igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

igenetics Mια Μεντελική προσέγγιση

Κεφάλαιο 17 (+ παράρτημα ε: mus musculus) Εφαρμογές της τεχνολογίας του ανασυνδυασμένου DNA. Αποτύπωμα DNA. 2

ΕΙΚΟΝΑ 17.1 Παράδειγμα μεταλλαξιγένεσης ειδικής θέσης με τη χρήση PCR. 3

παράρτημα ε Διαγονιδιακά ζώα Eνα διαγονιδιακό ποντίκι φέρει ξένο DNA ενσωματωμένο σε κάποιο από τα χρωμοσώματά του Eισάγουμε το ξένο DNA στον προπυρήνα του γονιμοποιημένου ωαρίου με μικροένεση και επιστρέφουμε το μονοκυττάριο έμβρυο στον ωαγωγό του θηλυκού, όπου θα συνεχίσει την ανάπτυξή του. Eνσωμάτωση του ξένου DNA σε κάποια τυχαία χρωμοσωμική θέση σε ποσοστό 25% με 50%. Η ένθεση μπορεί να συμβεί καθώς το έμβρυο είναι στο στάδιο του ενός κυττάρου, οπότε και το διαγονίδιο θα βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα του ενήλικου ατόμου.

Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων Southern blotting

Γονιδιακή στόχευση Η στοχευμένη μεταλλαξιγένεση, δίνει τη δυνατότητα να αφαιρέσουμε συγκεκριμένες αλληλουχίες από το γονιδίωμα του ποντικού Η στοχευμένη μεταλλαξιγένεση επιτελείται με ομόλογο ανασυνδυασμό και όχι τυχαία ενσωμάτωση.

Γονιδιακή στόχευση Γονιδιακή στόχευση εμβρυικών βλαστοκυττάρων

Μεταφορά των στοχευμένων βλαστοκυττάρων σε βλαστοκύστες για τη δημιουργία γονιδιακά στοχευμένων ζώων.

Κυτταροειδική γονιδιακή στόχευση: Cre-LoxP Συχνά η γονιδιακή στόχευση οδηγεί σε θνησιγόνο φαινότυπο. Σε αυτή τη περίπτωση επιλέγουμε να στοχεύσουμε ένα γονίδιο αποκλειστικά σε έναν τύπο κυττάρων. Cre: 38kDa ανασυνδυάση που κωδικοποιείται από το βακτηριοφάγο P1. LoxP: παλίνδρομες αλληλουχίες 34 βάσεων όπου γίνεται το κόψιμο και η ανταλλαγή των αλυσίδων του DNA

Κυτταροειδική γονιδιακή στόχευση: Cre-LoxP

Xgal (turns blue when cleaved by b-gal) Η Cre ρεκομπινάση αφαιρεί τα LoxP sites (πράσινα τρίγωνα) και την αλληλουχία STOP ανάμεσα τους επιτρέποντας τη μετάφραση του γονιδίου της β-γαλακτοσιδάσης και την επακόλουθη διάσπαση της Xgal δίνοντας μπλε χρώμα.

Ιστοειδικός έλεγχος της έκφρασης της Cre ρεκομπινάσης Rosa26 x P (gene of interest)-cre X-gal B-galactosidase activity

Ιστοειδική παθολογία (ένας τύπος ιστού/κυττάρων φέρει την αλλοίωση)

In vivo σήμανση γονιδιακής έκφρασης:

Κρυοσυντήρηση γενετικά τροποποιημένων ζώων

Κρυοσυντήρηση εμβρύων

Ανάλυση των πολυμορφισμών του DNA 19

Πολυμορφισμοί του DNA Πολυμορφισμοί DNA είναι οι διάφορες εναλλακτικές μορφές (αλληλόμορφα) ενός χρωμοσωμικού τόπου που διαφέρουν ως προς την αλληλουχία του DNA. Η πολυμορφική θέση βρίσκεται οπουδήποτε στο γονιδίωμα και δεν αφορά μόνο γονίδια. Πολλοί πολυμορφισμοί χρησιμοποιούνται ως δείκτες DNA. Συχνότητα: 1 ανά 350bp. Για αυτό τους χρησιμοποιούμε για να κατασκευάσουμε γενετικούς χάρτες υψηλής ακρίβειας. 20

Είδη Πολυμορφισμών του DNA Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) Βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις (Short Tandem Repeats, STRs) Ποικίλου αριθμού διαδοχικές επαναλήψεις (Variable Number of Tandem Repeats, VNTRs) 21

Μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί -μια αλλαγή σε ένα ζεύγος βάσεων -μεγάλη συχνότητα (1/350bp) -ευθύνονται για το 90-95% της ποικιλομορφίας του ανθρώπινου DNA. -δημιουργούνται από αυθόρμητες μεταλλαγές κατά την αντιγραφή. -χωρίζονται σε κωδικούς (csnps) και μη κωδικούς SNPs ανάλογα με το αν βρίσκονται σε κωδικές περιοχές ή όχι. -κάθε γονίδιο έχει περίπου 4 csnps. 22

ΕΙΚΟΝΑ 17.2 Aνάλυση SNP που επηρεάζουν θέσεις περιορισμού, με στύπωμα Southern. Ένα χρωμοσωμικό τμήμα μεγέθους 7 kb φέρει θέσεις BamHI σε κάθε άκρο του. Το αλληλόμορφο SNP 1 (επάνω) έχει μια τρίτη θέση BamHI, σε απόσταση 2 kb από το αριστερό άκρο. Στο αλληλόμορφο SNP 2 (κάτω) ένα ζεύγος βάσεων ΤΑ έχει αντικατασταθεί από ένα ζεύγος βάσεων CG, με αποτέλεσμα η τρίτη θέση BamHI να έχει εξαλειφθεί. Προκειμένου να γονοτυπηθεί ο γενετικός αυτός τόπος, το DNA πέπτεται με BamHI και ακολουθεί στύπωμα Southern και υβριδοποίηση με τον ιχνηθέτη που υποδεικνύεται. 1/1 και 2/2 = ομόζυγα 1/2 = ετερόζυγα 23

ΕΙΚΟΝΑ 17.3 RFLP: Aνάλυση SNP που επηρεάζουν θέσεις περιορισμού, με PCR. Ένα χρωμοσωμικό τμήμα μεγέθους 2 kb φέρει έναν SNP σε απόσταση 500 bp από το αριστερό του άκρο. Στο αλληλόμορφο SNP 1 (επάνω) υπάρχει μια θέση BamHI η οποία απουσιάζει από το αλληλόμορφο SNP 2 (κάτω), επειδή ένα ζεύγος βάσεων ΤΑ έχει αντικατασταθεί από ένα ζεύγος βάσεων CG. Προκειμένου να γονοτυπηθεί ο γενετικός αυτός τόπος, πραγματοποιείται πρώτα PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που υποδεικνύονται με βέλη, ακολουθεί πέψη με BamHI των προϊόντων της αντίδρασης και στη συνέχεια ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. 1/1 και 2/2 = ομόζυγα 1/2 = ετερόζυγα 24

ΕΙΚΟΝΑ 17.4 Αν δεν υπάρχουν πολυμορφικές θέσεις περιορισμού: Γονοτύπηση ενός SNP μέσω υβριδοποίησης με ένα αλληλομορφοειδικό ολιγονουκλεοτίδιο. Ένα ολιγονουκλεοτίδιο απόλυτα συμπληρωματικό προς το πιο κοινό αλληλόμορφο υβριδοποιείται με το DNA-στόχο υπό συνθήκες που ευνοούν το ζευγάρωμα μόνο μεταξύ πλήρως συμπληρωματικών μορίων. Αν γίνει υβριδοποίηση, σημαίνει ότι το DNA-στόχος έχει το πιο κοινό αλληλόμορφο. Αν δε γίνει, σημαίνει ότι ανάμεσα στο DNA-στόχο και τον ιχνηθέτη υπάρχει ένα αταίριαστο ζεύγος βάσεων και επομένως το DNA-στόχος δε φέρει το πιο κοινό αλληλόμορφο. 25

ΕΙΚΟΝΑ 17.5 Mικροσυστοιχία cdna Τι βλέπουμε στην εικόνα: cdna 1: φθορίζει πράσινο (Cy3 labeled dntps cdna 2: φθορίζει κόκκινο (Cy5 labeled dntps Ανάμειξη των δύο cdna δειγμάτων Για κάθε γονίδιο στόχο (spot), η ποσότητα cdna 1 που αντιστοιχεί στα επίπεδα έκφρασης mrna του δείγματος 1 μπορεί να είναι μικρότερη (πιο κόκκινο spot), ίση (κίτρινο spot) ή περισσότερη (πιο πράσινο spot) από την ποσότητα cdna 2 που αντιστοιχεί στα επίπεδα έκφρασης mrna του δείγματος 2. 26

Βραχείες διαδοχικές επαναλήψεις -επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους 2-6bp. -επαναλαμβάνονται από λίγες ως 100 φορές. -παράδειγμα: τα τελομερή -πολλές STRs είναι πολυμορφικές = ποικίλλει ο αριθμός επαναλήψεων -λόγω μικρού μεγέθους ανιχνεύονται με PCR Ποικίλου αριθμού διαδοχικές επαναλήψεις -επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες μήκους 7bp- δεκάδες bp. -επαναλαμβάνονται λιγότερο από τα STRs. -μοναδικοί ή πολλαπλοί γενετικοί τόποι -ανιχνεύονται με μονοτοπικούς ή πολυτοπικούς ιχνηθέτες -λόγω μεγάλου μεγέθους ανιχνεύονται με πέψη/southern 27

ΕΙΚΟΝΑ 17.6 Γονοτύπηση με PCR ενός γενετικού τόπου STR. Απομονώνεται γονιδιωματικό DNA και πραγματοποιείται PCR με εκκινητές που περιβάλλουν το γενετικό τόπο STR. Τα μεγέθη των προϊόντων της PCR προσδιορίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Στην εικόνα, το αλληλόμορφο STR 1 έχει 6 επαναλήψεις GATA, ενώ το αλληλόμορφο STR 2 έχει 10. Στο κάτω μέρος της εικόνας παρουσιάζονται τα αναμενόμενα πρότυπα ζωνών στο πήκτωμα για τους τρεις πιθανούς γονοτύπους: (6,6) [άτομο ομόζυγο ως προς το αλληλόμορφο με τις έξι επαναλήψεις], (10,10) και (6,10). Στην πραγματικότητα, η ποικιλομορφία ως προς τον αριθμό των επαναλήψεων σε ένα γενετικό τόπο STR είναι συνήθως μεγάλη, υπάρχουν δηλαδή πολλά διαφορετικά αλληλόμορφα. 6/6, 10/10: ομόζυγα 6/10: ετερόζυγα igenetics 28

Μοριακή ανάλυση DNA Προγεννητική διάγνωση: (αμνιοπαρακέντηση, γενετικές διαταραχές) Σάρωση νεογνών: (παρουσία μεταλλαγών σε νεογνά) Εντοπισμός φορέων: (παθολογικά αλληλόμορφα) Είδη αναλύσεων: -αναλύσεις πολυμορφισμών μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP) -αναλύσεις που βασίζονται στη PCR (σε γνωστή αλληλουχία) 29

ΕΙΚΟΝΑ 17.7 Παράδειγμα RFLP ανάλυσης: Η αρχή του γονιδίου της β-σφαιρίνης, του mrna του και του πολυπεπτιδίου του: οι φυσιολογικές αλληλουχίες HbA και οι μεταλλαγμένες αλληλουχίες HbS. Οι διαφορές στην αλληλουχία μεταξύ HbA και HbS επισημαίνονται με κόκκινα γράμματα. Η μεταλλαγή επηρεάζει μια θέση DdeI. 30

ΕΙΚΟΝΑ 17.8 Εντοπισμός του αλληλομόρφου της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας με RFLP. (α) Οι θέσεις περιορισμού DdeI γύρω από την αρχή του γονιδίου της β-σφαιρίνης. (β) Αποτελέσματα της ανάλυσης κατά Southern γονιδιωματικού DNA που έχει κοπεί με DdeI, χρησιμοποιώντας έναν ιχνηθέτη από την αρχή του γονιδίου της β-σφαιρίνης. 31

ΕΙΚΟΝΑ 17.9 Μοριακό τεστ DNA για τον εντοπισμό μεταλλαγών του γονιδίου του γλαυκώματος ανοικτής γωνίας GLC1A, χρησιμοποιώντας PCR και υβριδοποίηση με ASO. (α) Αποτελέσματα της αλληλούχισης τμήματος του GLC1A από ένα ετερόζυγο άτομο, στο ένα αλληλόμορφο του οποίου υπάρχει C αντί του φυσιολογικού Τ. Λόγω της μεταλλαγής στη θέση 370 του πολυπεπτιδίου, μια Pro μετατρέπεται σε Leu. (β) Οι αλληλουχίες των δύο ASO τα οποία χρησιμοποιούνται κατά την υβριδοποίηση. Η μία αντιστοιχεί στο αλληλόμορφο άγριου τύπου και η άλλη στο μεταλλαγμένο. (γ) Οι τρεις πιθανοί γονότυποι όπως εμφανίζονται στο αυτοραδιογράφημα. ASO: allele-specific oligonucleotide hybridization 32

Μοριακή ανάλυση DNA Δυσκολίες: 1. Το υπεύθυνο γονίδιο παραμένει άγνωστο. 2. Το γονίδιο είναι γνωστό αλλά οι μεταλλαγές είναι πολλές. 3. Η μεταλλαγή δεν οδηγεί πάντα σε παθογένεια. 4. Η παθογένεια ωφείλεται σε πολλά γονίδια. 33

Γονίδιο κυστικής ίνωσης 1. το πρώτο που κλωνοποιήθηκε στον άνθρωπο. 2. Σάρωση πολλών RFLP δεικτών. 3. Ανακάλυψη ενός RFLP που συνδέται με την εμφάνιση κυστικής ίνωσης σε πολλά άτομα. 4. Εύρεση του χρωμοσώματος που βρίσκεται το γονίδιο CFTR μέσω in situ hybridization: Chr 7. 34

ΕΙΚΟΝΑ 17.10 Χρωμοσωμικός περίπατος. Είναι δυνατό να κλωνοποιήσουμε ένα γονίδιο που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο γνωστούς δείκτες. Ξεκινούμε αρχικά από μια γνωστή περιοχή, δηλ. ένα δείκτη RFLP χρησιμοποιώντας ένα σημασμένο ιχνηθέτη. Ποιό από τα τμήματα φέρει το γονίδιο; Συχνά πρόκειται για συντηρημένες αλληλουχίες και κάνουμε zoo blotting με τον συγεκριμένο κλώνο σε άλλους οργανισμους (κοτόπουλο κτλ). 35

ΕΙΚΟΝΑ 17.11 Αποτύπωμα DNA με σκοπό τον έλεγχο πατρότητας. (Μ.Μ.Β.: Μάρτυρας μοριακού βάρους.) STRs ή VNTRs 36

Εφαρμογές DNA typing -Διερεύνηση ποικιλομορφίας ΕΙΚΟΝΑ 17.12 Ο Sir Alec Jeffreys που ανακάλυψε τις VNTR. Στα χέρια του κρατάει ένα αυτοραδιογράφημα με αποτυπώματα DNA. -Προσδιορισμός ράτσας αλόγων -Ιατροδικαστικές αναλύσεις -Ανίχνευση παθογόνων οργανισμών σε τρόφιμα -Ανίχνευση γενετικά τροποιπημένων οργανισμών Διαλέυκανση εγκλημάτων: DNA typing Υπόθεση Pitchfork (Leicestershide) Υπόθεση Ridgeway (Washington) Υπόθεση Reyes (New York)

Εντοπισμός αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών 38

To Gal4p γονίδιο προσδένεται στην upstream activating sequence για την ενεργοποίηση της μεταγραφής. Εχει 2 επικράτειες: -επικράτεια πρόσδεσης στο DNA (Binding domain) -Επικράτεια Ενεργοποίησης (Activating domain) ΕΙΚΟΝΑ 17.15 Εντοπισμός αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών με το σύστημα δύο υβριδίων στο ζυμομύκητα. 39

ΕΙΚΟΝΑ 17.16 Παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε διαγονιδιακό θηλαστικό (στην περίπτωση αυτή ένα πρόβατο). 40

ΕΙΚΟΝΑ 17.17 Σχηματισμός όγκων (κάλων) σε φυτά μέσω της μόλυνσής τους με ορισμένα είδη του βακτηρίου Agrobactrerium. Οι όγκοι επάγονται από το πλασμίδιο Ti του βακτηρίου. Μέρος του DNA του Ti (το Τ-DNA ή μετασχηματιστικό DNA) ενσωματώνεται στο γονιδίωμα του φυτικού κυττάρου. T-DNA: -περιβάλλεται από 2 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες 25bp που εμπλέκονται στην εκτομή του -ακολουθεί η μεταφορά του T-DNA από το βακτήριο στο πυρήνα και η ένθεση του στο πυρηνικό DNA -τα γονίδια της εκτομής, μεταφοράς κιαι ένθεσης βρίσκονται σε άλλη περιοχή του πλασμιδίου (virulence)

ΕΙΚΟΝΑ 17.18 Δημιουργία διαγονιδιακού φυτού καπνού, ανθεκτικού στο ζιζανιοκτόνο Roundup TM μέσω της εισαγωγής μιας τροποποιημένης μορφής του βακτηριακού γονιδίου που κωδικοποιεί το ένζυμο EPSPS. Roundup: γλυφοσάτη που καταστέλλει Το EPSPS, ένα ένζυμο των χλωροπλαστών και προκαλεί το θάνατο των φυτών. Αποτελεσματικό σε χαμηλές δόσεις και Αποικοδομείται γρήγορα στο περιβάλλον Εισαγωγή γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα που μετατρέπουν το ζιζανιοκτόνο σε μια ανενεργή μορφή (ανθεκτικό βακτηριακό EPSPS). 42