ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ"

Τερψιχόρη Γλυκύς
7 χρόνια πριν
Προβολές:

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Φοιτήτρια: ΠΕΤΡΙΣΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ Αριθμός

1 ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΑΓΓΕΛΜΑΤΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΠΡΟΝΟΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΩΝ Φοιτήτρια: ΠΕΤΡΙΣΗ ΠΑΝΑΓΙΩΤΑ Αριθμός Μητρώου: Εξάμηνο: Η Πρακτική άσκηση: Ε.ΚΕ.Β.Ε ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΓΚ 1

2 ΚΟΨΙΜΟ ΤΟΜΩΝ ΣΕ ΚΡΥΟΤΟΜΟ & ΧΡΩΣΗ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΟΓΚΩΝ ΥΛΙΚΑ PBS (10x) ph 7.4 NaCl 1.37 M KCl 27 mm Na 2 HPO mm KH 2 PO 4 18 Mm Αντίσωμα Dapi Παραφολμαδεϋδη 4 % Κόλλα moviol Triton 0.3% Αιματοξυλίνη Ηωσίνη Αιθανόλη Διάλυμα Scotch ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Κόψιμο κρυοτομών από καρκινικούς όγκους Δείγματα καρκινικών όγκων κόπηκαν σε κρυοτόμο με διατομές 20 μm και 30 μm. Χρώση κρυοτομών με αντίσωμα Dapi Τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών με τις τομές σε παραφολμαδεϋδη 4% για 10 λεπτά σε περιβάλλον θερμοκρασίας 4 ο C. Ξέπλυμα 3 φορές με PBS (1x) διάρκειας 5 λεπτών το καθένα. Προσθήκη σε κάθε τομή 300 μl Triton 0.3% με 100 μl PBS (1x) για 10 λεπτά. Ξέπλυμα 3 φορές με PBS (1x) διάρκειας 5 λεπτών το καθένα. 2

3 Προσθήκη σε κάθε τομή αντισώματος DAPI με PBS (1x) σε αναλογία 1:500 για 30 λεπτά. Προσθήκη σε κάθε τομή 20 μl moviol κόλλα και σφράγισμα με καλυπτρίδα. Παρατήρηση κρυοτομών βαμμένων με αντίσωμα Dapi σε μικροσκόπιο φθορισμού. TUMOR: VILP 22-2 DAPI 30 μm 3

4 TUMOR: VILP 22-2 DAPI 30 μm TUMOR: VILP 22-3 DAPI 20 μm 4

5 TUMOR: VILP 22-3 DAPI 30 μm TUMOR: VILP 22-3 DAPI 30 μm 5

6 Χρώση κρυοτομών με αιματοξυλίνη-ηωσίνη Τοποθέτηση των αντικειμενοφόρων πλακών με τις τομές σε αιματοξυλίνη για 2 λεπτά. Ξέπλυμα κάτω από τρεχούμενο νερό μέχρι να απομακρυνθεί η περίσσεια αιματοξυλίνης. Γρήγορη εμπότιση σε αιθανόλη. Γρήγορη εμπότιση σε dh 2 O. Παραμονή για 3 λεπτά σε διάλυμα Scotch. Ξέπλυμα κάτω από τρεχούμενο νερό. 5 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 50% αιθανόλη. 5 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 70% αιθανόλη. Παραμονή σε ηωσίνη για 2.5 λεπτά. Ξέπλυμα κάτω από τρεχούμενο νερό. 10 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 50% αιθανόλη. 10 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 70% αιθανόλη. 15 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 90% αιθανόλη. 20 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 100% αιθανόλη. 20 γρήγορες εμβαφτίσεις σε 100% αιθανόλη. Παραμονή για 1 λεπτό σε ξυλίνη Προσθήκη ειδικής κόλλας. Σφράγισμα με καλυπτρίδες. Παρατήρηση κρυοτομών βαμμένων με αιματοξυλίνη-ηωσίνη σε οπτικό μικροσκόπιο. TUMOR: VILP 22-2 H&E 30 μm x4 6

7 TUMOR: VILP 22-2 H&E 30 μm x10 TUMOR: VILP 22-3 H&E 20 μm x10 7

8 ΈΝΘΕΣΗ ΜΕΛΑΝΩΜΑΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ ΠΟΝΤΙΚΙΑ ΥΛΙΚΑ PBS (10x) ph 7.4 NaCl 1.37M KCl 27mM Na 2 HPO 4 100mM KH 2 PO 4 18Mm Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM) θρεπτικό υλικό (1x) εταιρεία Gibco 1 g/l D-Glucose L-Glutamine Pyruvate Διατήρηση στους 2-8 ο C Ένζυμο θρυψίνη Μονιμοποιητικό υλικό (OCT) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που περιγράφονται παρακάτω διεξήχθησαν εντός θαλάμου νηματικής ροής υπό άσηπτες συνθήκες. Ξεπάγωμα μελανωματικών κυττάρων (B16FO cells) Τα καρκινικά κύτταρα μεταφέρθηκαν από το υγρό άζωτο στο οποίο διατηρούνται σε πάγο. Τοποθετήθηκαν σε δοχείο με νερό μέσα σε φούρνο μικροκυμάτων προκειμένου να ρευστοποιηθεί το ίζημά τους. Αναρροφήθηκε το ίζημα των 8

9 καρκινικών κυττάρων και επαναιωρήθηκε σε 5 ml DMEM θρεπτικό υλικό. Το εναιώρημα παρέμεινε σε φλάσκα με DMEM θρεπτικό υλικό εντός επωαστικού κλιβάνου (37 ο C) για 16 ώρες. Μέτρηση μελανωματικών κυττάρων (B16FO cells) Απομακρύνθηκε το DMEM θρεπτικό υλικό από την φλάσκα, ξέπλυμα των κυττάρων 2 φορές με PBS (1x),προσθήκη 1mL ενζύμου θρυψίνη και παραμονή της φλάσκας σε επωαστικό κλίβανο (37 ο C) για 1 λεπτό. Παρατήρηση των αποκολλημένων κυττάρων σε μικροσκόπιο και επαναδιά-λυσή τους σε 5 ml DMEM θρεπτικό υλικό. Φυγοκέντρηση του εναιωρήματος για 5 λεπτά στις στροφές. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 10 ml PBS (1x) και φυγοκεντρήθηκε για 5 λεπτά στις στροφές. Το κυτταρικό ίζημα επαναιωρήθηκε σε 5 ml PBS (1x). Σε πλάκα μέτρησης κυττάρων προστέθηκαν 5μl από το εναιώρημα κυττάρων, 4 μl PBS (1x) και 1 μl χρωστική Trypton Blue. Μετρήθηκε σε μικροσκόπιο ο μέσος όρος των κυττάρων από 3 σετ της πλάκας και ενέθηκαν καρκινικά κύτταρα υποδορίως σε πειραματόζωα ποντίκια σε συγκέντρωση 2 x 10 6 /ποντίκι ( συνολικά 2 ποντίκια). Ένθεση μελανωματικών κυττάρων σε πειραματόζωα ποντίκια Ένθεση υποδορίως 150 μl αναισθητικού/ποντίκι. Μετά την πλήρη αναισθητοποίηση των ποντικών ενέθηκαν σε αυτά υποδορίως μελανωματικά κύτταρα συγκέντρωσης 2 x 10 6 /ποντίκι. Χρησιμοποιήθηκε σύριγγα μεγάλης διαμέτρου προκειμένου να μην καταστραφούν τα μελανωματικά κύτταρα. Προσοχή να μην τραυματι-στεί ζωτικό όργανο. Απομάκρυνση της σύριγγας σταδιακά. Τοποθέτηση των ποντικών σε κλουβί και σε περιβάλλον όπου πληρούνται οι κατάλληλες προϋποθέσεις επιβίωσής τους. Εξαγωγή μελανωματικών όγκων από πειραματόζωα ποντίκια Μετά από διάστημα 14 ημερών από την ένθεση των μελανωματικών κυττάρων τα πειραματόζωα ποντίκια θανατώθηκαν με τον όσο πιο δυνατό ανώδυνο τρόπο. Αφαιρέθηκε το δέρμα αυτών στο οποίο ήταν προσκολλημένοι οι μελανωματικοί όγκοι. 9

10 Εξαγωγή των μελανωματικών όγκων από το δέρμα των πειραματόζωων ποντικών. Τοποθέτηση των όγκων σε μονιμοποιητικό υλικό (OCT). Τοποθέτηση σε υγρό άζωτο. Διατήρηση στους 80 ο C. 10

Σχετικά έγγραφα

Ειδικές Μέθοδοι Ανάλυσης Κυτταρικών Διεργασιών

ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΔΗΜΟΚΡΑΤΙΑ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ Ειδικές Μέθοδοι Ανάλυσης Κυτταρικών Διεργασιών Τίτλος Εργαστηριακής Άσκησης: Παρατήρηση κυτταρικής διαίρεσης με μικροσκοπία φθορισμού Έλενα Κουιμτζόγλου Τμήμα Βιολογίας