ΜΕΡΟΣ ΙI: Η ΡΟΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Σύνθεση και επεξεργασία του RNA

Ευάγγελος Κωλέττας, B.Sc (HONS), Ph.D.(LON) Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Βιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων ΜΕΡΟΣ ΙI: Η ΡΟΗ ΤΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΩΝ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Σύνθεση και επεξεργασία του RNA 7.1. Η μεταγραφή στους προκαρυωτικούς οργανισμούς 7.2. Η RNA πολυμεράση των ευκαρυωτικών οργανισμών και οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες 7.3. Η ρύθμιση της μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς 7.4. Επεξεργασία και ανακύκλωση του RNA Πείραμα-Σταθμός: Η απομόνωση ενός μεταγραφικού παράγοντα Πείραμα-Σταθμός: Η ανακάλυψη των snrnp ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στα Κ5 και Κ6 εξετάστηκαν η οργάνωση του γονιδιωματικού DNA, καθώς και οι μηχανισμοί με τους οποίους εξασφαλίζεται η πιστή μεταβίβαση του από γενιά σε γενιά. Το γονιδιωματικό DNA μπορεί να θεωρηθεί η πηγή των γενετικών οδηγιών που ελέγχουν τις κυτταρικές λειτουργίες. Οι οδηγίες αυτές εκτελούνται μέσω της σύνθεσης του RNΑ και των πρωτεϊνών. Ωστόσο να σημειωθεί πως τα χαρακτηριστικά ενός κυττάρου δεν καθορίζονται μόνο από το ποια γονίδια έχει κληρονομήσει, αλλά και από το ποια από αυτά εκφράζονται σε κάθε δεδομένη στιγμή. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει στα κύτταρα να προσαρμόζονται στις αλλαγές του περιβάλλοντος τους και είναι υπεύθυνη για τις ξεχωριστές ιδιότητες κάθε κυτταρικού τύπου των σύνθετων ζωικών οργανισμών. Για παράδειγμα, τα μυϊκά και τα ηπατικά κύτταρα διαθέτουν τα ίδια γονίδια. Έχουν όμως διαφορετικές ιδιότητες, καθώς κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, από την αρχή ακόμα της διαφοροποίησης τους, εκφράζουν διαφορετικά γονίδια μέσω ειδικών μηχανισμών ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Το πρώτο στάδιο της έκφρασης ενός γονιδίου, η μεταγραφή του DNA σε RNA, αποτελεί το αρχικό επίπεδο όπου ρυθμίζεται η γονιδιακή έκφραση τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Στη συνέχεια, τα RNA των ευκαρυωτικών κυττάρων τροποποιούνται με διάφορους τρόπους - για παράδειγμα, αφαιρούνται τα ιντρόνια με το μάτισμα - προκειμένου το πρωτογενές μετάγραφο να αποκτήσει τη λειτουργική του μορφή. Οι διάφοροι τύποι του RNΑ έχουν συγκεκριμένο ρόλο στα κύτταρα: τα αγγελιαφόρο RNA (mrna) λειτουργούν ως μήτρες για τη σύνθεση πρωτεϊνών, ενώ τα ριβοσωμικά RNA (rrna) και τα μεταφορικά RNA (trna) συμμετέχουν στη μετάφραση του mrna. Επιπλέον, ορισμένα μικρά RNA συμμετέχουν στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων, στο μάτισμα του mrna, στην ωρίμανση του rrna και στη διαλογή των πρωτεϊνών στους ευκαρυώτες. Στην πραγματικότητα, μερικά από τα σημαντικότερα σύγχρονα επιτεύγματα της βιολογίας σχετίζονται με τον ρόλο των μικρών μη κωδικών μορίων RNA (mirna) ως ρυθμιστών της έκφρασης των γονιδίων στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η μεταγραφή και η ωρίμανση του RNA εξετάζονται σε αυτό το κεφάλαιο. Το τελικό στάδιο της έκφρασης των γονιδίων, η μετάφραση του mrna σε πρωτεΐνη, εξετάζεται στο Κ8. 7.1. Η μεταγραφή στους προκαρυωτικούς οργανισμούς Όπως στους περισσότερους τομείς της μοριακής βιολογίας, έτσι και στη μεταγραφή η Ε. coli έχει αποτελέσει τον οργανισμό-μοντέλο με τη μελέτη του οποίου τέθηκαν οι βάσεις όπου στηρίχτηκε αργότερα η έρευνα στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Στο Κ4 αναφέρθηκε ότι το mrna ανακαλύφθηκε στην Ε. coli. Η Ε. coli αποτέλεσε επίσης τον πρώτο οργανισμό από τον οποίο απομονώθηκε και μελετήθηκε η RNΑ πολυμεράση. Οι βασικοί μηχανισμοί ρύθμισης της μεταγραφής διευκρινίστηκαν χάρη σε καινοτόμα πειράματα στην Ε. coli, όπου η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει στα κύτταρα να ανταποκρίνονται σε αλλαγές του περιβάλλοντος, όπως είναι οι αλλαγές στη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών. Η κατανόηση της μεταγραφής στην Ε. coli αποτέλεσε τη βάση για τη μελέτη των πιο σύνθετων μηχανισμών ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης που παρατηρούνται στα ευκαρυωτικά κύτταρα. 1

RNA πολυμεράση και μεταγραφή Το κύριο ένζυμο για τη σύνθεση του RNΑ είναι η RNA πολυμεράση (RNA polymerase), η οποία καταλύει τον πολυμερισμό 5'-τριφωσφορικών ριβονουκλεοσιδίων (ΝΤΡ, Nucleoside Triphosphates), με τη σειρά που υπαγορεύεται από ένα μόριο DNA το οποίο χρησιμοποιείται ως μήτρα. Η σύνθεση του RNA είναι παρόμοια με αυτή του DNA. Η RNA πολυμεράση, όπως και η DNA πολυμεράση, καταλύει την επιμήκυνση των αλυσίδων RNA πάντα με κατεύθυνση 5' προς 3'. Αντίθετα με την DNA πολυμεράση, η RNA πολυμεράση δε χρειάζεται έναν προϋπάρχοντα εκκινητή για να ξεκινήσει τη σύνθεση του RNΑ. Η μεταγραφή ξεκινάει de novo από ειδικές περιοχές στην αρχή των γονιδίων, με τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού ανάμεσα στα δύο πρώτα ΝΤΡ του υπό σύνθεση μορίου RNΑ. Η διαδικασία της έναρξης είναι ιδιαίτερα σημαντική, επειδή αποτελεί βασικό στάδιο για τη ρύθμιση της μεταγραφής. ΕΙΚΟΝΑ 7.1. Η RNA πολυμεράση της Ε. coli. Το πλήρες ένζυμο αποτελείται από έξι υπομονάδες: δύο α, μία β, μία β', μία ω και μία σ [(α2ββ'ω)σ]. Η υπομονάδα σ συνδέεται πιο χαλαρά και έτσι μπορεί να αποσπαστεί σχετικά εύκολα από τις υπόλοιπες υπομονάδες, οι οποίες συνιστούν τη λεγόμενη κεντρική πολυμεράση (ή ολοένζυμο) (α2ββ'ω). Οι α, β και β έχουν σχετικά σταθερά μεγέθη σε διάφορα είδη βακτηρίων, ενώ η σ ποικίλλει σε μεγαλύτερο βαθμό. Η RNA πολυμεράση, όπως και η DNA πολυμεράση, είναι ένα σύνθετο ένζυμο που αποτελείται από πολλές πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Το πλήρες βακτηριακό ένζυμο αποτελείται από 5 διαφορετικούς τύπους υπομονάδων που ονομάζονται α, β, β', ω και σ (Εικ. 7.1). Η υπομονάδα σ είναι σχετικά χαλαρά προσδεδεμένη και μπορεί να διαχωριστεί εύκολα από τις άλλες υπομονάδες, οπότε προκύπτει η λεγόμενη κεντρική πολυμεράση (core polymerase), που αποτελείται από δύο υπομονάδες α, μία β, μία β' και μία ω. Η κεντρική RNA πολυμεράση μπορεί να καταλύσει τον πολυμερισμό των ΝΤΡ στο RNΑ, γεγονός που αποδεικνύει ότι η υπομονάδα σ δεν είναι απαραίτητη για τη βασική καταλυτική ενεργότητα του ενζύμου. Ωστόσο, απουσία της σ, η κεντρική πολυμεράση δεν προσδένεται με ειδικότητα, όπως συμβαίνει φυσιολογικά στις αλληλουχίες του DNA που σηματοδοτούν την έναρξη της μεταγραφής. Επομένως, η υπομονάδα σ είναι απαραίτητη για την αναγνώριση των σωστών περιοχών έναρξης της μεταγραφής. Η αναγνώριση των περιοχών αυτών αποτελεί κρίσιμο στοιχείο της μεταγραφής, επειδή η σύνθεση ενός RNΑ, προκειμένου να είναι λειτουργικό, πρέπει να ξεκινάει από την αρχή του αντίστοιχου γονιδίου. Τα περισσότερα βακτήρια, συμπεριλαμβανομένης της Ε. coli, διαθέτουν αρκετές υπομονάδες σ, καθεμία από τις οποίες κατευθύνει την RNA πολυμεράση σε διαφορετικές περιοχές έναρξης της μεταγραφής (δηλαδή σε διαφορετικά γονίδια). Να σημειωθεί ότι υπάρχουν περισσότερα μόρια κεντρικής πολυμεράσης (ολοενζύμου) από ότι μόρια του παράγοντα σ. Τα βακτήρια, χρησιμοποιώντας εναλλακτικές υπομονάδες σ κάτω από διαφορετικές (περιβαλλοντικές) συνθήκες (για παράδειγμα, ανάλογα με τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών συστατικών, θερμοκρασία), ενεργοποιούν διαφορετικές ομάδες γονιδίων τους. 2

Εκτός από τον σ70, η E. coli έχει αρκετούς παράγοντες σίγμα που επάγονται σε συγκεκριμένες περιβαλλοντικές συνθήκες. Ο εκθέτης στο όνομα του παράγοντα υποδηλώνει τη μάζα του. σ70(rpod) ή σa (The housekeeping sigma factor): Ο παράγοντας σ βασικών λειτουργιών (κύριος παράγοντας σ) εμπλέκεται στη μεταγραφή των περισσοτέρων γονιδίων στα βακτηριακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται και αυξάνονται, έτσι ώστε να διατηρούνται ενεργά τα απαραίτητα γονίδια και οι μεταβολικές πορείες. Τα γονίδια που αναγνωρίζονται από το σ70 περιέχουν στους υποκινητές τους τις συγκαταβατικές αλληλουχίες (στοιχεία -10 και -35). σ38(rpos) (Starvation/stationary phase σ factor): Παράγοντας σ που εμπλέκεται στη μεταγραφή γονιδίων σε περίοδο ασιτίας και κατά την στατική φάση αύξησης. σ32 (RpoH) (The heat shock σ factor): Επάγεται όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε υψηλές θερμοκρασίες (>370C). Ως αποτέλεσμα της επαγωγής της έκφρασης του, ο σ32 δεσμεύεται στην κεντρική πολυμεράση, η οποία με τη σειρά της μεταγράφει γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του θερμικού στρες (heat shock proteins), που θα βοηθήσουν τα βακτήρια να επιβιώσουν σε υψηλότερες θερμοκρασίες. Μερικές απ αυτές τις πρωτεΐνες που επάγονται από την ενεργοποίηση του σ32 είναι πρωτεΐνες-συνοδοί (chaperones), πρωτεάσες και ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA. σ24 (RpoE) ή σε (The extracytoplasmic/extreme heat stress sigma factor): Ο παράγοντας σ24 επάγεται στο κυτταρόπλασμα όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε πάρα πολύ υψηλές θερμοκρασίες. σ54 (RpoN) (The nitrogen-limitation sigma factor): Επάγεται όταν υπάρχει έλλειψη αζώτου, και συμβάλλει στη μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό του αζώτου. σ28 (RpoF) (The flagellar σ factor): Συμβάλλει στη μεταγραφή μαστιγιακών γονιδίων. Η περιοχή του DNA όπου προσδένεται η RNA πολυμεράση για να ξεκινήσει τη μεταγραφή ενός γονιδίου ονομάζεται υποκινητής (promoter). Οι αλληλουχίες του DNA που συμμετέχουν στη λειτουργία του υποκινητή προσδιορίστηκαν μέσω της σύγκρισης των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των υποκινητών μιας σειράς διαφορετικών γονιδίων της Ε. coli. Από τέτοιες συγκρίσεις προέκυψε ότι η περιοχή που βρίσκεται ανοδικά (προς το 5') της θέσης έναρξης της μεταγραφής περιέχει δύο μικρής έκτασης τμήματα με κοινή αλληλουχία σε πολλά γονίδια. Πρόκειται για δύο εξανουκλεοτίδια, που ονομάζονται στοιχεία -10 και -35 (Εικ. 7.2). Η ονομασία τους υποδηλώνει τη θέση τους σε σχέση με το σημείο έναρξης της μεταγραφής, το οποίο ορίζεται ως +1. Η πρότυπη αλληλουχία του στοιχείου -10 είναι TATAAT, ενώ του στοιχείου -35 είναι TTGACA. Όμως, σε διαφορετικούς υποκινητές, οι αλληλουχίες των στοιχείων -10 και -35 δεν είναι πανομοιότυπες, είναι όμως αρκετά όμοιες και από τη στοίχιση τους προκύπτουν πρότυπες αλληλουχίες οι οποίες υποδεικνύουν τα νουκλεοτίδια που εμφανίζονται συχνότερα σε κάθε θέση. ΕΙΚΟΝΑ 7.2. Οι χαρακτηριστικές αλληλουχίες των υποκινητών της Ε. coli. Οι υποκινητές της Ε. coli φέρουν 2 χαρακτηριστικές αλληλουχίες που βρίσκονται 10 και 35 ζεύγη βάσεων ανοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (+1). Οι πρότυπες αλληλουχίες που υποδεικνύονται εδώ αντιστοιχούν στα νουκλεοτίδια που συναντώνται συχνότερα σε κάθε θέση με βάση τη σύγκριση των αντίστοιχων αλληλουχιών από διαφορετικούς υποκινητές. 3

Αρκετά πειραματικά δεδομένα υποστηρίζουν τον λειτουργικό ρόλο των στοιχείων -10 και -35 των υποκινητών. Πρώτον, τα γονίδια των οποίων οι υποκινητές διαφέρουν σημαντικά από τις πρότυπες αλληλουχίες μεταγράφονται λιγότερο αποτελεσματικά από αυτά με υποκινητές που εμφανίζουν μεγαλύτερη ομολογία προς τις πρότυπες αλληλουχίες. Δεύτερον, η εισαγωγή μεταλλαγών σε οποιαδήποτε από τις πρότυπες αλληλουχίες -35 και -10 επηρεάζει σημαντικά τη λειτουργία του υποκινητή. Τρίτον, η σύνδεση της RNA πολυμεράσης στις περιοχές αυτές των υποκινητών έχει διαπιστωθεί με πειράματα ιχνηλάτησης του DNA (DNA footprinting). Η ιχνηλάτηση του DNΑ χρησιμοποιείται ευρέως για τον εντοπισμό των περιοχών πρόσδεσης πρωτεϊνών στο DNA (Εικ. 7.3). ΕΙΚΟΝΑ 7.3: Ιχνηλάτηση του DNA. Μια αρχική ποσότητα του υπό έλεγχο τμήματος DNA με ραδιοσημασμένο το ένα του άκρο χωρίζεται στα δύο. Το ένα δείγμα επωάζεται με την πρωτεΐνη που αναγνωρίζει μια συγκεκριμένη αλληλουχία του τμήματος DNA και προσδένεται σε αυτή. Κατόπιν, τα δύο δείγματα υφίστανται μερική πέψη με DNάση, ώστε κάθε μόριο να κόβεται κατά μέσο όρο σε μία θέση. Στο δείγμα που έχει επωαστεί με την πρωτεΐνη, η περιοχή του DNA στην οποία αυτή συνδέεται προστατεύεται από τη δράση της DNάσης και δεν κόβεται. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης υφίστανται αποδιάταξη και τα μεγέθη των ραδιοσημασμένων μορίων που έχουν προκύψει από την πέψη με την DNάση προσδιορίζονται με ηλεκτροφόρηση των δύο δειγμάτων σε πήκτωμα ακρυλαμιδίου. Στο δείγμα που επωάστηκε με την πρωτεΐνη απουσιάζουν τα κομμάτια του DNA που προκύπτουν από πέψη με την DNάση στην περιοχή πρόσδεσης της πρωτεΐνης. 4

Σε αυτού του τύπου τα πειράματα, το υπό έλεγχο τμήμα DNA σημαίνεται στο ένα του άκρο με κάποιο ραδιοϊσότοπο ή με μια φθορίζουσα χρωστική. Κατόπιν, το σημασμένο DNA επωάζεται με την πρωτεΐνη που εξετάζεται (π.χ. με την RNΑ πολυμεράση) και στη συνέχεια υποβάλλεται σε μερική πέψη με DΝάση. Όταν οι πρωτεΐνες βρίσκονται συνδεδεμένες με το DNA, εμποδίζουν την πέψη από την DΝάση στις περιοχές πρόσδεσης τους. Σε αυτό ακριβώς το γεγονός βασίζεται η μέθοδος της ιχνηλάτησης του DNA. Συγκρίνοντας τα προϊόντα της μερικής πέψης ενός δείγματος DNA που έχει επωαστεί με πρωτεΐνη με τα προϊόντα της μερικής πέψης ενός δεύτερου δείγματος DNΑ το οποίο αναλύεται παράλληλα χωρίς όμως να επωαστεί προηγουμένως με πρωτεΐνη, προσδιορίζονται οι περιοχές πρόσδεσης της πρωτεΐνης. Παραλλαγές αυτής της βασικής μεθόδου, όπου χρησιμοποιούνται χημικά αντιδραστήρια που τροποποιούν και κόβουν το DNA σε συγκεκριμένα νουκλεοτίδια, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ώστε να εντοπιστούν οι συγκεκριμένες βάσεις που αλληλεπιδρούν με μια πρωτεΐνη. Τα πειράματα ιχνηλάτησης έδειξαν ότι η RNA πολυμεράση προσδένεται σε μια περιοχή των γονιδίων μήκους περίπου 60 bp, η οποία εκτείνεται από τη θέση -40 έως τη θέση +20 (δηλαδή από 40 νουκλεοτίδια ανοδικά μέχρι 20 νουκλεοτίδια καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής). Η υπομονάδα σ προσδένεται ειδικά στις αλληλουχίες και των δυο περιοχών -35 και -10, γεγονός που υποδεικνύει τη σημασία των στοιχείων αυτών στη λειτουργία του υποκινητή. Επιπλέον, μερικοί υποκινητές της Ε. coli διαθέτουν μια τρίτη αλληλουχία, η οποία βρίσκεται ανοδικά του στοιχείου -35 και λειτουργεί ως ειδική περιοχή πρόσδεσης για την υπομονάδα α της RNA πολυμεράσης. 7.1. ANIMATION (http://sites.sinauer.com/cooper6e/animation0701.html) Μεταγραφή. Μεταγραφή ονομάζεται η διαδικασία σύνθεσης του RNA, την οποία καταλύει το ένζυμο RNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως μήτρα το DNA. Απουσία της υπομονάδας σ, η RNA πολυμεράση προσδένεται μη ειδικά και με μικρή συγγένεια στο DNA. Ο ρόλος της σ είναι, μέσω της ειδικής πρόσδεσης της στις αλληλουχίες -35 και -10, να κατευθύνει την RNA πολυμεράση στους υποκινητές (Εικ. 7.4). Από την αρχική πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στον υποκινητή προκύπτει το λεγόμενο κλειστό σύμπλοκο υποκινητή, που ονομάζεται έτσι επειδή το DNA δεν έχει ακόμα ξετυλιχτεί. Στη συνέχεια, η RNΑ πολυμεράση ξετυλίγει 12-14 βάσεις του DNΑ, από περίπου τη θέση -12 μέχρι τη θέση +2, οπότε σχηματίζεται το λεγόμενο ανοικτό σύμπλοκο υποκινητή, στο οποίο η μία αλυσίδα του μονόκλωνου πλέον DNA λειτουργεί ως μήτρα για τη μεταγραφή. Η μεταγραφή ξεκινά με τη σύνδεση μέσω φωσφοδιεστερικού δεσμού δύο ελεύθερων ΝΤΡ. Μετά την προσθήκη των δέκα πρώτων νουκλεοτιδίων, η σ αποδεσμεύεται από την RNA πολυμεράση, η οποία κατόπιν απομακρύνεται από τον υποκινητή καθώς κινείται κατά μήκος της μήτρας DNA επιμηκύνοντας την αναπτυσσόμενη αλυσίδα του RNA. 5

ΕΙΚΟΝΑ 7.4. Η μεταγραφή στην Ε. coli. Η RNA πολυμεράση αρχικά προσδένεται χωρίς ειδικότητα στο DNA και μετακινείται κατά μήκος του μορίου μέχρι η υπομονάδα σ να προσδεθεί στα στοιχεία -35 και -10, ώστε να σχηματιστεί το λεγόμενο κλειστό σύμπλοκο υποκινητή. Κατόπιν, η πολυμεράση ξετυλίγει το DNA γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής και ξεκινάει ο πολυμερισμός ελεύθερων ΝΤΡ. Ακολούθως, η υπομονάδα σ αποδεσμεύεται από την κεντρική πολυμεράση, η οποία αρχίζει να κινείται καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή επιμηκύνοντας το υπό σύνθεση μόριο RNA. Κατά τη διάρκεια της επιμήκυνσης και ενώ συνεχίζει τη σύνθεση του mrna, η RNA πολυμεράση παραμένει συνδεδεμένη με τη μήτρα DNA. Καθώς κινείται κατά μήκος του DNA, ξετυλίγει την περιοχή που βρίσκεται μπροστά της και τυλίγει ξανά την περιοχή που βρίσκεται πίσω της. Το τμήμα του DNΑ στην περιοχή της μεταγραφής που ανά πάσα στιγμή είναι ξετυλιγμένο έχει μήκος περίπου 15 βάσεις. Στην αλυσίδα-μήτρα, 8-9 από τις βάσεις αυτές βρίσκονται συνδεδεμένες με τις συμπληρωματικές βάσεις της αναπτυσσόμενης αλυσίδας RNA. Υψηλής ανάλυσης μελέτες της δομής της βακτηριακής RNA πολυμεράσης έδειξαν ότι οι υπομονάδες β και β' σχηματίζουν μια δομή με σχήμα δαγκάνας καβουριού που «γραπώνει» τη μήτρα DNA (Εικ. 7.5). Το ενεργό κέντρο 6

της RNA πολυμεράσης εντοπίζεται σε έναν εσωτερικό δίαυλο που σχηματίζεται μεταξύ των υπομονάδων β και β' και χωράει περίπου 20 ζεύγη βάσεων DNA. Η σύνθεση του RNA συνεχίζεται μέχρι η RNA πολυμεράση να συναντήσει ένα σήμα τερματισμού. Στο σημείο που σταματάει η μεταγραφή, το RNA αποδεσμεύεται από την RNA πολυμεράση και το ένζυμο αποσυνδέεται από τη μήτρα DNA. ΕΙΚΟΝΑ 7.5. Δομή της βακτηριακής RNA πολυμεράσης. Οι υπομονάδες α της πολυμεράσης απεικονίζονται με σκούρο πράσινο και ανοιχτό πράσινο χρώμα. Με μπλε χρώμα απεικονίζεται η υπομονάδα β, με ροζ χρώμα η υπομονάδα β' και με κίτρινο χρώμα η υπομονάδα ω. (Ευγενική προσφορά του Seth Darst, Rockefeller University). Υπάρχουν δύο εναλλακτικοί μηχανισμοί τερματισμού της μεταγραφής στην Ε. coli. Ο απλούστερος και πιο κοινός τύπος σήματος τερματισμού αποτελείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη, πλούσια σε GC αλληλουχία που ακολουθείται από περίπου επτά νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-μήτρα (Εικ. 7.6). ΕΙΚΟΝΑ 7.6. Τερματισμός της μεταγραφής. Ο τερματισμός της μεταγραφής σηματοδοτείται από μια ανάστροφα επαναλαμβανόμενη αλληλουχία πλούσια σε GC, η οποία ακολουθείται από περίπου επτά νουκλεοτίδια αδενίνης (Α) στην αλυσίδα-μήτρα. Η μεταγραφή της ανάστροφης επανάληψης οδηγεί στον σχηματισμό μιας δομής στελέχους-βρόχου στο μόριο του RNA, η οποία αποσταθεροποιεί τη σύνδεση του μεταγράφου με τη μήτρα DNA προκαλώντας την απελευθέρωση του. Η μεταγραφή πλούσιων σε GC ανάστροφων επαναλήψεων δημιουργεί ένα τμήμα RNA που μπορεί να σχηματίσει μια σταθερή δομή στελέχους-βρόχου μέσω του ζευγαρώματος συμπληρωματικών βάσεων. Τέτοιες δομές αποσταθεροποιούν τη σύνδεση του RNΑ με τη μήτρα DNΑ και προκαλούν τον τερματισμό της μεταγραφής. Η παρουσία καταλοίπων αδενίνης (Α) καθοδικά των ανάστροφων επαναλήψεων θεωρείται ότι διευκολύνει τον διαχωρισμό του RNA από τη μήτρα του, επειδή μεταξύ A-U αναπτύσσονται δύο μόνο δεσμοί υδρογόνου αντί των τριών που αναπτύσσονται μεταξύ G-C. Εναλλακτικά, η μεταγραφή ορισμένων γονιδίων σταματά από 7

συγκεκριμένες πρωτεΐνες τερματισμού που προσδένονται στο RNA και ονομάζονται Rho. Η πρόσδεση των Rho πραγματοποιείται σε μεγάλα τμήματα (περισσότερο από 60 νουκλεοτίδια) μονόκλωνου RNA. Επειδή τα βακτηριακά mrna συνδέονται με τα ριβοσώματα και μεταφράζονται ενώ ακόμα εξελίσσεται η μεταγραφή τους, τέτοια μεγάλα μονόκλωνα τμήματα υπάρχουν μόνο στην 3' μη μεταφραζόμενη περιοχή των mrna. Καταστολείς και αρνητικός έλεγχος της μεταγραφής Η μεταγραφή ρυθμίζεται στα στάδια της έναρξης και της επιμήκυνσης, αλλά η μεταγραφική ρύθμιση στα βακτήρια συμβαίνει κυρίως στο στάδιο της έναρξης. Οι πρώτες μελέτες της γονιδιακής ρύθμισης στην Ε. coli έγιναν τη δεκαετία του 1950 από τον Francois Jacob και τον Jacques Monod. Οι ερευνητές αυτοί και οι συνεργάτες τους ανέλυσαν την έκφραση των γονιδίων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της λακτόζης. Η λακτόζη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πηγή άνθρακα και ενέργειας, αφού προηγουμένως διασπαστεί σε γλυκόζη και λακτόζη (Εικ. 7.7). Δεδομένου ότι το κύτταρο αποφεύγει τη σύνθεση μη απαραίτητων RNΑ και πρωτεϊνών για λόγους εξοικονόμησης ενέργειας, προϋπόθεση για την παραγωγή του ενζύμου που καταλύει τη διάσπαση της λακτόζης (της β-γαλακτοζιδάσης) και άλλων ενζύμων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της λακτόζης είναι να υπάρχει λακτόζη διαθέσιμη. Η λακτόζη λοιπόν επάγει τη σύνθεση ενζύμων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της. Εκτός από τη β-γαλακτοζιδάση, στην αξιοποίηση της λακτόζης συμμετέχουν τα προϊόντα δύο ακόμα στενά συνδεδεμένων γονιδίων: της περμεάσης της λακτόζης, που μεταφέρει τη λακτόζη μέσα στο κύτταρο, και της τρανσακετυλάσης, η οποία θεωρείται ότι απενεργοποιεί τους τοξικούς θειογαλακτοζίτες που μεταφέρονται στο κύτταρο μαζί με τη λακτόζη από την περμεάση. ΕΙΚΟΝΑ 7.7. Μεταβολισμός της λακτόζης. Η βγαλακτοζιδάση καταλύει την υδρόλυση της λακτόζης σε γλυκόζη και γαλακτόζη. Οι Jacob και Monod, εκτελώντας απλά γενετικά πειράματα, ανακάλυψαν τον μηχανισμό ρύθμισης της έκφρασης αυτών των γονιδίων και διαμόρφωσαν ένα μοντέλο που παραμένει θεμελιώδες για την κατανόηση της μεταγραφικής ρύθμισης. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τη β-γαλακτοζιδάση, την περμεάση και την τρανσακετυλάση εκφράζονται ως μια μονάδα, που ονομάζεται οπερόνιο (operon) (Εικ. 7.8). Οι Jacob και Monod, μελετώντας μεταλλάγματα τα οποία αδυνατούν να ρυθμίσουν την έκφραση αυτών των γονιδίων, εντόπισαν δύο διαφορετικούς γενετικούς τόπους, τους ο και i, που ελέγχουν την έκφραση του οπερονίου. Η πλήρης ονομασία του γενετικού τόπου ο είναι χειριστής (operator). Ο χειριστής είναι ένα τμήμα DNA που βρίσκεται κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής του οπερονίου. Το γονίδιο i, που βρίσκεται σε κάποια άλλη περιοχή του γονιδιώματος, κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που ρυθμίζει τη μεταγραφή του οπερονίου μέσω της πρόσδεσης της στον χειριστή. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι τα μεταλλάγματα που αποτυγχάνουν να συνθέσουν λειτουργικό προϊόν του γονιδίου i εκφράζουν το οπερόνιο ιδιοστατικά (ανεξαρτήτως συνθηκών), δηλαδή ακόμα και όταν δεν υπάρχει διαθέσιμη λακτόζη. Αυτό αποδεικνύει ότι το φυσιολογικό προϊόν του γονιδίου i είναι ένας καταστολέας (repressor), που αναστέλλει τη μεταγραφή όταν προσδένεται στον γενετικό τόπο ο. Η προσθήκη λακτόζης οδηγεί στην επαγωγή του οπερονίου, γιατί η λακτόζη προσδένεται στον καταστολέα και δεν του επιτρέπει να προσδεθεί στο DNA του χειριστή. 8

ΕΙΚΟΝΑ 7.8: Αρνητική ρύθμιση του οπερονίου lac. Το γονίδιο i κωδικοποιεί έναν καταστολέα ο οποίος, όταν δεν υπάρχει λακτόζη (επάνω τμήμα της εικόνας), προσδένεται στον χειριστή (ο) και εμποδίζει την RNA πολυμεράση να μεταγράψει τα τρία δομικά γονίδια του οπερονίου (z: βγαλακτοζιδάση, y: περμεάση και a: τρανσακετυλάση). Όταν υπάρχει λακτόζη (κάτω τμήμα της εικόνας), αυτή προσδένεται στον καταστολέα και τον εμποδίζει να προσδεθεί στον χειριστή, με αποτέλεσμα την επαγωγή της έκφρασης του οπερονίου. P = υποκινητής, Pol = RNA πολυμεράση. Η επιβεβαίωση της ισχύος αυτού του βασικού μοντέλου έγινε με ποικίλα πειράματα, συμπεριλαμβανομένων της απομόνωσης του καταστολέα lac και της ανάλυσης της πρόσδεσης του στο DNΑ του χειριστή από τον Walter Gilbert τη δεκαετία του 1960. Εξακριβώθηκε λοιπόν ότι ο χειριστής έχει μήκος περίπου 20 ζευγών βάσεων και αρχίζει λίγα ζεύγη βάσεων πριν από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Με πειράματα ιχνηλάτησης του DNA, αυτή η περιοχή αναγνωρίστηκε ως η θέση πρόσδεσης του καταστολέα, ο οποίος αναστέλλει τη μεταγραφή. Όπως προβλεπόταν από το μοντέλο, διαπιστώθηκε ότι, όταν η λακτόζη προσδένεται στον καταστολέα, αυτός δεν μπορεί να προσδεθεί στον χειριστή. Από τη μελέτη του οπερονίου της λακτόζης προκύπτει μια κεντρική αρχή σχετικά με τη γονιδιακή ρύθμιση που ισχύει τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα: Ο έλεγχος της μεταγραφής επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης ρυθμιστικών πρωτεϊνών με ειδικές ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA. Οι ρυθμιστικές αλληλουχίες του DNA, όπως ο χειριστής, ονομάζονται cis-δραστικά ρυθμιστικά στοιχεία (cis-acting control elements), επειδή επηρεάζουν την έκφραση συνδεδεμένων γονιδίων που βρίσκονται στο ίδιο μόριο DNA με αυτές. Οι ρυθμιστικές πρωτεΐνες, όπως ο καταστολέας, ονομάζονται trans-δραστικοί παράγοντες (trans-acting factors), επειδή μπορούν να επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων που βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα του κυττάρου. Το οπερόνιο lac αποτελεί παράδειγμα αρνητικού ελέγχου, καθώς η πρόσδεση του καταστολέα εμποδίζει τη μεταγραφή. Αυτό ωστόσο δεν αποτελεί το μοναδικό δυνατό σενάριο. Πολλοί trans-δραστικοί παράγοντες λειτουργούν ως ενεργοποιητές και όχι ως αναστολείς της μεταγραφής. 9

Θετικός έλεγχος της μεταγραφής Το καλύτερο παράδειγμα θετικού ελέγχου στην Ε. coli αφορά την επίδραση της γλυκόζης στην έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν ένζυμα του καταβολισμού (της διάσπασης) άλλων σακχάρων (συμπεριλαμβανομένης της λακτόζης). Τα σάκχαρα αυτά αποτελούν εναλλακτικές πηγές άνθρακα και ενέργειας. Επειδή όμως η γλυκόζη αποτελεί την προτιμώμενη από το κύτταρο πηγή άνθρακα και ενέργειας, όταν είναι διαθέσιμη δε συντίθενται τα ένζυμα που συμμετέχουν στον καταβολισμό άλλων σακχάρων. Για παράδειγμα, αν η Ε. coli αναπτύσσεται σε θρεπτικό μέσο που περιέχει και γλυκόζη και λακτόζη, δεν επάγεται το οπερόνιο lac και τα βακτήρια χρησιμοποιούν μόνο τη γλυκόζη. Επομένως, η παρουσία της γλυκόζης εμποδίζει την επαγωγή του οπερονίου lac ακόμα και παρουσία του επαγωγέα του (της λακτόζης). ΕΙΚΟΝΑ 7.9: Θετική ρύθμιση του οπερονίου lac από τη γλυκόζη. Όταν τα επίπεδα γλυκόζης είναι μειωμένα, ενεργοποιείται η αδενυλική κυκλάση, η οποία μετατρέπει το ATP σε κυκλικό AMP (camp). Το camp προσδένεται στον ενεργοποιητή καταβολικών γονιδίων (CAP) και διεγείρει την πρόσδεσή του σε ρυθμιστικές αλληλουχίες διαφόρων οπερονίων. Τα οπερόνια που ενεργοποιούνται από τον CAP κωδικοποιούν ένζυμα του μεταβολισμού άλλων, πέραν της γλυκόζης, εναλλακτικών σακχάρων, για παράδειγμα της λακτόζης. Η πρωτεΐνη CAP διευκολύνει την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στον υποκινητή μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με την υπομονάδα α του ενζύμου. Η καταστολή μέσω της γλυκόζης (η οποία γενικά ονομάζεται καταβολική καταστολή) επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός συστήματος θετικού ελέγχου, το οποίο συνδέεται με το ενδοκυτταρικό επίπεδο του κυκλικού AMP (camp, cyclic AMP) (Εικ. 7.9). Στα βακτήρια, το ένζυμο αδενυλική κυκλάση, που μετατρέπει το ΑΤΡ σε camp, ρυθμίζεται έτσι ώστε τα επίπεδα του camp να αυξάνονται όταν τα επίπεδα της γλυκόζης ελαττώνονται. To camp προσδένεται σε μια ρυθμιστική πρωτεΐνη της μεταγραφής που ονομάζεται ενεργοποιητής καταβολικών γονιδίων (CAP, Catabolite Activator Protein). Η πρόσδεση του camp διεγείρει την πρόσδεση της CAP στις αλληλουχίες του DNA που αποτελούν τους στόχους της. Για παράδειγμα, όταν τα επίπεδα της γλυκόζης είναι χαμηλά και κατά συνέπεια τα επίπεδα του camp υψηλά, η CAP μπορεί να προσδεθεί στο οπερόνιο lac περίπου 60 βάσεις ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, η CAP αλληλεπιδρά με την υπομονάδα α της RNA πολυμεράσης και ενεργοποιεί τη μεταγραφή διευκολύνοντας την πρόσδεση του ενζύμου στον υποκινητή. 10

7.2. Η RNA πολυμεράση μεταγραφικοί παράγοντες των ευκαρυωτικών οργανισμών και οι γενικοί Αν και η μεταγραφή βασίζεται στους ίδιους θεμελιώδεις μηχανισμούς σε όλα τα κύτταρα, είναι πολύ πιο πολύπλοκη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς απ' ότι στα βακτήρια. Αυτό οφείλεται σε τρεις διαφορές ανάμεσα στα προκαρυωτικά και στα ευκαρυωτικά συστήματα. Πρώτον, ενώ στα βακτήρια όλα τα γονίδια μεταγράφονται από μια κεντρική RNA πολυμεράση, τα ευκαρυωτικά κύτταρα διαθέτουν πολλές διαφορετικές RNA πολυμεράσες που μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων. Δεύτερον, οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες πρέπει να αλληλεπιδράσουν με ποικίλες άλλες πρωτεΐνες στο πλαίσιο της έναρξης και της ρύθμισης της μεταγραφής. Τέλος, σε αντίθεση με το προκαρυωτικά, το ευκαρυωτικά DNA είναι οργανωμένο σε χρωματίνη και σε μεγάλο βαθμό η μεταγραφική ενεργότητα των ευκαρυωτικών γονιδίων ρυθμίζεται στο επίπεδο της δομής της χρωματίνης τους. Η αυξημένη πολυπλοκότητα της ευκαρυωτικής μεταγραφής προσφέρει επιπλέον δυνατότητες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης, γεγονός που διευκολύνει τη δημιουργία πολλών διαφορετικών κυτταρικών τύπων με χαρακτηριστικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης στους πολυκύτταρους οργανισμούς. Ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες Τα ευκαρυωτικά κύτταρα περιέχουν στον πυρήνα τους τρεις διαφορετικές RNA πολυμεράσες οι οποίες μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων (Πίνακας 7.1). ΠΙΝΑΚΑΣ 7.1: Κατηγορίες γονιδίων που μεταγράφονται από τις ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες. *Μερικά snrna και scrna μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II, ενώ άλλα μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση IIΙ. **Οι μιτοχονδριακές και χλωροπλαστικές RNA πολυμεράσες μοιάζουν με τα αντίστοιχα βακτηριακά ένζυμα. Τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταγράφονται σε mrna από την RNA πολυμεράση II. Η ίδια πολυμεράση μεταγράφει και τα microrna (mirna), τα οποία έχουν καθοριστικό ρυθμιστικό ρόλο στη γονιδιακή έκφραση των ευκαρυωτικών κυττάρων. Τα ριβοσωμικά RNA (rrna, ribosomal RNA) και τα μεταφορικά RNA (trna, transfer RNA) μεταγράφονται από τις RNA πολυμεράσες I και III αντίστοιχα. Η RNA πολυμεράση I είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφή των τριών μεγαλύτερων ειδών rrna, που ονομάζονται 28S, 18S και 5,8S σύμφωνα με την ταχύτητα καθίζησης (Sedimentation) κατά τη διάρκεια φυγοκέντρισης ταχύτητας. Η RNA πολυμεράση III μεταγράφει τα γονίδια των trna και το μικρότερο είδος ριβοσωμικού RNA (το 5S rrna). Ορισμένα μικρά RNA, όπως το μικρό πυρηνικό RNA (snrna, small nuclear RNA), που συμμετέχει στο μάτισμα του prerna, και το μικρό κυτταροπλασματικό RNA (scrna, small cytoplasmic RNA), που συμμετέχει στη μεταφορά πρωτεϊνών, μεταγράφονται επίσης από την RNA πολυμεράση III. Άλλα μικρά RNA μεταγράφονται, όπως προαναφέρθηκε, από την RNA πολυμεράση II. Επιπλέον, στους χλωροπλάστες και στα μιτοχόνδρια βρίσκονται κάποιες ξεχωριστές RNΑ πολυμεράσες, παρόμοιες με τις βακτηριακές RNA πολυμεράσες, που μεταγράφουν το DNA αυτών των οργανιδίων. 11

ΕΙΚΟΝΑ 7.10: Δομή της RNA πολυμεράσης ΙΙ του σακχαρομύκητα. Οι διαφορετικές υπομονάδες απεικονίζονται με διαφορετικά χρώματα. (Kramer P.D., et al., 2001. Science 292: 1863). Οι τρεις RNA πολυμεράσες του πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι σύνθετα ένζυμα, που αποτελούνται από 12-17 υπομονάδες. Αν και αναγνωρίζουν διαφορετικούς υποκινητές και μεταγράφουν διαφορετικά είδη γονιδίων, μοιράζονται αρκετά κοινά χαρακτηριστικά τόσο μεταξύ τους όσο και με τις βακτηριακές RNA πολυμεράσες. Συγκεκριμένα, περιέχουν εννέα συντηρημένες υπομονάδες, πέντε από τις οποίες είναι όμοιες με τις υπομονάδες α, β, β' και ω της βακτηριακής RNA πολυμεράσης. Η δομή της RNA πολυμεράσης II του σακχαρομύκητα μοιάζει ιδιαίτερα με αυτή του βακτηριακού ενζύμου (Εικ. 7.10), γεγονός που υποδεικνύει ότι ο βασικός μηχανισμός λειτουργίας όλων των πολυμερασών είναι εξελικτικά συντηρημένος. Γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II Η RNA πολυμεράση II αποτέλεσε το επίκεντρο των περισσότερων μελετών της μεταγραφής στους ευκαρυώτες, γιατί είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση του mrna των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Οι αρχικές μελέτες αυτού του ενζύμου έδειξαν ότι συμπεριφέρεται διαφορετικά από την προκαρυωτική RNA πολυμεράση. Η καθαρισμένη προκαρυωτική RNA πολυμεράση μπορεί να μεταγράψει in vitro τις αλληλουχίες ενός μορίου DNA που βρίσκονται καθοδικά από κάποιον υποκινητή τον οποίο αναγνωρίζει. Δεν ισχύει όμως το ίδιο για την ευκαρυωτική RNΑ πολυμεράση. Ο λόγος αυτής της διαφοράς αποσαφηνίστηκε το 1979, όταν ο Robert Roeder και οι συνεργάτες του ανακάλυψαν ότι η RNA πολυμεράση II ξεκινάει τη μεταγραφή μόνο αν προστεθούν στην αντίδραση επιπλέον πρωτεΐνες. Επομένως, η μεταγραφή στα ευκαρυωτικά συστήματα φαίνεται ότι χρειάζεται παράγοντες έναρξης, οι οποίοι (σε αντίθεση με τους βακτηριακούς παράγοντες σ) δεν αποτελούν συστατικά της πολυμεράσης. Μεταγενέστερα, με βιοχημική κλασμάτωση πυρηνικών εκχυλισμάτων, εντοπίστηκε μια σειρά από πρωτεΐνες οι οποίες ονομάστηκαν μεταγραφικοί παράγοντες (transcription factors) και είναι απαραίτητες για την έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II. Οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες (general transcription factors) συμμετέχουν στη μεταγραφή από όλους τους υποκινητές της RNA πολυμεράσης II και συνεπώς αποτελούν στοιχεία του βασικού μηχανισμού της μεταγραφής από το ένζυμο αυτό. Επιπρόσθετα, όπως θα δούμε και στη συνέχεια αυτού του κεφαλαίου, ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται ο καθένας σε ρυθμιστικές αλληλουχίες συγκεκριμένων γονιδίων και ελέγχουν την έκφραση τους. Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 10% των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος κωδικοποιεί μεταγραφικούς παράγοντες, γεγονός ενδεικτικό της σημασίας αυτών των πρωτεϊνών. Οι υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την πολυμεράση II περιέχουν αρκετά διαφορετικά ρυθμιστικά στοιχεία γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (Εικ. 7.11). Το πρώτο από αυτά που εντοπίστηκε ήταν μια αλληλουχία παρόμοια με το ΤΑΤΑΑ, 25-30 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Αυτή η αλληλουχία, που ονομάζεται πλαίσιο TATA (TATA box), μοιάζει με το στοιχείο -10 των βακτηριακών υποκινητών και αρχικά θεωρήθηκε ότι χαρακτηρίζει όλους τους υποκινητές των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση II. Ωστόσο, πιο πρόσφατες μελέτες σε επίπεδο γονιδιώματος έδειξαν ότι πλαίσιο TATA υπάρχει μόνο στο 10-20% των υποκινητών της RNA πολυμεράσης II. Άλλες ρυθμιστικές αλληλουχίες των υποκινητών των γονιδίων που μεταγράφονται από την RNΑ πολυμεράση II είναι ο εναρκτής (Inr, initiator), που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB (το BRE), που βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, καθώς και αρκετά στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (όπως τα DPE, DCE και ΜΤΕ). Οι υποκινητές διαφορετικών γονιδίων περιέχουν ποικίλους συνδυασμούς αυτών των στοιχείων, τα οποία συμμετέχουν από κοινού στην πρόσδεση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων. 12

ΕΙΚΟΝΑ 7.11: Ο σχηματισμός in vitro του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Οι υποκινητές της RNA πολυμεράσης ΙΙ περιλαμβάνουν διάφορες ρυθμιστικές αλληλουχίες, όπως το πλαίσιο ΤΑΤΑ (με πρότυπη αλληλουχία TATAA) 25-30 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, το στοιχείο αναγνώρισης του TFIIB (BRE) 35 νουκλεοτίδια ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής, τον εναρκτή (Inr), ο οποίος περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής, καθώς και διάφορα στοιχεία τα οποία βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (τα DCE, MTE και DPE). Ο σχηματισμός του μεταγραφικού συμπλόκου ξεκινά με την πρόσδεση του μεταγραφικού παράγοντα TFIID. Μια υπομονάδα του TFIID, η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP), προσδένεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Άλλες υπομονάδες του TFIID, οι παράγοντες που συνδέονται με την TBP (TAF), προσδένονται στον εναρκτή, καθώς και στα στοιχεία που βρίσκονται καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Κατόπιν, στρατολογείται ο TFIIB (B), ο οποίος προσδένεται στην TBP και στο στοιχείο BRE. Ακολουθεί η πρόσδεση της πολυμεράσης η οποία βρίσκεται ήδη συνδεδεμένη με τον TFIIF (F). Ο σχηματισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου ολοκληρώνεται με την προσθήκη του TFIIE (E) και του TFIIH (H). 13

Τουλάχιστον πέντε γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες απαιτούνται για την έναρξη της μεταγραφής από την RNA πολυμεράση II σε in vitro συστήματα (βλ. Εικ. 7.11). Το πρώτο βήμα για τον σχηματισμό του μεταγραφικού συμπλόκου είναι η πρόσδεση στον υποκινητή ενός γενικού μεταγραφικού παράγοντα, που ονομάζεται TFIID (τα αρχικά TF υποδηλώνουν πως πρόκειται για μεταγραφικό παράγοντα - Transcription Factor -, ενώ το II παραπέμπει στην RNA πολυμεράση II). Ο TFIID αποτελείται από πολλές υπομονάδες, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεΐνης πρόσδεσης στο TATA (ΤΒΡ, TATA-Binding Protein) και άλλων 14 πολυπεπτιδίων, που ονομάζονται παράγοντες που συνδέονται με την ΤΒΡ (TAF, TBP-Associated Factors). Η ΤΒΡ προσδένεται στο πλαίσιο TATA, ενώ οι TAF προσδένονται στα στοιχεία Inr, DPE, DPC και ΜΤΕ. Η πρόσδεση του TFIID ακολουθείται από τη στρατολόγηση ενός δεύτερου γενικού μεταγραφικού παράγοντα, του TFIIB, ο οποίος αλληλεπιδρά με την ΤΒΡ αλλά και με το στοιχείο BRE. Στη συνέχεια, ο TFIIB λειτουργεί ως γέφυρα για την RNA πολυμεράση II, η οποία, αφού προηγουμένως προσδεθεί σε έναν τρίτο γενικό μεταγραφικό παράγοντα, του TFIIF, προσδένεται στο σύμπλοκο TBP-TFIIB. ΕΙΚΟΝΑ 7.12: Μοντέλο του προεναρκτήριου συμπλόκου της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Ένα μοριακό μοντέλο της RNA πολυμεράσης ΙΙ (γκρι), της TBP (πράσινο), του TFIIB (κίτρινο), του TFIIE (μοβ), του TFIIF (μπλε) και του TFIIH (καφέ) στη μορφή του συμπλόκου που συγκροτούν πάνω σε έναν υποκινητή. Στη φωτογραφία αυτή, ο προσανατολισμός του προεναρκτήριου συμπλόκου πάνω στο DNA είναι αντίστροφος από αυτόν της Εικόνας 7.11. (Bushnell D.A., et al., 2004. Science 303: 983). Μετά την πρόσδεση της RNA πολυμεράσης στον υποκινητή, η πρόσδεση δύο ακόμα γενικών μεταγραφικών παραγόντων, του TFIIE και του TFIIH, ολοκληρώνει τον σχηματισμό του λεγόμενου προεναρκτήριου συμπλόκου (preinitiation complex), ένα μοριακό μοντέλο του οποίου παρουσιάζεται στην Εικ. 7.12. O TFIIH αποτελείται από πολλές υπομονάδες και έχει δύο τουλάχιστον σημαντικούς ρόλους. Πρώτον, δύο υπομονάδες του είναι ελικάσες που ξετυλίγουν το DNA γύρω από την περιοχή έναρξης. Πρόκειται για τις πρωτεΐνες ΧΡΒ και XPD, που είναι απαραίτητες για την επιδιόρθωση με εκτομή νουκλεοτιδίου (nucleotide-excision repair), όπως αναφέρθηκε στο Κ6. Δεύτερον, μια άλλη υπομονάδα του ΤFIΙΗ έχει δράση κινάσης που φωσφορυλιώνει μια αμινοξική αλληλουχία η οποία επαναλαμβάνεται στην καρβοξυτελική επικράτεια (CTD, CarboxyTerminal Domain) της μεγαλύτερης υπομονάδας της RNA πολυμεράσης II. Η CTD της RNA πολυμεράσης II περιλαμβάνει διαδοχικές επαναλήψεις (27 στον σακχαρομύκητα και 52 στον άνθρωπο) επτά αμινοξέων με πρότυπη αλληλουχία την Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Η φωσφορυλίωση από την πρωτεϊνική κινάση του ΤFIΙΗ των επαναλήψεων της CTD στη σερίνη της θέσης 5 της πρότυπης αλληλουχίας οδηγεί στην αποδέσμευση της RNA πολυμεράσης II από το προεναρκτήριο σύμπλοκο και προκαλεί την έναρξη της μεταγραφής. Οι πέντε γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες και η RNA πολυμεράση II, που, όπως περιγράφηκε παραπάνω, στρατολογούνται διαδοχικά πάνω στον υποκινητή, συνιστούν το ελάχιστο απαιτούμενο σύστημα για τη μεταγραφή in vitro. Η πραγματοποίηση όμως της μεταγραφής στο κύτταρο προϋποθέτει την παρουσία επιπλέον παραγόντων. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνεται ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλοκο, ο Διαμεσολαβητής (Mediator), το οποίο αποτελείται από περισσότερες από 20 διαφορετικές υπομονάδες και αλληλεπιδρά τόσο με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες όσο και με την RNA πολυμεράση (Εικ. 7.13). 14

ΕΙΚΟΝΑ 7.13: Το σύμπλοκο της RNA πολυμεράσης ΙΙ με τον διαμεσολαβητή και η έναρξη της μεταγραφής. Η RNA πολυμεράση ΙΙ αλληλεπιδρά με τις πρωτεΐνες του Διαμεσολαβητή, καθώς και με τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες στην περιοχή του υποκινητή. Ο Διαμεσολαβητής προσδένεται στη μη φωσφορυλιωμένη CTD της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Η φωσφορυλίωση της CTD έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση του Διαμεσολαβητή και την έναρξη της μεταγραφής. Η φωσφορυλιωμένη CTD αλληλεπιδρά με παράγοντες επιμήκυνσης και επεξεργασίας του μεταγράφου που υποβοηθούν τη σύνθεση και επεξεργασία του mrna. Ο Διαμεσολαβητής όχι μόνο ενεργοποιεί την έναρξη της μεταγραφής από τους γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες, αλλά και διαδραματίζει κύριο ρόλο στη σύνδεση των γενικών μεταγραφικών παραγόντων με τους ειδικούς για κάθε γονίδιο μεταγραφικούς παράγοντες που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Οι πρωτεΐνες του Διαμεσολαβητή αποδεσμεύονται από την πολυμεράση μετά τη συναρμολόγηση του προεναρκτήριου συμπλόκου και τη φωσφορυλίωση της CTD της πολυμεράσης. Η φωσφορυλιωμένη CTD προσδένεται σε άλλες πρωτεΐνες που χρειάζονται για την επιμήκυνση και την ωρίμανση του mrna, όπως αναλύεται στη συνέχεια του κεφαλαίου. Μεταγραφή από τις RNA πολυμεράσες I και III Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, διαφορετικές RNA πολυμεράσες είναι υπεύθυνες για τη μεταγραφή των γονιδίων που κωδικοποιούν τα ριβοσωμικά RNΑ, τα μεταφορικά RNΑ και κάποια μικρά μη κωδικό RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ωστόσο, και οι τρεις RNA πολυμεράσες χρειάζονται επιπρόσθετα και μεταγραφικούς παράγοντες για να συνδεθούν με τις κατάλληλες αλληλουχίες του υποκινητή. Η RNA πολυμεράση I εστιάζεται αποκλειστικά στη μεταγραφή των 28S, 18S και 5,8S γονιδίων του ριβοσωμικού RNA, τα οποία οργανώνονται σε διαδοχικές επαναλήψεις. Από τη μεταγραφή τους προκύπτει αρχικά ένα μεγάλο πρόδρομο pre-rrna, το 45S, από το οποίο στη συνέχεια αποκόπτονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna (Εικ. 7.14). 15

ΕΙΚΟΝΑ 7.14: Τα γονίδια του ριβοσωμικού RNA. Το ριβοσωμικό DNA (rdna) μεταγράφεται σε ένα μεγάλο πρόδρομο μόριο RNA (το 45S prerrna), από το οποίο στη συνέχεια αποκόπτονται τα 28S, 18S και 5,8S rrna. Ο υποκινητής των γονιδίων του rrna εκτείνεται περίπου 150 ζεύγη βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και αναγνωρίζεται από δύο μεταγραφικούς παράγοντες. Οι μεταγραφικοί αυτοί παράγοντες, που ονομάζονται ανοδικός παράγοντας πρόσδεσης (UBF, Upstream Binding Factor) και παράγοντας επιλεκτικότητας 1 (SL1, Selectivity factor 1), προσδένονται συνεργειακά στον υποκινητή και κατόπιν στρατολογούν την RNΑ πολυμεράση I, οπότε σχηματίζεται το σύμπλοκο έναρξης (Εικ. 7.15). Ο SL1 αποτελείται από τέσσερις πρωτεϊνικές υπομονάδες, μία από τις οποίες είναι η ΤΒΡ. Καθώς ο υποκινητής των γονιδίων του ριβοσωμικού RNΑ δεν περιέχει πλαίσιο TATA, η ΤΒΡ δεν προσδένεται σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία του υποκινητή. Η σύνδεση της επιτυγχάνεται μέσω αλληλεπιδράσεων που αναπτύσσει με τις υπομονάδες του SL1. ΕΙΚΟΝΑ 7.15: Η έναρξη της μεταγραφής του rdna. Δύο μεταγραφικοί παράγοντες, ο UBF και ο SL1, συνδέονται συνεργειακά στον υποκινητή του rdna και στρατολογούν την RNA πολυμεράση Ι, προκειμένου να σχηματιστεί το σύμπλοκο έναρξης. Μια υπομονάδα του SL1 είναι η πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP). Τα γονίδια των trna, του 5S rrna και ορισμένων μικρών RNA που συμμετέχουν στο μάτισμα και στη μεταφορά πρωτεϊνών μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση III. Υπάρχουν τρεις τύποι υποκινητών της RNA πολυμεράσης III, δύο από τους οποίους (αυτοί των trna και του 5S rrna) βρίσκονται στο εσωτερικό και όχι ανοδικά της μεταγραφόμενης αλληλουχίας (Εικ. 7.16). 16

ΕΙΚΟΝΑ 7.16: Η μεταγραφή από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Υπάρχουν τρεις τύποι υποκινητών που χρησιμοποιούν την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων του 5S rrna και των trna βρίσκονται καθοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Η μεταγραφή του γονιδίου του 5S rrna ξεκινά με την πρόσδεση του TFIIIA, η οποία ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIC, του TFIIIB και της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ. Οι υποκινητές των γονιδίων των trna δε φέρουν τη θέση πρόσδεσης για τον TFIIA. Η μεταγραφή τους ξεκινάει με την πρόσδεση του TFIIIC, η οποία ακολουθείται από την πρόσδεση του TFIIIB και της πολυμεράσης. Ο υποκινητής του γονιδίου του U6 snrna βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ, που αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη πρόσδεσης στο ΤΑΤΑ (TBP) η οποία αποτελεί υπομονάδα του TFIIIB. Φέρει επίσης μια θέση πρόσδεσης ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα, του SNAP. Οι TFIIIB και SNAP προσδένονται συνεργειακά σε αυτόν τον υποκινητή. Τα περισσότερο μελετημένα γονίδια που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση III είναι αυτά του 5S RNA στον Xenopus. Η συναρμολόγηση του μεταγραφικού συμπλόκου ξεκινά με την πρόσδεση του TFIIIA (ο οποίος αποτελεί τον πρώτο μεταγραφικό παράγοντα που απομονώθηκε βιοχημικά) σε συγκεκριμένες αλληλουχίες του υποκινητή του 5S rrna. Ακολουθεί η διαδοχική πρόσδεση του TFIIIC, του TFIIIB και της πολυμεράσης. Οι υποκινητές των γονιδίων των trna διαφέρουν από τον υποκινητή του 5S rrna, καθώς δεν περιέχουν την αλληλουχία DNA που αναγνωρίζει ο TFIIIA. Πρώτος στον υποκινητή των γονιδίων των trna προσδένεται ο TFIIIC και ακολουθεί ο σχηματισμός του μεταγραφικού συμπλόκου με την πρόσδεση του TFIIIB και της πολυμεράσης. Ο τρίτος τύπος υποκινητή της RNΑ πολυμεράσης III βρίσκεται ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής και περιέχει πλαίσιο TATA (όπως και οι υποκινητές κάποιων γονιδίων της RNA πολυμεράσης II), καθώς και μια περιοχή πρόσδεσης ενός άλλου παράγοντα που ονομάζεται SNAP. Σχετικά παραδείγματα αποτελούν οι υποκινητές κάποιων μικρών RNA, όπως των snrna που συμμετέχουν στη διαδικασία του ματίσματος. Ο SNAP και ο TFIIIB προσδένονται συνεργειακά σε αυτούς τους υποκινητές. Ο TFIIIB προσδένεται απευθείας στο πλαίσιο TATA μέσω της ΤΒΡ, που αποτελεί υπομονάδα του. Όπως συμβαίνει και στους υποκινητές των άλλων γονιδίων της RNA πολυμεράσης III, ο TFIIIB συνδέει την πολυμεράση στο μεταγραφικό σύμπλοκο. 17

7.3. Η ρύθμιση της μεταγραφής στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης είναι πολύ πιο σύνθετος στους ευκαρυώτες απ' ότι στα βακτήρια, αν και γενικά ισχύουν οι ίδιες βασικές αρχές. Όπως και στα βακτήρια, η μεταγραφή στα ευκαρυωτικά κύτταρα ελέγχεται από πρωτεΐνες που προσδένονται σε συγκεκριμένες ρυθμιστικές αλληλουχίες και μεταβάλλουν τη λειτουργία της RNA πολυμεράσης. Μια σημαντική διαφορά στη ρύθμιση της μεταγραφής ανάμεσα στους προκαρυώτες και τους ευκαρυώτες προκύπτει από το πακετάρισμα του ευκαρυωτικού DNA στη χρωματίνη, που περιορίζει τη διαθεσιμότητα του ως μήτρας για τη μεταγραφή. Έτσι, η τροποποίηση της δομής της χρωματίνης διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Ένα νέο και ιδιαίτερα συναρπαστικό ερευνητικό πεδίο έχει βασιστεί στη σχετικά πρόσφατη ανακάλυψη ότι στα ευκαρυωτικά κύτταρα τόσο ορισμένες πρωτεΐνες όσο και κάποια μικρά μη κωδικά RNΑ ρυθμίζουν τη μεταγραφή μέσω τροποποιήσεων στη δομή της χρωματίνης. cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες: Υποκινητές και Ενισχυτές Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η μεταγραφή στα βακτήρια ρυθμίζεται από την πρόσδεση των πρωτεϊνών σε cis-δραστικές αλληλουχίες (όπως ο χειριστής του οπερονίου lac) που ελέγχουν τη μεταγραφή γειτονικών προς αυτές γονιδίων. Παρόμοια cis-δραστικά στοιχεία που ελέγχουν τη γονιδιακή έκφραση έχουν χαρακτηριστεί και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, κυρίως με μεθόδους μεταφοράς γονιδίων (gene transfer assays), με τις οποίες ελέγχονται περιοχές κλωνοποιημένων γονιδίων που ενδέχεται να περιέχουν cis-δραστικές αλληλουχίες (Εικ. 7.17). ΕΙΚΟΝΑ 7.17: Ταυτοποίηση ευκαρυωτικών ρυθμιστικών αλληλουχιών. Η εν δυνάμει ρυθμιστική αλληλουχία ενός κλωνοποιημένου ευκαρυωτικού γονιδίου τοποθετείται σε ένα πλασμίδιο ανοδικά κάποιου γονιδίου αναφοράς το οποίο κωδικοποιεί ένα εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν. Κατόπιν, με το πλασμίδιο διαμολύνεται μια καλλιέργεια ευκαρυωτικών κυττάρων. Αν η υπό έλεγχο αλληλουχία περιλαμβάνει τη θέση αναγνώρισης ενός ενεργοποιητή της μεταγραφής, θα πρέπει στα διαμολυσμένα κύτταρα να ανιχνευτεί το προϊόν του γονιδίου αναφοράς. Στα πειράματα αυτά δημιουργούνται κατασκευές στις οποίες οι υπό έλεγχο αλληλουχίες συνδέονται με ένα γονίδιο αναφοράς (reporter gene) που κωδικοποιεί κάποιο εύκολα ανιχνεύσιμο προϊόν, όπως η λουσιφεράση της πυγολαμπίδας. Στη λουσιφεράση οφείλεται η βιοφωταύγεια που εμφανίζει το έντομο. Με τέτοιες κατασκευές είναι δυνατόν να διαμολυνθούν τα κύτταρα μιας καλλιέργειας, οπότε, για παράδειγμα, η ενδεχόμενη έκφραση του γονιδίου αναφοράς υποδεικνύει την παρουσία ενός βιολογικά ενεργού στοιχείου που επάγει τη μεταγραφή. Περαιτέρω μελέτες με in vitro μεταλλαξιγένεση είναι δυνατόν να επιτρέψουν τον ακριβή προσδιορισμό συγκεκριμένων βάσεων του DNA που είναι κρίσιμες για τη λειτουργία του cis-δραστικού στοιχείου (Βιοφωταύγεια ονομάζεται το φαινόμενο της εκπομπής φωτός κατά την επιτέλεση μιας βιολογικής αντίδρασης. Η λουσιφεράση καταλύει την οξείδωση της λουσιφερίνης, που συνοδεύεται από την εκπομπή φωτός). 18

ΕΙΚΟΝΑ 7.18: Ένας ευκαρυωτικός υποκινητής. Ο υποκινητής του γονιδίου της κινάσης της θυμιδίνης του HSV φέρει ανοδικά από το πλαίσιο ΤΑΤΑ τρία στοιχεία τα οποία χρειάζονται για τη μεταγραφή του σε φυσιολογικά επίπεδα: ένα πλαίσιο CCAAT και δύο πλαίσια GC των οποίων η πρότυπη αλληλουχία είναι GGGCGG. Τα μεταγραφόμενα από την RNA πολυμεράση II γονίδια διαθέτουν ειδικές περιοχές πρόσδεσης γενικών μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων του πλαισίου TATA και του Inr. Άλλες cis-δραστικές αλληλουχίες λειτουργούν ως περιοχές πρόσδεσης ποικίλων ρυθμιστικών παραγόντων που ελέγχουν την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Αυτές οι cis-δραστικές ρυθμιστικές αλληλουχίες βρίσκονται συχνά, αλλά όχι πάντα, ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Για παράδειγμα, δύο ρυθμιστικές αλληλουχίες παρούσες σε πολλά ευκαρυωτικά γονίδια εντοπίστηκαν κατά τη μελέτη του υποκινητή ενός γονιδίου του ιού του απλού έρπητα (HSV, Herpes Simplex Virus) το οποίο κωδικοποιεί την κινάση της θυμιδίνης (Εικ. 7.18). Τα δύο αυτά στοιχεία βρίσκονται σε μια περιοχή 100 ζευγών βάσεων ανοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Οι πρότυπες αλληλουχίες τους είναι CCAAT και GGGCGG (ονομάζεται πλαίσιο GC). Έχουν ήδη ταυτοποιηθεί συγκεκριμένες πρωτεΐνες που προσδένονται με ειδικότητα σε αυτές τις αλληλουχίες και ενεργοποιούν τη μεταγραφή. ΕΙΚΟΝΑ 7.19: Ο ενισχυτής του SV40. Ο ενισχυτής του ιού SV40 που είναι υπεύθυνος για την έκφραση των πρώιμων γονιδίων φέρει ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ και έξι πλαίσια GC τα οποία βρίσκονται ανά δύο σε μία αλληλουχία που επαναλαμβάνεται τρεις φορές. Προκειμένου τα επίπεδα της μεταγραφής να είναι φυσιολογικά, χρειάζεται και η παρουσία ενός ανοδικού ενισχυτή, ο οποίος αποτελείται από δύο επαναλήψεις των 72 ζευγών βάσεων. Σε αντίθεση με τη σχετικά απλή οργάνωση των πλαισίων CCAAT και GC του υποκινητή της κινάσης της θυμιδίνης του HSV, πολλά γονίδια των θηλαστικών ελέγχονται από ρυθμιστικές αλληλουχίες που βρίσκονται αρκετά μακριά (μερικές φορές περισσότερο από 50 χιλιάδες βάσεις) από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Τέτοιες αλληλουχίες, που ονομάζονται ενισχυτές (enhancers), εντοπίστηκαν αρχικά κατά τη μελέτη του υποκινητή ενός άλλου ιού, του SV40 (Εικ. 7.19). Για την αποτελεσματική μεταγραφή από αυτόν τον υποκινητή, εκτός από ένα πλαίσιο TATA και μια ομάδα έξι πλαισίων GC, χρειάζονται και δύο επαναλήψεις 72 ζευγών βάσεων που βρίσκονται ανοδικά και σε σχετικά μεγάλη απόσταση. Βρέθηκε ότι αυτές οι αλληλουχίες ενεργοποιούν τη μεταγραφή τόσο από αυτόν όσο και από άλλους υποκινητές. Διαπιστώθηκε μάλιστα τελείως απροσδόκητα ότι η δραστικότητα τους δεν εξαρτάται ούτε από την απόσταση τους από τη θέση έναρξης της μεταγραφής ούτε από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με αυτή (Εικ. 7.20). Μπορούν να ενεργοποιήσουν τη μεταγραφή είτε τοποθετηθούν ανοδικά είτε καθοδικά σε σχέση με τον υποκινητή και ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους. 19

ΕΙΚΟΝΑ 7.20: Η λειτουργία των ενισχυτών. Χωρίς τη δράση ενός ενισχυτή, ένα γονίδιο μεταγράφεται σε χαμηλά επίπεδα (Α). Παρουσία ενός ενισχυτή, Ε - για παράδειγμα, των δύο επαναλήψεων 72 ζευγών βάσεων του SV40 -, η μεταγραφή διεγείρεται. Ο ενισχυτής είναι ενεργός όχι μόνο όταν τοποθετείται ακριβώς ανοδικά σε σχέση με τον υποκινητή (Β) αλλά και όταν τοποθετείται αρκετές κιλοβάσεις είτε ανοδικά είτε καθοδικά της θέσης έναρξης της μεταγραφής (Γ και Δ). Επίσης, οι ενισχυτές είναι ενεργοί ανεξάρτητα από τον προσανατολισμό τους σε σχέση με τη θέση έναρξης της μεταγραφής (Ε). Η ικανότητα των ενισχυτών να δρουν ακόμα και όταν βρίσκονται μακριά από τις θέσεις έναρξης της μεταγραφής δημιούργησε αρχικά την εντύπωση ότι λειτουργούν με διαφορετικούς μηχανισμούς από τους υποκινητές. Ωστόσο, διαπιστώθηκε ότι αυτό δεν είναι σωστό. Οι ενισχυτές, όπως και οι υποκινητές, λειτουργούν προσδένοντας μεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι στη συνέχεια αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση. Αυτό πιθανώς επιτυγχάνεται μέσω της αναδίπλωσης του μορίου του DNA και του σχηματισμού ενός βρόχου, με αποτέλεσμα ένας μεταγραφικός παράγοντας που βρίσκεται συνδεδεμένος σε κάποιον απομακρυσμένο ενισχυτή να μπορεί να αλληλεπιδράσει στον χώρο με το σύμπλοκο μεταγραφικών παραγόντων-rna πολυμεράσηςδιαμεσολαβητή, που βρίσκεται στην περιοχή του υποκινητή (Εικ. 7.21). 20