ΤΟ ΦΩΤΟΜΕΤΡΟ. Διάφοροι τύποι σύγχρονων φωτόμετρων. Βασική αρχή λειτουργίας

Transcript

1 ΤΟ ΦΩΤΟΜΕΤΡΟ Το φασματοφωτόμετρο αποτελεί το πιο διαδεδομένο όργανο των βιοχημικών εργαστηρίων. Χρησιμοποιείται για την μέτρηση της συγκέντρωσης ουσιών μέσα σε ένα υγρό διάλυμα π.χ. για την μέτρηση του σακχάρου στον ορό του αίματος, για την μέτρηση του λευκώματος στα ούρα κ.α. Για να επιτευθεί αυτό το όργανο αξιοποιεί μία από τις βασικές ιδιότητες του φωτός. Αυτή είναι η απορρόφηση τμήματος του φωτός όταν αυτό διέρχεται μέσα από ένα διάλυμα. Διάφοροι τύποι σύγχρονων φωτόμετρων Βασική αρχή λειτουργίας Tο φως που παράγεται από ένα λαμπτήρα κατευθύνεται με μία ορισμένη ισχύ (P o ) προς ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει μία ουσία σε ορισμένη συγκέντρωση (C g/lt). Το υδατικό διάλυμα απορροφάει τμήμα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας και έτσι η ακτινοβολία που απομακρύνεται από αυτό έχει ισχύ P μικρότερη από την αρχική P o (P<P o ).

2 H διαφορά στην απορρόφηση του φωτός μεταξύ πυκνού και αραιού διαλύματος H απορρόφηση Α της προσπίπτουσας αντινοβολίας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης (C) της ουσίας μέσα στο υδατικό διάλυμα. Όσο πυκνότερο είναι το διάλυμα τόσο περισσότερη ακτινοβολία απορροφάται δηλαδή τόσο το P είναι μικρότερο (βλ. εικόνες Α και Β). Φάσμα φωτός Στην πράξη το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να είναι συγκεκριμένου μήκους κύματος λ. Όπως γνωρίζουμε το ορατό φως αποτελεί τμήμα ενός μεγάλου αριθμού ηλεκτρομαγνητικών ακτινοβολιών που καλύπτουν ένα πολύ μεγάλο φάσμα μηκών κύματος. Το φάσμα του φωτός που αξιοποιείται στα ιατρικά εργαστήρια μπορεί να διαιρεθεί σε τρεις περιοχές: 1. Στην υπεριώδη περιοχή (ultraviolet ή U.V.) που είναι αόρατη στο μάτι, με μήκος κύματος mμ. 2. Στην ορατή περιοχή (visible ή Vis) που είναι ορατή στο μάτι, με μήκος κύματος ακτινοβολίας mμ. 3. Στην υπέρυθρη περιοχή (infrared ή I.R.) που είναι αόρατη στο μάτι, με μήκος κύματος ακτινοβολίας 780 mμ-15 μ. Τα πιο συνηθισμένα φασματόμετρα που συναντώνται στα ιατρικά εργαστήρια είναι τα φασματοφωτόμετρα ορατής-υπεριώδους ακτινοβολίας που χρησιμοποιούν τα μήκη κύματος mμ.

3 Επιλογή περιοχής φωτός για την φασματοφωτομετρική μέτρηση Το φως που χρησιμοποιείται στο φασματοφωτόμετρο επιλέγεται να έχει συγκεκριμένο μήκος κύματος ή έστω να ανήκει να ανήκει σε ένα συγκεκριμένο εύρος. Αυτό το μήκος κύματος αντιστοιχεί σε ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που απορροφάται από τα μόρια της ουσίας την οποία θέλουμε να μετρήσουμε. Στην πράξη κάθε ουσία έχει το δικό της μέγιστο απορρόφησης του φωτός που αντιστοιχεί σε συγκεκριμένο μήκος κύματος το οποίο οφείλουμε να γνωρίζουμε όταν θέλουμε να μετρήσουμε την συγκέντρωσή της. Η απορρόφηση του φωτός (Α) και η συγκέντρωση της ουσίας (C) συνδέονται με την παρακάτω σχέση (νόμος των Lambert-Beer). A = a b C Όπου: C : η συγκέντρωση της ουσίας σε g/lt b: το μήκος διανυθείσας διαδρομής μέσα στο διάλυμα (στην πράξη αντιστοιχεί στο πάχος της κυψελίδας που είναι συνήθως 1 cm) α: σταθερά αναλογίας η οποία ονομάζεται απορροφητικότητα. Τα μεγέθη b και α σε κάθε μέτρηση στο φασματοφωτόμετρο είναι σταθερά με αποτέλεσμα η απορρόφηση Α να είναι ανάλογη της συγκέντρωσης C (όπως δείξαμε στα σχήματα στην αρχή). Αυτή η αναλογία φαίνεται στο παρακάτω διάγραμμα. Η σχέση της συγκέντρωσης με την απορρόφηση

4 Τα βασικά μέρη ενός φασματοφωτόμετρου 1. Η λυχνία παραγωγής φωτός (εκπομπέας φωτός). Χρησιμοποιούνται διάφορες λυχνίες ανάλογα με το φάσμα του φωτός (UV, Vis, IR) που θέλουμε να παράγουμε (προσπίπτουσα ακτινοβολία P o ). 2. Το όργανο παραγωγής μονοχρωματικής ακτινοβολίας. Όπως είπαμε η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία που θα διέλθει από το διάλυμα πρέπει να έχει συγκεκριμένο μήκος κύματος τέτοιο ώστε να απορροφάται από την ουσία που θέλουμε να μετρήσουμε. Αυτό επιτυγχάνεται με χρήση ειδικών οργάνων όπως είναι οι α) μονοχρωμάτορες, β) φίλτρα γ) πρίσματα και δ) φράγματα περιθλάσεως. 3. Κυψελίδες. Oι κυψελίδες είναι μικρά γυάλινα κυλινδρικά ή ορθογώνια σωληνάρια μέσα στα οποία τοποθετείται το διάλυμα που θέλουμε να μετρήσουμε. Είναι συγκεκριμένου πάχους και διαμέτρου και κατασκευάζονται από διάφορα υλικά (όχι μόνο γυαλί) ανάλογα με το χρησιμοποιούμενο μήκος κύματος. Οι κυψελίδες πρέπει να διατηρούνται σχολαστικά καθαρές αφού η παραμικρή ακαθαρσία θα επηρεάσει σημαντικά την μέτρηση μας. 4. Φωτοκύτταρο (ανιχνευτής φωτός). Είναι το όργανο που μετράει την ακτινοβολία P που διέρχεται μέσα από το διάλυμα. Οδηγίες χρήσης φασματοφωτομέτρου 1. Μηδενίζουμε το όργανο μετρώντας αέρα. 2. Μετράμε το τυφλό μας διάλυμα. Το τυφλό διάλυμα είναι διάλυμα που περιέχει όλες τις ουσίες του μετρούμενου διαλύματος (διαλύτη, αντιδραστήρια) εκτός από την μετρούμενη ουσία (δείγμα). 3. Μηδενίζουμε ξανά το όργανο 4. Μετράμε την απορρόφηση της πρότυπης ουσίας Α προτύπου. Η πρότυπη ουσία είναι ένα δείγμα παρόμοιο με αυτό που θέλουμε να μετρήσουμε και το οποίο περιέχει την ουσία μας σε συγκεκριμένη γνωστή συγκέντρωση C προτύπου. Η μέτρηση της απορρόφησης του είναι απαραίτητη για τον υπολογισμό της άγνωστης συγκέντρωσης. 5. Μετράμε την απορρόφηση του δείγματος μας Α δείγματος. 6. Η άγνωστη συγκέντρωση του δείγματος C δείγματος υπολογίζεται από τον τύπο: C ί ί ύ xc ύ

5 Απλό φασματοφωτόμετρο Vis-UV Σύγχρονο ημιαυτόματο φωτόμετρο που περιέχει ενσωματωμένα προγράμματα