ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

Transcript

1 ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

2 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ 1. Μονοστιβάδες 2. Διπλοστιβάδες 3. Λιποσώματα 1.1 ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΕΣ Σχηματίζονται από μη-πολικά μόρια στη μεσόφαση αέρα/νερού Συσκευή μελέτης: Langmuir trough Μελέτη επιφάνειας (Α) και πλευρικής πίεσης (π) καμπύλη επιφάνειας-πίεσης Πληροφορίες για : -Ασυνέχειες λόγω μετάβασης φάσης -Σημείο κατάρρευσης Ελάχιστη επιφάνεια / μόριο Εφαρμογή: επιφανειοδραστικός παράγοντας των πνευμόνων

3 ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ μονομερές μονοστοιβάδα μικκύλιο κυστίδιο Κρίσιμη μικκυλιακή συγκέντρωση (CMC) Η συγκέντρωση πάνω από την οποία μία υδρόφοβη ουσία βρίσκεται υπό μορφή μικκυλίων

4 ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΜΙΚΥΛΛΙΩΝ Μη-πολική ουσία : Διάλυση σε υδατικό περιβάλλον, πάνω από κάποια συγκέντρωση δημιουργία ξεχωριστής φάσης Αμφίφιλα μόρια : Πολική & μη-πολική περιοχή Διάλυση σε υδατικό περιβάλλον, πάνω από κάποια συγκέντρωση δημιουργία ξεχωριστής φάσης (μικύλλια) λόγω ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων του νερού με την πολική κεφαλή Κρίσιμη Μικυλλιακή Συγκέντρωση : [C] στην οποία ποσοστό > 50 % της ουσίας βρίσκεται σε μορφή μικυλλίων Μορφές μικυλλίων : σφαιρικά, ραβδοειδή, διπλοστοιβάδες

5 ΛΙΠΙΔΙΑ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση (CMC): Η συγκέντρωση πάνω από την οποία η ουσία βρίσκεται υπό μορφή μικυλλίων

6 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

7 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

8 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

9 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

10 ΛΙΠΙΔΙΑ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Αναφέρεται στις δομές που υιοθετούν τα λιπίδια με την ενυδάτωσή τους

11 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Οι βασικότερες δομές είναι: Στιβαδωτή υγρή-κρυσταλλική φάση (lamellar liquid crystalline phase) (L α ) Στιβαδωτή κρυσταλλική φάση πηκτώματος (lamellar gelcrystalline phase) (L β ) Εξαγωνική φάση Ι (hexagonal I phase, Η Ι ) Εξαγωνική φάση ΙΙ (hexagonal II phase, Η Ι )

12 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ 1. X-ray diffraction Προσδιορισμός δομής υδατικών-λιπιδικών συστημάτων Επίδραση συγκέντρωσης λιπιδίων και θερμοκρασίας 2. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Αρχιτεκτονική λιπιδικής φάσης (L α, L β, Η II ) Εξέταση λιπιδικών σωματιδίων (lipidic particles) Σύστημα δυαδικών λιπιδίων όπου το ένα λιπίδιο προτιμά δομή Η II και το άλλο σχηματίζει διπλοστοιβάδα (ανάστροφα μικύλλια σε βιολογικές μεμβράνες) P-NMR Χαρακτηρισμός δομικών ιδιοτήτων ένυδρων λιπιδίων Μελέτη προσανατολισμού και δυναμικής πολικής κεφαλής φωσφολιπιδίων

13 ΜΙΓΜΑΤΑ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Φωσφολιπίδια / Χοληστερόλη

14 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ Περίθλαση ακτίνων Χ 31 P-NMR Ηλεκτρονική μικροσκοπία (freeze fracture electron microscopy)

15 Δυνάμεις: Van der Waals (ασθενείς), ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΛΙΠΙΔΙΚΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ Δεσμοί υδρογόνου (ενδιάμεσης ισχύος), Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (ισχυρές): Η μη ευνοϊκή αλληλεπίδραση μεταξύ νερού και μη πολικής ουσίας που αποβλέπει στη μείωση της επαφής τους. Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις: Cl Δημιουργία κελύφους από μόρια νερού Προσανατολισμός: Μη ευνοϊκός από άποψη εντροπίας και Ευνοϊκός λόγω ισχυρών ηλεκτροστατικών δυνάμεων. Καθαρή μεταβολή ενέργειας ευνοϊκή Μη-πολική ουσία Δημιουργία κελύφους από μόρια νερού Προσανατολισμός: Μη ευνοϊκός από άποψη εντροπίας και Μη Ευνοϊκός λόγω ασθενών ηλεκτροστατικών δυνάμεων Καθαρή μεταβολή ενέργειας μη ευνοϊκή

16 ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΑ ΣΤΑΘΕΡΕΣ ΔΟΜΕΣ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑΤΩΝ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΛΙΠΙΔΙΑ ΦΑΣΗ ΜΟΡΙΑΚΟ ΣΧΗΜΑ ν / l S o Λυσοφωσφολιπίδια Απορρυπαντικά Μικύλλιο Ανάστροφος κώνος < 1 / 3: σφαίρα 1 / 3 1 / 2: ράβδοι, Σφαιρικά σχήματα PC, PS, PI, CL, Sph, PA Διπλοστοιβάδα Κύλινδρος 1 / 2-1 CL-Ca 2+ PS (ph < 4.0) PA (ph < 3.0) Η II ΕΞΑΓΩΝΙΚΗ ΔΟΜΗ Κώνος > 1

17 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΣΤΟ ΠΑΧΟΣ ΚΑΙ ΣΤΟ ΣΧΗΜΑ ΤΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ

18

19

20

21 ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Μεταβατικές καταστάσεις Συμπεριφορά φάσης: Ανάλογα με τη θερμοκρασία, τα λιπίδια περνούν από τη μεταβατική κατάσταση πηκτώματος (gel) στην υγρή-κρυσταλλική (liquid-crystal) φάση.

22 ΜΕΤΑΒΑΤΙΚΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ (TRANSITION STATES) Ο όρος αναφέρεται στις μεταβολές της φυσικής κατάστασης πολυμορφικών λιπιδίων Λιπίδια σε μορφή συσσωματωμάτων Κατά τη μετάβαση από τη φάση L β στην L α υπάρχει μια ενδιάμεση φάση (Ρ β ) Μετάβαση από L β σε Ρ β προ-μετάβαση Μετάβαση από Ρ β σε L α κύρια μετάβαση Μελέτη αλλαγών φυσικής κατάστασης πολυμορφικών λιπιδίων γίνεται με την τεχνική της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης, Differential Scanning Calorimetry (DSC)

23 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY

24 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY ΜΕΤΑΒΑΣΗ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΣ ΤΗΞΗ

25 ΜΕΤΑΒΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ (transition state) Α. Σχήματα διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης Β. Μοριακή οργάνωση φωσφολιπιδίων

26 1. Η μεταβατική θερμοκρασία εξαρτάται από το είδος των ακυλομάδων 2. Λιπίδια με πολικά άκρα που καταλαμβάνουν μεγάλη επιφάνεια περνάνε και από μια προ-μεταβατική φάση 3. Η κορεσμένη φωσφατιδυλαιθανολαμίνη έχει σημείο τήξεως 20º C μεγαλύτερο αυτού της φωσφατιδυλοχολίνης λόγω δεσμών υδρογόνου 4. Η διαφορά αυτή μειώνεται σημαντικά με την παρουσία στις ακυλομάδες cis-διπλών δεσμών 5. Φωσφολιπίδια με διαφορετικά πολικά άκρα έχουν παρόμοιες μεταβατικές φάσεις 6. Φορτισμένα λιπίδια είναι ευαίσθητα σε δυνάμεις ιοντισμού, ph και δισθενή κατιόντα 7. Πίεση επιφέρει μετάβαση φάσης

27 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΕΣ ΜΕ ΤΙΣ ΔΟΜΕΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΕΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΥΠΟΣΤΗΡΙΓΜΑΤΑ Μελέτη ενζύμων, πρωτεϊνών/διαύλων ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΕΣ Μελέτη πόρων, καναλιών και πρωτεϊνών που βοηθούν στην μεταφορά φορτίου Bimolecular lipid membranes (BLM) Patch-pipet ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΕΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΥΠΟΣΤΗΡΙΓΜΑΤΑ Μελέτη φυσικοχημικών ιδιοτήτων λιπιδίων και μεμβρανικών πρωτεϊνών

28 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ 1. Μονοστιβάδες 2. Διπλοστιβάδες 3. Λιποσώματα 1.1 ΜΟΝΟΣΤΟΙΒΑΔΕΣ ΑΕΡΑ-ΥΔΑΤΟΣ Κυρίως μη-πολικά μόρια Langmuir trough : Μέτρηση επιφάνειας (Α) και πλευρικής πίεσης (π) καμπύλη επιφάνειας-πίεσης Πληροφορίες για : -Ασυνέχεια λόγω μετάβασης φάσης -Σημείο κατάρρευσης Ελάχιστη επιφανεια / μόριο

29 LANGMUIR TROUGH (Αύλαξ Langmuir) Ζυγός Wilhelmy ΣΥΜΠΙΕΣΗ ΥΓΡΟΥ (LC) LC - LE ΕΠΕΚΤΑΣΗ ΥΓΡΟΥ (LE) Ε Π Ι Φ Α Ν Ε Ι Α

30 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ PATCH PIPET BIMOLECULAR LIPID MEMBRANES

31

32 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

33 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΩΝ / ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΩΝ Black lipid membranes Διπλοστοιβάδες

34 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΓΛΥΚΙΝΗ

35 ΛΙΠΙΔΙΑ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

36 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΜΟΝΤΕΛΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠ0 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ,ΚΑΘΑΡΙΣΜΟ & ΧΗΜΙΚΟ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟ Λιποσώματα / MLV (Multilamellar vesicles) Μόνο το 10% των λιπιδίων στην εξωτερική μεμβράνη

37 ΑΝΑΛΥΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Χαρακτηριστικές αντιδράσεις Ήπια αλκαλική υδρόλυση Οξινη υδρόλυση Φωσφολιπάσες

38 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ & ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΤΥΠΟ ΛΙΠΙΔΙΟΥ Εκχύλιση κατά Bligh & Dyer Απομόνωση λιπιδίων, πιο διαδεδομένη Χρωματογραφία στήλης Απομόνωση ενός μόνο τύπου λιπιδίων Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Ανίχνευση Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης κανονικής φάσης Γρήγορη, μεγάλες ποσότητες Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ανάστροφης φάσης Απομόνωση λιπιδίων ίδιας κατηγορίας σύμφωνα με το μήκος της αλυσίδας τους

39 Ανάλυση και ταυτοποίηση μεμβρανικών λιπιδίων Εκχύλιση (συστήματα μη πολικά) Διαχωρισμός - TLC - np ή rp-hplc με διάφορους ανιχνευτές), - GC με διάφορους ανιχνευτές Ταυτοποίηση (MS)

40 GLC

41 HPLC

42

43

44

45

46

47 ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

48 ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ

49 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ 1. Μονοστιβάδες 2. Διπλοστιβάδες 3. Λιποσώματα 1.1 ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΕΣ Σχηματίζονται από μη-πολικά μόρια στη μεσόφαση αέρα/νερού Συσκευή μελέτης: Langmuir trough Μελέτη επιφάνειας (Α) και πλευρικής πίεσης (π) καμπύλη επιφάνειας-πίεσης Πληροφορίες για : -Ασυνέχειες λόγω μετάβασης φάσης -Σημείο κατάρρευσης Ελάχιστη επιφάνεια / μόριο Εφαρμογή: επιφανειοδραστικός παράγοντας των πνευμόνων

50 ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ μονομερές μονοστοιβάδα μικκύλιο κυστίδιο Κρίσιμη μικκυλιακή συγκέντρωση (CMC) Η συγκέντρωση πάνω από την οποία μία υδρόφοβη ουσία βρίσκεται υπό μορφή μικκυλίων

51 ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑ ΜΙΚΥΛΛΙΩΝ Μη-πολική ουσία : Διάλυση σε υδατικό περιβάλλον, πάνω από κάποια συγκέντρωση δημιουργία ξεχωριστής φάσης Αμφίφιλα μόρια : Πολική & μη-πολική περιοχή Διάλυση σε υδατικό περιβάλλον, πάνω από κάποια συγκέντρωση δημιουργία ξεχωριστής φάσης (μικύλλια) λόγω ευνοϊκών αλληλεπιδράσεων του νερού με την πολική κεφαλή Κρίσιμη Μικυλλιακή Συγκέντρωση : [C] στην οποία ποσοστό > 50 % της ουσίας βρίσκεται σε μορφή μικυλλίων Μορφές μικυλλίων : σφαιρικά, ραβδοειδή, διπλοστοιβάδες

52 ΛΙΠΙΔΙΑ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ Κρίσιμη μικυλλιακή συγκέντρωση (CMC): Η συγκέντρωση πάνω από την οποία η ουσία βρίσκεται υπό μορφή μικυλλίων

53 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

54 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

55 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

56 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

57 ΛΙΠΙΔΙΑ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Αναφέρεται στις δομές που υιοθετούν τα λιπίδια με την ενυδάτωσή τους

58 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Οι βασικότερες δομές είναι: Στιβαδωτή υγρή-κρυσταλλική φάση (lamellar liquid crystalline phase) (L α ) Στιβαδωτή κρυσταλλική φάση πηκτώματος (lamellar gelcrystalline phase) (L β ) Εξαγωνική φάση Ι (hexagonal I phase, Η Ι ) Εξαγωνική φάση ΙΙ (hexagonal II phase, Η Ι )

59 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ 1. X-ray diffraction Προσδιορισμός δομής υδατικών-λιπιδικών συστημάτων Επίδραση συγκέντρωσης λιπιδίων και θερμοκρασίας 2. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Αρχιτεκτονική λιπιδικής φάσης (L α, L β, Η II ) Εξέταση λιπιδικών σωματιδίων (lipidic particles) Σύστημα δυαδικών λιπιδίων όπου το ένα λιπίδιο προτιμά δομή Η II και το άλλο σχηματίζει διπλοστοιβάδα (ανάστροφα μικύλλια σε βιολογικές μεμβράνες) P-NMR Χαρακτηρισμός δομικών ιδιοτήτων ένυδρων λιπιδίων Μελέτη προσανατολισμού και δυναμικής πολικής κεφαλής φωσφολιπιδίων

60 ΜΙΓΜΑΤΑ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Φωσφολιπίδια / Χοληστερόλη

61 ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ Περίθλαση ακτίνων Χ 31 P-NMR Ηλεκτρονική μικροσκοπία (freeze fracture electron microscopy)

62 Δυνάμεις: Van der Waals (ασθενείς), ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΛΙΠΙΔΙΚΟΥ ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΥ Δεσμοί υδρογόνου (ενδιάμεσης ισχύος), Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (ισχυρές): Η μη ευνοϊκή αλληλεπίδραση μεταξύ νερού και μη πολικής ουσίας που αποβλέπει στη μείωση της επαφής τους. Υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις: Cl Δημιουργία κελύφους από μόρια νερού Προσανατολισμός: Μη ευνοϊκός από άποψη εντροπίας και Ευνοϊκός λόγω ισχυρών ηλεκτροστατικών δυνάμεων. Καθαρή μεταβολή ενέργειας ευνοϊκή Μη-πολική ουσία Δημιουργία κελύφους από μόρια νερού Προσανατολισμός: Μη ευνοϊκός από άποψη εντροπίας και Μη Ευνοϊκός λόγω ασθενών ηλεκτροστατικών δυνάμεων Καθαρή μεταβολή ενέργειας μη ευνοϊκή

63 ΘΕΡΜΟΔΥΝΑΜΙΚΑ ΣΤΑΘΕΡΕΣ ΔΟΜΕΣ ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑΤΩΝ ΦΩΣΦΟΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΕ ΥΔΑΤΙΚΟ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝ ΛΙΠΙΔΙΑ ΦΑΣΗ ΜΟΡΙΑΚΟ ΣΧΗΜΑ ν / l S o Λυσοφωσφολιπίδια Απορρυπαντικά Μικύλλιο Ανάστροφος κώνος < 1 / 3: σφαίρα 1 / 3 1 / 2: ράβδοι, Σφαιρικά σχήματα PC, PS, PI, CL, Sph, PA Διπλοστοιβάδα Κύλινδρος 1 / 2-1 CL-Ca 2+ PS (ph < 4.0) PA (ph < 3.0) Η II ΕΞΑΓΩΝΙΚΗ ΔΟΜΗ Κώνος > 1

64 ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΣΤΟ ΠΑΧΟΣ ΚΑΙ ΣΤΟ ΣΧΗΜΑ ΤΗΣ ΛΙΠΙΔΙΚΗΣ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ

65

66

67

68 ΦΥΣΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Μεταβατικές καταστάσεις Συμπεριφορά φάσης: Ανάλογα με τη θερμοκρασία, τα λιπίδια περνούν από τη μεταβατική κατάσταση πηκτώματος (gel) στην υγρή-κρυσταλλική (liquid-crystal) φάση.

69 ΜΕΤΑΒΑΤΙΚΕΣ ΦΑΣΕΙΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ (TRANSITION STATES) Ο όρος αναφέρεται στις μεταβολές της φυσικής κατάστασης πολυμορφικών λιπιδίων Λιπίδια σε μορφή συσσωματωμάτων Κατά τη μετάβαση από τη φάση L β στην L α υπάρχει μια ενδιάμεση φάση (Ρ β ) Μετάβαση από L β σε Ρ β προ-μετάβαση Μετάβαση από Ρ β σε L α κύρια μετάβαση Μελέτη αλλαγών φυσικής κατάστασης πολυμορφικών λιπιδίων γίνεται με την τεχνική της διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης, Differential Scanning Calorimetry (DSC)

70 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY

71 DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY ΜΕΤΑΒΑΣΗ ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΣ ΤΗΞΗ

72 ΜΕΤΑΒΑΤΙΚΗ ΦΑΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ (transition state) Α. Σχήματα διαφορικής θερμιδομετρίας σάρωσης Β. Μοριακή οργάνωση φωσφολιπιδίων

73 1. Η μεταβατική θερμοκρασία εξαρτάται από το είδος των ακυλομάδων 2. Λιπίδια με πολικά άκρα που καταλαμβάνουν μεγάλη επιφάνεια περνάνε και από μια προ-μεταβατική φάση 3. Η κορεσμένη φωσφατιδυλαιθανολαμίνη έχει σημείο τήξεως 20º C μεγαλύτερο αυτού της φωσφατιδυλοχολίνης λόγω δεσμών υδρογόνου 4. Η διαφορά αυτή μειώνεται σημαντικά με την παρουσία στις ακυλομάδες cis-διπλών δεσμών 5. Φωσφολιπίδια με διαφορετικά πολικά άκρα έχουν παρόμοιες μεταβατικές φάσεις 6. Φορτισμένα λιπίδια είναι ευαίσθητα σε δυνάμεις ιοντισμού, ph και δισθενή κατιόντα 7. Πίεση επιφέρει μετάβαση φάσης

74 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΕΣ ΜΕ ΤΙΣ ΔΟΜΕΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΕΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΥΠΟΣΤΗΡΙΓΜΑΤΑ Μελέτη ενζύμων, πρωτεϊνών/διαύλων ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΕΣ Μελέτη πόρων, καναλιών και πρωτεϊνών που βοηθούν στην μεταφορά φορτίου Bimolecular lipid membranes (BLM) Patch-pipet ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΕΣ ΣΕ ΣΤΕΡΕΑ ΥΠΟΣΤΗΡΙΓΜΑΤΑ Μελέτη φυσικοχημικών ιδιοτήτων λιπιδίων και μεμβρανικών πρωτεϊνών

75 ΜΟΝΤΕΛΑ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΣΥΣΤΗΜΑΤΩΝ 1. Μονοστιβάδες 2. Διπλοστιβάδες 3. Λιποσώματα 1.1 ΜΟΝΟΣΤΟΙΒΑΔΕΣ ΑΕΡΑ-ΥΔΑΤΟΣ Κυρίως μη-πολικά μόρια Langmuir trough : Μέτρηση επιφάνειας (Α) και πλευρικής πίεσης (π) καμπύλη επιφάνειας-πίεσης Πληροφορίες για : -Ασυνέχεια λόγω μετάβασης φάσης -Σημείο κατάρρευσης Ελάχιστη επιφανεια / μόριο

76 LANGMUIR TROUGH (Αύλαξ Langmuir) Ζυγός Wilhelmy ΣΥΜΠΙΕΣΗ ΥΓΡΟΥ (LC) LC - LE ΕΠΕΚΤΑΣΗ ΥΓΡΟΥ (LE) Ε Π Ι Φ Α Ν Ε Ι Α

77 ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ PATCH PIPET BIMOLECULAR LIPID MEMBRANES

78

79 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ

80 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΔΙΠΛΟΣΤΙΒΑΔΩΝ / ΜΟΝΟΣΤΙΒΑΔΩΝ Black lipid membranes Διπλοστοιβάδες

81 BIOXHMEIA, TOMOΣ I ΠANEΠIΣTHMIAKEΣ EKΔOΣEIΣ KPHTHΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΛΙΠΟΣΩΜΑΤΩΝ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΓΛΥΚΙΝΗ

82 ΛΙΠΙΔΙΑ ΩΣ ΦΟΡΕΙΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΟΥΣΙΩΝ

83 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΔΗΜΙΟΥΡΓΙΑΣ ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΩΝ ΜΟΝΤΕΛΩΝ ΜΕΤΑ ΑΠ0 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ,ΚΑΘΑΡΙΣΜΟ & ΧΗΜΙΚΟ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟ Λιποσώματα / MLV (Multilamellar vesicles) Μόνο το 10% των λιπιδίων στην εξωτερική μεμβράνη

84 ΑΝΑΛΥΣΗ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Χαρακτηριστικές αντιδράσεις Ήπια αλκαλική υδρόλυση Οξινη υδρόλυση Φωσφολιπάσες

85 ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ & ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗ ΤΕΧΝΙΚΗ ΓΙΑ ΚΑΘΕ ΤΥΠΟ ΛΙΠΙΔΙΟΥ Εκχύλιση κατά Bligh & Dyer Απομόνωση λιπιδίων, πιο διαδεδομένη Χρωματογραφία στήλης Απομόνωση ενός μόνο τύπου λιπιδίων Χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας Ανίχνευση Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης κανονικής φάσης Γρήγορη, μεγάλες ποσότητες Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης ανάστροφης φάσης Απομόνωση λιπιδίων ίδιας κατηγορίας σύμφωνα με το μήκος της αλυσίδας τους

86 Ανάλυση και ταυτοποίηση μεμβρανικών λιπιδίων Εκχύλιση (συστήματα μη πολικά) Διαχωρισμός - TLC - np ή rp-hplc με διάφορους ανιχνευτές), - GC με διάφορους ανιχνευτές Ταυτοποίηση (MS)