Μετάφραση του mrna mrna Translation Βιοσύνθεση πρωτεϊνών Πολυμερισμός αμινοξέων 1 Γενικά χαρακτηριστικά
A. Μετάφραση της αλληλουχίας νουκλεοτιδίων του mrna σε αλληλουχία αμινοξέων- Γενικές έννοιες 1. Γενετικός κώδικας: Οι κανόνες μετάφρασης/αποκωδικοποίησης 2. Ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF): Η αλληλουχία διαδοχικών κωδικονίων (τριάδες νουκλεοτιδίων) από το εναρκτήριο έως το τερματικό. 3. Τα μεταφορικά RNAs (trnas) είναι τα κλειδιά της αποκωδικοποίησης, που λειτουργούν ως «προσαρμοστές/adaptors» μεταξύ κωδικονίων και αμινοξέων Κάθε αμινοξύ συνδέεται με το δικό του μόριο trna, και το αμινοακυλ- trna που σχηματίζεται συνδέεται εξειδικευμένα μόνο με το αντίστοιχο κωδικόνιο. 2 Αντίδραση πολυμερισμού
4. Η αμινο-ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινο-ακυλ-trna προσβάλλει τον αμινο-ακυλ εστερικό δεσμό του προ-υπάρχοντος αμινοακυλ- ή πεπτιδυλ- trna (κατεύθυνση Ν -> C ) 5. Το mrna μεταφράζεται με κατεύθυνση 5 -> 3 ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑΑ ΑΑC Lys Lys Lys Lys Asn 3 Δομικά στοιχεία των trnas
Δομικά χαρακτηριστικά των trnas 1. Το ~ ½ των νουκλεοτιδίων συνδέονται σε ζεύγη βάσεων 2. Το 3 άκρο CCA, βραχίονας υποδοχής 3. Η θηλιά ΤψC (ριβο Τ - ψευδο U-C) 4. Ο «μεταβλητός» επιπλέον βραχίονας 5. Η θηλιά διυδροουρακίλης (DHU) 6. Η θηλιά αντικωδικονίου 7. Πολλές μονο- και δι-μεθυλιωμένες βάσεις A,U,C,G. Ουρακίλη Διυδροουρακίλη DHU Ψευδο ουρακίλη Ψ 4 Adaptor Structure
Η δομή των trnas ανταποκρίνεται στο ρόλο του απόλυτα ειδικού «προσαρμοστή» (Adaptor) 1. Διαθέτει ελεύθερα άκρα αφενός για τη σύνδεση του αμινοξέος (CCA) και αφετέρου για συμπληρωματικό ζευγάρωμα με το αντίστοιχο κωδικόνιο μέσω του αντικωδικονίου. 2. Αναγνωρίζεται εξειδικευμένα από ΜΙΑ αμινοακυλ-trna συνθετάση 5 αα trna συνθετάσες
B. Οι Αμινοακυλ-tRNA συνθετάσες είναι τα ένζυμα που διαβάζουν/ερμηνεύουν τον γενετικό κώδικα α) Προσαρτούν κάθε αμινοξύ αυστηρά στο αντίστοιχο trna (με το ΣΩΣΤΟ αντικωδικόνιο) ) β) To αμινοακυλ-trna που προκύπτει (εστέρας αμινοξέος- trna) είναι ένα «ενεργοποιημένο αμινοξύ» που επιτρέπει ενεργειακά τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμών Συνθετάσες τάξης Ι και ΙΙ: Εστεροποίηση στο 2-ΟΗ ή 3-ΟΗ, αντίστοιχα, μονομερείς και διμερείς 3 Αδενυλίωση 6
Οι αμινοακυλ-trna συνθετάσες καταλύουν δύο επιμέρους διαδοχικές αντιδράσεις Α. Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται αρχικά με αδενυλίωση 1. αμινοξύ + ΑΤΡ -> αμινοακυλο-αμρ + ΡΡj j 2. ΡΡj -> 2Ρj (η πυροφωσφατάση καθιστά την αντίδραση μη αντιστρεπτή) Το αμινο-ακυλο ακυλο αδενυλικό (μικτός ανυδρίτης) είναι ένα ενεργοποιημένο ενδιάμεσο, μεταβατικό, προιόν trna Β. Και στη συνέχεια εστεροποιούνται με το trna 3. αμινοακυλο-αμρ + trna -> αμινοάκυλο-trna + ΑΜΡ Λιπο ακυλ αδενυλικό 3 7
Ενεργοποιημένα ακυλο-αδενυλικά ενδιάμεσα δημιουργούνται και σε άλλες βιοχημικές πορείες πχ ενεργοποίηση λιπαρών οξέων για σύνθεση τριακυλογλυκερολών R-COOH +ATP ΡΡjj 2xΡj 8 Εξειδίκευση trna αμινοακυλίωσης
Οι αμινοακυλ-trna συνθετάσες αναγνωρίζουν τα αμινοξέα τους με εξαιρετική ακρίβεια: Το παράδειγμα της θρεονυλ-trna συνθετάσης Zn ZN H θρεονυλ- trna συνθετάση διακρίνει τη θρεονίνη απ τη βαλίνη με βάση το σύμπλοκο συναρμογής Zn OH - NH3 Δεν μπορεί όμως να διακρίνει, με αυτόν το μηχανισμό, τη θρεονίνη απ τη σερίνη 9 Διορθωτική ικανότητα
Η διορθωτική ικανότητα των αμινοακυλ-trna συνθετασών εξασφαλίζει μεγαλύτερη εξειδίκευση Πείραμα: Ser έχει συνδεθεί λανθασμένα/τεχνητά με trna Thr και το λάθος σερινυλ-trna Thr επωάζεται με θρεονυλ-trna συνθετάση: Ser-tRNA Thr ---> Ser + trna Thr θρεονυλ-trna συνθετάση Συμπέρασμα: Το αμινοακυλ-trna παλινδρομεί μεταξύ κέντρου ενεργοποίησης και κέντρου διόρθωσης και, αν είναι λανθασμένο, μπορεί να υδρολύεται στα συστατικά του (αα + trna) 10 Αναγνώριση αντικωδικίου
Στην εξειδίκευση συμβάλλει η αναγνώριση της θηλιάς του αντικωδικίου ή/και τoυ βραχίονα υποδοχής των μορίων trnas Θρεονυλο-tRNA συνθετάση Γλουταμινυλο-tRNA συνθετάση 11 Ριβόσωμα
Γ. Ριβόσωμα : Η μοριακή μηχανή που πολυμερίζει αμινοξέα συνταιριάζοντας mrna και αμινοακυλ-trnas Προκαρυωτικό ~20 aa/sec Ευκαρυωτικό ~2 aa/sec ~2/3 ~1/3 Η μικρή υπομονάδα συνταιριάζει το mrna με το trna, ενώ η μεγάλη υπομονάδα καταλύει τη δημιουργία πεπτιδικών δεσμών Mεγάλη υπομονάδα Μικρή υπομονάδα A: aminoacyl- Αcceptor P: Peptide E: Exit 12 Καταλυτικός ρόλος του rrna
Tα rrnas σχηματίζουν το μεγαλύτερο μέρος των θέσεων Α, Ρ και Ε και To 16S rrna της 30S παίζουν κύριο καταλυτικό ρόλο στη πρωτεϊνισύνθεση, L19 σε αντίθεση με τις απλούστερης γενικά- δομής ριβοσωμικές πρωτείνες. 13 Mεταφραστική έναρξη
Shine-Dalgarno ΑUG Η αλληλουχία Shine- Dalgarno και το εναρκτήριο AUG προσδιορίζουν ρ το σημείο έναρξης της βακτηριακής μετάφρασης Α) η αλληλουχία Shine-Dalgarno AGGAGG (U) ζευγαρώνει με την συμπληρωματική CCUCC στο 3 άκρο του 16S rrna Β) ) το αντικωδικόνιο CAT του Met- trnaf ζευγαρώνει με το κωδικόνιο έναρξης AUG Θυμηθείτε!!, Τα βακτηριακά mrnas είναι πολυκιστρονικά και μεταφραστική έναρξη συντελείται και εσωτερικά!! 14 Met-tRNAf OR G
fmet-trna f H βακτηριακή μετάφραση αρχίζει με φόρμυλο-μεθειονυλ-trna (fmet-trnaf) To trnaf διαφέρει από το trnam που μεταφέρει Met σε εσωτερικά κωδικόνια,, παρ όλο που και τα δυο αναγνωρίζονται από την ίδια συνθετάση H Met μπορεί να φορμυλιωθεί μόνον όταν είναι προσαρτημένη στο trnaf σε αντίθεση με την Met που προσαρτάται στο trnam Αυτό είναι αποτέλεσμα της εξειδίκευσης της τρανσφορμυλάσης, που αναγνωρίζει trnaf αλλά όχι trnam Τι εξυπηρετεί η φορμυλίωση?? Θα το δούμε σε λίγο!! 15 IF2
IF2 (Initiation Factor 2) O παράγοντας έναρξης 2 (IF2) είναι ένας μοριακός διακόπτης (G protein) που τοποθετεί το fmet-trna trna στη θέση Ρ κατά το σχηματισμό του συμπλόκου έναρξης 70S IF2 Εναλλάσσεται μεταξύ δυο μορφών: Συνδεδεμένος είτε GTP, είτε με GDP Ο IF2-GTP σε συνδυασμό με το fmet-trna trna oρίζει το πλαίσιο ανάγνωσης στο mrna οδηγώντας το fmet-trna στη θέση Ρ IF2 Αποσύνδεση IF2 και άλλων IFs Μεταπίπτει στην μορφή IF2-GDP, αποσυνδέεται, και προκαλεί τη σύνδεση της 50S υπομονάδας και σχηματισμό συμπλόκου έναρξης 70S. Σύνδεση 50S υπομονάδας 16 EF-Tu
EF-Tu (Elongation Factor Tu) O παράγοντας επιμήκυνσης Tu (EF-Tu, G protein), ένας δεύτερος μοριακός διακόπτης, παραδίδει τα αμινοακυλο-trnas στη θέση Α Ο EF-Tu δεν αναγνωρίζει fmet-trnaf. Γι αυτό, fmet-trnaf δεν μεταφέρεται στη θέση Α (αλλά στη Ρ) και fmet δεν ενσωματώνεται σε εσωτερικές θέσεις 17 Proofreading -EF-Tu ανακύκλωση
Ο EF-Tu - GTP μεταπίπτει στη μορφή EF-Tu - GDP και αποσυνδέεται μόνο αν το trna ζευγαρώσει σωστά με το αντίστοιχο κωδικόνιο EF-Tu GTP EF-Tu GDP GTP EF-Ts EF-Tu + GDP Ο παράγοντας EF-Ts επάγει την απελευθέρωση του GDP επιτρέποντας στον EF-Tu να επανασυνδεθεί με GTP N1 Ranεy 18
Το αντικωδικόνιο του αμινοακυλ-trna και όχι το αμινοξύ καθορίζει την αναγνώριση του αντίστοιχου κωδικονίου στο mrna, και επομένως το αμινοξύ που τελικά ενσωματώνεται στην πρωτεΐνη που συντίθεται Πείραμα: Εάν η κυστείνη του Cys-tRNA cys μετατραπεί χημικά/τεχνητά σε αλανίνη τότε το Ala-tRNA cys θα συνεχίζει να αναγνωρίζει κωδικόνιο κυστείνης και κατά την πρωτεινοσύνθεση θα ενσωματώσει αλανίνη στη θέση της κυστείνης Εφαρμογή: σύνθεση «αφύσικων» πρωτεϊνών in vitro!!! Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού 19
Η αντίδραση σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού Η αμινική ομάδα του νέο-εισερχόμενου αμινοακυλο-trna στη θέση Α προσβάλλει την καρβονυλική ομάδα του εστερικού δεσμού του προηγούμενου άκυλο-trna στη θέση Ρ Ρόλος φορμυλίωσης OR EFG 20
Ο πιθανός ρόλος της φορμυλίωσης στην εναρκτήρια μεθειονίνη είναι η προστασία του πρώτου πεπτιδυλ-trna δεσμού στη πρωκαρυωτική μετάφραση Η προσβολή του πεπτιδικού δεσμού από την -ΝΗ2 της μεθειονίνης θα οδηγούσε στο σχηματισμό σταθερού εξαμερούς δακτυλίου, υδρόλυση του πεπτίδυλ-trna εστερικού δεσμού και τερματισμό της μετάφρασης Γιατί αυτό δεν είναι πρόβλημα στην ευκαρυωτική μετάφραση??? 21 EF-G
EF-G (Elongation Factor G) O παράγοντας επιμήκυνσης EF-G είναι επίσης μια πρωτείνη G, που υδρολύοντας GTP μετατοπίζει το ριβόσωμα κατά τρία νουκλεοτίδια. Μετακινεί το απο-ακυλιωμένο trna στη θέση Ε και το πεπτιδυλ-trna στη θέση Ρ, ενώ η μετακίνηση του mrna ανοίγει τη θέση Α στο επόμενο κωδικόνιο 22 τερματισμός της μετάφρασης
RFs:Οι πρωτεϊνικοί παράγοντες τερματισμού RF1, RF2, Rf3 (Release factors) αναγνωρίζουν τα κωδικόνια τερματισμού UAA, UGA, UAG Επιτρέπουν τη διέλευση ενός μορίου Η2Ο (προσαρτημένο ρ ρ σε Gly-Gly-Gln) y στην Α θέση RF με αποτέλεσμα την αυτόματη υδρόλυση του πεπτιδυλ-trna εστερικού δεσμού Ο αποκλεισμός του Η2Ο από το κέντρο της πεπτιδυλμεταφοράσης προστατεύει τον πεπτιδυλ-trna εστερικό δεσμό από αυθόρμητη υδρόλυση Ευκαρυωτική Μετάφραση 23
5. Η ευκαρυωτική μετάφραση είναι πιο σύνθετη και διαφέρει απο την προκαρυωτική ρ κυρίως στο μηχανισμό μ έναρξης eif4e (Eukaryotic Initiation Factor 4E) eif2 (Eukaryotic Initiation Factor 2) eif2 Ο ευκαρυωτικός παράγοντας έναρξης eif4e αναγνωρίζει το 5 κάλυμμα (Cap) και ο eif2 συνδεδεμένος με GTP και σε σύμπλοκο με το Met-tRNAi και την 40S ριβοσωμική υπομονάδα σχηματίζει το σύμπλοκο προέναρξης 43S, που σαρώνει το mrna ψάχνοντας για AUG eif4e Kozak consensus : -3A, +4G Πού συγκροτούνται οι ευκαρυωτικές ριβοσωμικές υπομονάδες? 24 eif2-gdp - 80S
Η συγκρότηση του 80S συμπλόκου έναρξης πραγματοποιείται με τη σύνδεση της 60S ριβοσωμικής υπομονάδας, αφού προηγηθεί υδρόλυση του eif2-gtp σε eif2-gdp Η διεργασία επιμήκυνσης και τερματισμού είναι μηχανιστικά ανάλογες με αυτές των προκαρυωτικών συστημάτων 25 Tι είναι τα πολυσώματα?
Πολλά ριβοσώματα μεταφράζουν συγχρόνως το ίδιο μόριο 26 folding
Πώς αποκτούν οι πρωτεΐνες την τρισδιάστατη δομή τους? 1. Αυθόρμητα 27 Hsps
2. Με κατανάλωση ενέργειας (ΑΤΡ) Οι πρωτείνες θερμοπληξίας συντελούν στην αναδίπλωση νεοσυντιθέμενων πρωτεινών 28 Αντιβιοτικά
Αντιβιοτικά στοχεύουν την προκαρυωτική μετάφραση Η στρεπτομυκίνη παρεμβαίνει στη δέσμευση φόρμυλο μεθειονυλο-trna,, ενώ άλλες αμινογλυκοσίδες (νεομυκίνη, γενταμυκίνη, καναμυκίνη) παρεμβαίνουν στη θέση αποκωδίκευσης (θέση 1492 του 16S rrna) Η πουρομυκίνη, που μοιάζει με το αμινο-ακυλικό άκρο ενός αμινοακυλ-trna αποσυνδέει την πολυπεπτιδική αλυσίδα από το ριβόσωμα 29 διφθερίτιδα
Τοξίνες στοχεύουν μεταφραστικούς παράγοντες Η τοξίνη της διφθερίτιδας (Corynebacterium diphtheriae) προσθέτει ADP-ριβόζη στο διφθαμίδιο (τροποποιημένη His) του ευκαρυωτικού EF2 με αποτέλεσμα την απόλυτη αδρανοποίησή του Η τοξίνη της χολέρας ADP- ριβοσυλιώνει πρωτείνες G προκαλώντας μαζική έκκριση υγρών από το λεπτό έντερο,αφυδάτωση και θάνατο 30
Ασκήσεις: Stryer Σελ. 946-947 2, 4, 10, 14, 17, 18. Lehninger Kεφ. 27 5, 6, 7, 12. Επίσης σκεφθείτε και το παρακάτω πρόβλημα: O Mπάμπης και ο Ερμάνος, δίδυμοι που ζουν στο ίδιο άγονο νησί, προσβάλλονται από το ίδιο πιθανότατα- παθογόνο βακτήριο. Στον Ερμάνο ο αγροτικός γιατρός χορηγεί χλωραμφενικόλη και σε λίγες μέρες αναρρώνει. Ο Μπάμπης, με υπόδειξη και βοήθεια της «φίλης» του, παίρνει μερικα mgs κυκλοεξιμίδιο και το ίδιο βράδυ πεθαίνει. Ο Βιολόγος του σχολείου ισχυρίζεται ότι και οι δύο χημικές ουσίες αναστέλλουν ισχυρά την σύνθεση πρωτεϊνών, ενώ ο φαρμακοποιός του νησιού βεβαιώνει ότι το κυκλοεξιμίδιο δεν διατίθεται ποτέ σε ασθενείς. Γιατί πέθανε ο Μπάμπης?? 31