ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ. Σ. Τσάκας

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Σ. Τσάκας ΠΑΤΡΑ 2014

2 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γενική αίματος 1. Επίχρισμα αίματος 2. Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων 3. Πήξη αίματος χρόνος προθρομβίνης Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών 1. Γενική ούρων stick ούρων 2. Γενική ούρων μικροσκοπική παρατήρηση 3. Προσδιορισμός ουρίας, κρεατινίνης 4. Κάθαρση ουρίας, κάθαρση κρεατινίνης Χημική ανάλυση ουρόλιθου Διερεύνηση αναιμίας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Διερεύνηση φλεμονής 1. C αντιδρώσα πρωτεΐνη 2. Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι αναλύσεις οι οποίες επιλέχθηκαν για το πρακτικό μέρος του μαθήματος «Κλινικό Εργαστήριο» είναι μερικές από αυτές που εφαρμόζονται σήμερα σε ένα τέτοιο χώρο. Στο φυλλάδιο εργαστηριακών ασκήσεων αναφέρεται επιγραμματικά η θεωρία κάθε άσκησης, αφού ο φοιτητής μπορεί να ανατρέξει για περισσότερες λεπτομέρειες στις σημειώσεις του μαθήματος. Στόχος τόσο του μαθήματος όσο και του Εργαστηρίου, κυρίως, είναι να έχει τη αίσθηση ο φοιτητής, έστω και για λίγο ότι βρίσκεται πράγματι, σε ένα Κλινικό Εργαστήριο και είναι υπεύθυνος για το αποτέλεσμα που θα δώσει. Κάτι που μπορεί να συμβεί και στην πραγματικότητα μετά από δύο χρόνια. Όλες οι ασκήσεις είναι υποχρεωτικές και απουσία σε μια από αυτές αφαιρούν το δικαίωμα συμμετοχής στις τελικές εξετάσεις. Σε όλες τις ασκήσεις είναι υποχρεωτική η εργαστηριακή ρόμπα. Πριν την έναρξη των ασκήσεων θα έχει προηγηθεί σεμινάριο για το χειρισμό των δειγμάτων και των κανόνων ασφαλείας. Η βαθμολογία των Εργαστηρίων θα είναι το αποτέλεσμα της συνεχούς προφορικής εξέτασης κατά τη διάρκεια μιας άσκησης, καθώς και μιας σύντομης γραπτής δοκιμασίας. Η ύλη των εργαστηριακών ασκήσεων περιλαμβάνεται στην εξεταστέα ύλη του μαθήματος. 3

4 4

5 ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 1 Γενική αίματος Επίχρισμα αίματος Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων Πήξη αίματος χρόνος προθρομβίνης 5

6 6

7 Γενική αίματος Με τον όρο γενική αίματος εννοούμε την εξέταση δείγματος από περιφερικό αίμα που δίνει πληροφορίες τόσο για τον αριθμό των κυτταρικών τύπων όσο και για το μέγεθος και το σχήμα τους. Το αίμα, μέσω των έμμορφων συστατικών του, επιτελεί τρεις πολύ σημαντικές λειτουργίες: α) μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς με τα ερυθρά αιμοσφαίρια, β) κυτταροφαγία και παραγωγή αντισωμάτων με τα λευκά αιμοσφαίρια και γ) συμμετοχή στην πήξη του αίματος με τα αιμοπετάλια. Σήμερα, η γενική αίματος γίνεται αρχικά σε αυτόματο αιματολογικό αναλυτή και δίνει πληροφορίες για αριθμό ερυθρών, λευκών και αιμοπεταλίων, αιματοκτρίτη, συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης καθώς και διάφορα υπολογιστικά μεγέθη, που αφορούν τον όγκο των ερυθρών και την περιεχόμενη αομοσφαιρίνη σε αυτά (εικόνα 1). Εικόνα 1. Έκθεση αποτελεσμάτων γενικής αίματος από αιματολογικό αναλυτή Όταν όμως παρουσιαστούν στη έκθεση των αποτελεσμάτων του αιματολογικού αναλυτή σημαντικές ανωμαλίες, σε έναν ή περισσότερους κυτταρικούς πληθυσμούς, ακολουθεί οπτική επιβεβαίωση, που γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση επιχρίσματος περιφερικού αίματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα ή κοινώς πλακάκι. Στην εξέταση αυτή επίχρισμα αίματος απλώνεται σε λεπτή στιβάδα σε αντικειμενοφόρο πλάκα (εικόνα 2) και αφού στεγνώσει, βάφεται με ειδικές χρωστικές. Ο κλινικός εργαστηριακός επιστήμονας, στη συνέχεια, εκτιμά τα φυσικά χαρακτηριστικά των ερυθρών και λευκών αιμοσφαιρίων στο μικροσκόπιο και οποιαδήποτε 7

8 επιπρόσθετη πληροφορία καταγράφεται και αναφέρεται στον Μικροβιολόγο ή Αιματολόγο ιατρό που έχει και την ευθύνη των αποτελεσμάτων. Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC) Τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι κύτταρα με σχήμα αμφίκοιλου φακού και στο μικροσκόπιο εμφανίζονται με ελαφρά κόκκινο χρώμα. Η γενική αίματος μας δίνει πληροφορίες για τη συγκέντρωση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και εάν ο πληθυσμός των ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι ο φυσιολογικός, τόσο μορφολογικά όσο και στην περιεκτικότητα του σε αιμοσφαιρίνη. Σε φυσιολογικές καταστάσεις τα ερυθρά αιμοσφαίρια έχουν όλα το ίδιο μέγεθος και σχήμα. Αλλαγές παρατηρούνται σε έλλειψη βιταμίνης Β12 και φυλικού οξέως, σε έλλειψη σιδήρου και σε παρουσία μη φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης. Ένα άτομο μπορεί να έχει ερυθρά αιμοσφαίρια με φυσιολογικό μέγεθος και σχήμα αλλά είναι λιγότερα στον αριθμό, είτε λόγω αναιμίας είτε λόγω απώλειας αίματος. Σε αντίθετη περίπτωση, μπορεί στο αίμα να κυκλοφορούν πολύ περισσότερα ερυθρά αιμοσφαίρια (ερυθραιμία ή ερυθροκυττάρωση), γεγονός που μπορεί νε οδηγήσει σε παρεμπόδιση της φυσιολογικής ροής του αίματος. σταγόνα αίματος Εικόνα 2. Στάδια παρασκευής επιχρίσματος αίματος Λευκά αιμοσφαίρια (WBC) Τα λευκά αιμοσφαίρια είναι υπεύθυνα για την προστασία του οργανισμού από την εισβολή μικροοργανισμών και επιβλαβών ουσιών. Διακρίνονται σε πέντε κατηγορίες: ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και μονοπύρηνα. Η αναλογία των πέντε τύπων των λευκών αιμοσφαιρίων είναι σταθερή και μεταβάλλεται ανάλογα σε κάθε νοσογόνο κατάσταση. Έτσι μια λοίμωξη μπορεί να επάγει την παραγωγή ουδετερόφιλων σε μεγάλη συγκέντρωση για να καταπολεμηθεί το βακτήριο-εισβολέας. Στις αλλεργίες αυξάνεται ο αριθμός των ηωσινόφιλων που απελευθερώνουν αντιισταμινικές ουσίες για να ελαχιστοποιήσουν την 8

9 αλλεργική αντίδραση. Τα λεμφοκύτταρα επάγονται για να παράγουν αντισώματα. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η λευχαιμία, εμφανίζονται πρόδρομες μορφές λευκών αιμοσφαιρίων (βλαστοκύτταρα) ενώ αυξάνεται και ο αριθμός. Αιμοπετάλια Τα αιμοπετάλια είναι ειδικά κυτταρικά θραύσματα που συμμετέχουν στην πήξη του αίματος. Ασθενής που δεν έχει αρκετά αιμοπετάλια, έχει αυξημένο κίνδυνο για σοβαρή αιμορραγία. Στη γενική αίματος μετράμε τον αριθμό και το μέγεθος των αιμοπεταλίων. Σε κάποιες περιπτώσεις, στη γενική αίματος καταγράφεται αυξημένο μέγεθος αιμοπεταλίων που μπορεί να οφείλεται σε συσσώρευση τους, με αποτέλεσμα να μην είναι αξιόπιστη καταμέτρησή τους από τον αναλυτή. Στην περίπτωση αυτή επιβάλλεται η εξέταση επιχρίσματος περιφερικού αίματος. Χρόνος προθρομβίνης Με την ανάλυση του χρόνου προθρομβίνης (prothrombin time, PT) διερευνώνται προβλήματα που σχετίζονται με αιμορραγίες και μειωμένη πηκτική ικανότητα του αίματος. Η ανάλυση αυτή βασίζεται στην προσθήκη αντιδραστηρίου που περιέχει θρομβοπλαστίνη και ιόντα ασβεστίου σε δείγμα πλάσματος και στη συνέχεια μέτρηση του χρόνου που απαιτείται για να δημιουργηθεί και να γίνει ορατός με γυμνό μάτι θρόμβος. Ένας παρατεταμένος χρόνος PT συνήθως υποδηλώνει ανεπάρκεια σε έναν ή περισσότερους παράγοντες του εξωγενούς συστήματος πήξης του αίματος. Η δυσλειτουργία αυτή μπορεί να οφείλεται σε κληρονομικά αίτια, ανεπάρκεια βιταμίνης Κ, ηπατική νόσο ή λήψη φαρμάκων. Αρχή της μεθόδου Η θρομβοπλαστίνη ενεργοποιεί το εξωγενές σύστημα πήξης του αίματος, παρουσία ιόντων ασβεστίου, με αποτέλεσμα την υδρόλυση του ινοδογόνου και το σχηματισμό πλέγματος ινίνης. Έτσι σε περίπτωση έλλειψης κάποιου παράγοντα πήξης η δημιουργία ορατού θρόμβου θα απαιτήσει περισσότερο χρόνο. 9

10 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Φλεβικό αίμα σε σωληνάκι με αντιπηκτικό K 2 EDTA Φλεβικό αίμα σε σωληνάκι με αντιπηκτικό οξαλικά ιόντα Αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες Γάντια Δοχεία χρώσης Μεθανόλη Χρωστική May-Grünwall Χρωστική Giesma Μικροσκόπιο Σωλήνες καθίζησης Αντιδραστήριο θρομβοπλαστίνης Χρονόμετρο Υδατόλουτρο 37 ο C ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΟΣ Τοποθετείστε μια μικρή ποσότητα αίματος (10 μl) στην άκρη μιας αντικειμενοφόρου πλάκας. Φέρτε σε επαφή με το αίμα την μικρή πλευρά μιας άλλης αντικειμενοφόρου, την οποία στην συνέχεια σύρετε υπό γωνία 30 ο -40 ο προς την άλλη άκρη ώστε να απλώσετε τη σταγόνα αίματος όπως φαίνεται στο σχήμα. Αφήστε το παρασκεύασμα να στεγνώσει για min. ΧΡΩΣΗ Τοποθέτηση δειγμάτων σε δοχείο με μεθανόλη για 5 min. Μεταφορά δειγμάτων σε δοχείο με χρωστική May- Grünwall Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης Μεταφορά δειγμάτων σε δοχείο με χρωστική Giemsa Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης Στέγνωμα και επικάλυψη με μια σταγόνα γλυκερόλης Τοποθέτηση καλυπτρίδας ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ Παρατηρείστε τα παρασκευάσματα στο μικροσκόπιο με αντικειμενικό φακό 40x. Προσπαθήστε να αναγνωρίσετε τους διάφορους τύπους των λευκών αιμοσφαιρίων. Παρατηρήστε τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια 10

11 ΧΡΟΝΟΣ ΠΡΟΘΡΟΜΒΙΝΗΣ Τοποθετείστε σωληνάκι με 100 μl πλάσμα σε υδατόλουτρο 37 ο C Τοποθετείστε σωληνάκι με 200 μl αντιδραστήριο θρομβοπλαστίνης σε υδατόλουτρο 37 ο C Μετά από 5 min μεταφέρετε με πιπέτα, το αντιδραστήριο στο σωληνάκι του δείγματος Ταυτόχρονα ενεργοποιήστε το χρονόμετρο και ανακινώντας το σωληνάκι απαλά μέσα στο υδατόλουτρο καταγράψτε μετά από πόσα sec δημιουργήθηκε θρόμβος. 11

12 12

13 ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 2 Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Γενική ούρων stick ούρων Γενική ούρων μικροσκοπική παρατήρηση Προσδιορισμός ουρίας, κρεατινίνης Κάθαρση ουρίας, κάθαρση κρεατινίνης Χημική ανάλυση ουρόλιθου 13

14 14

15 Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Οι νεφροί παίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του οργανισμού, αφού ρυθμίζουν το ισοζύγιο ύδατος, τη συγκέντρωση βασικών ηλεκτρολυτών και την απομάκρυνση τοξικών ουσιών. Επίσης συμμετέχουν στη ρύθμιση της αιμοποίησης με την παραγωγή ερυθροποιητίνης και στη ρύθμιση της πίεσης του αίματος με την παραγωγή ρενίνης. Με βάση αυτά τα δεδομένα, εξωκρινική ή ενδοκρινική δυσλειτουργία των νεφρών σημαίνει αυτόματα εμφάνιση αναιμίας, υπέρτασης και τοξικότητας, όχι απαραίτητα με αυτή τη σειρά, με ό,τι επιπλοκές μπορεί να εμφανιστούν σε άλλα όργανα. Ο αρχικός έλεγχος των νεφρικών λειτουργιών περιλαμβάνει τη γενική ούρων και την ικανότητα απέκκρισης τοξικών ουσιών. Γενική ούρων Η γενική ούρων ξεκινάει με τη μακροσκοπική εικόνα ενός δείγματος πρωινών ούρων και αφορά το χρώμα (κιτρινωπό, κοκκινωπό, κίτρινο ιριδίζον) και τη διαύγεια ή τη θολερότητα του. Στη συνέχεια ακολουθεί προσδιορισμός διαφόρων παραμέτρων με τα λεγόμενα stick ούρων. Αυτά είναι πλαστικές ταινίες που φέρουν στην επιφάνεια τους αντιδραστήρια ξηράς χημείας για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό ειδικού βάρους, νιτρικών αλάτων, αιμοσφαιρίνης, πρωτεϊνών, γλυκόζης, κετονοσωμάτων, ουροχολινογόνου και παρουσίας λευκών αιμοσφαιρίων. Σε περίπτωση που ένας από τους παραπάνω δείκτες είτε μακροσκοπικά είτε στο stick, φανεί μη φυσιολογικός, ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση του ιζήματος των ούρων μετά από φυγοκέντρηση. Η μικροσκοπική παρατήρηση αφορά παρουσία ερυθρών και λευκών αιμοσφαιρίων, κρυσταλλικών σχηματισμών από άλατα, κυλίνδρων, επιθηλιακών κυττάρων και μικροοργανισμών. Κρεατινίνη και ουρία ορού Η κρεατινίνη και η ουρία είναι οι βασικοί βιοχημικοί δείκτες για τον έλεγχο της νεφρικής λειτουργίας. Η κρεατινίνη διηθείται από το σπείραμα και απεκκρίνεται στα ούρα. Η ουρία αντίθετα ενώ διηθείται από το σπείραμα, ένα μέρος της επαναρροφάται από το νεφρικό σωληνάρια με αποτέλεσμα η συγκέντρωση της στο ορό να είναι μεγαλύτερη από αυτή της κρεατινίνης. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης τους στον ορό γίνεται φασματοφωτομετρικά. Η συγκέντρωση της κρεατινίνης γίνεται με κινητική αντίδραση και της ουρίας με ανττίδραση τελικού σημείου. Κάθαρση κρεατινίνης και ουρίας Η κάθαρση μιας ουσίας από τον οργανισμό είναι ένα υπολογιστικό θεωρητικό μέγεθος που αφορά τον όγκο αίματος που καθαρίζεται από αυτή την ουσία ανά λεπτό. Στην περίπτωση της κρεατινίνης η κάθαρση της είναι ανάλογη του ρυθμού σπειραματικής διήθησης του νεφρού, αφού διηθείται πλήρως και δεν επαναρροφάται. Η κρεατινίνη δεν είναι τοξική για τον οργανισμό αλλά η κάθαρση και η συγκέντρωση της είναι ανάλογες με αυτές των διαφόρων τοξινών οι οποίες απομακρύνονται από το αίμα, μέσω των νεφρών. 15

16 Φασματοφωτομετρία Διάφορες ουσίες που περιέχουν συγκεκριμένες δομές στο μόριο τους, απορροφούν είτε την ορατή ακτινοβολία, όπως η αιμοσφαιρίνη λόγω της αίμης, είτε την υπεριώδη ακτινοβολία, όπως οι πρωτεΐνες λόγω των αρωματικών δακτυλίων διαφόρων αμινοξέων. Κάθε τέτοιο μόριο απορροφά ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκους κύματος, κάνοντας την φασματοφωτομετρία ένα χρήσιμο εργαλείο του εργαστηρίου. Σύμφωνα με το νόμο των Lambert και Beer εάν μια ακτινοβολία με μήκος κύματος λ και ένταση I ο περάσει μια διαδρομή a μέσα από διάλυμα μιας ουσίας με συγκέντρωση c και συντελεστή μοριακής απορρόφησης b, τότε το διάλυμα θα εκπέμψει ακτινοβολία με ένταση I. Το μέγεθος log I/I o ονομάζεται οπτική πυκνότητα OD (optical density) και συνδέεται με τα υπόλοιπα μεγέθη σύμφωνα με τον τύπο: OD λ = - log I/I o = a x b x c Στην ουσία ο τύπος αυτός μας λέει ότι η ένταση του χρώματος μιας διαλυμένης έγχρωμης ουσίας είναι ευθέως ανάλογο με την συγκέντρωση της. Σε περίπτωση όπου θέλουμε να βρούμε τη συγκέντρωση ενός άχρωμου μορίου σε ένα διάλυμα αρκεί με μια χημική ή ενζυμική αντίδραση ώστε να δημιουργηθεί ένα έγχρωμο προϊόν, του οποίου η αύξηση της OD θα είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουσίας που μελετάμε και συμμετείχε σε αυτή την αντίδραση. Φασματοφωτομετρία τελικού σημείου Όταν η παραγωγή έγχρωμου προϊόντος γίνει αυτόματα με την ανάμιξη των συστατικών της χημικής αντίδρασης τότε μιλάμε για φασματοφωτομετρία τελικού σημείου. Με αυτό τον τρόπο προσδιορίζεται η συγκέντρωση της ουρίας σε ένα βιολογικό υγρό με προσθήκη το οποίο σχηματίζει με την ουρία έγχρωμο σύμπλοκο του οποίου η οπτική πυκνότητα στα 520nm, είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ουρίας. Φασματοφωτομετρία κινητικής Όταν η αλλαγή του χρώματος γίνεται σταδιακά με την πάροδο του χρόνου και ακολουθεί παραβολική καμπύλη, όπως μια ενζυμική αντίδραση, τότε μιλάμε για φασματοφωτομετρία κινητικής αντίδρασης. Έτσι γίνεται ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της κρεατινίνης η οποία δημιουργεί έγχρωμο σύμπλοκο με το πικρικό οξύ σε αλκαλικό περιβάλλον, το οποίο απορροφά στα 490 nm. Η δημιουργία του συμπλόκου είναι σταδιακή σχεδόν ανάλογη στην αρχή μέχρι που επιβραδύνει και σταθεροποιείται μετά από μερικά λεπτά. 16

17 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Δείγματα ούρων (πρωινή συλλογή) Δείγματα ορών Stick ούρων Κλινική φυγόκεντρος Σωληνάκια φυγοκέντρου Φασματοφωτόμετρο Ρυθμιζόμενες πιπέτες μl, μl Σωληνάρια Falcon Σωληνάρια RIA Κυβέτες φωτομέτρου Kit προσδιορισμού ουρίας Kit προσδιορισμού κρεατινίνης Χρονόμετρο STICK ΟΥΡΩΝ Βυθίστε από μια ταινία (stick) ούρων σε κάθε δείγμα ούρων και αφού αφήσετε να απομακρυνθεί η περίσσεια υγρού ακουμπήστε την στο στόμιο του δοχείου. Μετά από 3-5 λεπτά καταγράψτε την αλλαγή του χρώματος και κάντε την αντιστοίχιση για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΙΖΗΜΑΤΟΣ ΟΥΡΩΝ Μεταφέρετε σε πλαστικό σωληνάκι Falcon 10 ml ούρων. Φυγοκεντρήστε για 5 λεπτά σε στροφές. Αδειάστε το υπερκείμενο χωρίς να στραγγίσετε. Επαναιωρείστε το ίζημα στη μικρή ποσότητα υγρού που έχει μείνει στο σωληνάκι. Μεταφέρετε 50 μl σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα και Παρατηρείστε στο μικροσκόπιο με φακό 40Χ. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΟΥΡΙΑΣ Ετοιμάστε σωληνάρια RIA για τα δείγματα, συν δύο ακόμα για control και τυφλό Προσθέστε από 1 ml αντιδραστήριο Ρυθμίστε το φωτόμετρο σε μήκος κύματος 520 nm Προσθέστε 25 μl από κάθε δείγμα Τοποθετείστε την κυβέτα στο φωτόμετρο Καταγράψτε την οπτική πυκνότητα των δειγμάτων Για τα δείγματα ούρων κάντε αραίωση 1/10 17

18 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΚΡΕΑΤΙΝΙΝΗΣ Ετοιμάστε κυβέτες φωτομέτρου για τα δείγματα, συν μια ακόμα για control Προσθέστε από 1 ml αντιδραστήριο Ρυθμίστε το φωτόμετρο σε μήκος κύματος 490 nm Μηδενίστε το χρονόμετρο Προσθέστε 100 δείγμα control και ταυτόχρονα εκκινήστε το χρονόμετρο Τοποθετείστε την κυβέτα στο φωτόμετρο Σε χρόνο 20 sec μηδενίστε το φωτόμετρο Σε χρόνο 1 min 20 sec καταγράψτε την ένδειξη του φωτομέτρου Επαναλάβετε τη διαδικασία για όλα τα δείγματα ορού και ούρων Για τα δείγματα ούρων κάντε αραίωση 1/10 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΘΑΡΣΗΣ ΚΡΕΑΤΙΝΙΝΗΣ ΚΑΙ ΟΥΡΙΑΣ Υπολογίστε την ημερήσια απέκκριση κρεατινίνης και ουρίας Υπολογίστε τις καθάρσεις κρεατινίνης και ουρίας Συγκρίνεται τα παραπάνω μεγέθη με τις φυσιολογικές τιμές 18

19 ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 3 Διερεύνηση αναιμίας Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Διερεύνηση φλεγμονής C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών 19

20 20

21 ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ Η αιμοσφαιρίνη (hemoglobin, Hb) είναι η κύρια πρωτεΐνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η οποία δεσμεύει οξυγόνο από τους πνεύμονες και το μεταφέρει στους ιστούς. Η σύνθεση της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης Hb A, στα ενήλικα άτομα, είναι του τύπου α 2 β 2. Εκτός από τις αμινοξικές αντικαταστάσεις σε αλυσίδες της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, μη φυσιολογικά μόρια δημιουργούνται και από τη αντικατάσταση και των δύο β αλυσίδων από άλλες, με εντελώς διαφορετική αμινοξική αλληλουχία και ηλεκτροφορητική κινητικότητα (Πίνακας 1). Τέτοιες αιμοσφαιρίνες είναι η Hb A 2 (α 2 δ 2 ) και η Hb F (α 2 γ 2 ), που έχουν μικρότερη ικανότητα πρόσληψης του οξυγόνου σε σχέση με την Hb A. ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΔΟΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Η αιμοσφαιρίνη αποτελείται από δύο ζεύγη πολυπεπτιδικών αλυσίδων που η κάθε μία περιέχει ένα μόριο αίμης που έχει ένα δισθενές άτομο σιδήρου στο κέντρο. Στα ενήλικα άτομα η φυσιολογική αιμοσφαιρίνη (Hb A) αποτελείται από ένα ζεύγος αλυσίδων α και ένα ζεύγος β (α 2 β 2 ). Μη φυσιολογικά μόρια αιμοσφαιρίνης προκαλούν αναιμία και αυτά μπορεί να δημιουργηθούν είτε από αλλαγή της αμινοξικής αλληλουχία των α και β αλυσίδων, είτε από αντικατάσταση των β αλυσίδων από άλλες, με διαφορετική αμινοξική αλληλουχία και διαφορετικές ιδιότητες ως προς την πρόσληψη του οξυγόνου. Η πιστοποίηση της ύπαρξης μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών γίνεται με ηλεκτροφορητική ανάλυση, όπου οι διάφοροι τύποι κινούνται, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, σε διαφορετικές αλλά συγκεκριμένες θέσεις, λόγω διαφορετικού φορτίου (εικόνα 1). Δρεπανοκυτταρική αναιμία Η αντικατάσταση του πολικού γλουταμινικού οξέος στη θέση 5 των β αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης, από το μη πολικό βαλίνη, λόγω σημειακής μεταλλαγής του γονιδίου, έχει ως αποτέλεσμα το μεταλλαγμένο μόριο να χάσει αρνητικό φορτίο και να υστερεί σε ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Σε μια ηλεκτροφόρηση, η αιμοσφαιρίνη S δίνει μια ζώνη στη μέση περίπου του ηλεκτροφορήματος. Όμως, η εμφάνιση μιας τέτοιας ζώνης, δεν σημαίνει και απαραίτητα ύπαρξη δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης, αφού την ίδια περίπου κινητικότητα έχει και μια άλλη αιμοσφαιρίνη, που ονομάζεται αιμοσφαιρίνη C (Hb C) και προέρχεται επίσης από σημειακή μεταλλαγή. β-θαλασσαιμία Σε κάθε άνθρωπο κάθε μια από τις α-αλυσίδα και β-αλυσίδες κληρονομείται από τον ένα γονέα. Σε ετεροζυγωτία, με μη λειτουργικές β-αλυσίδες, αυξάνεται η σύνθεση της λειτουργικής Hb A, συμπληρώνεται από αύξηση της σύνθεσης Hb A 2 που εμφανίζεται με αύξηση του ποσοστού της 3,5%-6,5% (στίγμα). Σε περίπτωση ομοζυγωτίας στην προηγούμενη περίπτωση, η Hb A εξαφανίζεται εντελώς και στη θέση της αρχίζει να συνθέτονται γ-αλυσίδες, με αποτέλεσμα την εμφάνιση Hb F αιμοσφαιρίνης, ενώ αυξάνεται και η σύνθεση της Hb A 2. 21

22 Πίνακας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Ηλεκτροφορητική ζώνη Είδος αιμοσφαιρίνης Λειτουργία (+) Hb A (96-98 %) Αιμοσφαιρίνη Α Η φυσιολογική αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων Hb F (0-2 %) Εμβρυική αιμοσφαιρίνη Αιμοσφαιρίνη που εμφανίζεται στο εμβρυικό στάδιο Hb C/S (0 %) Αιμοσφαιρίνη C ή S Αιμοσφαιρίνης C ή S από σημειακή μεταλλαγή Hb A2 (1,8-3,3 %) Αιμοσφαιρίνη A2 Αιμοσφαιρίνη που υπάρχει στους ενήλικες σε μικρό ποσοστό Καρβονική ανυδράση (-) Βοηθάει τη δέσμευση Ο 2 και CO 2 στα ερυθρά αιμοσφαίρια Hb A Hb F Hb C/S Hb A 2 Εικόνα 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών 22

23 Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Σε ένα δείγμα αίματος, σε ηρεμία, τα ερυθρά καθιζάνουν λόγω βάρους με την πάροδο του χρόνου. Το ύψος της στήλης του πλάσματος σε mm μετά από 1 h ονομάζεται ταχύτητα καθίζησης ερυθρών. Η ταχύτητα καθίζησης ερυθρών είναι μια εύκολη, απλή και οικονομική εξέταση που συνήθως συνοδεύει ένα παραπεμπτικό γενικής αίματος. Μια αυξημένη τιμή σε αυτή την εξέταση δημιουργεί υποψίες για την ύπαρξη κάποιας φλεγμονής, λοίμωξης ή γενικά μιας διαταραχής στην ισορροπία του οργανισμού. CRP Η φλεγμονή (inflammation) είναι ένα σύνολο διεργασιών, σε ένα ιστό, ως αντίδραση σε κάποια βλάβη. Τα συμπτώματά της φλεγμονής είναι οίδημα, ερυθρότητα, πόνος και πολλές φορές πυρετός. Η οξεία φλεγμονή (acute inflammation), όπως μια παιδική ασθένεια ή σκωλικοειδίτιδα, συνήθως συνοδεύεται από αύξηση των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων στο αίμα, αύξηση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) στον ορό και αύξηση της ταχύτητας καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ΤΚΕ). Παράλληλα, τόσο στη χρόνια όσο και στην οξεία φλεγμονή, ως απόκριση του οργανισμού, παρουσιάζεται αλλοίωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου των πρωτεϊνών του ορού. Ο πιο γρήγορος τρόπος για την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της πορείας μιας φλεγμονής είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της στον ορό. Μέχρι πρότινος αυτό γινόταν αποκλειστικά με ανοσοσυγκόλληση, όμως τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται μέθοδοι που βασίζονται στη νεφελομετρία και γίνονται σε βιοχημικό αναλυτή. Αρχή της μεθόδου Η αναοσοσυγκόλληση χρησιμοποιεί πολυμερή σφαιρίδια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώματα έναντι της CRP. Η ανάμιξη αντιδραστηρίου σφαιριδίων με ίση ποσότητα ορού δίνει αναοσοσυγκόλληση, σε συγκεντρώσεις CRP πάνω από το φυσιολογικό όριο των 6 μg/ml. Για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης της, χρησιμοποιούμε υποδιπλασιαζόμενες αραιώσεις ορού μέχρι να προσδιοριστεί η μέγιστη αραίωση που δίνει ανοσοσυγκόλληση. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση της CRP ισούται με τι γινόμενο 6 μg/ml επί το συντελεστή αραίωσης. 23

24 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Συσκευή ηλεκτροφόρησης - Τροφοδοτικό συνεχούς ρεύματος Συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 2) Θάλαμος θερμού αέρα Θήκη πηκτώματος για χρώση Δοχεία χρώσης Χρονόμετρο Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των λ Φυσιολογικός ορός 0,9% NaCl Πήκτωμα Αγαρόζης 0,8% Ρυθμιστικό διάλυμα: 0,1 Μ tris-barbital ph 9,2 Δείγματα ολικού αίματος Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι 1 l): 0,1Μ tris-barbital ph 9,2 Διάλυμα μονιμοποίησης: 60% αιθανόλη, 10% οξεικό, 30% απιονισμένο νερό Χρωστική (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι όγκο 300 ml): 0,4% amidoblack, 6,7% αιθυλενογλυκόλη Αποχρωστικό (stock διάλυμα 1 ml σε 1 l απιονισμένο νερό): 0,05% κιτρικό οξύ Απιονισμένο νερό ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Σε σωληνάκια Eppendorff προσθέτουμε 200 μl ολικό αίμα από κάθε δείγμα Προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό και αναδεύουμε απαλά Φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουμε και φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουμε και φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο Σε αντίστοιχα σωληνάκια Eppendorff προσθέτουμε 130 μl διαλύματος λύσης Σε κάθε σωληνάκι προσθέτουμε 10 μl από το αντίστοιχα ίζημα ερυθρών Λύουμε τα ερυθρά με Vortex για 5-6 sec ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιμάζουμε τη συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 2) Στην επιφάνεια τοποθέτησης του πηκτώματος ρίχνουμε 100 λ Η 2 Ο 24

25 Βγάζουμε το πήκτωμα από το φάκελο του και το τοποθετούμε στη συσκευή (εικόνα 3) Στεγνώνουμε το πήκτωμα με διηθητικό χαρτί Προσθέτουμε 10 λ αιμολύματος από κάθε δείγμα στις αριθμημένες θέσεις της συσκευής (εικόνα 4) Ακουμπάμε το βραχίονα εναπόθεσης πάνω στο πήκτωμα για 1 min (εικόνα 5) Απομακρύνουμε το βραχίονα Μεταφέρουμε το πήκτωμα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προσθέτουμε 300 ml ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Κλείνουμε το καπάκι της συσκευής και συνδέουμε τα ηλεκτρόδια Ανοίγουμε το τροφοδοτικό Ρυθμίζουμε την τάση του ρεύματος στα 150 V Αφήνουμε να αναπτυχθεί η ηλεκτροφόρηση για 11 min Κλείνουμε το τροφοδοτικό Βγάζουμε το πήκτωμα από τη συσκευή και το τοποθετούμε στο πλαίσιο χρώσης ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΖΩΝΩΝ Τοποθετούμε το πήκτωμα στο μονιμοποιητικό για 4 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 15min Τοποθετούμε το πήκτωμα στο πλαίσιο χρώσης Τοποθετούμε το πλαίσιο στη χρωστική για 4 min Ξεπλένουμε καλά με νερό βρύσης Τοποθετούμε το πλαίσιο διαδοχικά τρεις φορές σε αποχρωστικό από 2 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 3 min Σαρώνουμε το ηλεκτροφόρημα ΗΜIΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ CRP Σε κατάλληλο λευκό πλακίδιο τοποθετούμε 30 μl ορό και 30 μl αντιδραστήριο Αναμιγνύουμε με τη βοήθεια ενός κίτρινου ρύγχους από πιπέτα Τοποθετούμε το πλακίδιο σε αναδευτήρα Ελέγχουμε το δείγμα μας για κροκίδωση μετά 3-4 min Σε περίπτωση κροκίδωσης επαναλαμβάνω με υποδιπλασιαζόμενες ποσότητες ορού Με βάση το συντελεστή αραίωσης του τελευταίου δείγματος που κροκιδώθηκε υπολογίστε τη συγκέντρωση της CRP ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΚΑΘΙΖΗΣΗΣ ΕΡΥΘΡΩΝ Σε σωληνάκι με αίμα τοποθετήστε κατάλληλα το σωληνάκι καθίζησης. Παρατηρήστε πως γεμίζει με αίμα και αφήστε σε ηρεμία για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, καταγράψτε το ύψος του πλάσματος στην κορυφή της στήλης. 25

26 ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Εικόνα 2: συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων Εικόνα 3: τοποθέτηση πηκτώματος πήκτωμα Εικόνα 4: εναπόθεση δειγμάτων Εικόνα 5: εναπόθεση δειγμάτων στο 26

27 ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 3 Διερεύνηση φλεμονής Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) 27

28 28

29 ΟΡΟΣ ΠΛΑΣΜΑ Η υπερκείμενη διαλυτή φάση του αίματος που ξεχωρίζει μετά από φυγοκέντρηση, παρουσία αντιπηκτικού, ονομάζεται πλάσμα (plasma). Όταν στο δείγμα αίματος δεν προστεθεί αντιπηκτικό, τότε τα τοιχώματα του σωληναρίου, στο οποίο έχει συλλεχθεί το αίμα, θα ενεργοποιήσουν τη διαδικασία της πήξης του αίματος με αποτέλεσμα τη δημιουργία θρόμβου (clot). Η υπερκείμενη διαλυτή φάση του αίματος που ξεχωρίζει μετά από φυγοκέντρηση απουσία αντιπηκτικού ονομάζεται ορός (serum). Ουσιαστικά ο ορός είναι το πλάσμα χωρίς το ινωδογόνο (fibrinogen) που συμμετέχει στη δημιουργία του θρόμβου με την παραγωγή του πλέγματος ινικής (fibrin). ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Ένα σωματίδιο με φορτίο q που βρίσκεται σε ένα μέσο με συντελεστή ιξώδους f, θα κινηθεί με σταθερή ταχύτητα υ όταν εφαρμοστεί ηλεκτρικό πεδίο ένταση Ε=V/l. Στο φορτίο q θα ασκηθεί δύναμη F = Eq = fυ Vq/l = fυ υ = Vq / fl υ = V Η ταχύτητα μεταφοράς σε ένα μέσο με συντελεστή τριβής, ενός φορτισμένου μορίου, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου έντασης εξαρτάται από : 1. Την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (V/cm) 2. To καθαρό φορτίο του μορίου 3. Το μέγεθος και το σχήμα του μορίου 4. Το ιξώδες, την ιοντική ισχύ και τη θερμοκρασία του μέσου ηλεκτροφόρησης Η ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΩΣ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΟ ΜΕΣΟ Στις διαγνωστικές ηλεκτροφορήσεις χρησιμοποιούνται πηκτώματα αγαρόζης σε διάφορες συγκεντρώσεις ανάλογα με το είδος των προς ανάλυση πρωτεϊνών. Οι ηλεκτροφορήσεις που χρησιμοποιούνται ευρύτερα είναι: πρωτεινών ορού (λοιμώξεις, δυσλειτουργία οργάνων) αιμοσφαιρινών (αιμοσφαιρινοπάθειες) λιποπρωτεϊνών ορού (υπερλιπιδαιμίες) πρωτεϊνών ούρων (πρωτεϊνουρία) Ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνών του ορού O διαχωρισμός των πρωτεϊνών του ορού με ηλεκτροφόρηση (εικόνα 1) δίνει πέντε χαρακτηριστικές ζώνες οι οποίες αποτελούνται από ένα ή περισσότερα διαφορετικά είδη πρωτεϊνικών μορίων (πίνακας 1). 29

30 - Αλβουμίνη - Ζώνη α1 - Ζώνη α2 - Ζώνη β - Ζώνη γ Εικόνα 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών ορού Πίνακας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών ορού Ηλεκτροφορητική ζώνη Πρωτεΐνες Λειτουργία (+) (-) Αλβουμίνη (55-68 %) Αλβουμίνη Διατήρηση του όγκου του αίματος Μεταφορά χολερυθρίνης α1 σφαιρίνες (2-4 %) α1 αντιτρυψίνη α1 αντιχυμοτρυψίνη α2 μακροσφαιρίνη Απτοσφαιρίνη α2 σφαιρίνες (8-13 %) Αναστολείς ενζύμων Σερουλοπλασμίνη Μεταφορά πρωτεϊνών, ορμονών α λιποπρωτεΐνη και Τρανσφερρίνη λιποδιαλυτών μορίων Πλασμινογόνο β σφαιρίνες (7-13 %) Φιμπρονεκτίνη C3 συμπλήρωμα β λιποπρωτεΐνη γ σφαιρίνες (9-16 %) IgG, IgA, IgM, IgD, IgE Καταπολέμηση μολύνσεων 30

31 CRP Η φλεγμονή (inflammation) είναι ένα σύνολο διεργασιών, σε ένα ιστό, ως αντίδραση σε κάποια βλάβη. Τα συμπτώματά της φλεγμονής είναι οίδημα, ερυθρότητα, πόνος και πολλές φορές πυρετός. Η οξεία φλεγμονή (acute inflammation), όπως μια παιδική ασθένεια ή σκωλικοειδίτιδα, συνήθως συνοδεύεται από αύξηση των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων στο αίμα, αύξηση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) στον ορό και αύξηση της ταχύτητας καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ΤΚΕ). Παράλληλα, τόσο στη χρόνια όσο και στην οξεία φλεγμονή, ως απόκριση του οργανισμού, παρουσιάζεται αλλοίωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου των πρωτεϊνών του ορού. Ο πιο γρήγορος τρόπος για την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της πορείας μιας φλεγμονής είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της στον ορό. Μέχρι πρότινος αυτό γινόταν αποκλειστικά με ανοσοσυγκόλληση, όμως τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται μέθοδοι που βασίζονται στη νεφελομετρία και γίνονται σε βιοχημικό αναλυτή. Αρχή της μεθόδου Η αναοσοσυγκόλληση χρησιμοποιεί πολυμερή σφαιρίδια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώματα έναντι της CRP. Η ανάμιξη αντιδραστηρίου σφαιριδίων με ίση ποσότητα ορού δίνει αναοσοσυγκόλληση, σε συγκεντρώσεις CRP πάνω από το φυσιολογικό όριο των 6 μg/ml. Για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης της, χρησιμοποιούμε υποδιπλασιαζόμενες αραιώσεις ορού μέχρι να προσδιοριστεί η μέγιστη αραίωση που δίνει ανοσοσυγκόλληση. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση της CRP ισούται με τι γινόμενο 6 μg/ml επί το συντελεστή αραίωσης. 31

32 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Τροφοδοτικό συνεχούς ρεύματος Συσκευή ηλεκτροφόρησης Συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 2) Θάλαμος θερμού αέρα Θήκη πηκτώματος για χρώση Δοχεία χρώσης Χρονόμετρο Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των λ Πήκτωμα Αγαρόζης 0,8% Ρυθμιστικό διάλυμα: 0,1 Μ tris-barbital ph 9,2 Δείγματα ορών Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι 1 l): 0,1Μ tris-barbital ph 9,2 Διάλυμα μονιμοποίησης: 60% αιθανόλη, 10% οξεικό, 30% απιονισμένο νερό Χρωστική (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι όγκο 300 ml): 0,4% amidoblack, 6,7% αιθυλενογλυκόλη Αποχρωστικό (stock διάλυμα 1 ml σε 1 l απιονισμένο νερό): 0,05% κιτρικό οξύ Απιονισμένο νερό ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιμάζουμε τη συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 2) Στην επιφάνεια τοποθέτησης του πηκτώματος ρίχνουμε 100 λ Η 2 Ο Βγάζουμε το πήκτωμα από το φάκελο του και το τοποθετούμε στη συσκευή (εικόνα 3) Στεγνώνουμε το πήκτωμα με διηθητικό χαρτί Προσθέτουμε 10 λ από κάθε δείγμα στις αριθμημένες θέσεις της συσκευής (εικόνα 4) Ακουμπάμε το βραχίονα εναπόθεσης πάνω στο πήκτωμα για 40 sec (εικόνα 5) Απομακρύνουμε το βραχίονα Μεταφέρουμε το πήκτωμα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προσθέτουμε 300 ml ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Κλείνουμε το καπάκι της συσκευής και συνδέουμε τα ηλεκτρόδια 32

33 Ανοίγουμε το τροφοδοτικό Ρυθμίζουμε την τάση του ρεύματος στα 100 V Αφήνουμε να αναπτυχθεί η ηλεκτροφόρηση για 20 min Κλείνουμε το τροφοδοτικό Βγάζουμε το πήκτωμα από τη συσκευή και το τοποθετούμε στο πλαίσιο χρώσης ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΖΩΝΩΝ Τοποθετούμε το πήκτωμα στο μονιμοποιητικό για 4 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 15min Τοποθετούμε το πήκτωμα στο πλαίσιο χρώσης Τοποθετούμε το πλαίσιο στη χρωστική για 4 min Ξεπλένουμε καλά με νερό βρύσης Τοποθετούμε το πλαίσιο διαδοχικά τρεις φορές σε αποχρωστικό από 2 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 3 min Σαρώνουμε το ηλεκτροφόρημα ΗΜIΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ CRP Σε κατάλληλο λευκό πλακίδιο τοποθετούμε 30 μl ορό και 30 μl αντιδραστήριο Αναμιγνύουμε με τη βοήθεια ενός κίτρινου ρύγχους από πιπέτα Τοποθετούμε το πλακίδιο σε αναδευτήρα Ελέγχουμε το δείγμα μας για κροκίδωση μετά 3-4 min Σε περίπτωση κροκίδωσης επαναλαμβάνω με υποδιπλασιαζόμενες ποσότητες ορού Με βάση το συντελεστή αραίωσης του τελευταίου δείγματος που κροκιδώθηκε υπολογίστε τη συγκέντρωση της CRP 33

34 ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Εικόνα 2: συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων Εικόνα 3: τοποθέτηση πηκτώματος πήκτωμα Εικόνα 4: εναπόθεση δειγμάτων Εικόνα 5: εναπόθεση δειγμάτων στο 34

35 ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 4 Αυτοανοσία Αντιπυρηνικά αντισώματα 35

36 36

37 Αυτοανοσία Ο ανθρώπινος οργανισμός έχει την ικανότητα να αντιστέκεται και να αντιμετωπίζει την εισβολή παθογόνων μικροοργανισμών (ιοί, βακτήρια και παράσιτα) μέσω του ανοσοποιητικού συστήματος (immune system) με την παραγωγή εξειδικευμένων πρωτεϊνών που ονομάζονται αντισώματα (antibodies). Όμως υπάρχουν περιπτώσεις όπου το ανοσοποιητικό σύστημα αρχίζει να δυσλειτουργεί και να αναγνωρίζει δικά του βιομόρια (πρωτεΐνες, υδατάνθρακες, DNA) ως ξένα με αποτέλεσμα την παραγωγή αντισωμάτων έναντι των δικών του μορίων. Η δυσλειτουργία αυτή, ονομάζεται αυτοανοσία (autoimmunity) και τα παραγόμενα αντισώματα ονομάζονται αυτoαντισώματα (auto-antibodies). Τα αντιγόνα έναντι των οποίων ένας οργανισμός παράγει αυτό-αντισώματα, μπορεί να βρίσκονται είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων. Στην πρώτη περίπτωση ονομάζονται αντιπυρηνικά αντισώματα (antinuclear antibodies) και περιλαμβάνουν αντισώματα έναντι δίκλωνου ή μονόκλωνου DNA (anti-dsdna ή anti-ssdna, αντίστοιχα), ριβοσωματικού RNA (rrna) καθώς και πυρηνικών πρωτεϊνών (histones). Στην κατηγορία των αντικυτταροπλασματικών αντισωμάτων (anticytoplasmic antibodies) τα αντιγόνα μπορεί να βρίσκονται στα μιτοχόνδρια, στον κυτταροσκελετό, στα ριβοσώματα κ.α. Ανοσοφθορισμός Tα αντισώματα, εκτός από τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης ουσιών σε διάφορα βιολογικά υλικά, χρησιμοποιούνται και για τον εντοπισμό της θέσης ενός αντιγόνου σε μεμονωμένα κύτταρα ή σε ένα ιστό. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται ανοσοκυτταροχημεία (immunocytochemistry) ή ανοσοϊστοχημεία (immunohistochemistry) αντίστοιχα (Eικόνα 2). Για να γίνει ο εντοπισμός ενός αντιγόνου απαιτείται η μονιμοποίηση ιστού ή κυττάρων πάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα. Η υπόλοιπη διαδικασία περιλαμβάνει δύο στάδια: 1. Αναγνώριση και σύνδεση του αντισώματος πάνω στο αντιγόνο στην επιφάνεια ή στο εσωτερικό ενός κυττάρου (πυρήνας, κυτταρόπλασμα) Ορός με αυτοαντίσωμα + Αντικειμενοφόρος πλάκα με επιστρωμένα κύτταρα ή τομή ιστού 2. Αναγνώριση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος με τη χρήση ενός δεύτερου αντισώματος που είναι συνδεδεμένο με ένα φθορίζον μόριο (φλουοροσεΐνη. Φ Αντί IgG φλουοροσεϊνη + Σύμπλοκο αντιγόνου-αντισώματος πάνω στον ιστό 37

38 Η εμφάνιση ανοσοφθορισμού (immunofluoresense), σε ένα σημείο του ιστού ή των κυττάρων, αντικατοπτρίζει την ύπαρξη συγκεκριμένου αντιγόνου και η παρατήρηση του παρασκευάσματος γίνεται σε μικροσκόπιο φθορισμού. Αντιπυρηνικά αντισώματα Ο έλεγχος για την ύπαρξη αυτο-αντισωμάτων σε ένα δείγμα ορού, γίνεται σε αντικειμενοφόρες πλάκες που κυκλοφορούν στο εμπόριο, οι οποίες είναι επιστρωμένες με ενδοθηλιακά κύτταρα Hep-2, πολυμορφοπύρηνα κύτταρα καθώς και τομές από διάφορους ιστούς, όπως μυικός, ηπατικός, νεφρικός κ.α. Ο πρώτος έλεγχος για την παρουσία αυτοάνοσου νοσήματος είναι η ανίχνευση αντιπυρηνικών αντισωμάτων στον ορό ενός ασθενή, με τον εντοπισμό αντιγόνων στον πυρήνα ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων. Τα θετικά δείγματα παρουσιάζουν χαρακτηριστικό πρότυπο ανοσοφθορισμού (pattern). Αντικυτταροπλασματικά αντισώματα Σε περίπτωση απουσίας αντιπυρηνικών αντισωμάτων αλλά με δεδομένη την υποψία για την ύπαρξη αυτοάνοσου νοσήματος, το επόμενο βήμα είναι η αναζήτηση αυτοαντιγόνων στο κυτταρόπλασμα. Τα θετικά δείγματα παρουσιάζουν χαρακτηριστικό πρότυπο ανοσοφθορισμού (pattern). 38

39 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Δείγματα ανθρώπινων ορών Αντικειμενοφόρες πλάκες επιστρωμένες με ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα Hep-2 Καλυπτρίδες Μικροσκόπιο φθορισμού με αντικειμενικό φακό 40Χ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Φωσφορικός φυσιολογικός ορός PBS (phosphate buffered saline) Αντισώματα έναντι ανθρώπινων IgG συνδεμένα με φλουοροσεΐνη Γλυκερόλη ΠΟΡΕΙΑ Ετοιμάζουμε αραιωμένα δείγματα ανθρώπινων ορών 1:80 σε PBS. Σε κάθε θέση Hep-2 κυττάρων πάνω στην αντικειμενοφόρο πλάκα τοποθετούμε 20 λ αραιωμένου ορού. Επωάζουμε για 20 min σε θερμοκρασία δωματίου. Αφαιρούμε τον ορό και ξεπλένουμε με PBS τέσσερις φορές. Προσθέτουμε 20 λ αντισώματα έναντι ανθρώπινων IgG συνδεμένα με φλουοροσεΐνη. Αφαιρούμε το αντίσωμα και ξεπλένουμε με PBS τέσσερις φορές. Προσθέτουμε μια σταγόνα γλυκερόλη και καλύπτουμε με καλυπτρίδα. Παρατηρούμε σε μικροσκόπιο φθορισμού. Μορφοποιημένo: Κουκκίδες και αρίθμηση 39

40 40