Τα λιποσώματα ως μοντέλα για την μελέτη της επίδρασης ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης σε κύτταρα.

Τα λιποσώματα ως μοντέλα για την μελέτη της επίδρασης ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης σε κύτταρα. Διπλωματική εργασία για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στην κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική Φαρμακευτική Ανάλυση» Ματραλή Σοφία Στυλιανή Φαρμακοποιός Πάτρα 2014

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ Διπλωματική Εργασία Τα λιποσώματα ως μοντέλα για την μελέτη της επίδρασης ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης σε κύτταρα. Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Αντιμησιάρη Σοφία (επιβλέπουσα) Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Σβάρνας Παναγιώτης Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Τεχνολογίας Υπολογιστών Κλεπετσάνης Παύλος Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής 2

Το αφιερώνω στην οικογένειά μου. Στους γονείς μου Χαράλαμπο και Χριστίνα και στην αδερφή μου Αγγελική. Στην μνήμη του Καστρή και του Κωσταντίνου. 3

Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος Ειδίκευσης στη κατεύθυνση «Βιομηχανική Φαρμακευτική Φαρμακευτική Ανάλυση» κατά τα έτη 2011 2014. Αρχικά θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές ευχαριστίες μου προς την επιβλέπουσα καθηγήτρια κ. Σ. Αντιμησιάρη, καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής, για την ανάθεση του θέματος και την πολύτιμη βοήθεια και καθοδήγηση που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσης εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Π. Σβάρνα για την αρωγή του στην κατανόηση ενός νέου για εμένα ερευνητικού πεδίου και τον κ. Π. Κλεπετσάνη για τις πολύτιμες συμβουλές του καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών μου. Επιπλέον θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Dr. Β. Δρακόπουλο του ιδρύματος ΙΤΕ/ΙΕΧΜΗ και τον Dr. F. Clément του Université De Pau et Des Pays De l Adour. Επιπροσθέτως θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για την άψογη συνεργασία και τις χρήσιμες συμβουλές τους. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτορα κ. Ε. Μαρκουτσά για την συμβολή της στην περάτωση των πειραμάτων επεξεργασίας καρκινικών κυττάρων. Τέλος οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στην οικογένειά μου και όλους τους αγαπημένους μου ανθρώπους για την πολύπλευρη στήριξη που μου προσέφεραν. 4

Περίληψη Τα λιποσώματα αναπτύχθηκαν αρχικά από τον Alec Bangham το 1964. Έκτοτε μελετώνται τόσο ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων όσο και ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών με σκοπό την αποσαφήνιση της δομής και των λειτουργιών τους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι αποτελούνται από τα ίδια δομικά συστατικά με εκείνα των βιολογικών μεμβρανών και η ευελιξία της δομής τους προσφέρει τη δυνατότητα προσομοίωσης της δομής και σύστασης διαφορετικών βιολογικών μεμβρανών. Στις εφαρμογές του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης, cold atmospheric pressure plasma (CAPP), που μελετώνται τα τελευταία χρόνια συγκαταλέγονται και βιοιατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα μελετάται η χρήση του ως μέσω απολύμανσης και αποστείρωσης, στην ανάπλαση δέρματος, ως αντικαρκινική θεραπεία κ.τ.λ. Εντούτοις ο ακριβής μηχανισμός της αλληλεπίδρασης του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης με κύτταρα και ιστούς δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός. Παρότι οι μέχρι τώρα μελέτες για την αποσαφήνιση της αλληλεπίδρασης αυτής πραγματοποιούνται με την χρήση κυτταρικών καλλιεργειών, η χρήση λιποσωμάτων είναι μια πιθανή εναλλακτική. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η χρήση λιποσωμικών διασπορών, ως μοντέλα κυττάρων, έχει αποδειχθεί μια πιο εύκολη, ταχύτερη και χαμηλότερου κόστους εναλλακτική των κυτταρικών καλλιεργειών για την αποσαφήνιση βιολογικών διεργασιών. Η παρούσα εργασία έχει ως σκοπό τη διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης των λιποσωμάτων ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών για την μελέτη της αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα. Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση λιποσωμάτων CAPP και επιχειρήθηκε η παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής. Τα λιποσώματα, που εγκλωβίζουν υδατικό διάλυμα καλσεΐνης, παρασκευάσθηκαν με την τεχνική της ενυδάτωσης λεπτού υμενίου και έγινε χρήση υπερήχησης με σκοπό την μείωση του μεγέθους τους. Τα λιπίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: φωσφατιδυλοχολίνη, φωσφατιδυλογλυκερόλη και χοληστερόλη. Υπέστησαν επεξεργασία τόσο με CAPP όσο και με αφόρτιστο φέρον αέριο. Ο χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων έγινε μέσω μέτρησης των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών. Ως μέτρο της αλληλεπίδρασης CAPP-λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκε η μεταβολή του εγκλωβισμού της καλσεΐνης. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μορφολογική ανάλυση των λιποσωμάτων, μέσω ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας σάρωσης, πριν και μετά την επεξεργασία. Με σκοπό την παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής έγινε μελέτη της μεταβολής των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των λιποσωμάτων ως συνάρτηση του χρονικού διαστήματος επεξεργασίας και του χρόνου επώασης (σε PBS στους 4 C) μετά την επεξεργασία. 5

Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν πειράματα αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα B- 16, καρκινικά κύτταρα μελανώματος ποντικού. Ως οι κυριότεροι παράγοντες της αλληλεπίδρασης CAPP λιποσωμάτων διαφαίνονται η συγκέντρωση της λιποσωμικής διασποράς και ο χρόνος επεξεργασίας. Η μείωση του ποσοστού εγκλωβισμού της καλσεΐνης αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση τόσο της συγκέντρωσης όσο και του χρόνου επεξεργασίας. Επιπλέον η λιπιδική σύσταση επηρεάζει το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης. Η ύπαρξη αρνητικού επιφανειακού φορτίου επηρεάζει θετικά το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης ενώ η ύπαρξη χοληστερόλης οδηγεί σε πιο ανθεκτικά λιποσώματα μόνο στη μέγιστη συγκέντρωση (50%). Μείωση του μεγέθους και του αριθμού των διπλοστιβάδων των λιποσωμάτων οδηγεί σε πιο ευαίσθητα κυστίδια. Διαφυγή της καλσεΐνης παρατηρήθηκε μέχρι και 96 ώρες μετά την επεξεργασία ενώ με το πέρας του χρόνου παρατηρήθηκε επιπλέον συσσωμάτωση των κυστιδίων, το οποίο επιβεβαιώνεται με μορφολογικές μελέτες, και μεταβολή τους επιφανειακού τους φορτίου. Η επίδραση του CAPP στα κύτταρα Β-16 επηρεάζεται τόσο από την αρχική πληρότητα (confluence) της καλλιέργειας όσο και από τις διαστάσεις των κελιών της χρησιμοποιούμενης πλάκας. Παρότι η ανωτέρω ανάλυση υποστηρίζει την αρχική υπόθεση, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του CAPP με βιολογικά δείγματα. 6

Abstract Liposomes were originally developed by Alec Bangham in 1964. Since then, they have been studied as carriers of bioactive compounds and as biological membrane models in structural and functional studies. This is due to the fact that they are composed of the same building blocks as biological membranes and because their structural versatility offers the opportunity to create vesicles that resemble the structure and composition of different biological membranes. In recent years cold atmospheric pressure plasma, CAPP, has been studied for a variety of applications some of which are found in the biomedical milieu. More precisely these applications include: decontamination, sterilization, skin regeneration, tumor treatment, etc. Nevertheless the exact mechanism of the interaction between CAPP and cells/tissue is not yet completely understood. Although currently researchers use cell cultures to investigate this interaction, liposomes could be an alternative. The applicability of liposomal dispersions, as cell models, has proved to be an easier, faster and less expensive tool for the investigation of cell cellular environment interactions. The purpose of this thesis was to investigate the possibility of using liposomes as cell membrane models to study the CAPP-cells interactions. The CAPP-liposomes interaction was studied and parameterization of this interaction was attempted. Calcein-encapsulating liposomes were prepared using the thin-film hydration technique and the sonication technique was used to decrease the size of the vesicles. The lipids used were: phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and cholesterol. The samples were treated both with CAPP and with the uncharged carrier-gas. Characterization of liposomes was made by measuring their physicochemical characteristics. The variation of the percent of calcein encapsulation was used to measure the effect of CAPP-liposomes interaction. Moreover morphological evaluation of the samples before and after treatment was realized thought scanning electron microscopy, SEM. The variation of liposomes physicochemical characteristics versus time, duration of treatment and incubation (in PBS at 4 C), was realized in order to parameterize this interaction. The effect of CAPP on B-16 cells, mouse melanoma cancer cells, was also investigated. The major parameters of the CAPP-liposomes interaction were proved to be the concentration of the liposomal dispersion and the duration of treatment. The increase of both the lipid concentration and the duration of treatment lead to increase of the reduction of 7

calcein s encapsulation provoked by CAPP treatment. The composition of the liposomal membrane also affects the interaction s result. Negative surface charge increases the impact of CAPP and the presence of cholesterol leads to more stable structures only when its concentration is maximum (50%). Reduction of the size and lamellarity of the vesicles leads to more fragile liposomes. Release of calcein was observed even 96 hours after treatment in combination with aggregation of the vesicles, which was also proved via morphological evaluation, and change of liposomes surface charge. The impact of CAPP treatment on B-16 cells seems to depend on the initial confluence of the culture as well as the dimensions of the plate s wells. Although the aforementioned analysis supports the initial hypothesis, further investigation of the interaction between CAPP and biological samples is necessary. 8

Συντομογραφίες PC Chol DSPG PBS MLV SUV CAPP APGS Φωσφατιδυλοχολίνη Χοληστερόλη Διστεαροϋλοφωσφατιδυλογλυκερόλη Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών Μεγάλα Πολυστοιβαδιακά Λιποσώματα Μικρά Μονοστοιβαδιακά Λιποσώματα Cold Atmospheric-Pressure Plasma, Ψυχρό Πλάσμα Ατμοσφαιρικής Πίεσης Atmospheric Pressure Guided Streamers, Οδηγούμενα-Κατευθυνόμενα Κύματα Ιονισμού Ατμοσφαιρικής Πίεσης SEM Latency % Retention % Scanning Electron Μicroscopy, Ηλεκτρονιακή Μικροσκοπία Σάρωσης Ποσοστό εγκλωβισμού της καλσεΐνης στα λιποσώματα Ποσοστό συγκράτησης της καλσεΐνης από τα λιποσώματα 9

Περιεχόμενα Σελίδες 1. Εισαγωγή 15 1.1. Λιποσώματα 15 1.1.1. Οργάνωση Λιποσωμάτων 16 1.1.2. Δομικά Στοιχεία 17 1.1.2.1. Αμφιπαθή Μόρια 17 1.1.2.1.1. Λιπίδια 17 1.1.2.1.1.1.Φωσφολιπίδια 18 1.1.2.1.1.2. Χοληστερόλη 21 1.1.2.2. Σχηματισμός Λιποσωμάτων 23 1.1.2.3. Θερμοκρασία Μετάπτωσης (Phase Transition Temperature, Tm) 25 1.1.3. Τύποι Λιποσωμάτων 28 1.1.3.1. Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστιβάδων τους 28 1.1.3.1.1. Πολυστιβαδιακά Λιποσώματα (Multilamellar Vesicles, MLVs) 28 1.1.3.1.2. Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Unilamellar Vesicles, UVs) 29 1.1.3.1.2.1. Μεγάλα Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Large Unilamellar Vesicles, LUVs) 30 1.1.3.1.2.2. Μικρά Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Small Unilamellar Vesicles, SUVs) 30 1.1.3.1.3. Πολυδιαμερισματικά Λιποσώματα (Multivesicular) 31 1.1.3.2. Ταξινόμηση με βάση τον τρόπο δράσης και τις εφαρμογές τους 32 1.1.3.2.1. Συμβατικά Λιποσώματα (Conventional liposomes) 33 1.1.3.2.2. Λιποσώματα Μακράς Κυκλοφορίας (Long Circulating, Stealth or Sterically Stabilized Liposomes) 33 1.1.3.2.3. Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes) 34 1.1.3.2.4. Κατιονικά Λιποσώματα (Cationic Liposomes) 35 1.1.3.2.5. Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic Liposomes) 35 1.1.3.2.6. Λιποσώματα ευαίσθητα στο ph 35 1.1.4. Μέθοδοι Παρασκευής 36 1.1.4.1. Ενυδάτωση λεπτού υμενίου 36 1.1.4.2. Υπέρηχοι 37 1.1.4.3. Μέθοδοι Ένεσης (Injection Methods) 38 1.1.4.4. Εξώθηση διαμέσου φίλτρων (Extrusion) 39 10

1.1.4.5. Συμπίεση σε θάλαμο υψηλής πίεσης (French Press) 39 1.1.4.6. Μικρογαλακτωματοποίηση (Microfluidization) 40 1.1.4.7. Μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης (Reverse-Phase Evaporation, REV) 40 1.1.4.8. Μέθοδος Ψύξης Απόψυξης (Freeze Thaw) 41 1.1.4.9. Αφυδατωμένα Ενυδατωμένα Κυστίδια (Dehydrated Rehydrated Vesicles, DRV) 41 1.1.4.10. Γιγάντια Λιποσώματα 42 1.1.4.11. Δημιουργία μικτών μικυλλίων με απορρυπαντικά (Detergent Depletion) 43 1.1.4.12. Παρασκευή LUVs μέσω Κοχλιοειδών (LUVs from Cochleates) 43 1.1.4.13. Τεχνική ενός βήματος (One Step Method) 44 1.1.4.14. Πολυδιαμερισματικά λιποσώματα (Multivesicular) 45 1.1.4.15.Μέθοδος Θέρμανσης (Heating Methode) 45 1.1.4.16. Παρασκευή λιποσωμάτων σε μεγάλες ποσότητες (Large Scale Manufacturing) 46 1.1.5. Μέθοδοι Καθαρισμού 46 1.1.5.1. Διαπίδυση ισορροπίας (Dialysis) 46 1.1.5.2. Χρωματογραφία αποκλεισμού μεγεθών (Size Exclusion Chromatography) 47 1.1.5.3. Φυγοκέντρηση (Centrifugation) 48 1.1.6. Φυσικοχημικές Ιδιότητες και Χαρακτηρισμός Λιποσωμικών Διασπορών 48 1.1.6.1. Κατανομή μεγέθους των λιποσωμάτων 48 1.1.6.2. Επιφανειακό φορτίο των λιποσωμάτων 50 1.1.6.3. Ικανότητα εγκλωβισμού/ενσωμάτωσης των λιποσωμάτων 51 1.1.6.4. Σταθερότητα των λιποσωμάτων 53 1.1.7. Εφαρμογές 54 1.1.7.1. Αύξηση υδατοδιαλυτότητας 54 1.1.7.2. Προστασία 54 1.1.7.3. Ενδοκυττάρια χορήγηση 54 1.1.7.4. Διάρκεια δράσης 55 1.1.7.5. Γονιδιακή θεραπεία 55 1.1.7.6. Μείωση ανεπιθύμητων ενεργειών 55 1.1.7.7. Δυνατότητα κατεύθυνσης-στόχευσης 56 1.1.7.8. Ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση 56 1.1.7.9. Ανοσοενίσχυση 56 1.1.7.10. Αντικαρκινική θεραπεία 56 1.1.8. Εμπορικά Σκευάσματα 57 11

1.1.8.1. Λιπιδικά σκευάσματα αμφοτερικίνης Β 57 1.1.8.2. Αντινεοπλασματικά σκευάσματα 57 1.2. Πλάσμα 59 1.2.1. Τι είναι το πλάσμα; 59 1.2.2. Σχηματισμός 59 1.2.3. Σύσταση 60 1.2.4. Κατηγορίες Πλάσματος 60 1.2.4.1. Θερμικό Πλάσμα 60 1.2.4.2. Ψυχρό Πλάσμα 61 1.2.5. Ιδιότητες Ψυχρού Πλάσματος Ατμοσφαιρικής Πίεσης, (CAPP) 62 1.2.6. Εφαρμογές Ψυχρού Πλάσματος (Χαμηλής και Ατμοσφαιρικής Πίεσης) 63 1.2.6.1. Επεξεργασία Στερεών 63 1.2.6.2. Επεξεργασία Υγρών 64 1.2.6.3. Περιβαλλοντικές Εφαρμογές 64 1.2.6.4. Χημικές Εφαρμογές 64 1.2.6.5. Βιολογικές Εφαρμογές 66 Σκοπός 68 2. Πειραματικό μέρος 69 2.1. Όργανα και Υλικά 69 2.1.1. Όργανα 69 2.1.2. Υλικά 70 2.1.2.1. Υλικά για την παρασκευή των λιποσωμάτων 70 2.1.2.1.1. Λιπίδια 70 2.1.2.1.2. Διάλυμα καλσεΐνης 100mM (Διάλυμα ενυδάτωσης των λιποσωμάτων) 70 2.1.2.1.3. Υλικά για τον καθαρισμό των λιποσωμάτων με την χρήση υγρής χρωματογραφίας στήλης μοριακού αποκλεισμού 70 2.1.2.2. Υλικά για την παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, PBS 71 2.1.3. Αντιδραστήρια 71 2.1.3.1. Για την λύση των λιποσωμάτων 71 2.1.3.2. Για τον προσδιορισμό της λιπιδικής συγκέντρωσης των λιποσωμικών διαλυμάτων, μέθοδος Stewart 71 2.1.4. Για την καλλιέργεια κυττάρων Β-16 72 2.1.4.1. Πλήρες θρεπτικό μέσο 72 2.1.4.2. Θρεπτικό μέσο για την αποθήκευση κυττάρων 72 12

2.2. Μεθοδολογίες 73 2.2.1. Επεξεργασία των λιποσωμάτων με ψυχρό πλάσμα ατμοσφαιρικής πίεσης 73 2.2.1.1. Μέθοδος παρασκευής λιποσωμάτων 74 2.2.1.1.1. Καθαρισμός λιποσωμικών διασπορών 75 2.2.1.2. Χαρακτηρισμός Λιποσωμάτων 76 2.2.1.2.1. Μέθοδος προσδιορισμού λιπιδικής συγκέντρωσης Μέθοδος Stewart 76 2.2.1.2.2. Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων 78 2.2.1.2.2.1. Μέτρηση Μεγέθους Λιποσωμάτων 78 2.2.1.2.2.2. Μέτρηση ζ-δυναμικού Λιποσωμάτων 81 2.2.1.2.2.3. Μέτρηση Ωσμωτικότητας Διαλυμάτων προς εγκλωβισμό στα Λιποσώματα 82 2.2.1.2.2.4. Ηλεκτρονιακή Μικροσκοπία Σάρωσης, SEM 83 2.2.1.3. Μέθοδος προσδιορισμού ποσοστού εγκλωβισμού της καλσεΐνης 84 2.2.2. Επεξεργασία κυττάρων B - 16 με ψυχρό πλάσμα ατμοσφαιρικής πίεσης 86 2.2.2.1. Μέθοδος προσδιορισμού της κυτταρικής βιωσιμότητας, ΜΤΤ 86 3. Αποτελέσματα Συζήτηση 88 3.1. Προσδιορισμός πειραματικών συνθηκών 88 3.1.1. Χαρακτηριστικά πειραματικής διάταξης 88 3.1.2. Χαρακτηριστικά δειγμάτων εργασίας 89 3.2. Μελέτη επίδρασης του μεγέθους των λιποσωμάτων (αριθμού διπλοστοιβάδων - lamellarity) 94 3.3. Μελέτη επίδρασης της λιπιδικής σύστασης 99 3.3.1. Επίδραση συγκέντρωσης χοληστερόλης στην λιπιδική διπλοστοιβάδα 99 3.3.2. Επίδραση Φορτίου Επιφανείας (ζ-δυναμικού) 102 3.4. Μελέτη μεταβολής του ποσοστού συγκράτησης της καλσεΐνης με τον χρόνο μετά την επεξεργασία 107 3.5. Μελέτη του μηχανισμού επίδρασης του APGS στην ακεραιότητα των λιποσωμικών εναιωρημάτων 114 3.5.1. Μορφολογική Μελέτη των λιποσωμάτων 114 3.5.2. Μελέτη της μεταβολής του μεγέθους και του ζ-δυναμικού των λιποσωμάτων 116 3.5.3. Μελέτη της επίδρασης της τοπικής αύξησης της θερμοκρασίας του δείγματος ως απόρροια της επεξεργασίας με APGS 119 3.6. Μελέτη επίδρασης του APGS σε καρκινικά κύτταρα Β-16 121 3.7. Μηχανισμός αλληλεπίδρασης APGS με βιολογικά συστήματα 124 13

4. Συγκεντρωτικά Συμπεράσματα 126 4.1. Πειραματικές Συνθήκες 126 4.2. Επίδραση της λιπιδικής σύστασης των λιποσωμάτων 128 4.3. Επίδραση του μεγέθους του αριθμού των στιβάδων των λιποσωμάτων (Lamellarity) 128 4.4. Μεταβολή της ακεραιότητας των λιποσωμάτων μετά την επεξεργασία 130 4.5. Μηχανισμός αλληλεπίδρασης λιποσωμάτων με το ψυχρό πλάσμα ατμοσφαιρικής πίεσης 131 4.6. Επίδραση ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης σε καρκινικά κύτταρα 132 Βιβλιογραφία 134 Παράρτημα 146 14

1. Εισαγωγή 1.1. Λιποσώματα Στόχος των συστημάτων χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων είναι η βελτίωση της φαρμακοκινητικής και της βιοκατανομής με σκοπό την επίτευξη του επιθυμητού θεραπευτικού ή διαγνωστικού αποτελέσματος. Η χρήση φορέων για την χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων προσφέρει το πλεονέκτημα της ρύθμισης τόσο της απελευθέρωσης από τον φορέα όσο και της απορρόφησης από τον οργανισμό. Παραδείγματα τέτοιων φορέων είναι οι νανοσφαίρες, οι νανοκάψουλες, τα πολυμερικά μικύλλια, τα δενδριμερή, οι λιποπρωτεΐνες και κολλοειδής δομές όπως τα λιποσώματα. Εικόνα 1: Σχηματική απεικόνιση νανοφορέων βιοδραστικών ενώσεων. Τα λιποσώματα είναι κυστίδια κυρίως λιπιδικής φύσεως που αναπτύχθηκαν αρχικά από τον Alec Bangham ως μοντέλο κυτταρικών μεμβρανών. Τη δεκαετία του 1970 άρχισαν να μελετώνται ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων. Σε σχέση με άλλες φαρμακομορφές χαρακτηρίζονται από τα εξής πλεονεκτήματα: 1) Η ευέλικτη δομή τους μπορεί εύκολα να τροποποιηθεί με βάση την εκάστοτε εφαρμογή, 2) Είναι μη τοξικά, μη ανοσογόνα και πλήρως βιοσυμβατά και βιοαποικοδομήσιμα συστήματα και 3) Διαθέτουν τόσο υδρόφοβες όσο υδρόφιλες περιοχές επιτρέποντας την μεταφορά τόσο υδρόφιλων όσο υδρόφοβων μορίων. Εκτός από τον τομέα της χορήγησης βιοδραστικών ενώσεων (χημειοθεραπευτικοί παράγοντες, αντιγόνα, ανοσοτροποποιητές, χηλικές ενώσεις, παράγωγα αίματος, λιπίδια και γενετικό υλικό), τα λιποσώματα χρησιμοποιούνται και ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών με σκοπό την αποσαφήνιση της δομής και των λειτουργιών τους. Παραδείγματα χρήσης των λιποσωμάτων ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών αποτελούν η μελέτη διαπερατότητας βιοδραστικών ενώσεων, μηχανισμών ενδοκυττάρωσης και μεταβολών των ηλεκτρικών 15

ιδιοτήτων των βιολογικών μεμβρανών. Όσον αφορά την χορήγηση βιοδραστικών ενώσεων βρίσκουν εφαρμογή σε τομείς όπως: η διάγνωση, η ανοσολογία, η δερματολογία, στη στόχευση στον εγκέφαλο, στην αντιμετώπιση λοιμωδών και οφθαλμικών παθήσεων, στη γονιδιακή θεραπεία και στην αντικαρκινική θεραπεία. Επιπλέον μελέτη γίνεται και για την χρήση τους στον τομέα της κοσμετολογίας. (1 7) 1.1.1. Οργάνωση Λιποσωμάτων Τα λιποσώματα ορίζονται ως μικρά λιπιδικά κυστίδια σφαιρικού σχήματος και κολλοειδούς χαρακτήρα που αποτελούνται από μία ή περισσότερες διπλοστιβάδες λιπιδίων που εναλλάσσονται με υδατικά τμήματα. Τα λιποσώματα σχηματίζονται αυθόρμητα όταν τα λιπίδια, κύριο γνώρισμα των οποίων είναι ο αμφιπαθής χαρακτήρας τους, διασπείρονται σε υδατικό περιβάλλον. Τυπική δομή λιποσώματος δίνεται στην εικόνα 2. Εικόνα 2: Τυπική δομή λιποσώματος. Τα υδρόφοβα μόρια ενσωματώνονται στις λιπιδικές διπλοστιβάδες ενώ τα υδρόφιλα εγκλωβίζονται στα υδατικά μέρη. Το πάχος των διπλοστιβάδων είναι περίπου 4 nm ενώ η διάμετρος των λιποσωμάτων κυμαίνεται από 25 με 50 nm έως μερικά μm. Κατά την διάρκεια της παρασκευής τους μπορούν να ενσωματώσουν υδρόφοβα μόρια, στις λιπιδικές τους διπλοστιβάδες, ή να εγκλωβίσουν υδρόφιλες ενώσεις, στα υδατικά τμήματα. Η αξία τους ως μοντέλα μεμβρανικών συστημάτων έγκειται στο γεγονός ότι μπορεί να παρασκευαστούν από συστατικά φυσικής προέλευσης, έτσι ώστε η λιποσωμική μεμβράνη 16

να σχηματίζει τη δομή διπλοστιβάδας. Η δομή αυτή στα βασικά της χαρακτηριστικά είναι πανομοιότυπη με το λιπιδικό τμήμα των φυσικών κυτταρικών μεμβρανών (μοντέλο ρευστού μωσαϊκού κατά Singer και Nicolson, (8). Η ομοιότητα αυτή δύναται να ενισχυθεί επιπλέον μέσω χημικής τροποποίησης της λιποσωμικής μεμβράνης. Η δυνατότητα αυτή καθιστά τα λιποσώματα πολύτιμο εργαλείο στην στόχευση βιοδραστικών ενώσεων ή ανοσοτροποποίηση in vitro και in vivo. Συνεπώς η ικανότητα των λιποσωμάτων να μιμούνται τη συμπεριφορά μεμβρανών φυσικής προέλευσης και να αποικοδομούνται από τις ίδιες οδούς τα καθιστά ένα ασφαλές και αποτελεσματικό σύστημα με ποικίλες ιατρικές εφαρμογές. (7, 9) 1.1.2. Δομικά Στοιχεία Για την παρασκευή των λιποσωμάτων μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο φυσικά ή συνθετικά συστατικά. Συνήθως χρησιμοποιούνται φυσικά λιπίδια και κυρίως φωσφολιπίδια και στερόλες. Σταθερά κυστίδια λιπιδικής διπλοστιβάδας μπορούν όμως να σχηματιστούν και από άλλα αμφιπαθή μόρια ή μίγματά τους όπως λιπαρά οξέα και δευτεροταγής αμίνες διπλής αλυσίδας. (7, 9) 1.1.2.1. Αμφιπαθή Μόρια Αμφιπαθή ή αμφίφιλα ονομάζονται τα μόρια που αποτελούνται από μία υδρόφιλη και μία υδρόφοβη ομάδα. Το υδρόφοβο τμήμα συνήθως αποτελείται από υδρογοανθρακικές αλυσίδες ενώ το υδρόφιλο τμήμα από φορτισμένες ομάδες, εστέρες του φωσφορικού ή θειϊκού οξέος, ή πολικές μη φορτισμένες δομές, αλκοόλες και ολιγοαιθυλενογλυκόλες. Ειδικό χαρακτηριστικό, κοινό για όλα τα αμφιπαθή μόρια είναι η δυνατότητά τους να συσσωματώνονται αυθόρμητα, να αυτό - οργανώνονται σε ποικίλες δομές που τα καθιστά χρήσιμα σε μεγάλο αριθμό εφαρμογών. Παραδείγματα εφαρμογών αποτελούν τα απορρυπαντικά, τα χρώματα, είδη τροφίμων και φαρμακευτικών προϊόντων. 1.1.2.1.1. Λιπίδια Στα αμφιπαθή μόρια κατατάσσονται και τα λιπίδια. Τα λιπίδια είναι βιομόρια αδιάλυτα στο νερό και διαλυτά σε οργανικούς διαλύτες όπως το χλωροφόρμιο. Ο όρος λιπίδια χαρακτηρίζει μία ιδιαίτερα ετερογενή ομάδα φυσικών μορίων όπως: κηροί, λίπη, λιποδιαλυτές βιταμίνες, φωσφολιπίδια, στερόλες, και γλυκολιπίδια. Τα λιπίδια ασκούν μια ποικιλία βιολογικών ρόλων όπως: καύσιμα μόρια, υψηλής πυκνότητας αποθήκες ενέργειας, σηματοδοτικά μόρια και συστατικά βιολογικών μεμβρανών. Τα κύρια μεμβρανικά λιπίδια είναι τα φωσφολιπίδια, τα γλυκολιπίδια και οι στερόλες, συγκεκριμένα η χοληστερόλη. 17

1.1.2.1.1.1. Φωσφολιπίδια Τα φωσφολιπίδια αποτελούνται από τέσσερα δομικά συστατικά: λιπαρά οξέα, μία εξέδρα στην οποία προσδένονται τα λιπαρά οξέα (γλυκερόλη ή σφιγγοσίνη), μία φωσφορική ομάδα και μία αλκοόλη προσδεμένη σε αυτή. Τα λιπαρά οξέα που σχηματίζουν τα φωσφολιπίδια έχουν από 12 έως 20 άτομα άνθρακα που οργανώνονται σε κορεσμένες ή ακόρεστες υδρογονοανθρακικές αλυσίδες. Τα κορεσμένα λιπαρά οξέα διαθέτουν μόνο απλούς δεσμούς ενώ οι ακόρεστες υδρογονοανθρακικές αλυσίδες διαθέτουν έναν ή περισσότερους διπλούς δεσμούς που χωρίζονται μεταξύ τους από μία τουλάχιστον ομάδα μεθυλενίου. Το ισομερές που συναντάτε στα ακόρεστα λιπαρά οξέα είναι σχεδόν πάντα στη cis μορφή. Πίνακας 1: Λιπαρά οξέα που συμμετέχουν στον σχηματισμό φωσφολιπιδίων. Κοινή Ονομασία Χημικός Τύπος Κορεσμένα Λιπαρά οξέα Λαυρικό CH 3 (CH 2 ) 10 COO - Μυριστικό CH 3 (CH 2 ) 12 COO - Παλμιτικό CH 3 (CH 2 ) 14 COO - Στεατικό CH 3 (CH 2 ) 16 COO - Αραχιδικό CH 3 (CH 2 ) 18 COO - Βεχενικό CH 3 (CH 2 ) 20 COO - Λιγνοκερικό CH 3 (CH 2 ) 22 COO - Ακόρεστα Λιπαρά οξέα Παλμιτελαϊκό CH 3 (CH 2 ) 5 CH=CH(CH 2 ) 7 COO - Ελαϊκό CH 3 (CH 2 ) 7 CH=CH(CH 2 ) 7 COO - Λινελαϊκό CH 3 (CH 2 ) 4 (CH=CHCH 2 ) 2 (CH 2 ) 6 COO - Λινολενικό CH 3 CH 2 (CH=CHCH 2 ) 3 (CH 2 ) 6 COO - Αραχιδονικό CH 3 (CH 2 ) 4 (CH=CHCH 2 ) 4 (CH 2 ) 2 COO - Τα δύο λιπαρά οξέα απαρτίζουν την υδρόφοβη ουρά ενώ τα υπόλοιπα συστατικά την πολική κεφαλή. Η οργάνωση αυτή προσδίδει στα φωσφολιπίδια τον αμφιπαθή τους χαρακτήρα. Το επιφανειακό φορτίο των λιπιδίων καθορίζεται από την πολική κεφαλή. Τα φωσφολιπίδια μπορεί να είναι θετικά ή αρνητικά φορτισμένα, χωρίς φορτίο ή υπό τη μορφή διπολικού ιόντος (zwitterionic). 18

Εικόνα 3: Βασική δομή φωσφοδιγλυκεριδίου και οι χαρακτηριστικές ομάδες. Τα φωσφολιπίδια που διαθέτουν γλυκερόλη ως εξέδρα ονομάζονται φωσφοδιγλυκερίδια ενώ αυτά που διαθέτουν σφιγγοσίνη ονομάζονται σφιγγολιπίδια. Στα φωσφοδιγλυκεριδία, εικόνα 3, οι υδροξυλομάδες των ανθράκων C 1 και C 2 της γλυκερόλης εστεροποιούνται με τις καρβοξυλικές ομάδες δύο λιπαρών οξέων. Η υδροξυλομάδα του άνθρακα C 3 εστεροποιείται με φωσφορικό οξύ. Η δομή αυτή ονομάζεται φωσφατιδικό οξύ (PA) και αποτελεί το πιο απλό φωσφοδιγλυκερίδιο. Η εστεροποίηση της φωσφορικής ομάδας με την υδροξυλική ομάδα μιας αλκοόλης οδηγεί στον σχηματισμό των κυριότερων φωσφοδιγλυκεριδίων. Οι πιο κοινές αλκοολικές ομάδες των φωσφοδιγλυκεριδίων δίνονται στην εικόνα 4. Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση των κυριότερων φωσφοδιγλυκεριδίων. Όπου ως ΡΑ αναφέρεται το φωσφατιδικό οξύ. 19

Η φωσφατιδυλοχολίνη (PC) ή λεκιθίνη είναι ένα από τα κύρια συστατικά των λιποσωμικών μεμβρανών. Σε φυσιολογικό ph βρίσκεται υπό τη μορφή διπολικού ιόντος και μπορεί να εξαχθεί από το κρόκο του αυγού. H φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (PE) βρίσκεται και αυτή υπό τη μορφή διπολικού ιόντος, ενώ αντίθετα η φωσφατιδυλοσερίνη (PS), η φωσφατιδυλοϊνοσιτόλη (PI) και η φωσφατιδυλογλυκερόλη (PG) είναι αρνητικά φορτισμένες και χρησιμοποιούνται για να προσδώσουν αρνητικό φορτίο στις λιποσωμικές μεμβράνες. Επιπλέον τα αρνητικά φορτισμένα φωσφολιπίδια αυξάνουν την απόσταση δύο διαδοχικών διπλοστιβάδων οδηγώντας σε αύξηση της ικανότητας εγκλωβισμού υδατοδιαλυτών μορίων. Η φωσφατιδυλοχολίνη μπορεί να εξαχθεί από φυσικές πηγές αλλά και να συντεθεί χημικά. Εξάγεται εύκολα από κρόκο αυγού και από σόγια. Επιπλέον μπορεί να εξαχθεί, αλλά λιγότερο εύκολα, και από καρδιά και νωτιαίο μυελό βοοειδών. Αποτελεί το κύριο συστατικό των λιποσωμικών μεμβρανών σε ένα ευρύ φάσμα εφαρμογών καθότι υπό σύνηθες ph είναι υπό τη μορφή διπολικού ιόντος, είναι χαμηλού κόστους σε σχέση με άλλα φωσφολιπίδια και σχετικά χημικά αδρανής. Η φωσφατιδυλοχολίνη φυσικής προέλευσης είναι στην πραγματικότητα ένα μίγμα φωσφολιπιδίων, οι φωσφατιδυλοχολίνες ή λεκιθίνες. Το μίγμα αυτό αποτελείται από μόρια με διαφορετικές υδρογονανθρακικές αλυσίδες. Οι φυσικές λεκιθίνες έχουν υψηλό ποσοστό ακορεστότητας των αλυσίδων, ενώ αντίθετα οι λεκιθίνες ζωικής προέλευσης περιέχουν υψηλό ποσοστό πλήρως κορεσμένων αλυσίδων. Τα λιπαρά οξέα φυσικής προέλευσης έχουν σχεδόν αποκλειστικά ζυγό αριθμό ανθράκων στην αλυσίδα καθώς η σύνθεση των αλυσίδων τους γίνεται με βασική μονάδα τους δύο άνθρακες του μηλόνυλοcoa που προκύπτει από την καρβοξυλίωση του ακέτυλοcoa. Η επιμήκυνση της αλυσίδας γίνεται με διαδοχική προσθήκη δύο ατόμων άνθρακα προερχόμενων από το μηλόνυλοcoa μέχρι τη δημιουργία του παλμιτικού οξέος (C 16 ). Πέραν αυτού η διεργασία της επιμήκυνσης μπορεί να γίνει παράλληλα με την προσθήκη διπλού δεσμού και οι διεργασίες αυτές διεκπεραιώνονται από άλλα ενζυμικά συστήματα. Η διαμόρφωση και ο αριθμός των διπλών δεσμών καθώς και το μήκος της αλυσίδας επιδρά στο σημείο τήξης και στα χαρακτηριστικά ρευστότητας της μεμβράνης. Τα περισσότερα φωσφολιπίδια φυσικής προέλευσης είναι μείγματα επειδή τα δύο λιπαρά οξέα του ίδιου μορίου είναι συνήθως διαφορετικά μεταξύ τους. Συνήθως η μία αλυσίδα είναι κορεσμένη ενώ η άλλη ακόρεστη μεγαλύτερου μήκους. Τα χαρακτηριστικά των φωσφολιπίδιων επηρεάζουν τα χαρακτηριστικά της παραγόμενης διπλοστιβάδας: 1) αύξηση του μήκους της υδρογοανθρακικής αλυσίδας των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων οδηγεί σε αύξηση της συνοχής της διπλοστιβάδας, 2) αύξηση του ποσοστού κορεσμού αντίθετα μειώνει την συνοχή και 3) ομοίως επιδρά και η αύξηση των διακλαδώσεων των αλυσίδων. 20

Τα φωσφολιπιδία φυσικής προέλευσης είναι δυνατόν να τροποποιηθούν χημικά, απαλκυλίωση ή επιπλέον αλκυλίωση, ούτως ώστε να φέρουν συγκεκριμένες ιδιότητες. Συνήθως χρησιμοποιούνται φωσφολιπίδια μυριστικού, παλμιτικού και στεατικού οξέος και συμβολίζονται με τέσσερα γράμματα όπως DMPC. Τα δύο πρώτα αναφέρονται στον αριθμό και τον τύπο του λιπαρού οξέος, DM = di-myristoyl που σημαίνει ότι φέρει δύο μόρια μυριστικού οξέος. Τα άλλα δύο στο είδος της πολικής κεφαλής, PC που σημαίνει ότι είναι μόριο φωσφατιδυλοχολίνης. Επιπλέον υπάρχουν πλέον εμπορικά διαθέσιμα σύμπλοκα φωσφολιπιδίων με πολυαιθυλενογλυκόλη, πρωτεΐνες και πεπτίδια που μελετώνται σε διάφορες εφαρμογές. Τα θετικά φορτισμένα φωσφολιπίδια δύναται να σχηματίσουν σύμπλοκα με δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ, DNA. Το χαρακτηριστικό τους αυτό τα καθιστά χρήσιμο εργαλείο στην έρευνα γύρω από τις γονιδιακές θεραπείες. Τέλος υπό μελέτη βρίσκονται και τροποποιημένα φωσφολιπίδια με αντικαρκινική δράση όπως τα αρσονολιπίδια. (1, 2, 5, 9, 10,) 1.1.2.1.1.2. Χοληστερόλη Κατηγορία λιπιδίων αποτελούν και οι στερόλες στις οποίες ανήκει και η χοληστερόλη. Οι στερόλες είναι σημαντικά μόρια των περισσότερων φυσικών μεμβρανών και η ενσωμάτωσή τους στις διπλοστιβάδες των λιποσωμάτων μπορεί να επιφέρει σημαντικές αλλαγές στις ιδιότητες των μεμβρανών, όπως αλλαγές στη ρευστότητα και την διαπερατότητά τους. Στα θηλαστικά η κυρίαρχη στερόλη είναι η χοληστερόλη. Κοινά χαρακτηριστικά όλων των στερολών είναι η 3β-υδροξυλική ομάδα, ένας επίπεδος πυρήνας στεροειδούς, δομημένος από τέσσερις δακτυλίους υδρογονοανθράκων, και μία αλειφατική πλευρική αλυσίδα (εικόνα 5). 21

Εικόνα 5: Το μόριο της χοληστερόλης. Η χοληστερόλη δεν δημιουργεί από μόνη της διπλοστιβαδιακές δομές αλλά μπορεί να ενσωματωθεί σε φωσφολιπιδικές μεμβράνες σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις με μοριακή αναλογία πάνω από 1:1. στις φυσιολογικές μεμβράνες η μοριακή αναλογία ποικίλει από 0,1-1 ανάλογα με την ανατομική και κυτταρική τοποθεσία. Στις μεμβράνες, ως αμφίφιλο μόριο, η χοληστερόλη είναι προσανατολισμένη παράλληλα προς τις αλυσίδες λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων, ενώ η υδροξυλική ομάδα, η πολική κεφαλή, αλληλεπιδρά με γειτονικές κεφαλές φωσφολιπιδίων (εικόνα 6) (10). 1. 2. Εικόνα 6: Οργάνωση χοληστερόλης μεταξύ των φωσφολιπιδίων, 1 (11 (εικόνα 10-11)) και εντός των διπλοστιβάδων, 2. Η 3β-υδροξυλική ομάδα βρίσκεται τοποθετημένη πλησίον των καρβοξυλικών κατάλοιπων των εστερικών δεσμών των φωσφολιπιδίων, με πολύ μικρή ελευθερία κινήσεων στον κάθετο άξονα. Το υδροξύλιο της πολικής κεφαλής της χοληστερόλης σχηματίζει 22

δεσμούς υδρογόνου με το καρβονυλικό οξυγόνο της πολικής κεφαλής ενός φωσφολιπιδίου ενώ η υδρογονοανθρακική ουρά της βρίσκεται μέσα στον μη πολικό ενδιάμεσο χώρο της διπλοστιβάδας. Η παρουσία του άκαμπτου πυρήνα στεροειδούς κατά μήκος των πρώτων δέκα περίπου ανθράκων των φωσφολιπιδίων έχει ως αποτέλεσμα την μείωση της ελευθερίας κινήσεων αυτών των ανθράκων. Παράλληλα δημιουργείται χώρος για ποικιλία κινήσεων των υπόλοιπων ανθράκων στο άκρο των αλυσίδων. Συνεπώς οι μεμβράνες με υψηλό ποσοστό χοληστερόλης δεν παρουσιάζουν την κλίση των αλυσίδων που παρατηρείται στη στερεή φάση των λιποσωμάτων που σχηματίζονται μόνο από φωσφολιπίδια. Η χοληστερόλη προστίθεται στα λιποσώματα για τους εξής λόγους: 1) καθιστά τις μεμβράνες πιο συμπαγής, 2) μειώνει τη γωνία κλίσης της φωσφολιπιδικής αλυσίδας στη ρευστή φάση, 3) μεταβάλλει τη θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης των λιποσωμικών μεμβρανών. (1, 2, 7, 9, 10) 1.1.2.2. Σχηματισμός Λιποσωμάτων Η δυνατότητα αυθόρμητης συσσωμάτωσης που χαρακτηρίζει τα αμφιπαθή μόρια οφείλεται στον ιδιαίτερο συνδυασμό των τμημάτων που τα απαρτίζουν καθώς και από την ευελιξία που τα χαρακτηρίζει. Οι δύο ομάδες που απαρτίζουν ένα αμφίφιλο μόριο διαλυτοποιούνται σε διαλύτες με μεγάλη διαφορά πολικότητας. Συνεπώς η διάλυση τέτοιων ενώσεων σε μη πολικούς διαλύτες ή σε πολύ πολικούς διαλύτες όπως το νερό συνεπάγεται την αυτό-οργάνωση και αυτό-δόμηση των μορίων αυτών κατά τρόπο τέτοιο ούτως ώστε τα μη διαλυτά τμήματα να κρύβονται από το περιβάλλον του διαλύτη. Στα υδατικά διαλύματα τα αμφίφιλα μόρια διαλύονται αρχικά ως μονομερή. Αύξηση της συγκέντρωσης πέραν μιας ορισμένης τιμής οδηγεί σε αυθόρμητη συσσωμάτωση με σκοπό να ελαχιστοποιηθούν οι υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις. Αυτή η αυτό-οργάνωση συνοδεύεται συνήθως από αύξηση της εντροπίας του συστήματος (11, 12). Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων του νερού και των υδρογονοανθράκων εξαναγκάζουν τα μόρια του νερού να διαταχθούν γύρω από το υδρόφοβο τμήμα όταν τα αμφίφιλα μόρια διασπείρονται ελεύθερα στον υδατικό μέσο ως μονομερή. Απελευθέρωση των διατεταγμένων μορίων νερού μπορεί να επιτευχθεί με την απομάκρυνση των υδρόφοβων τμημάτων από το υδατικό περιβάλλον και το διαχωρισμό τους εντός του συσσωματώματος. Η από-διάταξη των μορίων του νερού οδηγεί σε αύξηση της εντροπίας του συστήματος και συνεπώς σε μείωση της ελεύθερης ενέργειας. Για το λόγο αυτό η διαδικασία της συσσωμάτωσης γίνεται αυθόρμητα. Στο σημείο αυτό εντούτοις θα πρέπει να σημειωθεί ότι ο μηχανισμός αυτός είναι ακόμα υπό διερεύνηση. (13, 14) Η αυθόρμητη συσσωμάτωση δεν οφείλεται μόνο στο μηχανισμό που περιγράφει παραπάνω αλλά και σε άλλες μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις. Η συνάθροιση των υδρογοανθρακικών αλυσίδων ευνοείται από τις μεταξύ τους ελκτικές δυνάμεις Van der 23

Waals. Η συσσωμάτωση ενισχύεται επιπλέον και από τις ηλεκτροστατικές δυνάμεις και τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των πολικών κεφαλών και των μορίων του νερού. Επιπροσθέτως η συμπεριφορά των λιπιδίων σε υδατικό μέσο υπαγορεύονται και από εγγενείς παράγοντες όπως η πολικότητα του λιπιδίου, το μήκος της υδρογονοανθρακικής αλυσίδας των λιπαρών οξέων, η θέση και ο βαθμός ακορεστότητας της αλυσίδας και το μέγεθος και το φορτίο της πολικής κεφαλής. Σημαντικό ρόλο όμως διαδραματίζουν και η συγκέντρωση (lyotropism) και η θερμοκρασία (thrermotropism) του εναιωρήματος. Επειδή τα λιποσώματα διατηρούν τη συνοχή τους μέσω πολλών αλληλοενισχυόμενων μη ομοιοπολικών αλληλεπιδράσεων (κυρίως υδροφοβικών) χαρακτηρίζονται συνεργειακές δομές. Ένας τρόπος αυτό-οργάνωσης είναι ο σχηματισμός μικκυλίου (micelle), μιας σφαιρικής δομής όπου οι πολικές κεφαλές βρίσκονται στην επιφάνεια του μικκυλίου και σε επαφή με το νερό ενώ οι υδρονοανθρακικές αλυσίδες έχουν συσσωρευθεί στο εσωτερικό του αλληλεπιδρώντας η μία με την άλλη. Η οργάνωση σε μικκύλια πραγματοποιείται όταν η συγκέντρωση των αμφιπαθών μορίων υπερβεί την κρίσιμη συγκέντρωση μικκυλιοποίησης, critical micelle concentration (CMC). Εναλλακτικά οι σθεναρά αντικρουόμενες προτιμήσεις των υδρόφιλων και υδρόφοβων τμημάτων μπορούν να ικανοποιηθούν με τον σχηματισμό διπλοστοιβάδας (η εμφάνιση της δομής αυτής συμβαίνει συνήθως σε συγκέντρωση μεγαλύτερη της CMC) αποτελούμενης από δύο φύλλα αμφίφιλων μορίων (εικόνα 7). Η διπλοστοιβάδα αυτή ορίζεται και ως διμοριακό φύλλο. Οι υδρόφοβες ουρές του κάθε φύλου αλληλεπιδρούν μεταξύ τους σχηματίζοντας ένα υδρόφοβο εσωτερικό περιβάλλον το οποίο λειτουργεί ως φραγμός διαπερατότητας. Τα δύο αντιτιθέμενα φύλλα ονομάζονται μονοστιβάδες. Εικόνα 7: Οργάνωση διαφορετικών λιπιδίων στο χώρο με βάση τη γεωμετρία τους. 24

Η ευνοούμενη δομή για τα περισσότερα φωσφολιπίδια σε υδατικό περιβάλλον είναι το διμοριακό λεπτό φύλλο και όχι το μικκύλιο. Ο λόγος είναι ότι οι δύο αλυσίδες των λιπαρών οξέων των φωσφολιπιδίων καταλαμβάνουν πάρα πολύ μεγάλο όγκο και δεν χωρούν στο εσωτερικό του μικκυλίου. Οι κλειστές διπλοστιβάδες που σχηματίζουν δημιουργούν μικρά σωματίδια παρόμοια με τα σωματικά κύτταρα και τα οργανίδιά τους. (5, 9, 10, 15, 16) 1.1.2.3. Θερμοκρασία Μετάπτωσης (Phase Transition Temperature, Tm) Οι λιποσωμικές μεμβράνες δεν είναι άκαμπτες και στατικές δομές. Τα λιπίδια βρίσκονται σε διαρκή κίνηση στο επίπεδο της μεμβράνης. η διεργασία αυτή ονομάζεται πλευρική διάχυση (lateral diffusion) και είναι σύμφυτη με το μοντέλο του ρευστού μωσαϊκού (Singer και Nicolson, 1972). Η βασική θεώρηση του μοντέλου είναι ότι οι κυτταρικές μεμβράνες είναι διαλύματα σε δύο διαστάσεις που αποτελούνται από προσανατολισμένες σφαιρικές πρωτεΐνες και λιπίδια. Εκτός όμως από την κίνηση στο επίπεδο της μεμβράνης τα λιπίδια έχουν τη δυνατότητα αυθόρμητης περιστροφής από τη μία πλευρά της μεμβράνης στην άλλη, εγκάρσια διάχυση (transverse diffusion ή flip flop). Η μετακίνηση αυτή δεν επιτρέπεται από το μοντέλο του ρευστού μωσαϊκού και πραγματοποιείται με πολύ μικρότερη ταχύτητα από την πλευρική διάχυση. Η διαπερατότητα της λιποσωμικής μεμβράνης εξαρτάται από την ρευστότητα, την κίνηση των μεμβρανικών λιπιδίων. Η οποία ρευστότητα με τη σειρά της εξαρτάται από τις ιδιότητες των αλυσίδων των λιπαρών οξέων που βρίσκονται είτε σε μία καλώς διατεταγμένη και δύσκαμπτη κατάσταση είτε σε μία σχετικά άτακτη και ρευστή κατάσταση. Η μετάπτωση από τη δύσκαμπτη (ή στερεή κατάσταση ή κατάσταση γέλης) στη ρευστή κατάσταση (ή υγρή ή ρευστή κρυσταλλική κατάσταση) συμβαίνει όταν η θερμοκρασία υπερβεί τη θερμοκρασία τήξης των λιπιδίων ή θερμοκρασία μετάπτωσης, Tm. (εικόνα 8) Αυτή η θερμοκρασία μετάπτωσης εξαρτάται από το μήκος των αλυσίδων των λιπαρών οξέων και από το βαθμό κορεσμού τους. Εικόνα 8: Μετάπτωση από την στερεή στη ρευστή δομή μέσω αύξησης της θερμοκρασίας. 25

Η δύσκαμπτη κατάσταση ευνοείται από την παρουσία κορεσμένων λιπαρών οξέων διότι οι άκαμπτες υδρογονοανθρακικές αλυσίδες τους αλληλεπιδρούν με μεγάλη ευκολία μεταξύ τους. Αντίθετα ένας διπλός δεσμός cis προκαλεί κάμψη στην υδρογονοανθρακική αλυσίδα. Αυτή η κάμψη παρεμποδίζει την καλώς διατεταγμένη στοίχιση των αλυσίδων των λιπαρών οξέων με αποτέλεσμα την ελάττωση της Tm. Η θερμοκρασία μετάπτωσης επηρεάζεται και από το μήκος της αλυσίδας των λιπαρών οξέων. Οι επιμήκεις υδρογονοανθρακικές αλυσίδες αλληλεπιδρούν πολύ πιο έντονα μεταξύ τους από ότι οι αντίστοιχες μικρότερου μήκους. Συγκεκριμένα κάθε πρόσθετη ομάδα CH 2 προσθέτει περίπου -0,5kcal/mol (-2,1kJ/mol) στην ελεύθερη ενέργεια αλληλεπίδρασης μεταξύ δύο διπλανών υδρογονοανθρακικών αλυσίδων. Η μετάβαση από τη μία φάση στην άλλη μπορεί να διαπιστωθεί με φυσικές μεθόδους κατά την αύξηση της θερμοκρασίας. Η πλέον διαδεδομένη τεχνική για τον προσδιορισμό της θερμοκρασίας μετάπτωσης είναι η διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (Differential Scanning Calorimetry, DSC) η οποία χρησιμοποιείται εκτενώς για την θερμοδυναμική ανάλυση των λιποσωμάτων. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θερμοκρασία μετάπτωσης της λιπιδικής διπλοστιβάδας μπορεί να ρυθμιστεί με την χρήση κατάλληλου μείγματος λιπιδίων. Η θερμοκρασία μετάπτωσης φάσης των φωσφολιπιδίων κυμαίνεται από -20 C έως 90 C. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η χοληστερόλη είναι καθοριστικός ρυθμιστής της μεμβρανικής ρευστότητας. το διαφορετικό σχήμα της χοληστερόλης, σε σύγκριση με εκείνο των φωσφολιπιδίων, διαταράσσει τις κανονικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των αλυσίδων των λιπαρών οξέων. Επιπλέον η χοληστερόλη φαίνεται να σχηματίζει συγκεκριμένα σύμπλοκα με ορισμένα φωσφολιπίδια. Τέτοιου είδους σύμπλοκα μπορεί να συγκεντρωθούν σε ορισμένες περιοχές της μεμβράνης. Ένα αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η μείωση της ρευστότητας των λιπιδίων, οπότε οι λιπιδικές μεμβράνες καθίσταται λιγότερο ρευστές αλλά και συνάμα λιγότερο επιρρεπείς σε μεταπτώσεις φάσης. Χαρακτηριστικά αναφέρεται το παράδειγμα των DPPC μεμβρανών. Στην περίπτωση αυτή παρουσία χοληστερόλης σε ποσοστό 33% mole οδηγεί σε αύξηση της θερμοκρασίας μετάπτωσης κατά 4 C. Όταν η συγκέντρωση της χοληστερόλης τείνει σε ποσοστό ισομοριακό με το φωσφολιπίδιο, η ελευθερία κίνησης πάνω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης μειώνεται τείνοντας στη συμπύκνωση της μεμβράνης και μείωση της ρευστότητάς της. Αντίθετα κάτω από την θερμοκρασία μετάπτωσης η απόσταση μεταξύ των φωσφολιπιδίων αυξάνεται, η οργάνωση των πολικών κεφαλών εξασθενεί και η ρευστότητα της μεμβράνης αυξάνεται. Με ανάλογο τρόπο μεταβάλλεται και η διαπερατότητα της μεμβράνης. 26

Η κατανόηση της επίδρασης της θερμοκρασίας μετάπτωσης στη ρευστότητα της μεμβράνης είναι χρήσιμη για την παρασκευή και τη βιομηχανική εκμετάλλευση των λιποσωμάτων. Λιποσώματα αποτελούμενα από λιπίδια με υψηλές τιμές Τm φαίνεται να απομακρύνονται σε μικρότερο ποσοστό από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα απ ότι εκείνα με λιπίδια χαμηλής Tm (17). Η φάση που βρίσκεται η λιποσωμική μεμβράνη καθορίζει χαρακτηριστικά όπως η διαπερατότητα, η ικανότητα σύντηξης, συσσωμάτωσης και την δέσμευση πρωτεϊνών. Επιπλέον ο διαχωρισμός που περιγράφει προηγουμένως διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στα βιοχημικά φαινόμενα επειδή συστατικά μεμβρανών όπως οι πρωτεΐνες μπορούν να διαχωριστούν στην μία ή την άλλη φάση και να είναι έτσι τοπικά συγκεντρωμένα, να έχουμε τοπικά ενεργοποιημένες δομές. Όλα τα παραπάνω επηρεάζουν σημαντικά την σταθερότητα των λιποσωμάτων και τη συμπεριφορά τους στα βιολογικά συστήματα. (1, 2, 7 10, 17, 18) 27

1.1.3. Τύποι Λιποσωμάτων Τα λιποσώματα διακρίνονται σε διάφορες κατηγορίες ανάλογα με το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστιβάδων τους. Διάκριση των λιποσωμάτων γίνεται επίσης και με βάση τις ιδιότητές τους όσον αφορά τον τρόπο δράσης τους και τις εφαρμογές τους. (5 7, 10) 1.1.3.1. Ταξινόμηση με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστιβάδων τους Τόσο το μέγεθος των κυστιδίων όσο και ο αριθμός των διπλοστιβάδων τους αποτελούν κρίσιμες παραμέτρους καθότι επηρεάζουν τόσο το ποσοστό εγκλωβισμού/ενσωμάτωσης των βιοδραστικών ενώσεων όσο και το χρόνο ημι-ζωής των λιποσωμάτων in vivo. (18) 1.1.3.1.1. Πολυστιβαδιακά Λιποσώματα (Multilamellar Vesicles, MLVs) Τα MLV λιποσώματα αποτελούνται από έναν μεγάλο αριθμό παράλληλων ομόκεντρων φωσφολιπιδικών διπλοστιβάδων. Πρόκειται για τον απλούστερο τύπο λιποσωμάτων ως προς την παρασκευή τους. Η κυριότερη μέθοδος παρασκευής των MLV λιποσωμάτων είναι η μέθοδος ενυδάτωσης λεπτού υμενίου. Υδατοδιαλυτές ενώσεις εγκλωβίζονται στα υδατικά μεσοδιαστήματα ανάμεσα στις μεμβράνες, ενώ λιπόφιλες ενώσεις μπορούν να ενσωματωθούν στο εσωτερικό των λιπιδικών διπλοστιβάδων. (εικόνα 9) 28

Εικόνα 9: Σχηματική απεικόνιση πολυστιβαδιακού λιποσώματος σε διατομή και μεγέθυνση των περιοχών του. Τα λιποσώματα αυτά έχουν μεγάλες και ετερογενείς διαμέτρους (από μερικές εκατοντάδες nm έως 10μm), χαμηλή ικανότητα εγκλωβισμού όγκου ανά μόριο λιπιδίου και διαθέτουν πολλαπλά εσωτερικά διαμερίσματα. Η απόσταση μεταξύ διαδοχικών διπλοστιβάδων καθορίζεται από την ισορροπία των ελκτικών δυνάμεων Van der Waals, ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων και άλλων δυνάμεων άπωσης. Τα χαρακτηριστικά αυτά καθιστούν τη χρήση τους ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων και ως μοντέλα κυτταρικών μεμβρανών αρκετά πολύπλοκη. 1.1.3.1.2. Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Unilamellar Vesicles, UVs) Είναι λιποσώματα που διαθέτουν μία λιπιδική διπλοστιβάδα. Το μέγεθος τους κυμαίνεται από 20 nm έως μερικά μικρόμετρα. Με βάση το μέγεθός τους χωρίζονται σε μικρά, SUV, μεγάλα, LUV, και τεράστια, GUV, μονοστιβαδιακά λιποσώματα (εικόνα 10). Η διάκριση μεταξύ δύο διαδοχικών τύπων δεν είναι πάντα ξεκάθαρη. 29

Εικόνα 10: Οι τρεις τύποι μονοστιβαδιακών λιποσωμάτων. (D. V. Swaay, A. demello, Lab on a Chip, 5, 2013) 1.1.3.1.2.1. Μεγάλα Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Large Unilamellar Vesicles, LUVs) Τα λιποσώματα αυτά έχουν διάμετρο της τάξης του 1 μm και είναι μονοστιβαδιακά. Ανάλογα με το επιθυμητό μέγεθος μπορούν να παρασκευασθούν με διάφορες μεθόδους όπως είναι η απομάκρυνση απορρυπαντικού, η μέθοδος εξάτμισης ανάστροφης φάσης και η μέθοδος κύκλων ψύξης απόψυξης. Τα λιποσώματα αυτά θεωρούνται κατάλληλα για εγκλωβισμό υδατοδιαλυτών ενώσεων αν και η παρουσία μιας και μόνο λιπιδικής μεμβράνης έχει ως συνέπεια μικρότερη μηχανική σταθερότητα και συγκράτηση της ουσίας σε σχέση με τα MLVs. Εντούτοις αυτός ο τύπος λιποσωμάτων κρίνεται αρκετά κατάλληλος για την ενεργή φόρτωση ιονιζόμενων μορίων. 1.1.3.1.2.2. Μικρά Μονοστιβαδιακά Λιποσώματα (Small Unilamellar Vesicles, SUVs) Τα SUV λιποσώματα αποτελούνται μόνο από μία διπλοστιβάδα και έχουν διάμετρο από 20 έως 100nm. Διαθέτουν το μικρότερο δυνατό μέγεθος στο οποίο τα φωσφολιπίδια δύναται να οργανωθούν σε λιποσωμική μορφή. Η δυνατότητα αυτή εξαρτάται από την ιονική ισχύ του διαλύματος των φωσφολιπιδίων και από τη λιπιδική σύσταση των μεμβρανών. Πρόκειται για θερμοδυναμικά ασταθή λιποσώματα που είναι επιρρεπή σε συσσωμάτωση και σύντηξη, ιδίως κάτω από τη θερμοκρασία μετάπτωσης. Οι μέθοδοι παρασκευής SUV λιποσωμάτων είναι η κατεργασία MLV λιποσωμικών διασπορών με υπέρηχους και η μέθοδος διαδοχικών κύκλων ψύξης - απόψυξης. Άλλες μέθοδοι είναι: η ένεση λιπιδίων και η εξώθηση διαμέσου φίλτρων. (10) 30

Εικόνα 11: Διατομή ενός μονοστιβαδιακού λιποσώματος. (20) Οι υδατοδιαλυτές ενώσεις μπορούν να εγκλωβισθούν, όπως φαίνεται στην εικόνα 11, στον υδατικό πυρήνα ή να συνδεθούν στην εξωτερική επιφάνεια. Οι λιπόφιλες ενώσεις μπορούν να ενσωματωθούν στη διπλοστιβάδα. Στα φθορίζοντα λιποσώματα οι φθορίζουσες ενώσεις είναι εγκλωβισμένες στο εσωτερικό ή/και συνδεδεμένες στην επιφάνειά τους (σήμανση F). 1.1.3.1.3. Πολυδιαμερισματικά Λιποσώματα (Multivesicular) Είναι μεγάλα πολυστιβαδιακά λιποσώματα που φέρουν στο εσωτερικό τους μικρότερα λιποσώματα με ποικιλία μεγεθών και αριθμού στιβάδων. Το μέγεθός τους κυμαίνεται από 2 έως 40 μm. Επιλογή κατάλληλων συνθηκών παρασκευής ή/και επιπλέον επεξεργασία έτοιμων πολυδιαμερισματικών λιποσωμάτων, με σκοπό την επίτευξη ομοιογενούς πληθυσμούς κυστιδίων, μπορεί να οδηγήσει σε περαιτέρω αύξηση ή μείωση της διαμέτρου χωρίς όμως να χάνεται ο πολυδιαμερισματικός χαρακτήρας των λιποσωμάτων. (21) 31

Εικόνα 12: Σχηματική απεικόνιση πολυδιαμερισματικού λιποσώματος, D. V. Swaay, A. demello, Lab on a Chip, 5, 2013 (19). 1.1.3.2. Ταξινόμηση με βάση τον τρόπο δράσης και τις εφαρμογές τους Ένα από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα των λιποσωμικών συστημάτων είναι η δυνατότητα μεταβολής των δομικών και φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών. Η ευελιξία αυτή επιτρέπει την τροποποίηση της in vivo συμπεριφοράς τους και το σχεδιασμό διάφορων λιποσωμικών μορφών ανάλογα με τις θεραπευτικές ανάγκες. Με βάση τη σύνθεσή τους και την επιθυμητή in vivo εφαρμογή τους, τα λιποσώματα διακρίνονται σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες οι οποίες παρουσιάζονται σχηματικά στην εικόνα 13. (6, 7, 18) Εικόνα 13: Σχηματική απεικόνιση διαφόρων τύπων λιποσωμάτων. 32

1.1.3.2.1. Συμβατικά Λιποσώματα (Conventional liposomes) Διαθέτουν τη βασική και απλούστερη δομή λιποσωμάτων. Αποτελούνται μόνο από φωσφολιπίδια (ουδέτερα ή/και αρνητικά φορτισμένα) παρουσία ή απουσία χοληστερόλης. Πρόκειται για την πλέον χρησιμοποιούμενη κατηγορία λιποσωμάτων όσον αφορά την μεταφορά βιοδραστικών ενώσεων. Διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικοχημικές τους ιδιότητες όπως το μέγεθος, τη λιπιδική τους σύσταση, το επιφανειακό φορτίο και τον αριθμό και τη ρευστότητα των λιπιδικών διπλοστιβάδων. Το κύριο μειονέκτημα αυτού του τύπου λιποσωμάτων είναι ο σχετικά μικρό χρόνος κυκλοφορίας στο αίμα. Όταν χορηγούνται in vivo (συνήθως με ενδοφλέβια ένεση) έχουν τη τάση να συσσωματώνονται με αποτέλεσμα να γίνονται ορατά από τα φαγοκύτταρα του μονοπυρηνικού συστήματος φαγοκυττάρων γνωστό επίσης και ως δικτυοενδοθηλιακό συστήμα (RES). Τα κύρια όργανα συσσώρευσης είναι το ήπαρ και η σπλήνα. Η ανωτέρω in vivo συμπεριφορά καθιστά τα λιποσώματα ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη διάθεση βιοδραστικών ενώσεων σε μολυσμένα μακροφάγα. Τέλος τα συμβατικά λιποσώματα βρίσκουν εφαρμογή στην μεταφορά αντιγόνων. Λιποσωμικά εμβόλια έχουν αποδειχθεί αποτελεσματικά κατά ιικών, βακτηριακών και παρασιτικών μολύνσεων καθώς επίσης και εναντίων όγκων. 1.1.3.2.2. Λιποσώματα Μακράς Κυκλοφορίας (Long Circulating, Stealth or Sterically Stabilized Liposomes) Τα λιποσώματα αυτά αναφέρονται επίσης ως αόρατα (stealth) ή στερεοχημικώς σταθεροποιημένα. Ο χαρακτηρισμός stealth αναφέρεται στην ικανότητά τους να διαφεύγουν των μακροφάγων του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος. Ο δεύτερος χαρακτηρισμός αφορά τον μηχανισμό στερεοχημικής σταθεροποίησης τους που είναι υπεύθυνος για την αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας. Η σταθερότητά τους οφείλεται στο τοίχωμα που περιβάλλει τα λιποσώματα και αποτελείται από υδρόφιλα πολυμερή μακράς αλυσίδας. Το περίβλημα αυτό αποτρέπει τις αλληλεπιδράσεις με μόρια και κυτταρικά συστατικά του βιολογικού περιβάλλοντος κυρίως πρωτεΐνες, όπως οι οψονίνες, μειώνοντας έτσι την κάθαρσή τους από τα κύτταρα του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος. Το πιο ενδιαφέρον χαρακτηριστικό αυτού του τύπου των λιποσωμάτων είναι ότι διαθέτουν την ικανότητα να εξέρχονται της κυκλοφορίας σε περιοχές με αυξημένη διαπερατότητα του αγγειακού τοιχώματος. Ταυτόχρονα παθολογικές περιοχές όπως συμπαγής όγκοι και φλεγμονές αιματώνονται από τριχοειδή αυξημένης διαπερατότητας. Συνεπώς τα λιποσώματα αυτά αποτελούν σημαντικό εργαλείο χορήγησης αντικαρκινικών και αντιφλεγμονωδών ουσιών. 33

Εικόνα 14: Σχηματική απεικόνιση ενός στερεοχημικά σταθεροποιημένου μονοστιβαδιακού λιποσώματος. Η επικάλυψη με PEG επιτρέπει στα λιποσώματα να αποφεύγουν τα φαγοκύτταρα αυξάνοντας το χρόνο ημιζωής του σκευάσματος στο σώμα. Σήμερα ο πιο δημοφιλής τρόπος παρασκευής λιποσωμάτων μακράς κυκλοφορίας είναι η ομοιοπολική σύνδεση του πολυμερούς πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) στην εξωτερική τους επιφάνεια (εικόνα 14). Το πάχος και η αποτελεσματικότητα της στιβάδας προστασίας που προσφέρει το PEG εξαρτάται από το μοριακό βάρος του χρησιμοποιούμενου πολυμερούς καθώς και από τη συγκέντρωσή του στην επιφάνεια του κυστιδίου. Η επικάλυψη με PEG μπορεί να επιτευχθεί είτε με προσθήκη συμπλόκου PEG-λιπιδίου στο μίγμα των λιπιδίων κατά την διάρκεια παρασκευής των λιποσωμάτων, είτε με σύζευξη του PEG σε προπαρασκευασμένα λιποσώματα (1, 22). Οι περισσότερες μέθοδοι σύζευξης PEG με λιπίδια περιλαμβάνουν τον σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού (23) και οι φυσικές ιδιότητες του συμπλόκου είναι παρόμοιες με αυτές των επιφανειοδραστικών ενώσεων. Η περιεκτικότητα της λιπιδικής μεμβράνης σε τέτοια σύμπλοκα είναι καίριας σημασίας καθότι σημαντική αύξηση του ποσοστού του συμπλόκου μπορεί να αποσταθεροποιήσει τον σχηματισμό διπλοστιβάδων (1, 24). 1.1.3.2.3. Ανοσολιποσώματα (Immunoliposomes) Διαθέτουν ειδικά αντισώματα ή τμήματα αντισωμάτων (Fab ή αντισώματα μονής αλυσίδας) στην επιφάνειά τους με σκοπό την στοχευμένη δράση τους σε περιοχές όπου υπερεκφράζονται οι αντίστοιχοι υποδοχείς. Παρουσιάζουν πολλές πιθανές θεραπευτικές εφαρμογές με την κυριότερη τη μεταφορά αντικαρκινικών παραγόντων. Όπως ισχύει και για 34

άλλα σωματίδια, είναι δύσκολο για τα ανοσολιποσώματα να εγκαταλείψουν την κυκλοφορία του αίματος σε άλλα σημεία πλην του ήπατος και του σπλήνα εάν έχουν μεγάλο μέγεθος, >200nm. Με σκοπό την καλύτερη προσέγγιση στους υποδοχείς επιχειρείται τοπική χορήγηση των λιποσωμάτων στις σωματικές κοιλότητες. 1.1.3.2.4. Κατιονικά Λιποσώματα (Cationic Liposomes) Αποτελούν μία σχετικά νέα κατηγορία λιποσωμάτων και βρίσκονται στο επίκεντρο της έρευνας για την μεταφορά γενετικού υλικού όπως πλασμίδια, RNA ή ολιγονουκλεοτίδια. Αποτελούν μια εναλλακτική στην χρήση ιικών φορέων Τα κατιονικά λιπίδια αλληλεπιδρούν και εξουδετερώνουν το αρνητικό φορτίο του DNA. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στην συμπύκνωση του DNA. Τα σύμπλοκα λιπιδίου-dna προστατεύουν το γενετικό υλικό και επάγουν την κυτταρική διείσδυση και τελικά την έκφραση του συμπυκνωμένου γενετικού υλικού. 1.1.3.2.5. Λιποσώματα που επάγουν τη σύντηξη (Fusogenic Liposomes) Τα λιποσώματα αυτά μπορούν να διευκολύνουν την ενδοκυττάρωση εγκλωβισμένων βιοδραστικών ενώσεων μέσω σύντηξής τους με τη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Υπάρχει πληθώρα μεθόδων παρασκευής τους μεταξύ των οποίων η χρήση λιπιδίων, όπως το DOPE, που είναι ικανά να προάγουν την αποσταθεροποίηση της διπλοστιβάδας και να προκαλούν φαινόμενα σύντηξης. Επιπλέον μπορούν να ενσωματωθούν στα λιποσώματα και πρωτεΐνες που επάγουν τη σύντηξη. Η μέχρι τώρα έρευνα έχει δείξει ότι η ενίσχυση της ικανότητας σύντηξης των λιποσωμάτων μπορεί να εφαρμοστεί προκειμένου να ενισχυθεί η αποτελεσματικότητα των λιποσωμάτων ως συστήματα μεταφοράς γενετικού υλικού. 1.1.3.2.6. Λιποσώματα ευαίσθητα στο ph Αποτελούνται από φωσφολιπίδια όπως φωσφατιδυλαιθανολαμίνη (PE) και διελαϋλοφωσφατιδυλοαιθανολαμίνη (DOPE). Σε χαμηλό ph ενώνονται με την κυτταρική μεμβράνη και ενδοκυτταρώνονται υπό τη μορφή ενδοσώματος. Τελικά απελευθερώνουν το περιεχόμενό τους στο κυτταρόπλασμα. Είναι κατάλληλα για ενδοκυτταρική μεταφορά ασθενών βάσεων και μακρομορίων. Η βιοκατανομή και η φαρμακοκινητική τους είναι ανάλογη με αυτή των συμβατικών λιποσωμάτων. 35