Εργαστηριακή μεθοδολογία διερευνήσεως σπέρματος Αξιολόγηση εργαστηριακής διερευνήσεως σπέρματος. Σταυρούλα Μπάκα. Αρεταίειο Νοσοκομείο

Transcript

1 Εργαστηριακή μεθοδολογία διερευνήσεως σπέρματος Αξιολόγηση εργαστηριακής διερευνήσεως σπέρματος Σταυρούλα Μπάκα Αν.. Καθηγήτρια α Αρεταίειο Νοσοκομείο

2 Η εξέταση σπέρματος: Αποτελεί βασική μέθοδο διερεύνησης της ανδρικής υπογονιμότητας εν υπάρχουν παράμετροι που να εξασφαλίσουν ότι τα σπερματοζωάρια θα φτάσουν στο σημείο της γονιμοποίησης εν μπορεί να προβλέψει την τεκνοποίηση Σύμφωνα με τα αποτελέσματά της οι άνδρες ρςκατατάσσονται σε ομάδες με διαφορετική θεραπευτική προσέγγιση

3 Έλεγχος του άνδρα συνήθως μετά από 1 χρόνο πριν το χρόνο: ιστορικό κρυψορχίας άμφω ηλικία της συντρόφου > 35 εάν ζητηθεί λόγω αμφίβολης γονιμότητας του άνδρα Αρχικά χρειάζεται: καλό ιστορικό 2 σπερμοδιαγράμματα σε διάστημα 1 μηνός + 3 ο δείγμα ά ξέ έ θ λ ή ξέ ό εάν εξέταση σπέρματος παθολογική: εξέταση από ουρολόγο

4

5 Η ανάγκη προτυποποίησης των μεθόδων εξέτασης σπέρματος: ΠΟΥ: WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction 5th edition, 2010 whqlibdoc.who.int/publications/2010/ _eng.pdf /index.html

6 Ιστορικό Ιστορικό υπογονιμότητας: διάρκεια, θεραπείες, προηγούμενη εγκυμοσύνη Οικογενειακό αναμνηστικό μη Ατομικό αναμνηστικό: παιδικές ασθένειες, γενικές και μεταβολικές νόσοι, φλεγμονές, τραυματισμοί, χειρουργικές επεμβάσεις, τοξικοί παράγοντες

7 Τοξικοί παράγοντες Φάρμακα (κυτταροστατικά, ανοσοκατασταλτικά, αντιρρευματικά, αντικαταθλιπτικά, αντιεπιληπτικά, υπνωτικά, αντιβιοτικά, αντιυπερτασικά, οιστρογόνα, αντιανδρογόνα, αναβολικά...) Νικοτίνη: ROS Οινόπνευμα Ναρκωτικά Περιβαλλοντικοί και επαγγελματικοί (κινητά, H/Y)

8 Σπέρμα Σπερματοζωάρια Σπερματικό πλάσμα 1. Σπερματοδόχες κύστες : 60% 2. Προστάτης : 30% 3. Επιδιδυμίδα : 5% 4. Περιουρηθρικοί ρη ρ αδένες : 5%

9 Συλλογή του δείγματος σαφείς οδηγίες σεξουαλική αποχή 2-5 ημερών, σταθερή περίοδος αποχής σε επόμενες μετρήσεις ειδικό δωμάτιο κοντά στο εργαστήριο αυνανισμό, αποστειρωμένο δοχείο, ολόκληρο το δείγμα όνομα, ημερομηνία και ώρα συλλογής σπίτι: σε 1 ώρα, μεταφορά στη t σώματος προφυλακτικό, μόνο ειδικό αρχική διάγνωση, 2 δείγμα σε 1 μήνα, 3 1 μήνα μετά το 2 ο

10 Μακροσκοπική εξέταση χρόνος ρευστοποίησης: ως 60 χροιά: λευκωπή, κιτρινωπή οσμή: χαρακτηριστική όγκος 1,5 ml γλοιότητα: σταγόνες, «σπερματικό νήμα»: 2cm ph 7,2

11 ΣΠΕΡΜΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ: ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΣΥΖΥΓΟΥ: ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ: ΕΤΟΣ ΓΕΝΝΗΣΕΩΣ: ΩΡΑ ΛΗΨΗΣ: ΩΡΑ ΠΑΡΑΛΑΒΗΣ: ΛΗΨΗ: Στο εργαστήριο / Εκτός εργαστηρίου ΗΜΕΡΕΣ ΑΠΟΧΗΣ: ΛΗΨΗ ΦΑΡΜΑΚΩΝ: - ΝΟΣΟΙ ΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ: - ΛΟΙΠΕΣ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ: - ΦΥΣΙΚΟΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΕΣ Όγκος: ml Τ.Α..: 1,5 ml Όψη: Χρόνος ρευστοποίησης: Τ.Α.: Έως 60 min. ph: Τ.Α.: 7,2 Γλοιότητα:

12 Ανάλυση ούρων μετά από εκσπερμάτιση χαμηλός όγκος < 1ml ή έλλειψη εκσπερμάτισης παλίνδρομη εκσπερμάτιση, υπογοναδισμός, συγγενή αμφοτερόπλευρη έλλειψη του σπερματικού πόρου

13 Ανάλυση ούρων μετά από εκσπερμάτιση φυγοκέντρηση για 10 λεπτά, 300g και μικροσκόπηση 400x: σε αζωοσπερμία ή ασπερμία,, η παρουσία και ενός σπερματοζωαρίου = παλίνδρομη εκσπερμάτιση σε ολιγοσπερμία με χαμηλό όγκο είναι απαραίτητη η παρουσία μεγάλου αριθμού σπερματοζωαρίων στα ούρα για να διαγνωσθεί παλίνδρομη εκσπερμάτιση

14 Μικροσκοπική εξέταση Συγκέντρωση Κινητικότητα Βιωσιμότητα Συγκολλήσεις Άλλα κύτταρα Μορφολογία

15 Συγκέντρωση -Makler

16 απλή και γρήγορη Συγκέντρωση - Makler το σπέρμα δεν χρειάζεται αραίωση ο αριθμός των σπερμζ. σε 10 τετράγωνα= εκατομμύρια/ml αμφισβητείται η ακρίβειά της σε ολιγοσπερμικούς συγκέντρωση και κινητικότητα μαζί

17 Συγκέντρωση - Neubauer πρώτα εκτιμάται περίπου η συγκέντρωση αραίωση σύμφωνα με τον αριθμό ανά ο.π. φορτώνουμε την πλάκα από τις 2 πλευρές τοποθέτηση σε υγρό θάλαμο για 15 μικροσκόπηση με x φακό πρέπει να μετρηθούν τουλάχιστον 200 σπερματοζωάρια

18 Διάλυμα για την αραίωση του σπέρματος 1. Προσθέτουμε 50 g διττανθρακικό νάτριο (NaHCO 3 ) και 10 ml φορμαλίνη 35% (v/v) σε 1000 ml απεσταγμένο νερό. 2. Για την καλύτερη παρατήρηση η των σπερματοζωαρίων ρ μπορούμε να προσθέσουμε 5 ml ιώδιο της γεντιανής. 3. Φυλάσσεται στους 4 C.

19 Συγκέντρωση - Neubauer Ένα οπτικό πεδίο (HPF) Χ200 = 16 nl ή Χ400 = 4 nl Σπερματοζωάρια Χ400 Σπερματοζωάρια Χ200 Αραίωση Σπέρμα (μl) Διάλυμα (μl) Εξεταζόμενα τετράγωνα >101 >404 1:20 (1+19) 19) , 4, :5 (1+4) , 4, :2 (1+1) , 4, 6 <2 <8 1:2 (1+1) Όλα (9)

20 Ποια σπερματοζωάρια μετράμε;

21 Συγκέντρωση - Neubauer Πρώτα μετράμε στην κεντρική περιοχή (5), ολόκληρες σειρές μέχρι να συμπληρωθούν 200 σπερματοζωάρια (δεν σταματάμε στην μέση της σειράς!). Εάν δεν συμπληρωθούν, συνεχίζουμε στις διπλανές περιοχές (4 και 6). Σημειώνουμε τον αριθμό των σειρών που μετρήσαμε τουλάχιστον 200 σπερμζ. Μετράμε στην απέναντι πλευρά της πλάκας τα σπερμζ τα οποία υπάρχουν στον ίδιο αριθμό σειρών, ακόμα και αν ο αριθμός είναι μικρότερος από

22 Συγκέντρωση - Neubauer Η συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων ρ στο σπέρμα είναι ο αριθμός τους (N) διαιρούμενο με τον αριθμό των σειρών και με τον όγκο στο οποίο βρέθηκαν (π.χ. 20 nl για κάθε τετράγωνο), πολλαπλασιάζοντας με την αραίωση. C = (N/n) x (1/20) x αραίωση C: συγκέντρωση N: αριθμός σπερματοζωαρίων n: αριθμός σειρών Για αραίωση 1:5, C = (N/n) Χ (1/20) Χ 5 σπερματοζωάρια/nl = (N/n) Χ (1/4) σπερματοζωάρια/nl ή 10 6 /ml Για αραίωση 1:20, C =(N/n) Χ (1/20) Χ 20 σπερματοζωάρια/nl = (N/n) σπερματοζωάρια/nl ή 10 6 /ml Για αραίωση 1:50, C = (N/n) Χ (1/20) Χ 50 σπερματοζωάρια/nl = (N/n) Χ 2.5 σπερματοζωάρια/nl ή 10 6 /ml

23 Παράδειγμα (1:20) αραίωση δείγμα 1: 201 σπερματοζωάρια σε 7 σειρές δείγμα 2: 245 σπερματοζωάρια σε 7 σειρές = 446 σε 14 σειρές διαφορά = 44 Στον πίνακα η αποδεκτή διαφορά είναι 41, συνεπώς χρειάζεται επανάληψη με καινούργια δί δείγματα μετά από καινούργιες αραιώσεις.

24 ΑΘΡΟΙΣΜΑ ΔΙΑΦΟΡΑ ΑΘΡΟΙΣΜΑ ΔΙΑΦΟΡΑ

25 Παράδειγμα (1:20) αραίωση δείγμα 1: 220 σπερματοζωάρια σε 4 σειρές δείγμα 2: 218 σπερματοζωάρια σε 4 σειρές = 438 σε 8 σειρές διαφορά = 2 Η συγκέντρωση για την αραίωση 1:20 είναι C = (N/n) x1.0 σπερματοζωάρια/nl C = (438/8) x 1.0 = σπερματοζωάρια/nl ή 55 x 10 6 /ml

26 Συγκέντρωση - Τιμές αναφοράς 15 Χ 10 6 / ml 39 Χ 10 6 / εκσπερμάτιση

27 Συγκέντρωση - CASA CASA = Computer-aided sperm analysis Hamilton Thorne (USA) Hobson Sperm Tracker (UK)

28 Αζωοσπερμία 1% στο σύνολο των ανδρών 10 15% των υπογόνιμων ανδρών απουσία σπερμζ στο ίζημα του φυγοκεντριμένου δείγματος σε 2 διαφορετικά δείγματα (10 λεπτά,, 300g) ιακρίνεται σε αποφρακτική και μη αποφρακτική. Αποφρακτική: Οφείλεται σε επίκτητη απόφραξη αμφότερων των εκφορητικών σπερματικών οδών (λόγω φλεγμονής ή τραυματισμού), σε συγγενή απλασία ή δυσπλασία τους, σε συγγενή αμφοτερόπλευρη έλλειψη των σπερματικών πόρων. Μη αποφρακτική: Έλλειψη παραγωγής σπερματοζωαρίων, η οποία μπορεί να είναι ιδιοπαθής ή να οφείλεται σε χρωμοσωμικές ανωμαλίες, λοιμώξεις (πχ. παρωτίτιδα σε μεγάλη ηλικία) και φλεγμονές, κρυψορχία, τραυματισμούς, ακτινοβολία, χημειοθεραπεία, ενδοκρινολογικά, μεταβολικά ή περιβαλλοντικά αίτια.

29 Κινητικότητα η Ποσοτική Ποιοτική Τα σπερματοζωάρια κατατάσσονται στις εξής κατηγορίες: Α : Ταχεία προωθητική κίνηση ( 5 μήκη κεφαλής ή μισή ουρά σπερματοζωαρίου / sec). Β : Βραδεία προωθητική κίνηση η Γ : Νωθρή επιτόπια κίνηση Δ : Ακίνητα Έκφραση των τεσσάρων κατηγοριών κινητικότητας σε ποσοστά %.

30 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ: Τ.Α.: 15 x 10 6 /ml ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ: Τ.Α.: 39 x 10 6 ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ ΕΚ ΤΩΝ ΚΙΝΗΤΩΝ ΩΡΑ % ΚΙΝΗΤΑ % ΤΑΧΕΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΙΚΗ ΚΙΝΗΣΗ % ΒΡΑΔΕΙΑ ΠΡΟΩΘΗΤΙΚΗ ΚΙΝΗΣΗ % ΝΩΘΡΗ ΕΠΙΤΟΠΙΑ ΚΙΝΗΣΗ % ΑΚΙΝΗΤΑ 1 η 3 η 24 η Τ.Α.: Συνολική κινητικότητα 40% ή προωθητική κινητικότητα 32%, την 1 η ώρα των παρατηρήσεων.

31 Οι μετρήσεις των ποσοστών κινητικότητας σπερματοζωαρίων πραγματοποιούνται αμέσως μετά τη ρευστοποίηση του δείγματος και επαναλαμβάνονται 3 και 24 ώρες μετά. Παράδειγμα ΕΚ ΤΩΝ ΚΙΝΗΤΩΝ % % ΤΑΧΕΙΑ % ΒΡΑ ΕΙΑ ΝΩΘΡΗ ΩΡ % % ΠΡΟΩΘΗΤΙΚ ΠΡΟΩΘΗΤΙΚ ΕΠΙΤΟΠ Α ΚΙΝΗΤΑ ΑΚΙΝΗΤΑ Η ΚΙΝΗΣΗ Η ΚΙΝΗΣΗ ΙΑ ΚΙΝΗΣΗ 1 η η η Τ.Α.: 40% με συνολική κινητικότητα (προωθητική + επιτόπια κίνηση) ή 32% με προωθητική κίνηση (ταχεία + βραδεία) την 1η ώρα.

32 ΤΕΣΤ ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑΣ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ α) Υπο-ωσμωτικό τεστ ή HOS test Χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση της λειτουργικής ακεραιότητας της μεμβράνης των σπερμζ βασίζεται στην ικανότητα της ακέραιας μεμβράνης του σπερμζ να διογκωθεί όταν βρεθεί σε ένα υποωσμωτικό διάλυμα υπολογίζεται το % των διογκωμένων σπερμζ TΑ: 58% β) Τεστ με χρώση ηωσίνης Νεκρό σπερματοζωάριο 50 μl σπέρμα + 50 μl ηωσίνη- νιγροσίνη: 30 επιστρώνεται σε αντικειμενοφόρο πλάκα μετρώνται 200 σπερμζ: % αναλογία Ζωντανό σπερματοζωάριο ρ μετρώνται 200 σπερμζ: %

33 Συγκολλήσεις Σπερματοζωάρια ή/και μεμονωμένα συστατικά δραστηριοποιούνται σαν αντιγόνα και οδηγούν στο σχηματισμό αντισπερματικών αντισωμάτων. Φυσιολογικό δείγμα Με συγκολλήσεις

34 A. Κεφαλή - κεφαλή B. Ουρά - ουρά C. Άκρη ουράς άκρη ουράς D. Μικτές E. Περιπλεγμένες

35 Συγκολλήσεις σπερματοζωαρίων Όλες αυτές οι συγκολλήσεις πρέπει να αφορούν κινητά σπερματοζωάρια, για να αξιολογηθούν. Πιθανά ανοσολογικά αίτια υπογονιμότητας Grade 1 (<10 σπ/ρια / συμμετέχουν στις συγκολλήσεις + πολλά ελεύθερα) λύθ ) Grade 2 (10-50 σπ/ρια συμμετέχουν στις συγκολλήσεις, πολλά ελεύθερα) Grade 3 (>50 σπ/ρια συμμετέχουν στις συγκολλήσεις, πολλά ελεύθερα) Grade 4 (το σύνολο των σπερματοζωαρίων εμπλέκεται σε συγκολλήσεις)

36 Μέθοδοι ανίχνευσης αντισπερματικών αντισωμάτων MAR (mixed antiglobulin reaction): αναμιγνύουμε σπέρμα με σωματίδια Latex ή ερυθρά αιμοσφαίρια πάνω στα οποία έχει προσροφηθεί ανθρώπινη Ig G ή Ig A. Προσθέτουμε ένα ειδικό αντιανθρώπινο Ig G αντιορός. Η δημιουργία συγκολλήσεων ανάμεσα στα σωματίδια και στα κινητά σπερματοζωάρια υποδηλώνουν παρουσία Ig G ή Ig A αντισωμάτων πάνω στα σπερματοζωάρια Immunobead: Πάνω στα ανοσοσφαιρίδια (πολυακρυλαμίδη) έχουν προσροφηθεί αντι-ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες κονίκλου. Αν υπάρχουν αντισώματα θα αναγνωρίσουμε τις συγκολλήσεις κάτω από το μικροσκόπιο. Θετικό 50% κινητά σπερματοζωάρια με σφαιρίδια

37 Παρουσία άλλων κυτταρικών στοιχείων Επιθηλιακά κύτταρα Κύτταρα προστάτη Κύτταρα σπερματογένεσης * Λευκοκύτταρα ** Ερυθροκύτταρα Μικροοργανισμοί * Αυξημένες ανώριμες μορφές σπερμ/ρίων Πιθανή διαταραχή σπερματογένεσης ** Αυξημένα λευκοκύτταρα (> 1 x 10 6 /ml) Πιθανή φλεγμονή (απαιτούνται μικροβιολογικές εξετάσεις)

38 Μορφολογία Εκτίμηση: σε ξηρά παρασκευάσματα Χρώσεις: Papanicolau, Giemsa, Bryan-Leishman, Shorr, Diff-Quick i Αξιολόγηση: υποκειμενικά κριτήρια, απαιτεί εξάσκηση και πείρα Τιμή αναφοράς: : 4%

39 Χρώση Papanicolaou Μονιμοποίηση: 1. Αιθανόλη 95% (v/v) 15 Χρώση: 1. Αιθανόλη 80% (v/v) Αιθανόλη 50% (v/v) Απεσταγμένο νερό Αιματοξυλίνη Harris 4 5. Απεσταγμένο νερό Οξυνισμένη αιθανόλη 4 8 εμβαπτίσεις 7. Κρύο νερό της βρύσης 5 8. Αιθανόλη 50% (v/v) Αιθανόλη 80% (v/v) Αιθανόλη 95% (v/v) Χρωστική G-6 orange Αιθανόλη 95% (v/v) Αιθανόλη 95% (v/v) Αιθανόλη 95% (v/v) Χρωστική EA-50 green Αιθανόλη 95% (v/v) Αιθανόλη 95% (v/v) Αιθανόλη 100% Αιθανόλη 100% 15

40 Χρώση Diff-Quik

41 Πως είναι το ιδανικό σπερματοζωάριο; Κεφαλή: σχήμα ωοειδές και κανονικό περίγραμμα (4-5 μm μήκος και 2,5-3,5 μm πλάτος) με ένα ανοιχτόχρωμο τμήμα μπροστά = ακρόσωμα (40-70% της κεφαλής) Μεσαίο τμήμα: 7-8 μm μήκος, 1 μm πάχος Ουρά: τοποθετημένη συμμετρικά στη βάση της κεφαλής, 45 μm μήκος Κυτταροπλασματική σταγόνα: 1/3 κεφαλής

42

43 N: Φυσιολογικό ΒΝ: Οριακά φυσιολογικό SLE: Ελαφρώς επιμηκυσμένο SE: Έντονα επιμηκυσμένο E: Επιμηκυσμένο μ DB: Dumbbell ανωμαλία

44 Globozoospermia Spermatid Pinheads

45

46

47

48

49 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΣΠΕΡΜΑΤΟΖΩΑΡΙΩΝ (Κατά αυστηρά κριτήρια Kruger) % ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ % ΑΝΩΜΑΛΕΣ ΜΟΡΦΕΣ % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΚΕΦΑΛΗΣ Μακροκέφαλα, μικροκέφαλα, στρογγυλές, επιμήκεις, πολλαπλές % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΜΕΣΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ Παρουσία κυτταροπλασματικών υπολειμμάτων, έλλειψη μέσου τμήματος % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΟΥΡΑΣ Πολλαπλές, γωνιώδεις, βραχείες, σπειροειδείς ουρές Τ.Α.: φυσιολογικές μορφές 4 % ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΕΙΣ : - ΛΟΙΠΑ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ (x 10 6 / ml) Πυοσφαίρια :0 Τ.Α.: 0-1 Ερυθρά αιμοσφαίρια: 0 Τ.Α.: 0 Κύτταρα σπερ/νεσης: 0 Τ.Α.: 0-3 Λοιπά: - ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΧΟΛΙΑ Τ.Α.: Τιμές αναφοράς σύμφωνα με τις νέες κατευθυντήριες οδηγίες της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας (WHO) για την εξέταση του σπέρματος (2010).

50 Παράδειγμα % ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΜΟΡΦΕΣ 21 % ΑΝΩΜΑΛΕΣ ΜΟΡΦΕΣ 79 % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΚΕΦΑΛΗΣ Μακροκέφαλα, μικροκέφαλα, στρογγυλές, επιμήκεις, πολλαπλές % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΜΕΣΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ Παρουσία κυτταροπλασματικών υπολειμμάτων, έλλειψη μέσου τμήματος % ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΟΥΡΑΣ Πολλαπλές, γωνιώδεις, βραχείες, σπειροειδείς ουρές Τ.Α.:.. φυσιολογικές ογ μορφές 4 %

51 ΤΙΜΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ ΣΠΕΡΜΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΟΣ (WHO, 2010) ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΙ ΤΙΜΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Όγκος σπέρματος (ml) 1,5 (1,4-1,7) Συγκέντρωση (10 6 /ml) 15 (12 16) Ολικός αριθμός (10 6 /εκσπερμάτιση) 39 (33 46) Συνολική κινητικότητα (%) 40 (38 42) Προωθητική κινητικότητα (%) 32 (31 34) Μορφολογία (φυσιολογικές μορφές, %) 4

52 ΟΡΙΣΜΟΙ ΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Ολιγοζωοσπερμία: μειωμένος αριθμός σπερματοζωαρίων, <15 x 10 6 /ml ή <39 x 10 6 στο συνολικό όγκο του δείγματος Ασθενοζωοσπερμία: ασθενής κινητικότητα, <40% γενική κινητικότητα ή <32% προωθητική κίνηση Τερατοζωοσπερμία: ποσοστό σπερματοζωαρίων με φυσιολογική μορφολογία (αυστηρά ά κριτήρια Kruger) <4 %

53 ΟΡΙΣΜΟΙ ΙΑΤΑΡΑΧΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΠΕΡΜΑΤΟΣ Ολιγοασθενοτερατοζωοσπερμία: συνύπαρξη μειωμένου αριθμού, ασθενούς κινητικότητας και αυξημένων μορφολογικών ανωμαλιών των σπερματοζωαρίων Αζωοσπερμία: εν παρατηρούνται σπερματοζωάρια στο δείγμα (ακόμα και μετά από φυγοκέντρηση του δείγματος και επανέλεγχο του ιζήματος) Ασπερμία: Απουσία εκσπερμάτισης

54 Κατακερματισμός μ του DNA των σπερματοζωαρίων Συνδέεται με την απόπτωση δημιουργούνται μικρότερου ρ μήκους τμήματα. Οφείλεται σε έκθεση σε τοξίνες ή χημικές ουσίες από την ατμόσφαιρα, τη δίαιτα, κάπνισμα, ROS, έντονο σωματικό στρες, χρήση Η/Υ, κινητών, κ.α.

55 Η εργαστηριακή ανάλυση περιλαμβάνει τον έλεγχο τουλάχιστον 500 σπερματοζωαρίων σε φρέσκο δείγμα σπέρματος και το αποτέλεσμα δίνεται ως ποσοστό σπερματοζωαρίων με κατακερματισμένο DNA (%). Χρώση με Acridine Orange Πράσινο: φυσιολογικό DNA / Κίτρινο-Πορτοκαλί-Κόκκινο: κατακερματισμένο DNA

56 Κατακερματισμός του DNA Κατακερματισμός του DNA (Fernández et al. Fertil Steril 84: , 2005)

57 Κατακερματισμός του DNA Συναντάται και σε δείγματα με φυσιολογικούς παραμέτρους (συγκέντρωση, κινητικότητα και μορφολογία σπερματοζωαρίων). ) Υψηλός βαθμός κατακερματισμού του DNA (> 30%) ευθύνεται για: 1. επαναλαμβανόμενες μ αποβολές 2. χαμηλό % γονιμοποίησης και αυξημένο % αποβολών σε IVF 3. έμβρυα που αξιολογούνται με χαμηλή βαθμολογία ως προς τη μορφολογία 4. αποτυχία εμφύτευσης του εμβρύου στη μήτρα Είναι αναστρέψιμη διαδικασία καθώς η χορήγηση βιταμινών και αντιοξειδωτικών έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωσή του.

58 SWIM-UP Επώαση ~ 60 σε επωαστή υπό κλίση 45 ο Τοποθέτηση καλλιεργητικού πάνω από το σπέρμα Απομάκρυνση υπερκείμενου Φυγοκέντρηση Καλλιεργητικό + υπερκείμενο Λήψη ιζήματος και επαναδιάλυση

59 ΚΛΑΣΜΑΤΑ ΙΑΒΑΘΜΙΣΜΕΝΗΣ ΠΥΚΝΟΤΗΤΑΣ 1 ml 80% +1 ml 40% 40% / 80% +1 ml σπέρμα Ίζημα + καλλιεργητικό Φυγοκέντρηση Φυγοκέντρηση (1300 rpm,20 min) (1500 rpm,10 min) Λήψη ιζήματος - επαναδιάλυση δάλ

60 ΕΝ ΟΜΗΤΡΙΑ ΣΠΕΡΜΑΤΕΓΧΥΣΗ (IUI) λιγότερο επεμβατική μέθοδος. για σπέρματα με συγκέντρωση > 10 x 10 6 /ml (οριακά από 5 x 10 6 /ml) 0,25 0,4 ml ενεργοποιημένου σπέρματος εισάγονται σε σύριγγα και μέσω ειδικού καθετήρα στη μήτρα.

61 Η διαδικασία της Εξωσωματικής Γονιμοποίησης (In Vitro Fertilization) Διέγερση γρ ωοθηκών Συλλογή των ωαρίων διακολπικά (U/S) Γονιμοποίηση (IVF ή ICSI) Μεταφορά στη μήτρα 2-3 εμβρύων (4 ή 6-8 κυττάρων 2 η μέρα) ή 1 βλαστοκύστη (5 η μέρα) Van Voorhis B. N Engl J Med 2007;356:

62

63

64

65

66

67 Ενδείξεις για ICSI < 5 x 10 6 σπερματοζωάρια/ml / l < 30% προωθητικά κινούμενα σπερματοζωάρια < 4% φυσιολογικές μορφές (αυστηρά κριτήρια Kruger) Αποτυχημένες / μικρά ποσοστά γονιμοποίησης σε προηγούμενες IVF. Αντισπερματικά αντισώματα.

68 whqlibdoc.who.int/publications/2010/ _eng.pdfwho int/publications/2010/ pdf

69 Παρουσίαση περιστατικών

70 Περιστατικό 1 ο Dada R, et al. Andrologia 43: , 2011 Ζευγάρι με υπογονιμότητα 12 ετών, ICSI x 3, όχι εγκυμοσύνη Γυναίκα: 46,ΧΧ Όλα φυσιολογικά, ιατρικό ιστορικό ελεύθερο Άνδρας: 42 ετών, μηχανικός Η/Υ Ύψος, βάρος, κλινική εξέταση = κφ Όχι κιρσοκήλη, κρυψορχία, υπέρταση ή Σ Όχι αλκοόλ, φάρμακα κ/α σπέρματος: τσιγάρα/ημέρα για χρόνια Εξέταση σπέρματος: 28 εκατ. σπερματοζωάρια/ml 10 % κινητικότητα 75 % φυσιολογικές μορφές./

71 Περιστατικό 1 ο Dada R, et al. Andrologia 43: , 2011 ιάγνωση: ασθενοζωοσπερμία Άλλα ευρήματα ROS 96% σπερμζ με κατακερματισμένο DNA (4% με ακέραιο DNA) 46, XY χωρίς μεταλλάξεις στα AZFa, AZFb, AZFc Ωστόσο, η μελέτη της αλληλουχίας των μιτοχονδριακών γονιδίων έδειξε 42 αλλαγές νουκλεοτιδίων στο mtdna των σπερματοζωαρίων

72

73 Περιστατικό 2 ο Sermondade, et al. Human Reproduction, 26 (11): , 2011 Γυναίκα: 24 ετών Όλα φυσιολογικά, ιατρικό ιστορικό ελεύθερο, υπογονιμότητα 1 χρόνο Άνδρας: 36 ετών ιατρικό ιστορικό ελεύθερο ΒΜΙ φυσιολογικό, όχι κάπνισμα, αλκοόλ ή άλλες τοξικές ουσίες 5 αδέλφια (2 υπογόνιμα,, χωρίς άλλες πληροφορίες) ρ 1 η : 52 εκατ./ml, 30% προωθητική κίνηση, 100% μορφολογικές ανωμαλίες 2 η : 18 εκατ./ml, 30% προωθητική κίνηση, 100% μορφολογικές ανωμαλίες/

74 Περιστατικό 2 ο Sermondade, et al. Human Reproduction, 26 (11): , 2011 ιάγνωση: Globozoospermia Ωστόσο, 1% των σπερμζ: πολύ μικρό ακρόσωμα Άλλες εξετάσεις Καρυότυπο: 46, ΧΥ χωρίς μεταλλάξεις Κατακερματισμός DNA: κφ./ ICSI 15 ωάρια: 11 ώριμα (Μ 2 ) 18 h: 7 x 2PN 48 h: εμβρυομεταφορά 2 εμβρύων (5 κρυοσυντήρηση) εγκυμοσύνη, 3500 g στις 38 εβδ, υγιής

75 whqlibdoc.who.int/publications/2010/ _eng.pdf