Προσδιορισµός συγκέντρωσης πρωτεϊνών
18
ΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΤΟΥ ΟΡΟΥ Σκοπός της άσκησης : η κατανόηση της αρχής της φασµατοφωτοµετρίας και η χρήση της ως µέσο προσδιορισµού συγκέντρωσης βιοµορίων σε ένα διάλυµα. ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ Οι κύριες κατηγορίες βιοµορίων µεγάλου µοριακού βάρους είναι οι πρωτεΐνες, τα νουκλεϊκά οξέα οι υδατάνθρακες και τα λιπίδια. Οι πρωτεΐνες αποτελούνται από αµινοξέα τα οποία συνδέονται µεταξύ τους µε πεπτιδικό δεσµό. Ανάλογα µε τη λειτουργικότητα τους οι πρωτεΐνες διακρίνονται σε 6 κύριες οµάδες οµικές πρωτεΐνες (ακτίνη - στοιχείο του κυτταροσκελετού, κολλαγόνο, ελαστίνη - συστατικά του δέρµατος) Μεταφορικές και αποθηκευτικές πρωτεΐνες (αιµοσφαιρίνη - µεταφορά Ο 2, α λιποπρωτεΐνη - µεταφορά λιπιδίων, φερριτίνη - αποθήκευση Fe) Κινητικές πρωτεΐνες (τροπονίνη, µυοσίνη - κίνηση µυών, τουµπουλίνη, κινεσίνη, δυνεΐνη - κίνηση ινιδίων µιτωτικής ατράκτου Ορµόνες (TSH ρύθµιση λειτουργίας θυρεοειδούς, LH, FSH - ρύθµιση έµµηνου κύκλου) Ένζυµα (αµυλάση - πέψη αµύλου, τρυψίνη, χυµοτρυψίνη - πέψη πρωτεϊνών) Αντισώµατα (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD - άµυνα του οργανισµού) Πρωτεΐνες ορού Το αίµα είναι ένας υγρός συνδετικός ιστός που βοηθάει στην επικοινωνία των διαφόρων οργάνων του ανθρώπινου σώµατος και στην οµοιόσταση του οργανισµού. Ο ορός, το διαλυτό µη κυτταρικό µέρος του αίµατος, χωρίς τους παράγοντες πήξης (βλέπε άσκηση ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών του ορού) περιέχει µια ποικιλία πρωτεϊνών που συµβάλλουν στη λειτουργικότητα του αίµατος. Στον πίνακα που ακολουθεί αναφέρονται οι κύριες πρωτεΐνες του ορού µετά από ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πήκτωµα αγαρόζης, καθώς και η λειτουργία τους. 19
Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών ορού Ηλεκτροφορητική Πρωτεΐνες Λειτουργία ζώνη (+) Αλβουµίνη (55-68 %) Αλβουµίνη ιατήρηση του όγκου του αίµατος Μεταφορά χολερυθρίνης α1 σφαιρίνες (2-4 %) α1 αντιτρυψίνη α1 αντιχυµοτρυψίνη (-) α2 µακροσφαιρίνη Απτοσφαιρίνη α2 σφαιρίνες (8-13 %) Σερουλοπλασµίνη α λιποπρωτεΐνη Τρανσφερρίνη Αναστολείς ενζύµων Μεταφορά πρωτεϊνών, ορµονών και λιποδιαλυτών µορίων Πλασµινογόνο β σφαιρίνες (7-13 %) Φιµπρονεκτίνη C3 συµπλήρωµα β λιποπρωτεΐνη γ σφαιρίνες (9-16 %) IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Καταπολέµηση µολύνσεων Στον παραπάνω πίνακα βλέπουµε ότι το µεγαλύτερο ποσοστό (55-68%) των πρωτεϊνών του ορού είναι η αλβουµίνη. Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης τόσο των ολικών πρωτεϊνών, όσο και της αλβουµίνης του ορού έχει σηµαντική διαγνωστική σηµασία, αφού πολλές ασθένειες συνδέονται µε ανωµαλίες στην συγκέντρωση τους αλλά και στην διαφοροποίηση των ποσοστών των κύριων οµάδων που εµφανίζονται ηλεκτροφορητικά. Ο προσδιορισµός των ολικών πρωτεϊνών και της αλβουµίνης γίνεται φωτοµετρικά λόγω της µεγάλης συγκέντρωσης (g/dl). Άλλες πρωτεΐνες του ορού µε µικρότερη συγκέντρωση (mg/dl) προσδιορίζονται µε ανοσολογικές µεθόδους. Φωτοµετρικά γίνεται και ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των ενζύµων µε χαρακτηριστικές ενζυµικές αντιδράσεις, παρ όλο που η συγκέντρωση τους είναι επίσης µικρή. 20
ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΑ Τα µόρια απορροφούν το φως. Το µήκος κύµατος στο οποίο απορροφούν εξαρτάται τόσο από τη δοµή του µορίου όσο και από το περιβάλλον του, κάνοντας την φασµατοφωτοµετρία ένα χρήσιµο εργαλείο του εργαστηρίου. Το φως στην κυµατική του µορφή είναι ένα ηλεκτροµαγνητικό πεδίο. Η ενέργεια Ε ενός µήκους κύµατος λ µε ταχύτητα c ισούται: Ε = hc / λ = hν Όπου h η σταθερά του Planck και ν η συχνότητα του µήκους κύµατος. Όταν ένα κύµα συναντήσει ένα µόριο µπορεί είτε να σκεδαστεί (να αλλάξει διεύθυνση) είτε να απορροφηθεί (η ενέργεια του να µεταφερθεί στο µόριο). Στη δεύτερη περίπτωση το µόριο µεταβαίνει σε µια διεγερµένη κατάσταση. Η απορρόφηση του κύµατος µπορεί να γίνει από όλο το µόριο ή από µια συγκεκριµένη περιοχή του. Η ενέργεια διέγερσης συνήθως µετατρέπεται σε θερµότητα ενώ σε µερικές περιπτώσεις επανεκπέµπεται (φθορισµός). Σε κάθε περίπτωση η ένταση του φωτός που εκπέµπεται από το µόριο είναι µικρότερη από την αρχική. Φάσµα απορρόφησης Ένα µόριο απορροφάει ακτινοβολία σε ορισµένη περιοχή µήκους κύµατος. Το φάσµα απορρόφησης (absorption spectrum) είναι το διάγραµµα απορρόφησης του φωτός από ένα µόριο σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος. Για να γίνει το διάγραµµα αυτό µετράµε την απορρόφηση ενός µορίου σε όλο το φάσµα µήκους κύµατος από 400-800 nm. Με τη διαδικασία αυτή βρίσκουµε το µήκος κύµατος όπου ένα µόριο εµφανίζει την µέγιστη απορρόφηση (εικ. 1). Νόµος Lambert-Beer Εάν µια ακτινοβολία µε µήκος κύµατος λ και ένταση I ο περάσει µια διαδροµή a µέσα από διάλυµα µιας ουσίας µε συγκέντρωση c και συντελεστή µοριακής απορρόφησης b, τότε η ένταση της ακτινοβολίας που θα εκπέµψει το διάλυµα θα είναι I. Οπτική πυκνότητα OD (optical density) ονοµάζεται το µέγεθος log I/I o και συνδέεται µε τα υπόλοιπα µεγέθη σύµφωνα µε τον τύπο OD λ = - log I/I o = a x b x c 21
Εικόνα 1. ιάγραµµα απορρόφησης της χρωστικής Amidoblack, όπου φαίνεται ότι η χρωστική αυτή παρουσιάζει µέγιστο απορρόφησης στα 615 nm. ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ ΣΤΟ ΥΠΕΡΙΩ ΕΣ ΦΩΣ Κάθε έγχρωµη ουσία παρουσιάζει τη µέγιστη απορρόφηση φωτός σε συγκεκριµένο µήκος κύµατος της ορατής ακτινοβολίας. Υπάρχουν όµως και µόρια τα οποία δεν είναι έγχρωµα, όµως παρουσιάζουν απορρόφηση σε µήκη κύµατος στην υπεριώδη περιοχή. Τέτοια µόρια είναι τα αµινοξέα που περιέχουν αρωµατικό δακτύλιο και οι βάσεις των νουκλεϊκών οξέων που περιέχουν πουρινικό και πυριµιδινικό δακτύλιο. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται τα λmax των ενώσεων αυτών. Μόριο λ max Μόριο λ max Τρυπτοφάνη 280, 219 Αδενίνη 260 Τυροσίνη 274, 222, 193 Γουανίνη 275 Φαινυλαλανίνη 257, 206, 188 Κυτοσίνη 267 Θυµίνη 264 Ουρακίλη 260 22
ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Ο προσδιορισµός της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών ενός διαλύµατος, γίνεται φωτοµετρικά µε τη δηµιουργία ενός έγχρωµου συµπλόκου που σχηµατίζουν οι πρωτεΐνες µε την δραστική ουσία του κατάλληλου αντιδραστηρίου. Η ένταση του χρώµατος που δηµιουργείται είναι ανάλογο µε τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών σύµφωνα µε το νόµο των Lambert-Beer: OD = a x b x c Όπου a στην περίπτωση αυτή είναι η διάµετρος κυβέτας. Προσδιορισµός πρωτεϊνών σε βιολογικά υγρά Στην κλινική διάγνωση δίνεται µεγάλη σηµασία στον προσδιορισµό της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών στον ορό, στα ούρα και στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό. Ανάλογα µε το περιστατικό, σηµαντικό ρόλο παίζει ο ποιοτικός (%) ή ο ποσοτικός προσδιορισµός της συγκέντρωσης κάποιων επί µέρους πρωτεϊνών, όπως η αλβουµίνη. Ολικές πρωτεΐνες Για τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών ενός διαλύµατος υπάρχουν διάφορες µέθοδοι όπως Mέθοδος ιουρίας, µε ανιχνευσιµότητα 100 µg/ml Μέθοδος Lowry, µε ανιχνευσιµότητα 1 µg/ml Μέθοδος Bradford, µε ανιχνευσιµότητα 1 µg/ml Απορρόφηση στα 280 nm µε ανιχνευσιµότητα 10 µg/ml Η µέθοδος Bradford που θα χρησιµοποιηθεί στην άσκηση αυτή βασίζεται στη δέσµευση της χρωστικής Coomasie G250 στα πρωτεϊνικά µόρια, µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία ενός µπλε διαλυτού συµπλόκου. Η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος φωτοµετράται στα 595 nm. Φυσιολογικές τιµές ολικών πρωτεϊνών ορού : 6,2 8,4 g/dl Αλβουµίνη Για τον προσδιορισµό της συγκέντρωσης της αλβουµίνης χρησιµοποιείται η χρωστική βρωµοκρεζόλη η οποία δεσµεύεται αποκλειστικά στην αλβουµίνη και δίνει ένα πράσινο διαλυτό σύµπλοκο. Η οπτική πυκνότητα του διαλύµατος φωτοµετράται στα 630 nm. Φυσιολογικές τιµές αλβουµίνης ορού : 3,8 5,4 g/dl. 23
ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΥΛΙΚΑ Φασµατοφωτόµετρο ορατού φωτός Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των 100 1000 λ Πλαστικά σωληνάκια των 4ml ΙΑΛΥΜΑΤΑ είγµατα ορών Απιονισµένο νερό ιάλυµα Bradford (πυκνό): 0,05% G250, 25% αιθανόλη, 50% φωσφορικό οξύ, 25% Η 2 Ο ιάλυµα βρωκρεζόλης Πρότυπος ορός, µε συγκέντρωση ολικών πρωτεϊνών 6,2 g/dl Πρότυπος ορός, µε συγκέντρωση αλβουµίνης 3,7 g/dl ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ Ολικές πρωτεϊνες Αραιώνουµε τα δείγµατα και τον πρότυπο ορό, µε Η 2 Ο σε αναλογία 1:100, σε αντίστοιχα σωληνάκια Σηµαίνουµε 5 σωληνάρια µε T (τυφλό), S (standard-πρότυπο) και 1, 2, 3 (3 δείγµατα) Σε κάθε σωληνάκι προσθέτουµε 1 ml Η 2 Ο και 250 λ πυκνό διάλυµα Bradford. Στο τυφλό προσθέτουµε 10 λ Η 2 Ο Για κάθε αραιωµένο δείγµα προσθέτουµε 10 λ στο αντίστοιχο σωληνάκι µε αντιδραστήριο Αναδεύουµε για 10 sec όλα τα σωληνάκια. Φωτοµετρούµε στα 595 nm και καταγράφουµε αφού µηδενίσουµε µε το τυφλό. 24
Γνωρίζοντας την οπτική πυκνότητα του πρότυπου διαλύµατος, τη συγκέντρωση του και την οπτική πυκνότητα κάθε δείγµατος, υπολογίζουµε τη συγκέντρωση των πρωτεϊνών του ορού µε απλή µέθοδο των τριών: Συγκέντρωση πρωτεϊνών ορού (g/dl) = OD δείγµατος ΟD πρότυπου x C πρότυπου (g/dl) Αλβουµίνη Ετοιµάζουµε 5 σωληνάκια µε 1 ml διάλυµα πράσινο της βρωµοκρεζόλης, µε ένδειξη Τ (τυφλό), S (standard-πρότυπο) και 1, 2, 3 (3 δείγµατα). Στο τυφλό προσθέτουµε 10 λ Η 2 Ο Στο standard προσθέτουµε 10 λ πρότυπο ορό (3,7 g/dl). Για κάθε δείγµα προσθέτουµε στο αντίστοιχο σωληνάκι 10 λ Αναδεύουµε για 10 sec όλα τα σωληνάκια. Φωτοµετρούµε στα 630 nm και καταγράφουµε αφού µηδενίσουµε µε το τυφλό. Γνωρίζοντας την οπτική πυκνότητα του πρότυπου διαλύµατος, τη συγκέντρωση του και την οπτική πυκνότητα κάθε δείγµατος, υπολογίζουµε τη συγκέντρωση της αλβουµίνης του ορού µε απλή µέθοδο των τριών: Συγκέντρωση αλβουµίνης ορού (g/dl) = OD δείγµατος ΟD πρότυπου x C πρότυπου (g/dl) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 1. Υπολογισµός της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών του ορού 2. Υπολογισµός της συγκέντρωσης αλβουµίνης του ορού 3. Υπολογισµός του ποσοστού της συγκέντρωσης της αλβουµίνης επί της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών και σύγκριση µε το αντίστοιχο από τη σάρωση του ηλεκτροφορήµατος 4. Υπολογισµός της συγκέντρωσης των επιµέρους οµάδων των ολικών πρωτεϊνών του ορού 25
26