Εργαστήριο Βιοχημείας

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ Εργαστήριο Βιοχημείας Χαρακτηρισμός, υδρόλυση και οξείδωση γλυκογόνου Διδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος

Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

125 ΑΣΚΗΣΗ 11 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΚΑΙ ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ 1. Γενικό μέρος Α. Εισαγωγικά Β. Όξινη υδρόλυση γλυκογόνου Γ. Ενζυμική υδρόλυση γλυκογόνου με α-αμυλάση Δ. Προσδιορισμός γλυκόζης κατά Nelson Ε. Οξείδωση γλυκογόνου με υπεριωδικά 2. Πειραματικό μέρος Α. Ιδιαιτερότητες της άσκησης Β. Όξινη υδρόλυση γλυκογόνου Γ. Ενζυμική υδρόλυση γλυκογόνου με α-αμυλάση Δ. Προσδιορισμός γλυκόζης Ε. Οξείδωση γλυκογόνου με υπεριωδικά ΣΤ. Αποτελέσματα - Υπολογισμοί 3. Βιβλιογραφία

126

127 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΙΚΑ Οι ζωντανοί οργανισμοί αποθηκεύουν τους υδατάνθρακες, φορείς ενεργείας, με τη μορφή πολυσακχαριτών (άμυλο, ινσουλίνη στα φυτά και γλυκογόνο στα ζώα). Το γλυκογόνο αποτελείται από μόρια α-d γλυκόζης που ενώνονται μεταξύ τους με α-1,4 γλυκοζιτικούς δεσμούς ως επί το πλείστον και σε λιγότερο ποσοστό με α-1,6 γλυκοζιτικούς δεσμούς. Σχηματίζονται έτσι ανά 10-12 μόρια γλυκόζης, διακλαδώσεις. Το ποσοστό των διακλαδώσεων προσδιορίζεται με οξείδωση με υπεριωδικά ή με εξαντλητική μεθυλίωση, ακολουθούμενη από υδρόλυση, ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό των μεθυλιωμένων προϊόντων. Σχήμα

Το γλυκογόνο έχει ΜΒ που κυμαίνεται από μερικές χιλιάδες ως πάνω από εκατομμύριο. Υδρολύεται πλήρως με ανόργανα οξέα (π.χ. ΗCI, Η 2 SO 4 ) με θέρμανση και δίνει σχεδόν αποκλειστικά D-γλυκόζη. Μια ποικιλία ενζύμων (α-αμυλάσες, α-1,6 γλυκοσιδάσες) καταλύουν επίσης την υδρόλυση του, διασπούν όμως εκλεκτικά ορισμένους δεσμούς, π.χ. τους α-1,4 ή α-1, 6 δεσμούς. Αν και η γλυκόζη είναι αναγωγικό σάκχαρο, το γλυκογόνο δεν είναι. Περιέχει μόνο ένα αναγωγικό άκρο σε κάθε μόριο, στο τέλος της αλυσίδας που έχει ελεύθερη την 1- υδροξυλομάδα. Οι υπόλοιπες 1-υδροξυλομάδες συνδέονται με α-1,6 και α-1,4 δεσμούς. Με την υδρόλυση βγάζουμε συμπεράσματα για την περιεκτικότητα ενός δείγματος καθαρισμένου γλυκογόνου σε γλυκογόνο, γιατί οι πολυσακχαρίτες συγκρατούν υγρασία που είναι δύσκολο να απομακρυνθεί. Μπορούμε επίσης να προσδιορίσουμε την καθαρότητα δείγματος γλυκογόνου, αν φωτομετρήσουμε την απορρόφηση στα 620 nm ίσων ποσοτήτων γλυκογόνου και γλυκόζης μετά από αντίδραση τους με ανθρόνη. (Υπολογίζουμε ότι η κάθε μονάδα γλυκόζης στο γλυκογόνο έχει ΜΒ-18 = 162). Στο πείραμα μας ο προσδιορισμός της γλυκόζης γίνεται με τη μέθοδο Nelson, που είναι ευαίσθητη και αναπαραγώγιμη (Είναι μέθοδος προσδιορισμού αναγόντων σακχάρων). Β. ΟΞΙΝΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ Αρχή της μεθόδου Οι γλυκοζιτικοί δεσμοί των πολυσακχαριτών υδρολύονται πλήρως στους 100 C με ανόργανα οξέα, (π.χ. ΗCl 2 Ν). Σχηματίζονται έτσι ολισακχαρίτες και τελικά μονοσακχαρίτες. Από το γλυκογόνο σχηματίζεται D-γλυκόζη. Η πρόοδος της υδρόλυσης παρακολουθείται με προσδιορισμούς της γλυκόζης ανά ορισμένα χρονικά διαστήματα,όπου και τερματίζεται με καταστροφή του όξινου περιβάλλοντος με προσθήκη Κ 2 HPO 4.

129 Γ. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΛΡΟΛΥΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ ΜΕ α-αμυλαση Αρχή της μεθόδου Η α-αμυλάση διασπά εκλεκτικά τους α-1,4 δεσμούς. Όμως, το γεγονός ότι μόνο 20-30% του ολικού ποσού αναγωγικών ουσιών παράγεται κατά την υδρόλυση, δεν αποδεικνύει την ύπαρξη α-1,6 δεσμών στο γλυκογόνο, αλλά μάλλον ότι η ισορροπία της αντίδρασης της υδρόλυσης των α-1,4 δεσμών δεν είναι πλήρως μετατοπισμένη προς τα δεξιά. Στο πείραμα θα χρησιμοποιήσουμε α-αμυλάση (ΜΒ = 5,5.10 4 ) από ανθρώπινο σάλιο. Το ένζυμο περιέχει 1 mole Ca ++ ανά mole πρωτεΐνης και αποδείχτηκε ότι το Ca ++ είναι απαραίτητο για να παρουσιάζεται ενζυμική δράση. Οι αμυλάσες των θηλαστικών ενεργοποιούνται με ανιόντα, με πιο δραστικό ενεργοποιητή το CI -. Δ. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΚΑΤΑ NELSON Αρχή της μεθόδου Τα σάκχαρα σε αλκαλικό περιβάλλον σχηματίζουν ενοδιόλες, ενδιάμεσα προϊόντα ισομε-ρισμού. Οι ενοδιόλες, με ήπια οξειδωτικά όπως σιδηρικυανιούχα, 3,5- δινιτροσαλικυλικό, Cu ++ κλπ., οξειδώνονται σε οξέα. Το ΗΝΟ 3 οξειδώνει τα σάκχαρα και στα δόο ακραία άτομα άνθρακος παράγοντας σακχαρικά οξέα. Η έκταση της αναγωγής ιόντων Cu ++ προς Cu, μπορεί να μετρηθεί φασματοφωτομετρικά μετά από επανοξείδωσή τους από αρσενομολυβδαινικό οξύ, που στην αναγμένη μορφή του (το αρσενομολυβδαινικό οξύ) έχει μπλε χρώμα, ανάλογο με την ποσότητα του σακχάρου. Η φωτομέτρηση γίνεται στα 510 ή, για περισσότερη ευαισθησία, στα 660 nm. Η μέθοδος προσδιορίζει περιοχή 0-90 μg γλυκόζης.

130 Ε. ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ ΜΕ ΥΠΕΡΙΩΛΙΚΟ Αρχή της μεθόδου Η οξείδωση των υδατανθράκων με υπεριωδικά μας δίνει σημαντικές πληροφορίες για τη δομή τους γιατί διασπώνται εκλεκτικά οι δεσμοί C-C με (γειτονικές) ομάδες -ΟΗ, -ΟΗ=C, -ΝΗ 2, >C=Ο, -SΗ. Δεν διασπάται ο δεσμός αν το υδροξύλιο είναι αλκυλιωμένο ή συμμετέχει σε γλυκοζιτικό δεσμό. Έτσι αποδεικνύεται η ύπαρξη πυρανικών, φουρανικών δακτυλίων και διαχωρίζονται οι αλδο- από τις κετο-εξόζες (1 mole γλυκόζης δίνει 5 mole ΗCΟΟΗ + 1 mole ΗCΗΟ, ενώ 1 mole φρουκτόζης δίνει 3 mole ΗCΟΟΗ + 2 moles ΗCΗΟ + 1 mole CO 2, καταναλώνοντας 5 mole JΟ - 4. Τα στάδια της αντιδράσεως είναι τα εξής: α) Διάσπαση του δεσμού C-C. β) Οξείδωση κάθε ανθρακατόμου στον επόμενο βαθμό οξειδώσεως π.χ. αλκοόλη αλδεΰδη καρβοξυλικό οξύ CΟ 2. - - γ) Αναγωγή ενός mole JO 4 JO 3 για κάθε δεσμό που διασπάται. Συνεπώς μόνο τα άκρα του γλυκογόνου θα δώσουν με οξείδωση ΗCΟΟΗ. Η CΗΟ CΗΟΗ CΗΟΗ CΗΟΗ + 5 JO - 4 5 ΗCΟΟΗ + ΗCΗΟ + 5 JO - 3 CΗΟΗ CΗ 2 ΟΗ

131 Τα αποτελέσματα της αντίδρασης τα μετράμε ποσοτικά με διάφορους τρόπους ανάλογα με τις συνθήκες, π.χ.: α) Αν ξεκινώντας έχουμε γνωστής οξύτητας διάλυμα και κατά την αντίδραση παράγεται ΗCΟΟΗ, προσδιορίζουμε το παραγόμενο ΗCΟΟΗ ογκομετρικά. β) Αν από τη διάσπαση παράγεται αμμωνία, την προσδιορίζουμε επίσης ογκομετρικά. γ) Μπορούμε να μετρήσουμε την κατανάλωση αντιδραστηρίου υπεριωδικού με ιωδιομετρία. Μη ανάγον άκρο γλυκογόνου

132 Aνάγον άκρο γλυκογόνου Παρατηρούμε ότι κάθε α-1,6 δεσμός αντιστοιχεί σε δύο μη αναγωγικές ομάδες γλυκόζης (βλέπε σχήμα 2). Αν Ν είναι ο αριθμός των μη αναγωγικών τελικών ομάδων, τότε ο αριθμός των α-1,6 δεσμών είναι (Ν-1). Λόγω του μεγάλου ΜΒ του γλυκογόνου θεωρούμε ότι Ν- 1 = Ν δηλαδή ότι ο αριθμός των μη αναγωγικών ομάδων γλυκόζης ισούται με τον αριθμό των α-1,6 δεσμών γλυκόζης ή με τον αριθμό των moles ΗCΟΟΗ που παράγονται από την οξείδωση με υπεριωδικό. = Οπότε: α-1,6 δεσμοί μείγματος % ποσοστό διακλαδώσεων =----------------------------------------------------x 100 ολικά μόρια γλυκόζης δείγματος mole ΗCΟΟΗ (από διάσπαση με JO - 4) = --------------------------------------------------------x 100 γλυκόζης δείγματος γλυκογόνου

133 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α. ΙΔΙΑΙΤΕΡΟΤΗΤΕΣ ΤΗΣ ΑΣΚΗΣΗΣ α. Προσοχή να μην χρησιμοποιούνται σιφώνια με το στόμα αλλά μόνο με πουάρ λόγω της ύπαρξης του αρσενομολυβδαινικού οξέος, προς αποφυγήν ατυχήματος. β. Προσοχή στους ατμούς του ύδατος του υδατόλουτρου των 100 C που προορίζεται για την όξινη υδρόλυση του γλυκογόνου, προς αποφυγή εγκαυμάτων. Το καπάκι θα ανοίγεται μόνο με το κατάλληλο γάντι γ. Το διάλυμα των αλάτων Nelson Α κρυσταλλώνεται εύκολα σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Γι αυτό πρέπει το δοχείο που το φέρει να τοποθετείται σε υδατόλουτρο 30 έως 40 βαθμών Κελσίου για αποφυγή της κρυστάλλωσης. Προσοχή χρησιμοποιείται μόνο ως μίγμα των Α και Β και ποτέ μόνο ας Α ή Β. δ. Μετά το τέλος της φάσης του προσδιορισμού γλυκόζης, όπου οι δοκιμαστικοί σωλήνες έχουν τοποθετηθεί σε 100 C, να αποφεύγεται η ψύξη των σωλήνων αμέσως με νερό αλλά αφού περάσουν λίγα λεπτά ώστε: να μην σπάσουν δοκιμαστικοί σωλήνες από την απότομη ψύξη. ε. Υπάρχουν δύο διαφορετικά διαλύματα γλυκογόνου και ένα διάλυμα γλυκόζης. Χρειάζεται προσοχή να μην χρησιμοποιηθεί κάποιο από αυτά αντί άλλου. Β. ΟΞΙΝΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ α. Αντιδραστήρια 1. Διάλυμα γλυκογόνου: 40.0 mg γλυκογόνου σε 5 ml Η 2 Ο 2.ΗCl 4Ν 3. Κ 2 ΗΡΟ 4 1 Μ β. Εκτέλεση Προσδιορισμού Προετοιμάζουμε 7 δοκιμαστικούς σωλήνες με 2,5 ml Κ 2 ΗΡΟ 4 1 Μ ανά δοκιμαστικό σωλήνα.

134 Σε ένα 8 δοκιμαστικό σωλήνα προσθέτουμε 3.0 ml του διαλύματος γλυκογόνου και 3,0 ml ΗCl 4 Ν. Αμέσως μετά την ανάμιξη μεταφέρουμε 0.5 ml του διαλύματος σε ένα από τους 7 δοκιμαστικούς σωλήνες που περιέχει 2,5 ml Κ 2 ΗΡO 4 1 Μ. Αναδεύουμε και αραιώνουμε στα 10 ml με νερό. Αυτό είναι το δείγμα για χρόνο μηδέν (0). Το υπόλοιπο διάλυμα γλυκογόνου ΗCl τοποθετείται σε υδρόλουτρο 100 C. Επαναλαμβάνουμε το ίδιο στα 5, 15, 30, 45 και 60 min με ποσότητες 0.5 ml του διαλύματος γλυκογόνου. Τυφλό: 0,5 ml ΗCl 2Ν μεταφέρεται σε 2,5 ml Κ 2 ΗΡΟ 4 1 Μ, αραιώνεται στα 10 ml και ακολουθεί καλή ανάδευση.. Σε δείγματα των 0,5 ml όλων των ανωτέρω αϊτό το αραιωμένο στα 10 ml γίνεται προσδιορισμός γλυκόζης κατά Nelson. Συνεχίζεται η διαδικασία προσδιορισμού γλυκόζης από το σημείο που γράφει:...και συμπληρώναμε ως 1 ml... Γ. ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΥΔΡΟΛΥΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ ΜΕ α-αμυλαση α. Αντιδραστήρια 1. Διάλυμα γλυκογόνου: 15 mg γλυκογόνου σε 5 ml Η 2 Ο. 2. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, pη 6,9, 0.5 Μ. (17,24 g ΚΗ 2 ΡΟ 4 και 21,77 g Κ 2 ΗΡΟ 4 φέρονται σε 250 ml Η 2 Ο). 3. Διάλυμα NaCl 0,1 Μ (5,85 g NaCl σε 1000 Η 2 Ο). 4. Διάλυμα α-αμυλάσης: σάλιο: νερό 1:1 περίπου. β. Εκτέλεση προσδιορισμού Παίρνουμε μια σειρά 8 δοκιμαστικών σωλήνων όπου τοποθετούμε από 0,05 ml ρυθμιστικού διαλύματος ανά σωλήνα, 0,1 ml διαλύματος ΝaCl 0.1 Μ, 0,1 ml διαλύματος γλυκογόνου και συμπληρώνουμε στα 0,9 ml με Η 2 O (εκτός του Τ 1 που συμπληρώνουμε στο 1 ml). Οι δύο σωλήνες (Τ 1 χωρίς αμυλάση, Τ 2 χωρίς γλυκογόνο) χρησιμεύουν σαν τυφλά, ο σωλήνας (0) για μέτρηση σε χρόνο μηδέν. Σε όλους τους σωλήνες (εκτός του Τ 1 ) προσθέτουμε από 0,1 ml διαλύματος α-αμυλάσης. Στο τέλος

135 των 3, 6, 12, 15 και 20 min τελειώνουμε την αντίδραση προσθέτοντας από 1 ml αντιδραστηρίου Nelson. Στον σωλήνα (0) προσθέτουμε 1 ml Nelson αμέσως μετά την προσθήκη 0,1 ml διαλύματος α-αμυλάσης. Η παραγόμενη γλυκόζη προσδιορίζεται με τη μέθοδο Nelson. (Συνεχίζεται η διαδικασία προσδιορισμού γλυκόζης από το σημείο της τοποθέτησης τους στο υδατόλουτρο 100 C και μετά). Δ. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΥΚΟΖΗΣ ΚΑΤΑ NELSON α. Αντιδραστήρια: 1. Αντιδραστήριο Nelson: Φρέσκο μίγμα 25:1 των διαλυμάτων Nelson Α και Β. Nelson Α: Διαλύουμε 12,5 g άνυδρου Na 2 SO 3, 12,5 g τρυγικού καλιονατρίου, 10 g NaHCO 3 και 100 G άνυδρου Νa 2 SΟ 4 σε 400 ml απεσταγμένου νερού και αραιώνουμε στα 500 ml. Αν σχηματισθεί ίζημα, το απομακρύνουμε με διήθηση. Η θερμοκρασία του διαλύματος δεν πρέπει να πέσει κάτω από -20 C. Nelson Β: Διαλύουμε 15 g CuSO4.5H2O σε 90 ml περίπου απεσταγμένου νερού, που περιέχει 1-2 σταγόνες πυκνού Η 2 SO 4. Αραιώνουμε το διάλυμα στα 100 ml. 2. Αρσενομολυβδαινικό αντιδραστήριο Διαλύουμε 25 g ένυδρου μολυβδαινικού αμμωνίου (ΝΗ 4 ) 6 Μο7Ο 24.4Η 2 Ο σε 450 ml απεσταγμένο Η 2 O. Στο διάλυμα, προσθέτουμε 21 ml π. Η 2 SΟ 4 υπό συνεχή ανάδευστη. Στη συνέχεια διαλύουμε 3 g αρσενικικό νάτριο (Νa 2 ΗΑsΟ 4.7Η 2 Ο) σε 25 ml απεσταγμένου νερού και το διάλυμα που σχηματίζεται το αναμιγνύουμε υπό συνεχή ανάδευση με το διάλυμα μολυβδαινικού αμμωνίου. Το προκύπτον κίτρινο διάλυμα αφήνεται στους 37 C 24 ώρες. Φυλάσσεται σε σκούρα γυάλινη φιάλη. 3. Πρότυπο διάλυμα γλυκόζης 0.5 mμ. Διαλύουμε 9,0 mg γλυκόζης και 5,6 g ΝaCl σε Η 2 Ο και αραιώνουμε στα 100 ml (συγκέντρωση 500 μμ).

136 β. Εκτέλεση προσδιορισμού Ετοιμάζουμε μια σειρά από 6 δοκιμαστικούς σωλήνες, όπου τοποθετούμε αντίστοιχα 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 ml του πρότυπου διαλύματος και συμπληρώνουμε ως 1 ml με αττεσταγμένο νερό. Προσθέτουμε στους σωλήνες 1 ml αντιδραστηρίου Νelson. Τους καλύπτουμε με αλουμινόχαρτο και τους τοποθετούμε σε υδρόλουτρο 100 C επί 20 min ακριβώς. Τους ψύχουμε, προσθέτουμε 1 ml αρσενομολυβδαινικού αντιδραστηρίου, και μετά από μερικά λεπτά προσθέτουμε σε κάθε σωλήνα 7 ml H 2 O. Ακολουθεί καλή ανάδευση. Φωτομετρούμε στα 510 και για περισσότερη ευαισθησία στα 660 nm, μετρώντας σε μονάδες οπτικής απορρόφησης (Absorbance). Ε. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ- ΥΠΟΛΟΠΣΜΟΙ α. Κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη γλυκόζης με εξαρτημένη μεταβλητή την οπτική απορρόφηση (Abs) και με ανεξάρτητη μεταβλητή την ποσότητα της γλυκόζης εκφρασμένη σε μmole. β. Κατασκευάζεται η καμπύλη της όξινης υδρόλυσης του γλυκογόνου με εξαρτημένη μεταβλητή τη ποσότητα της γλυκόζης σε μmole που αντιστοιχεί στη δεδομένη απορρόφηση για κάθε χρονικό διάστημα και με ανεξάρτητη μεταβλητή το κάθε χρονικό διάστημα. γ. Ομοίως κατασκευάζεται η καμπύλη για την ενζυμική υδρόλυση του γλυκογόνου από α-αμυλάση. δ. Προσδιορίζονται: Ι. Από την πρότυπη καμπύλη γλυκόζης τα μmole γλυκόζης ανά δοκιμαστικό σωλήνα που σχηματίζονται κατά την υδρόλυση με ΗCl σε κάθε χρονική στιγμή.

137 ΙΙ. Το % ποσοστό της υδρόλυσης με ΗCl αν διαιρέσουμε τα μmole γλυκόζης που παράγονται κάθε χρονική στιγμή δια των μmole γλυκόζης του πλήρως υδρολυμένου δείγματος και πολλαπλασιάσουμε επί 100 (υποθέτουμε ότι για αυτές τις συνθήκες υδρόλυσης και για χρόνο 30 min και άνω, έχουμε πλήρη υδρόλυση. Ως 100% υδρόλυση λαμβάνεται ο μέσος όρος των 2-3 τελευταίων τιμών). III. Από την περιεκτικότητα σε γλυκόζη ενός πλήρως υδρολυμένου δείγματος με ΗCl, τα μmole της γλυκόζης ανά mg γλυκογόνου. IV. Η θεωρητική περιεκτικότητα του γλυκογόνου σε γλυκόζη, εκφρασμένη σε μmole γλυκόζης ανά mg γλυκογόνου. V. Η % καθαρότητα του δείγματος γλυκογόνου αν διαιρέσουμε την περιεκτικότητα του πλήρως υδρολυμένου δείγματος σε γλυκόζη που βρήκαμε, δια της θεωρητικής και πολλαπλασιάσουμε επί 100. VI. Από την πρότυπη καμπύλη γλυκόζης προσδιορίζουμε τα μmole γλυκόζης που σχηματίζονται κατά την υδρόλυση με α-αμυλάση σε κάθε χρονική στιγμή. VII. Από την περιεκτικότητα σε γλυκόζη του καλύτερα υδρολυμένου δείγματος (μέσος όρος), τα μmole της γλυκόζης ανά mg γλυκογόνου. VIII Η % απόδοση της ενζυμικής υδρόλυσης ως προς την όξινη (με την υπόθεση ότι η όξινη υδρόλυση είναι πλήρης, δηλ. 100%). ΣΤ. ΟΞΕΙΔΩΣΗ ΓΛΥΚΟΓΟΝΟΥ ΜΕ ΥΠΕΡΙΩΔΙΚΑ- ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ α. Αντιδραστήρια 1.ΝaJO 4.3Μ

138 2. Διάλυμα γλυκογόνου: 0,200 g γλυκογόνου σε 50 ml διαλύματος 0,3 Μ ΝaJO 4 3. Πρότυπο διάλυμα NaOH 5 mμ 4. Αιθυλενογλυκόλη Προσοχή: Το Η 2 O όλων των διαλυμάτων πρέπει να βράζεται πριν χρησιμοποιηθεί για εκδίωξη του CΟ 2 β. Προσδιορισμός Διαλύουμε 0,200 g γλυκογόνου σε ογκομετρική φιάλη των 50 ml που περιέχει περίπου 25 ml Η 2 Ο (χωρίς CΟ 2 ). Σ' αυτό προσθέτουμε 10 ml 0,3 Μ ΝaJΟ 4 και συμπληρώνουμε με Η 2 O. Ετοιμάζουμε ένα τυφλό με 10 ml 0,3 Μ ΝaJΟ 4 και συμπληρώνουμε στα 50 ml με Η 2 Ο. Διατηρούμε τις φιάλες σε σκοτεινό μέρος. Ογκομετρούμε το ΗCΟΟΗ που παράγεται από την αντίδραση με πρότυπο διάλυμα ΝaΟΗ περίπου 5 mμ κατά διαστήματα 1, 4, 8, 24 ωρών μετά την έναρξη της. Για την ογκομέτρηση προσθέτουμε σε δύο κωνικές από 10 ml τυφλού και δείγματος, προσθέτουμε από 0,05 ml αιθυλενογλυκόλης για να αναχθεί η περίσσεια ΝaJO 4, αφήνουμε περίπου 10 min στο σκοτάδι, προσθέτουμε 0,05 ml 1% φαινολοφθαλεΐνης και ογκομετρού-με με το πρότυπο διάλυμα ΝaΟΗ. γ. Αποτελέσματα, συμπεράσματα Τα αποτελέσματα δίνονται στον πίνακα IV. ΠΙΝΑΚΑΣ IV Χρόνος (min) T 1 4 8 24 ml NaOH 0,005M μmole HCOOH Φτιάχνουμε διάγραμμα (χρόνου, μmole ΗCΟΟΗ) % ποσοστό διακλαδώσεων = Μέσο μήκος αλυσίδας =

139 Σχήμα 2: Σχηματική αναπαράσταση γλυκογόνου αναγωγικό άκρο, μη αναγωγικό άκρο. Στο παραπάνω διάγραμμα αντιστοιχούν 15 μη αναγωγικά άκρα (Ν), 14 σημεία διaκλαδώσεως (ν-1, α-1, 6 δεσμοί γλυκόζης). 3. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Experimental Biochemistry by J. M. Clark and R. L. Switzer, Freeman and Company (1977). 2. Method in Carbohydrate Chemistry, Vol. 6, R. K. Whistler and J. N. Be Miller, Eds., New York, Academic Press 3. Experimental and Methods in Biochemistry by D. C. Wharton and R. E. Mc Carty, Macmillan Publishing C.O. INC. N.Y., Collier Macmillan publishers, London. 4. Biochemistry by A. L. Lehninger, Woth Publishers, INC.1981.

140

Τέλος Ενότητας

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Σημειώματα

Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ. http://ecourse.uoi.gr/course/view.php? id=1374.

Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Αναπλ. Καθ. A. E. Κούκκου, Καθ. M. E. Λέκκα, Αναπλ. Καθ. Ε. Πάνου, Καθ. Ε. Παπαμιχαήλ, Καθ. Α. Τσελέπης, Καθ. Δ. Τσουκάτος. «Εργαστήριο Βιοχημείας. Χαρακτηρισμός, υδρόλυση και οξείδωση γλυκογόνου». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα 2014. Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: http://ecourse.uoi.gr/course/view.php?i d=1374.

Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1] https://creativecommons.org/licenses/ by-sa/4.0/.