Φασματομετρία Μαζών (Mass. Πέτρος Ταραντίλης- Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς - Επίκουρος καθηγητής

Φασματομετρία Μαζών (Mass Spectrometry, MS) Πέτρος Ταραντίλης- Αναπληρωτής καθηγητής Χρήστος Παππάς - Επίκουρος καθηγητής 1

Πορεία της παρουσίασης 1. Βασικές αρχές Ιονισμός των μορίων 2. Οργανολογία Παραγωγή ιόντων Αναλυτές μαζών Ανιχνευτές ιόντων 3. Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης ίδυμη φασματομετρία μ μαζών (ΜS/MS) Αέρια ή υγρή χρωματογραφίας - φασματομετρία μαζών (GC-MS ή PLC-MS) 4. Φάσματα μαζών Ερμηνεία 2

Βασικές αρχές έσμη ηλεκτρονίων Εισαγωγή δείγματος 1. Μια ουσία, στην αέρια φάση, δί βομβαρδίζεται με μια δέσμη ηλεκτρονίων που έχει την ενέργεια για να διασπάσει το μόριο σε θραύσματα. 2. Τα θετικά θραύσματα που παράγονται (κατιόντα) επιταχύνονται υπό κενό μέσα σε ένα σωλήνα και με την επίδραση ενός μαγνητικού πεδίου και ταξινομούνται βάσει του λόγου μάζα προς φορτίο (m/e). 3. Τα ιόντα που έχουν μικρή μάζα (χαμηλή ορμή) θα εκτραπούν και θα συγκρουστούν με τους τοίχους της συσκευής ανάλυσης. 4. Τα ιόντα που έχουν την κατάλληλη αναλογία (m/e), θα ακολουθήσουν την πορεία της συσκευής ανάλυσης, θα βγουν μέσω της σχισμής και θα συγκρουστούν με το συλλέκτη. Συλλέκτης ιόντων Επιταχυντής Ιόντων Μαγν νητικό πεδ δίο 5. Παράγεται ένα ηλεκτρικό ρεύμα, το οποίο ενισχύεται και ανιχνεύεται. 6. Μετράται το ηλεκτρικό ρεύμα, που παρέχουν τα ιόντα με διαφορετικό λόγο m/e. 7. Το διάγραμμα (προφίλ) που θα προκύψει από την ένταση του μετρούμενου ρεύματος, σε συνάρτηση με το λόγο m/e, αποτελεί το φάσμα μαζών. 3

Βασικές αρχές Φάσμα μαζών του βενζολίου (πηγή EI, ενέργεια ιονισμού 70eV) 4

Βασικές αρχές Ιονισμός των μορίων: M + e - M + + 2 e - Τα ιονιζόμενα μόρια (Μοριακό Ιόν, Μ + ) διασπώνται και σχηματίζουν: ιόντα μικρότερης μάζας, θραύσματα ιόντων και ουδέτερα μόρια Μ + Μ + 1 + Μ 2 Μ + 1 Μ + 2 + Μ 3 κ.ο.κ. 5

Οργανολογία Τα βασικά τμήμα ενός φασματόμετρου μ μαζών είναι: 1. Σύστημα εισαγωγής δείγματος 2. Θάλαμος παραγωγής γής ιόντων 3. Αναλυτής μαζών 4. Ανιχνευτής - Συλλέκτης ιόντων 5. Ενισχυτής 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 6

Παραγωγή ιόντων Οι κυριότεροι μέθοδοι παραγωγής ιόντων είναι: α) ) Ιονισμός με ηλεκτρόνια (Electron Impact, ΕΙ). β) Χημικός ιονισμός (Chemical Ionization, CI). γ) Ιονισμός πεδίου (Field Ionization, FI). δ) Ιονισμός με σπινθήρα (Spark Ionization, SΙ). 7

Παραγωγή ιόντων α) ) Ιονισμός με ηλεκτρόνια (ΕΙ). Τα μόρια του δείγματος κινούνται εξαιτίας της διαφοράς πίεσης μέσα στο θάλαμο παραγωγής ιόντων. Ένα ηλεκτρικά θερμαινόμενο μεταλλικό νήμα παράγει ηλεκτρόνια τα οποία συγκρούονται με τα μόρια και παράγονται θετικά φορτισμένα ιόντα (Μ+). 8

Παραγωγή ιόντων β) Χημικός ιονισμός (CI). Τα μόρια μιας χημικής ουσίας π.χ. μεθανίου εισερχόμενα στο θάλαμο παραγωγής ιόντων βομβαρδίζονται από μια δέσμη ηλεκτρονίων (ΕΙ) και προκαλείται ιονισμός και θραύση τους. Στη συνέχεια θα γίνουν ορισμένες αντιδράσεις ιόντος-μορίου εξαιτίας των συγκρούσεων και τελικά θα έχουμε την παραγωγή θετικών ιόντων. 9 Αυτά τα θετικά ιόντα χρησιμοποιούνται για τον ιονισμό των μορίων του δείγματος.

Παραγωγή ιόντων β) Χημικός ιονισμός (CI). Τα φάσματα μάζας με μεθόδους CI έχουν πάντα απλούστερη μορφή από εκείνα που παράγονται με μεθόδους ΕΙ. Το μικρό ποσοστό θραύσης συνεπάγεται μεγαλύτερη ευαισθησία, γιατί η διαδικασία ιονισμού επικεντρώνεται κυρίως στο μοριακό ιόν. Επομένως τα φάσματα CI παρέχουν άμεση πληροφόρηση ρη η για το μοριακό βάρος της ουσίας και είναι περισσότερο χρήσιμα για την ανάλυση μειγμάτων ουσιών. 10

Παραγωγή ιόντων γ) ) Ιονισμός πεδίου (FI). Όταν ένα μόριο που έχει μεγάλη διπολική ροπή και υψηλό πολώσιμο, τοποθετηθεί σε ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο έντασης ένα ηλεκτρόνιο μπορεί να αποσπαστεί, κι έτσι να παραχθεί ένα θετικό ιόν. Ένα τέτοιο ηλεκτρικό πεδίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί η για τον ιονισμό των μορίων του δείγματος. 11

Παραγωγή ιόντων γ) ) Ιονισμός πεδίου (FI). Το μεγαλύτερο πλεονέκτημα των πηγών ιονισμού με πεδίο είναι η ικανότητά τους να παράγουν σταθερά μοριακά ιόντα, τα οποία συνήθως δεν διασπώνται. Αυτό είναι χρήσιμο στη μελέτη φυσικών προϊόντων και άλλων μεγάλων μγ μορίων,, όπου το μοριακό ιόν (μητρική κορυφή) είναι δύσκολο να δημιουργηθεί με πηγές ΕΙ. Οι τεχνικές ιονισμού (ιοντισμού) που παρουσιάστηκαν εφαρμόζονται σε δείγματα σε αέρια κατάσταση. 12

Παραγωγή ιόντων δ) Τεχνικές ιονισμού με εκρόφηση (Desorption Ionization, DI). Εφαρμόζονται σε μη πτητικά δί δείγματα ή θερμικά ασταθή δείγματα. 1. Πηγές εκρόφησης πεδίου (Field Desorption, FD). 2. Ιονισμός εκρόφησης ης υποβοηθούμενος από υλικό μήτρας και λέιζερ (Matrix Assisted Desorption Ionization, MALDI). 3. Ιονισμόςμεηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI). 4. Πηγές βομβαρδισμού με ταχέα άτομα (Fast Atom Bombardment, FAB) 13

Παραγωγή ιόντων δ) Τεχνικές ιονισμού με εκρόφηση (Desorption Ionization, DI). Εφαρμόζονται σε μη πτητικά δί δείγματα ή θερμικά ασταθή δείγματα. 1. Πηγές εκρόφησης πεδίου (Field Desorption, FD). 2. Ιονισμός εκρόφησης υποβοηθούμενος από υλικό μήτρας και λέιζερ (Matrix Assisted Desorption Ionization, MALDI). 3. Ιονισμός με ηλεκτροψεκασμό (Electrospray Ionization, ESI). 4. Πηγές βομβαρδισμού με ταχέα άτομα (Fast Atom Bombardment, FAB) 14

Παραγωγή ιόντων Σύγκριση Τεχνικές ιονισμού γλουταμινικού οξέος α) Ιονισμός με ηλεκτρόνια (ΕΙ). β) Ιονισμός πεδίου (FI). γ) ) εκρόφησης πεδίου (Field Desorption, FD) 17

Αναλυτές μαζών Οι συνηθέστεροι τύποι αναλυτών μαζών είναι: 1. Αναλυτές απλής εστίασης με μαγνητική εκτροπή (Single focusing) 2. Αναλυτές διπλής εστιάσεως (Double focusing) 3. Τετραπολικοί αναλυτές μαζών (Quadrupole) 4. Αναλυτές «χρόνου πτήσης» (Time Of Flight) 5. Αναλυτές «παγίδας ιόντων» (Ion trap) 18

Αναλυτές μαζών Αναλυτές απλής εστίασης με μαγνητική εκτροπή (Single focusing) 19

Αναλυτές μαζών Αναλυτές διπλής εστιάσεως (Double focusing) Ηλεκτροστατικός αναλυτής και μαγνητικός αναλυτής Ηλεκτροστατικός αναλυτής (εστιάζει με βάση την ενέργεια) τοποθετείται μεταξύ της πηγής ιόντων και μαγνητικού αναλυτή (εστιάζει με βάση τη διεύθυνση). 20

Αναλυτές μαζών Τετραπολικοί αναλυτές μαζών (Quadrupole) 21

Αναλυτές μαζών Αναλυτές «χρόνου ό πτήσης» (Time of Flight) 22

Αναλυτές μαζών Αναλυτές «παγίδας ιόντων» (Ion trap) 23

Ανιχνευτές ιόντων Είναι συνήθως ένα συστήματα στα οποίο συλλέγονται τα ήδη διαχωρισμένα ιόντα. Έτσι δημιουργείται ένα ηλεκτρικό σήμα (ρεύμα) που είναι ανάλογο του αριθμού των ιόντων και του φορτίου τους. Οι συνηθέστερες τεχνικές ανίχνευσης ιόντων είναι: α) Κύπελλο (cup) Faraday. β) Ηλεκτρονοπολλαπλασιαστής λλ λ (Secondary Electron Multiplier, SEM). γ) Ανιχνευτής Daly. δ) Channeltron. ε) Πλάκα μικροδιόδων (Microchannel plate). 24

Οργανολογία Τα βασικά τμήμα ενός φασματόμετρου μ μαζών είναι: 1. Σύστημα εισαγωγής δείγματος 2. Θάλαμος παραγωγής γής ιόντων 3. Αναλυτής μαζών 4. Ανιχνευτής - Συλλέκτης ιόντων 5. Ενισχυτής 6. Καταγραφέας ή ηλεκτρονικός υπολογιστής - εκτυπωτής 25

Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης ίδυμη φασματομετρία μαζών (ΜS/MS). Σύνδεση συστημάτων αέριας ή υγρής χρωματογραφίας με φασματόμετρο μαζών (GC/MS ή PLC/MS). 26

Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης ίδυμη φασματομετρία μαζών (ΜS/MS). 27

Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης Σύνδεση συστημάτων αέριας ή υγρής χρωματογραφίας με φασματόμετρο μαζών (GC/MS ή PLC/MS). 28

Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης ίδυμη φασματομετρία μαζών (ΜS/MS). Σύνδεση συστημάτων αέριας ή υγρής χρωματογραφίας με φασματόμετρο μαζών (GC/MS ή PLC/MS). 29

Συνδυασμένες τεχνικές ανάλυσης Σύνδεση συστημάτων αέριας ή υγρής χρωματογραφίας με φασματόμετρο μαζών (GC/MS ή PLC/MS). Η GC ή PLC χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των ουσιών, ενώ η MS για την ταυτοποίηση των ουσιών αυτών. Το κύριο πρόβλημα, οι συνθήκες άριστου χρωματογραφικού διαχωρισμού να μην είναι συμβατές με τις απαιτούμενες συνθήκες για τον ιονισμό των ενώσεων που εκλούονται από τη στήλη. 30

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία 31

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Μοριακό Ιόν ή Μητρική ηρ Κορυφή. Το κύριο ιόν είναι το μοριακό ιόν,, Μ +, που παράγεται από την απώλεια ενός ηλεκτρονίου. Συνήθως υπάρχει και μια μικρή κορυφή (Μ+1) με μια μονάδα μάζας μεγαλύτερη από τη «μητρική κορυφή», εάν δυο βαριά ισότοπα τυχαίνει να βρίσκονται στο ίδιο μόριο, υπάρχει μια ακόμα μικρότερη κορυφή στο Μ+2. Βασική Κορυφή. Η μεγαλύτερη κορυφή που παρατηρείται, καλείται «βασική κορυφή» και τα άλλα ύψη των κορυφών μετρούνται ως προς αυτή. Έτσι οι συγκεντρώσεις των ιόντων δίνονται σε % της βασικής κορυφής. Κορυφές Θραυσμάτων. Τα οργανικά μόρια θραύονται με επαναλήψιμο τρόπο, όταν οι ενέργειες της ηλεκτρονικής δέσμης κυμαίνονται από 50 έως 80 ev. ιάγραμμα θραύσης. 32

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αλκάνια: Οι κορεσμένοι Η/C δίνουν: Μ +, M-C 3 = (m-15), M-C 2 5 =(m-29) ίνουν διαδοχικές κορυφές που διαφέρουν 14 μονάδες μάζας C 2 Η σταθερότητα των ιόντων καθορίζεται από το επαγωγικό και συζυγιακό ηλεκτρονικό φαινόμενο. Η πιθανότητα εμφάνισης τριτοταγούς κατιόντος είναι μεγαλύτερη αυτής του πρωτοταγούς δηλ. RC 2+ <R 3 C + 33

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αρωματικοί υδρογονανθράκες και παράγωγα Εμφανίζονται οι κορυφές ΧC + + 6 4+ m/e=x+76, C 6 5+ m/e=77, κ.λ.π. Τολουόλιο: m/e = 91, 77, 65, 63, κ.λ.π. 34

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Μοριακό Βάρος: 92 Φάσμα μαζών του τολουολίου 35

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία -28-26 -16-15 Φάσμα μαζών του βενζοϊκού μεθυλεστέρα 36

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αλδεΰδες και κετόνες: Αλδεΰδες: Απόσπαση του αλδεΰδικού Η (Μ-1) +, ή της φόρμυλο ομάδας -CO (Μ-29) + -. RCO + (Μ-1) +, RCO +.. -CO + R (Μ-29) + 37

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Κετόνες: Επέρχεται α-σχάση με σχηματισμό του σταθερού Ιόντος του ακυλίου + R 1 C O -R 2. R 1. -R 1 + C O R2 C O R 2 38

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αλκοόλες: χαρακτηριστική κορυφή είναι η (Μ-18) + β-απόσπαση Η 2 Ο R C C 2 +. +. O - 2 O RC C 2 δίνουν ιόντα με σχάση του γειτονικού δεσμού σε σχέση με το δεσμό C-O. +. -R. + R C 2 O C 2 O C 2 O + 39

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αλκοόλες: χαρακτηριστική κορυφή είναι η (Μ-18) + απόσπαση Η 2 Ο δίνουν ιόντα με σχάση του γειτονικού δεσμού σε σχέση με το δεσμό C-O. πρωτοταγείς m/e = 31 δευτεροταγείς m/e = 45..59..73, 40

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Αιθέρες: δίνουν ιόντα με σχάση του γειτονικού δεσμού σε σχέση με το δεσμό C-O. +. -R. C OR + + R C 2 OR C 2 OR C 2 OR 41

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Οξέα, εστέρες, και αμίδια: m/e = 45 και 44 Αλογονίδια: 42

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Ερωτήσεις Ποιο το πιθανό 135 Μοριακό Βάρος; 136 Ποιος ο αριθμός των ανθράκων; 76 92 107 137 45

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Απαντήσεις Πιθανό Μοριακό 135 Βάρος: 136 136 Ο αριθμός των ανθράκων 76 67 6/67 * 100 = 8,9% 92 107 137 6 8,9%/1,1% 1% = 8,1 ή 8 Ο 12 C είναι το πιο σύνηθες ισότοπο του άνθρακα. Μαζί του συνυπάρχει Ο 13 C σε φυσική αφθονία 1,1% 46

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία 135 136 1 1 = - 28 = -C=O C=O C x 76 15 = -C 3 16 = -O 92 107 16 15 28 137 47

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία C=O C x 135 (136 135) 1 = - (135 107) 28 = -C=O 76 92 107 136 1 (107 92) 15 = -C 3 ( 92 76) 16 = -O Κύριες κορυφές 136 135 107 92 76 16 15 28 137 48

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία C=O C x 135 (136 135) 1 = - (135 107) 28 = -C=O 76 92 107 136 1 (107 92) 15 = -C 3 ( 92 76) 16 = -O Κύριες κορυφές 136 135 107 92 76 16 15 28 137 O 49

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία C=O C x 135 (136 135) 1 = - (135 107) 28 = -C=O 76 92 107 136 1 (107 92) 15 = -C 3 ( 92 76) 16 = -O Κύριες κορυφές 136 135 107 92 76 16 15 28 137 50

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία C=O C x 135 (136 135) 1 = - (135 107) 28 = -C=O 76 92 107 136 1 (107 92) 15 = -C 3 ( 92 76) 16 = -O O Κύριες κορυφές 136 135 C 107 3 92 76 O O C 16 15 28 137 C O C 3 51

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία C=O C x 135 (136 135) 1 = - (135 107) 28 = -C=O 76 92 107 136 1 (107 92) 15 = -C 3 ( 92 76) 16 = -O O Κύριες κορυφές 136 135 C 107 3 92 76 O O C 16 15 28 137 C O C 3 52

Φάσματα μαζών - Ερμηνεία Πιθανές δομές: Έξι (6) 3 C 3 C 3 C O O O O C C o-methoxybenzaldehyde m-methoxybenzaldehyde p-methoxybenzaldehyde O O O O O C O C O C O C C 3 C 3 C 3 o-formic Acid Toluic Ester m-formic Acid Toluic Ester p-formic Acid Toluic Ester 53

Ταυτοποίηση ενώσεων με σύγκριση φασμάτων. Υπολογιστικά συστήματα αναζήτησης από ηλεκτρονικές βιβλιοθήκες. Για την πλήρη ταυτοποίηση πρέπει να συνδυαστούν και άλλες φασματοσκοπικές τεχνικές. 54