Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Τεχνολόγων Ιατρικών Εργαστηρίων ΤΕΤΡΑΔΙΟ ΑΣΚΗΣΕΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΓΕΝΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ ΕΠΙΘΕΤΟ ΣΠΟΥΔΑΣΤΗ: ΟΝΟΜΑ ΣΠΟΥΔΑΣΤΗ: ΕΞΑΜΗΝΟ: A.M.:
2
Αναλύσεις σπέρματος (1) Φυσικοί χαρακτήρες Μέτρηση κινητικότητας Προσδιορισμός συγκολλήσεων, συσσωρεύσεων και στρογγυλών κυττάρων Ημερομηνία: Ονοματεπώνυμο κατόχου δείγματος:. Φυσικοί χαρακτήρες ph:.. (Τιμή αναφοράς: > 7,2) Χροιά:. (Τιμή αναφοράς: Φαίον ιριδίζον) Οσμή:. (Τιμή αναφοράς: Ιδιάζουσα) Ρευστότητα:. (Τιμή αναφοράς: 20 60 min) Γλοιότητα:. (Τιμή αναφοράς: φυσιολογική) Όγκος:.(Τιμή αναφοράς: > 1,5 ml) Στάδια προσδιορισμού κινητικότητας 1. Προθερμάνετε αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες 2. Πάνω σε καθαρή αντικειμενοφόρο πλάκα να μεταφέρετε 10 μl σπέρματος 3. Βάλτε από πάνω καλυπτρίδα 22 x 22 mm 4. Περιμένετε ένα λεπτό να σταθεροποιηθεί το οπτικό πεδίο. 5. Μικροσκοπήστε με φακό αντίθετης φάσης. Κινητικότητα Κινητικότητα Σύνολο μετρημένων σπερματοζωαρίων Αριθμός σπερ/ίων (1 η και 2 η μέτρηση) Ποσοστό% Τιμή αναφοράς Προωθητική >32% Μη προωθητική Ακίνητα Σύνολο προωθητικής >50% 3
Σύνολο κινούμενης Υπάρχουν συγκολλήσεις: Καθόλου Λίγες Πολλές Πάρα πολλές Υπάρχουν συσσωρεύσεις: Καθόλου Λίγες Πολλές Πάρα πολλές Υπάρχουν στρογγυλά κύτταρα: Ναι Όχι Eλέξτε την ορθότητα των μετρήσεων της κινητικότητας χρησιμοποιώντας τον παρακάτω πίνακα. Διαλέξτε την κινητικότητα με το μεγαλύτερο ποσοστό και συγκρίνεται τις δύο μετρήσεις σας: Εύρος μέσου όρου (%) Οριακή διαφορά των δύο μετρήσεων 0 1 1 2 02 03 3 04-06 4 07-09 5 10-13 6 14-19 7 20-27 8 28-44 9 45-55 10 56-72 9 73-80 8 81-86 7 87-90 6 91-93 5 94-96 4 97-98 3 99 2 100 1 Aν η διαφορά σας είναι μεγαλύτερη από αυτή στον πίνακα να επαναλάβετε τις δύο μετρήσεις. 4
Αναλύσεις σπέρματος (2) Φυσικοί χαρακτήρες Μέτρηση κινητικότητας Μέτρηση αριθμού σπερματοζωαρίων Ημερομηνία: Ονοματεπώνυμο κατόχου δείγματος:. Φυσικοί χαρακτήρες ph:.. (Τιμή αναφοράς: > 7,2) Χροιά:. (Τιμή αναφοράς: Φαίον ιριδίζον) Οσμή:. (Τιμή αναφοράς: Ιδιάζουσα) Ρευστότητα:. (Τιμή αναφοράς: 20 60 min) Γλοιότητα:. (Τιμή αναφοράς: φυσιολογική) Όγκος:.(Τιμή αναφοράς: > 1,5 ml) Κινητικότητα Κινητικότητα Αριθμός σπερ/ίων Ποσοστό Τιμή αναφοράς Σύνολο μετρημένων σπερματοζωαρίων Προωθητική >32% Μη προωθητική Ακίνητα Σύνολο προωθητικής >40% Σύνολο κινούμενης Υπάρχουν συγκολλήσεις: Καθόλου Λίγες Πολλές Πάρα πολλές Υπάρχουν συσσωρεύσεις: Καθόλου Λίγες Πολλές Πάρα πολλές Υπάρχουν στρογγυλά κύτταρα: Ναι Όχι 5
Eλέξτε την ορθότητα των μετρήσεων της κινητικότητας χρησιμοποιώντας τον παρακάτω πίνακα. Εύρος μέσου όρου (%) Οριακή διαφορά των δύο μετρήσεων 0 1 1 2 02 03 3 04-06 4 07-09 5 10-13 6 14-19 7 20-27 8 28-44 9 45-55 10 56-72 9 73-80 8 81-86 7 87-90 6 91-93 5 94-96 4 97-98 3 99 2 100 1 Προεργασία για μέτρηση σε πλάκα Neubauer Μέτρηση αριθμού σπερματοζωαρίων σε τέσσερα οπτικά πεδία: 1.. 2.. 3 4. Υπολογισμός αραίωσης με βάση τον πίνακα Σπερματοζωάρια κ.ο.π. με φακό 40Χ Αραίωση Δείγμα (μl) Διαλύτης (μl) Ελάχιστα σπερματοζωάρια 1 : 1 (1 + 1) 100 100 < 15 1 : 5 (1 + 4) 100 400 15 40 1 : 10 (1 + 9) 50 450 40 200 1 : 20 (1 + 19) 50 950 > 200 1 : 50 (1 + 49) 50 2450 6
Μέτρηση σπερματοζωαρίων στο άνω αριστερό τετράγωνο των τετραγώνων της πλάκας Neubauer. Αφού υπολογίσετε τον αριθμό των σπερματοζωαρίων στο άνω αριστερό τετράγωνο υπολογίστε τον αριθμό των τετραγώνων που θα μετρήσετε σε κάθε πλέγμα της πλάκας Neubauer χρησιμοποιώντας τον παρακάτω πίνακα. Σπερμ/ρια στο επάνω αριστερό τετράγωνο Τετράγωνα < 10 25 10 40 10 > 40 5 (4 ακριανά και κεντρικό) Γράψτε το σύνολο από τα δύο πλέγματα: 1... και 2. Διαιρέστε το άθροισμα και των δύο πλεγμάτων με τον συντελεστή που θα υπολογίσετε από τον παρακάτω πίνακα. Αραίωση Αριθμός τετραγώνων που μετρήθηκαν 25 10 5 1 / 2 100 40 20 1 / 5 40 16 8 1 / 10 20 8 4 1 / 20 10 4 2 1 / 50 4 1,6 0,8 7
Στρογγυλοποιήστε το πηλίκο με τον πλησιέστερο ακέραιο και κατόπιν υπολογίστε τον αριθμό που βρήκατε με το 1.000.000. Ο αριθμός που θα βρείτε είναι η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων. Συγκέντρωση:. Συνολικός αριθμός σπερματοζωαρίων (συγκέντρωση x όγκο):. 8
Aν η διαφορά σας είναι μεγαλύτερη από αυτή στον πίνακα να επαναλάβετε τις δύο μετρήσεις. Μέσος όρος αθροισμάτων Οριακή διαφορά των δύο μετρήσεων Μέσος όρος αθροισμάτων Οριακή διαφορά των δύο μετρήσεων 969 1000 61 206-218 28 938 968 60 190-205 27 907 937 59 176-189 26 876 906 58 163-175 25 846 875 57 150-162 24 817 845 56 138-149 23 788 816 55 126-137 22 760 787 54 115-125 21 732 759 53 105-114 20 704 731 52 94 104 19 678 703 51 85 93 18 651 677 50 76 84 17 625 650 49 67 75 16 600 624 48 59 66 15 576 599 47 52 58 14 551 575 46 44 51 13 528 550 45 38 43 12 504 527 44 32 37 11 482 503 43 27 31 10 376 395 38 22 26 9 357 375 37 17 21 8 338 356 36 13 16 7 319 337 35 10 12 6 301 318 34 7-9 5 284-300 33 5 6 4 267-283 32 3 4 3 251-266 31 2 2 235-250 30 1 1 219-234 29 9
Αναλύσεις σπέρματος (3) Προσδιορισμός ζωτικότητας και μορφολογίας Ημερομηνία: Ονοματεπώνυμο κατόχου δείγματος:. Για τον προσδιορισμό της ζωτικότητας των σπερματοζωαρίων συμπληρώστε τον παρακάτω πίνακα: Zωτικότητα (Τιμή αναφοράς: > 58%) Σύνολο μετρημένων σπερματοζωαρίων: Σύνολο ζωντανών σπερματοζωαρίων: Απάντηση: % Στάδια χρώσης ζωτικότητας 1. Mεταφέρετε σε αντικειμενοφόρο πλάκα 50 μl χρώσης και 50 μl σπέρματος 2. Αναμίξτε με ένα tip για 1 λεπτό. 3. Μεταφέρετε 10 μl από το μίγμα αυτό σε άλλη πλάκα και επιστρώστε. 4. Αφήστε να στεγνώσει η χρώση για λίγα λεπτά 5. Μικροσκοπήστε σε μεγέθυνση 40Χ σε φωτεινό πεδίο. Για τον προσδιορισμό της μορφολογίας συμπληρώστε τον παρακάτω πίνακα: Ανωμαλίες Αριθμός σπερ/ίων Ποσοστό Τιμή αναφοράς Φυσιολογικές μορφές > 4% Ανωμαλίες κεφαλής Ανωμαλίες αυχένα Ανωμαλίες ουράς 10
Κυτταροπλασματική σταγόνα Δείκτης τερατοσπερμίας (ΤΖΙ) (Φ. τιμή < 1,60):.. Σύνολο ανωμαλιών / (100 φυσιολογικά) Υπολογίστε τον αριθμό των στρογγυλών κυττάρων από τον παρακάτω τύπο: Τα φυσικά χαρακτηριστικά ενός υγιούς σπερματοζωαρίου Κεφαλή: ωοειδές σχήμα κεφαλής με μπροστινό τμήμα (ακρόσωμα) ανοιχτόχρωμο, 4 5 μm μήκος και 2,5 3,5 μm πλάτος. Η αναλογία μήκους προς πλάτος κεφαλής πρέπει να είναι 1,50 1,75 μm. Ακρόσωμα: Καταλαμβάνει το 40-70% της κεφαλής και μπορεί να έχει ένα πυρηνίσκο. Αυχένας: To πρώτο τμήμα της ουράς μετά την κεφαλή. Είναι παχύτερος μετά την ουρά (μέγιστο πάχος 1 μm και 7,0 8,0 μm μήκος ή μέχρι το διπλάσιο της κεφαλής). Ουρά: Συμμετρικά τοποθετημένη στη βάση της κεφαλής. Μόνο μια ουρά πρέπει να είναι προσκολλημένη (περίπου 45 μm μήκος), χωρίς να είναι περιελιγμένη, σπασμένη ή διπλωμένη γύρω από τον εαυτό της. 11
Τα στάδια της χρώσης Παπανικολάου Οινόπνευμα 50% - 10 εμβαπτίσεις ή 10 sec Αποσταγμένο νερό - 10 εμβαπτίσεις Χρωστική Αιματοξυλίνη Harris 3 λεπτά Νερό βρύσης 5 λεπτά Όξινη αιθανόλη 2 βυθίσματα Νερό βρύσης 5 λεπτά Αποσταγμένο νερό - 1 εμβάπτιση Οινόπνευμα 50% - 10 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 70% - 10 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 80% - 10 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 95% - 10 εμβαπτίσεις Χρωστική Orange (OG6) 2 λεπτά Οινόπνευμα 95% - 8 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 95% - 8 εμβαπτίσεις Χρωστική Εωσίνη (ΕΑ 50) 5 λεπτά Οινόπνευμα 95% - 8 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 95% - 8 εμβαπτίσεις Οινόπνευμα 98 99% - 2 λεπτά Επικόλληση καλυπτρίδας 24 x 60 mm με τη χρήση επικολλητικής ουσίας π.χ. entellan, mountex. 12
Αναλύσεις σπέρματος (4) Προσδιορισμός αντισπερματικών αντισωμάτων και πυοσφαιρίων Για τον προσδιορισμό του αριθμού των πυοσφαιρίων κάντε τους παρακάτω προσδιορισμούς: Σύνολο στρογγυλών κυττάρων (θα έχουν προσδιοριστεί με πλάκα Neubauer ή χρώση Παπανικολάου): Aριθμός σπερματοζωαρίων: Αριθμός πυοσφαιρίων ανά 100 στρογγυλά κύτταρα με την χρώση Leucoscreen:. Αριθμός πυοσφαιρίων/ml: (υπολογίστε με βάση τους προηγούμενους προσδιορισμούς) Τιμή αναφοράς < 1.000.000/mL Τα στάδια της χρώσης Leucoscreen To Kit αποτελείται από δύο αντιδραστήρια 1 και 2. Από αυτά θα πρέπει να φτιαχτεί ένα διάλυμα εργασίας το οποίο παραμένει σταθερό γα μία ημέρα. Προσθέτονται 30 μl του αντιδραστηρίου 2 σε 1 ml του αντιδραστηρίου 1. 1. Πάνω σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα προσθέτονται 10 μl σπέρματος και 10 μl αντιδραστηρίου εργασίας. 2. Ανάμιξη για ένα λεπτό 3. Επώαση για δύο λεπτά. 4. Κάλυψη του μίγματος με καλυπτρίδα 5. Νέα επώαση για δύο λεπτά 6. Μικροσκόπηση με μεγέθυνση 40Χ σε φωτεινό πεδίο. Για τον προσδιορισμό του ποσοστού των αντισπερματικών αντισωμάτων με την μέθοδο SPERMAR ακολουθήστε τα στάδια: 1. Προσθέστε 10 μl σπέρματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα. 2. Προσθέστε 10 μl ανοσομαγνητικών σφαιριδίων και αναμίξτε. 3. Προσθέστε 10 μl αντισωμάτων IgG και αναμίξτε. 4. Επικαλύψτε το μίγμα με καλυπτρίδα 24 x 50 mm 5. Μικροσκοπήστε σε μεγέθυνση 40X με φακό αντίθεσης φάσης. 13
6. Mετρήστε 200 κινούμενα σπερματοζωάρια και χωρίστε τα σε αυτά που κινούνται ελεύθερα και αυτά που είναι κολλημένα με τις μπίλιες στο κεφάλι τους και τον αυχένα. Αντισπερματικά αντισώματα Αρνητικό: < 10% Υπάρχει πιθανότητα υπογονιμότητας ανοσολογικής αιτίας: < 10 39% Πολύ μεγάλη πιθανότητα υπογονιμότητας ανοσολογικής αιτίας: < 40% Σύνολο κινούμενων σπερματοζωαρίων: Σύνολο κινούμενων σπερματοζωαρίων κολλημένων μεταξύ τους : Απάντηση: % 14
Παράρτημα Παρασκευή διαλυμάτων και χρώσεων Παρασκευή οινοπνευμάτων Αντιδραστήρια Απόλυτη αιθυλική αλκοόλη ή αιθυλική αλκοόλη διαφόρων βαθμών Αποσταγμένο νερό Συνταγή για δημιουργία οινοπνεύματος 70 ο από απόλυτη αιθυλική αλκοόλη A. Σε ογκομετρικό κύλινδρο π.χ. 1000 ml προσθέτουμε 700 ml απόλυτης αιθυλικής αλκοόλης. B. Συμπληρώνουμε στα 1000 ml με αποσταγμένο νερό. Συνταγή για δημιουργία οινοπνεύματος 70 ο από αλκοόλη 95 ο A. Σε ογκομετρικό κύλινδρο π.χ. 1000 ml προσθέτουμε 700 ml αιθυλικής αλκοόλης 95 ο. B. Συμπληρώνουμε μέχρι τα 950 ml με αποσταγμένο νερό. Διάλυμα μέτρησης σπερματοζωαρίων Αντιδραστήρια 50 gr NaHCO 3 10 ml διαλύματος φορμαλδεΰδης 36 40%. Συνταγή 1. Διαλύετε τα συστατικά σε αποσταγμένο νερό και αραιώνετε μέχρι τα 1000 ml. 2. Φιλτράρετε, για να αποφύγετε τους κρυστάλλους σε ένα καθαρό μπουκάλι. 3. Αποθηκεύετε στους 4 ο C (μπορεί να αποθηκευτεί για τουλάχιστον 12 μήνες). 4. Φροντίστε να μην έχει στερεά σωματίδια. 15
Παρασκευή όξινης αιθανόλης για χρώση Παπανικολάου 0,25% HCl σε 70% αιθανόλη Αντιδραστήρια Υδροχλώριο (HCl) 96% Απόλυτη αλκοόλη Συνταγή 1. Δημιουργία διαλύματος 70 %v/v αλκοόλης 500 ml αναμιγνύοντας 350 ml αλκοόλη και 150 ml αποσταγμένο νερό. 2. Αναμιγνύουμε 5 ml HCl και 250 ml αποσταγμένο νερό. 3. Αναμιγνύουμε τα δύο διαλύματα. Ο τελικός όγκος διαλύματος θα είναι 750 ml. Χρώση νιγκροσίνης-εωσίνης Αντιδραστήρια 0,67 gr εωσίνη Υ (C.I. 45380, Europe M 15935) 10 gr νιγκροσίνη (C.I. 50429, Europe M 15924) 0,9 gr χλωριούχου νατρίου Αποσταγμένο νερό Συνταγή 1. Διαλύστε 0,67 gr εωσίνης και 0,9 gr χλωριούχου νατρίου σε 100 ml αποσταγμένου νερού με ελαφρά θέρμανση και προσθέστε 10 gr νιγκροσίνης. 2. Βράστε το διάλυμα και αφήστε να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Φιλτράρετε το διάλυμα μέσα από διηθητικό φίλτρο (π.χ. Munctell Class II). 4. Αποθηκεύστε το σε ένα καλά κλεισμένο γυάλινο δοχείο. 5. Το διάλυμα με τις χρωστικές μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι την χρήση. 16
Διάλυμα ΚCl 3 Μ (για το πεχάμετρο) Αντιδραστήρια Xλωριούχο Κάλιο (ΚCl) (ΑΒ K = 39, AB Cl = 35) Αποσταγμένο νερό Συνταγή 1. Διαλύστε 111 gr ΚCl σε 500 ml AD. 2. Αναδεύστε καλά μέχρι πλήρους διάλυσης 17