικά. Όλα τα θρεπτικά υλικά πρέπει να εκπληρώνουν τις ελάχιστες απαιτήσεις σε ουσίες και να παρέχουν βασικά στοιχεία για τη σύνθεση της κυτταρικής ουσίας. Απαιτήσεις σε ανόργανες θρεπτικές ουσίες. Η στοιχειακή σύσταση του κυττάρου περιλαμβάνει δέκα μακροστοιχεία (C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, Fe) και τα ιχνοστοιχεία Μn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Va, B, Cl, Na, Se, Si, καθώς επίσης και άλλα στοιχεία που δεν απαιτούνται από όλους τους μικροοργανισμούς. Τα περισσότερα εκ των στοιχείων αυτών περιέχονται συνήθως στις χημικές ουσίες (άλατα) και διοχετεύονται στα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται στην καλλιέργεια των μικροοργανισμών. Στον Πίνακα 5.1 δίνεται η σύσταση ενός απλού συνθετικού υλικού. Πηγές άνθρακα και ενέργειας. Ως πηγή ενέργειας δυνατόν να χρησιμεύσουν η ηλιακή ενέργεια, οργανικές ή ανόργανες ενώσεις, ενώ για τη σύνθεση των κυτταρικών πολυμερών είναι απαραίτητη η παρουσία ανθρακούχων ενώσεων. Ανάλογα με την πηγή άνθρακα και ενέργειας, οι μικροοργανισμοί διαιρούνται στις εξής κατηγορίες: 1. Αυτότροφοι: Οι μικροοργανισμοί που λαμβάνουν την ενέργεια μέσω της φωτοσύνθεσης ή από την οξείδωση των ανόργανων ενώσεων χρησιμοποιούν CO 2 ως κύρια πηγή ενέργειας. Εάν το ηλιακό φως χρησιμεύει για παροχή ενέργειας καλούνται «φωτοαυτότροφοι» ή «φωτοσυνθετικοί», ενώ εάν παίρνουν ενέργεια από την οξείδωση ανόργανων ουσιών καλούνται «χημειοαυτότροφοι» ή «χημειοσυνθετικοί». 2. Ετερότροφοι: Χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα οργανικές ενώσεις. Εάν χρησιμοποιούν ηλιακή ενέργεια καλούνται «φωτοετερότροφοι» ενώ όταν η πηγή 37
άνθρακα παρέχεται από οργανικές ενώσεις καλούνται «χημειοετερότροφοι». Στην κατηγορία των «χημειοετερότροφων» μικροοργανισμών ανήκει η μεγάλη πλειοψηφία των βακτηρίων, περιλαμβανομένων και αυτών που ασκούν παθογόνο δράση στον άνθρωπο. Ανάλογα με τον τρόπο που καταβολίζουν τις οργανικές ενώσεις τα βακτήρια διαιρούνται σε «αζυμωτικά» τα οποία έχουν την δυνατότητα να οξειδώνουν τις οργανικές ουσίες, και «ζυμωτικά» τα οποία έχουν την ιδιότητα να διασπούν τις οργανικές ουσίες με ζύμωση (καταβολισμός). Πίνακας 5.1 H σύσταση ενός απλού συνθετικού υλικού. Κ 2 ΗPO4 0.5g NH 4 Cl 1.0g MgSO 4.7H 2 O 0.2g FeSO 4.7H 2 O 0.01 CaCl 2.2H 2 O 0.01 Γλυκόζη 10.0 Η 2 Ο 1lt Διάλυμα 1ml ιχνοστοιχείων ph 6,5-7,5 Οι κύριες πηγές των οργανικών ουσιών είναι οι πολυσακχαρίτες κυτταρίνη και άμυλο και οι μονομερείς ουσίες αυτών (γλυκόζη) χρησιμοποιούνται από πολλούς μικροοργανισμούς. Σχεδόν όλες οι φυσικές οργανικές ουσίες είναι δυνατόν να διασπαστούν και να χρησιμοποιηθούν από τους μικροoργανισμούς. Άλλα θρεπτικά συστατικά. Εκτός των αναφερθέντων παραπάνω ουσιών, ορισμένοι μικροοργανισμοί απαιτούν για την ανάπτυξή των και άλλες ουσίες, που καλούνται παράγοντες ανάπτυξης και είναι απαραίτητοι για την επιτέλεση των λειτουργιών των μικροοργανισμών, και περιλαμβάνουν βιταμίνες, αμινοξέα και νουκλεϊινικές βάσεις (πουρίνη, πυριμιδίνη). Σημειώνεται ότι οι ουσίες αυτές αποτελούν δομικά τμήματα των πρωτεϊνών, των αμινοξέων και των συνενζύμων ή και άλλων προσθετικών ομάδων. 38
Ορισμένοι μικροοργανισμοί έχουν ανάγκη πλέον των 40 παραγόντων ανάπτυξης (γαλακτοβάκιλλοι). Γενικά τα Gram-θετικά βακτήρια έχουν μεγάλες απαιτήσεις, ενώ τα Gram-αρνητικά έχουν μικρές. Θείο και άζωτο. Αυτά τα δύο στοιχεία αποτελούν συστατικά πολλών οργανικών ομάδων του κυττάρου (σουλφυδρικές και άμινο-ομάδες). Ως πηγή θείου χρησιμεύουν τα ανόργανα θεϊικά άλατα και ως πηγή αζώτου ως επί το πλείστον τα αμμωνιακά άλατα. Ορισμένοι μικροοργανισμοί μπορεί να ανάγουν το άζωτο της ατμόσφαιρας και το μετατρέπουν σε ΝΗ 3. Παρομοίως μερικά βακτήρια απαιτούν την παρουσία Η 2 S ή αμινοξέα (κυστεϊνη). Φωσφόρος. Ο φωσφόρος αποτελεί συστατικό των DNA, RNA, ATP και των συνενζύμων NAD, NADP, FMN, FAD. Ως πηγή φωσφόρου χρησιμεύουν μόνο ανόργανα φωσφορικά άλατα. Οξυγόνο. Το οξυγόνο αποτελεί μέρος του μορίου του Η 2 Ο, του CO 2 και πολλών οργανικών ενώσεων. Η παρουσία του οξυγόνου είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των αυστηρώς αερόβιων βακτηρίων, ενώ η απουσία του είναι επιβεβλημένη στην περίπτωση των αυστηρώς αναερόβίων μικροοργανισμών. Ειδικότερα με βάση τις απαιτήσεις των βακτηρίων σε οξυγόνο διακρίνονται 4 ομάδες: υποχρεωτικώς αερόβια, δυνητικά αναερόβια, μικροαερόφιλα, και υποχρεωτικώς αναερόβια βακτήρια. Αερόβια βακτήρια. Χρησιμοποιούν το οξυγόνο ως τελικό δέκτη των ηλεκτρονίων που παράγονται στον μεταβολισμό. Αντίθετα τα αναερόβια για τον πιο πάνω σκοπό χρησιμοποιούν οργανικές ενώσεις. Η παρουσία του Ο 2 προκαλεί τη δημιουργία τοξικών προϊόντων (Η 2 Ο 2, Ο - 2 ). Τα προϊόντα αυτά αντιδρούν με το Η 2 Ο και παράγεται ελεύθερη ρίζα υδροξυλίου (ΟΗ ). Η ικανότητα των μικροοργανισμών να αναπτύσσονται παρουσία Ο 2 εξαρτάται από την ύπαρξη ενζύμων, τα οποία συνθέτει ο μικροοργανισμός και που καταστρέφουν τα αναφερθέντα τοξικά προϊόντα του οξυγόνου. Η καταλάση διασπά το μόριο του Η 2 Ο 2 σε Η 2 Ο και Ο 2. Η δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος μετατρέπει το υπεροξειδικό ανιόν (Ο - 2 ) σε Η 2 Ο 2 και Ο 2. Στη συνέχεια οι υπεροξειδάσες διασπούν το Η 2 Ο 2 και παράλληλα οξειδώνουν διάφορες οργανικές ενώσεις. Υποχρεωτικώς αερόβια βακτήρια. Περιέχουν τα ένζυμα καταλάση και δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος και γι αυτό το λόγο ανέχονται το 39
οξυγόνο. Αντιπροσωπευτικά βακτήρια της κατηγορίας αυτής είναι οι Βάκιλοι και οι Ψευδομονάδες. Δυνητικά αναερόβια βακτήρια. Περιέχουν καταλάση και δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος σε μικρή όμως ποσότητα. Με βάση την ιδιότητα τους αυτή μπορούν να αναπτύσσονται παρουσία ή απουσία οξυγόνου. Υπάρχουν 2 τύποι: στην πρώτη κατηγορία οι Γαλακτοβάκιλοι αναπτύσσονται απουσία Ο 2, αλλά δεν χρησιμοποιούν οξυγόνο και η πηγή της ενέργειας παρέχεται με ζύμωση. Στην δεύτερη κατηγορία ανήκουν τα Eντεροβακτηριοειδή και οι Σταφυλόκοκκοι που μπορεί να αναπτυχθούν παρουσία αλλά και απουσία Ο 2. Μικροαερόφιλα βακτήρια. Τα περισσότερα των αεροβίων βακτηρίων ανήκουν στην κατηγορία αυτή και απαιτούν ως πηγή ενέργειας οξυγόνο και αναπτύσσονται μόνο σε χαμηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου. Στερούνται συστήματος κυτοχρωμάτων και καταλάσης, ενώ παράγουν δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι Στρεπτόκοκκοι και οι Γαλακτοβάκιλοι. Υποχρεωτικώς αναερόβια βακτήρια. Αναπτύσσονται απουσία οξυγόνου. Διακρίνονται σε 2 ομάδες με βάση την ανθεκτικότητα τους στο οξυγόνο: μέτριας και εξαιρετικής ευαισθησίας. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα βακτήρια: Bacteroides fragilis, Prevotella spp., Fusobacterium nucleatum, Clostridium perfringens και ορισμένα στελέχη στρεπτοκόκκων. Η επιβίωση των βακτηρίων ποικίλει από 1 ½ ώρες μέχρι μερικές ημέρες και εξαρτάται από το είδος του βακτηρίου, από την περιεκτικότητα σε δισμουτάση του υπεροξειδικού ανιόντος, τη θερμοκρασία και την υγρασία. Η άλλη ομάδα («εξαιρετικής ευαισθησίας στο οξυγόνο βακτήρια») περιλαμβάνει ορισμένα είδη του γένους Eubacterium spp., B. fragilis, Peptostreptococcus spp. και Bifidobacteria spp. Τα βακτήρια αυτά δεν επιζούν περισσότερο από 10, και σπανίως απομονώνονται από λοιμώξεις του ανθρώπου. Θρεπτικά υλικά και συνθήκες ανάπτυξης μικροοργανισμών. Η ανάπτυξη των μικροοργανισμών όπως Pseudomonas spp., Εscherichia coli μπορεί να γίνει σε θρεπτικό υλικό του οποίου η σύσταση δίνεται στον παραπάνω Πίνακα 5.1. Ορισμένοι όμως μικροοργανισμοί απαιτούν για την ανάπτυξη των ιχνοστοιχεία, βιταμίνες ή άλλες ουσίες (αντιβιοτικά). Όταν ένα 40
θρεπτικό υλικό φτιάχνεται από επί μέρους χημικές ουσίες καλείται συνθετικό υλικό. Οι ελάχιστες απαιτήσεις σε θρεπτικά ουσίες εξαρτάται από τον τύπο του μικροοργανισμού προς ανάπτυξη και σε πολλές περιπτώσεις η εξεύρεση του κατάλληλου υλικού είναι αντικείμενο έρευνας καθώς διάφοροι τύποι μικροοργανισμών δυνατόν να έχουν διαφορετικές απαιτήσεις σε θρεπτικές ουσίες. Τα θρεπτικά υλικά διακρίνονται σε υγρά και σε στερεά θρεπτικά υλικά. Ως θρεπτικά υλικά χρησιμοποιούνται κατάλληλα υλικά που περιέχουν οργανικές και ανόργανες ουσίες, και που επιτρέπουν εντός αυτών την ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των διαφόρων μικροοργανισμών. Ένα από τα πλέον απλούστερα θρεπτικά υλικά είναι ο θρεπτικός ζωμός κρέατος και περιέχει πρωτεϊνες (πεπτόνη, πρωτεόζη και αμινοξέα). Στα υγρά θρεπτικά υλικά όμως δεν καθίσταται δυνατός διαχωρισμός δύο ή περισσοτέρων μικροοργανισμών λόγω της σύγχρονης ανάπτυξης αυτών στο υγρό θρεπτικό υλικό. Στερεά θρεπτικά υλικά. Ο Koch πρώτος το 1883 χρησιμοποίησε προς διαχωρισμό των μικροβίων «στερεά θρεπτικά υλικά». Αυτά παρασκευάζονται από τα υγρά θρεπτικά υλικά με προσθήκη άγαρ σε αναλογία 1-2%. Το άγαρ είναι πολυσακχαρίτης που λαμβάνεται από θαλάσσια φύκια, δεν διασπάται από τους μικροοργανισμούς, ρευστοποιείται σε 100 ο C και στερεοποιείται σε < 45 o C. Τα στερεά θρεπτικά υλικά παρασκευάζονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες (κεκλιμένο επίπεδο), σε τρυβλία (Petri), όπου η επιφάνεια της καλλιέργειας είναι μεγαλύτερη, επίπεδη και ομαλή. Στην επιφάνεια του στερεού θρεπτικού υλικού (Petri) οι μικροοργανισμοί πολλαπλασιαζόμενοι δημιουργούν «αποικία». ΟΙ αποικίες είναι δυνατόν να έχουν διάφορο σχήμα, μέγεθος, υφή και χρώμα. Είναι πιθανόν όμως μια αποικία να προέρχεται από περισσότερα του ενός βακτήρια. Γι αυτό ο όρος αποικία έχει αντικατασταθεί με τον όρο: Μονάδα Σχηματισμού Αποικίας (Colony Forming Unit, CFU). Αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται για τον ποσοτικό προσδιορισμό του αριθμού των ζώντων βακτηρίων σε υγρές καλλιέργειες καθώς επίσης και σε διάφορα τρόφιμα, υλικά. Από την εξέταση της μορφολογίας των διαφόρων αποικιών είναι δυνατή σε ορισμένες περιπτώσεις η διάκριση των διαφόρων βακτηρίων. Η ανάπτυξη των 41
αποικιών εξαρτάται όχι μόνο από το είδος βακτηρίου, αλλά από το θρεπτικό υπόστρωμα (υλικό), τη θερμοκρασία, το ph, και άλλους παράγοντες. ph. Η συγκέντρωση των ιόντων Η + και ΟΗ - παίζει ουσιώδη ρόλο στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών και η διατήρηση βέλτιστων τιμών ph συνεπώς είναι σημαντική. Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε ουδέτερο ph (6,5 7,5), ενώ υπάρχουν μερικοί που αναπτύσσονται σε χαμηλές τιμές ph (Θειοβάκιλοι). Οι ζύμες και οι μύκητες προτιμούν χαμηλότερες τιμές ph (5). Η διατήρηση σταθερών τιμών ph είναι σημαντική για μικροοργανισμούς που παράγουν οξύ και δεν είναι ανθεκτικοί στα οξέα (Γαλακτοβάκιλοι, Εντεροβακτηριοειδή, Ψευδομονάδες). Στην περίπτωση καλλιεργειών όπου παράγεται οξύ, προστίθεται ρυθμιστικό διάλυμα (buffer) όπως ανόργανα φωσφορικά άλατα. Τα περισσότερα βακτήρια είναι σχετικά ανθεκτικά για μικρές αλλαγές μεταξύ τιμών ph 6-9. Κατά την παρασκευή των θρεπτικών υλικών προσδιορίζεται το ph και ρυθμίζεται εντός των ορίων τα οποία επιτρέπουν άριστη ανάπτυξη του μικροβιακού είδους. Οσμωτική πίεση και ενεργότητα νερού. Οι μικροοργανισμοί έχουν διάφορες απαιτήσεις ως προς τις απαιτήσεις τους στο νερό. Η παράμετρος που χρησιμοποιείται για να εκφράσει την ανάγκη των μικροοργανισμών στο νερό είναι η ενεργότητα νερού (α w ). Οι περισσότεροι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε τιμές a w μεταξύ 0.998-0.6. Το κυτταρικό τοίχωμα των βακτηρίων προφυλάσσει από δυσμενείς επιδράσεις του περιβάλλοντος. Η παρουσία ΝaCl στο περιβάλλον σε συγκέντρωση 0.5-1.2% είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Θερμοκρασία. Οι μικροοργανισμοί επίσης διαφέρουν μεταξύ των σε σχέση με τις θερμοκρασίες που απαιτούνται για την ανάπτυξη αυτών. Mε βάση τη θερμοκρασία οι μικροοργανισμοί διακρίνονται σε τρεις μεγάλες ομάδες, μεσόφιλοι, ψυχρόφιλοι και θερμόφιλοι. Για όλα τα βακτήρια διακρίνουμε ελάχιστη, άριστη και μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης. Οι ψυχρόφιλοι αναπτύσσονται σε χαμηλή θερμοκρασία, 0-15 o C, οι θερμόφιλοι αναπτύσσονται σε θερμοκρασίες 50-60 ο C και οι μεσόφιλοι σε θερμοκρασία 30-40 ο C. Τα περισσότερα βακτήρια που βρίσκονται στο περιβάλλον (χώμα, αέρα. νερό, τρόφιμα) έχουν βέλτιστες θερμοκρασίες ανάπτυξης μεταξύ 20-42 ο C, ενώ τα παρασιτούντα στον άνθρωπο και στα ζώα έχουν άριστη θερμοκρασία 42
ανάπτυξης 37 ο C, η οποία είναι ή θερμοκρασία του σώματος. Τα ψυχρόφιλα βακτήρια διακρίνονται σε υποχρεωτικά και σε προαιρετικά ψυχρόφιλα. Τα υποχρεωτικά ψυχρόφιλα δεν αναπτύσσονται σε θερμοκρασία >10 ο C και έχουν άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης 15-18 o C. Tα προαιρετικά ψυχρόφιλα έχουν άριστη και μέγιστη θερμοκρασία ανάπτυξης αυτή των μεσοφίλων (25-42 o C). Όλα δε τα ψυχρόφιλα έχουν ελάχιστη θερμοκρασία ανάπτυξης τους 0 ο C. Tα θερμόφιλα βακτήρια είναι σχετικά σπάνια και ανευρίσκονται στις θερμοπηγές και αναπτύσσονται σε θερμοκρασία 30-100 ο C. H άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης για αυτά είναι μεταξύ 50 και 60 o C. Τόσο τα υποχρεωτικώς ψυχρόφιλα όσο και τα υποχρεωτικώς θερμόφιλα δεν ασκούν παθογόνο δράση στον άνθρωπο. Τα ψυχρόφιλα βακτήρια (Listeria κ.α.) τα οποία αναπτύσσονται σε τυποποιημένα προϊόντα, όπως και σε συντηρημένα τρόφιμα (γαλακτοκομικά, κρέατα, ψάρια κ.α.) είναι δυνατόν να προκαλέσουν σημαντικές βλάβες από καταστροφή των προϊόντων αυτών κατά την διατήρησή τους για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε θερμοκρασία ψυγείου. Η χειρότερη των περιπτώσεων είναι η συχνή επιμόλυνση των τροφίμων με ψυχρότροφα βακτήρια κατά την τυποποίηση φρέσκων και νωπών προϊόντων που προορίζονται έτοιμα προς κατανάλωση (Ready-to-Eat), και που σε πολλές περιπτώσεις τα τελευταία χρόνια έχουν προκαλέσει δυσάρεστες τροφοδηλητηριάσεις. 43
Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Τέλος Ενότητας
Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους. Σημειώματα Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκων: Καθηγητής Ιωάννης Σαββαΐδης. «Γενική Μικροβιολογία. ΔΙΑΤΡΟΦΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?id=1151. Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/.