Aντιγραφή, επιδιόρθωση και ανασυνδυασμός του DA DA Replication, Repair, and Recombination 1
Με την κυτταρική διαίρεση συγχρονίζεται ο διπλασιασμός των κυτταρικών δομών, των οργανιδίων, αλλά και της γενετικής πληροφορίας, δηλ. ο διπλασιασμός του DA 2 Βασικά χαρακτηριστικά αντιγαφής
Αντιγραφή του DA DA Replication To DA αντιγράφει επακριβώς τον εαυτό του. Τυχόν λάθη κατά την αντιγραφή στο DA = Μετάλλαξη (χρωμοσωμική / γενετική μετάλλαξη) Α. Γενικά χαρακτηριστικά της αντιγραφής του DA 1. Η δυνατότητα ακριβούς αντιγραφής στηρίζεται στο αυστηρό συμπληρωματικό ζευγάρωμα των βάσεων (base pairing) C G, A T. Ο κάθε κλώνος χρησιμεύει ως εκμαγείο για τη σύνθεση ενός νέου συμπληρωματικού κλώνου Η δομή του DA υπέδειξε το πιθανό μηχανισμό αυτό-διπλασιασμού του J. Watson και F. Crick, 1953 3 2. ημισυντηρητική 3. DA pol
2. Η αντιγραφή του DA είναι ΗΜΙΣΥΝΤΗΡΗΤΙΚΗ Καθένα από τα νέα δίκλωνα μόρια DA συνίσταται από έναν παλαιό (μητρικό) κλώνο και ένα νέο (θυγατρικό) κλώνο. Έτσι το DA κάθε νέου κυττάρου περιέχει ένα προγονικό κλώνο και ένα νέο κλώνο που συνετέθη κατά την τελευταία κυτταρική διαίρεση. 3. Οι πολυμεράσες του DA αντιγράφουν με εξαιρετική ακρίβεια (συχνότητα λάθους <1:10 10, δυνατότητα ορθής επανάληψης), με μεγάλη ταχύτητα ~1000 n/sec (E.coli DA 4.8 10 6 bp, <40min),????? και με επεξεργασημότητα (processive vs distributive) 4 Ι,ΙΙ,ΙΙΙ DA πολ
DA πολυμεράσες στα βακτήρια DA polymerase I III II polymerase exonuclease (proof reading) + + + + + + exonuclease + - - Αριθμός υπομονάδων 1 7 >10 Νουκλεοτ. /sec 20 40 250-1000 Επεξεργασημότητα 3-200 1500 >500.000 mol/ cell 400? 10-20 Why? Γονίδιο pol A pol B pol C * 5 Η αντίδραση
H βασική αντίδραση επιμήκυνσης ενός νέου κλώνου DA Νεο-εισερχόμενο νουκλεοτίδιο Δυο μεταλλικά ιόντα (Mg++) συμμετέχουν στην αντίδραση πολυμερισμού. Το πρώτο διευκολύνει την επίθεση της - ΟΗ ομάδας, ενώ η δεύτερη την αποχώρηση του PPj ασύμμετρο διμερές διόρθωση 6
Το ολοένζυμο της DA pol III είναι ένα ασύμμετρο διμερές 2 core complexes (α, ε, θ), πολυμερισμός και διόρθωση 2 β,τ complexes (β2,τ2) β2:ολισθαίνον σφιγκτήρας (sliding clamp) 1 γ complex, γ,δ,δ,χ,ψ συγκρότηση του «αντιγραφοσώματος», (replisome) Η DA πολυμεράση «διαβάζει» τις νέες βάσεις που προσθέτει και αφαιρεί τα λάθη μέσω της 3-5 εξονουκλολυτικής δράσης της υπομονάδας ε. Ελικάσες τοποισομεράσες 7
4. Ο διαχωρισμός των δυο κλώνων του DA χρειάζεται ειδικές ελικάσες και κατανάλωση ΑΤΡ H βακτηριακή ελικάση PcrA 5. Το τοπικό ξετύλιγμα των δύο κλώνων οδηγεί σε έντονο υπερτύλιγμα των γύρω περιοχών Ειδικές τοποϊσομεράσες εισάγουν αρνητικά υπερσπείράματα και ευνοούν τον διαχωρισμό των κλώνων παρεμποδίζοντας τις τάσεις που αναπτύσσονται Τύπου ΙΙ : Εισαγωγή αρνητικών υπερσπειραμάτων Tύπου Ι : Μερική χαλάρωση υπερπειρωμένου DA Η βακτηριακή τοποισομεράση (DA γυράση) είναι στόχος αντιβιοτικών 8 ri C
6. Η αντιγραφή του DA ξεκινά από ένα σημείο και εξελίσσεται προοδευτικά προς τις δυο κατευθύνσεις, E. coli genome 9 Διχάλα
---, σχηματίζοντας δυο διχάλες αντιγραφής Διχάλα αντιγραφής 3 Β. Μηχανισμός 10
Β. Μηχανισμός της Αντιγραφής του DA 1. Επιλογή του σημείου έναρξης της αντιγραφής στην Ε. Coli Η έναρξη της αντιγραφής πραγματοποιείται στο oric (origin of Chromosomal replication). To oric περιέχει μια ΑΤ περιοχή και 4 επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες δέσμευσης της πρωτείνης DnaA 11 DnaA-B- SSB
2. Διαχωρισμός των δυο κλώνων και σχηματισμός συμπλόκου προ-εκκίνησης. DnaA, DnaB (Ελικάση) και SSB (single strand binding) στις διχάλες αντιγραφής Πρόσδεση της DnaA στο oric Σύμπλοκο προ-εκκίνησης Διαχωρισμός των δύο κλώνων (Α/Τ) SSB SSB SSB SSB DnaB Δέσμευση της ελικάσης DnaB Δέσμευση της SSB στο μονόκλωνο DA Ο διαχωρισμός των δύο κλώνων επεκτείνεται προς τις δυο κατευθύνσεις σχηματίζοντας 2 διχάλες αντιγραφής Εναρξη επιμήκυνση 12 primase
3. Έναρξη και επιμήκυνση Ένα μόριο RA εκκίνησης (primer) που συντίθεται από την εκκινητάση (ειδική RA πολυμεράση) είναι απαραίτητο για την έναρξη σύνθεσης DA H DA πολυμεράση ΔΕΝ συνδέει εξ αρχής δύο ανεξάρτητα νουκλεοτίδια, επιμηκύνει έναν προυπάρχοντα κλώνο. Η Εκκινιτάση (primase) συνδέεται με το σύμπλοκο προ-εκκίνησης και συνθέτει ένα βραχύ (~10n) μόριο RA εκκίνησης To RA εκκίνησης θα επιμηκυνθεί ως DA από την DA πολ. ΙΙΙ και θα υδρολυθεί από την -> εξωνουκλεολυτική δράση της DA πολ. Ι 13 okazaki
Ο ένας κλώνος του DA συντίθεται συνεχώς (προπορευόμενος, leading strand), ενώ ο άλλος (καθυστερών / υπολειπόμενος, lagging strand) συντίθεται κατά τμήματα (τμήματα kazaki) Η DA pol συνθέτει DA πάντα με κατεύθυνση -> Διχάλα αντιγραφής Μεταξύ των τμημάτων kazaki αποκαθίστανται οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί από την DA λιγάση, αφού τo RA εκκίνησης υδρολυθεί από την -> εξω-νουκλεολυτική δράση της DA πολ. Ι (ick translation) kazaki 14 ligase
Η λιγάση του DA (ligase) συνδέει το -ΟΗ άκρο ενός μορίου DA με το ΡΟ3 άκρο ενός δεύτερου μορίου σε δίκλωνες περιοχές, π.χ στα τμήματα kazaki Μηχανισμός 15
Μηχανισμός αντίδρασης λιγάσης του DA Lys Ligase (E) 1. Ligase (E) + ATP PPi + E-AMP Α P H φωσφαμιδικός δεσμός E-AMP H H 2. E-AMP + P--DA E + AMP--DA Α P H H P - 5'-DA 5-5 φωσφοδιεστειρικός δεσμός AMP--DA 3. Α P P DA-3' --H + DA-- P AMP--DA - 5'-DA - 5'-DA + AMP-H H H Ασύμμετρη αλλά συντονισμένη 16
Η σύνθεση των δυο κλώνων DA συντελείται ταυτόχρονα Πώς είναι δυνατή η ανάπτυξη της διχάλας αντιγραφής προς τη μια κατεύθυνση και η σύγχρονη αντιγραφή και των δυο κλώνων DA από την ίδια DA πολ.? Διχάλα αντιγραφής 3 Το «τύλιγμα» του καθυστερώντος κλώνου επιτρέπει τη συντονισμένη και σύγχρονη αντιγραφή και των δυο κλώνων DA. 17 DA pol ασύμμετρο διμερές
Δομικά/λειτουργικά χαρακτηριστικά του ολοενζύμου της DA πολυμεράσης III Εξαιρετική καταλυτική ισχύς Πιστότητα Επεξεργασημότητα / Processivity Sliding clamp Ασύμμετρο διμερές loader Polymerase 3'-5' exonuclease Η β υπομονάδα αστεροειδής δακτύλιος Polymerase 18
Η επεξεργασιμότητα -δηλ. η συνεχής αντίδραση πολυμερισμού- οφείλεται στη δομή της διμερούς υπομονάδας β, που λειτουργεί ως «ολισθαίνον σφιγκτήρας» Η αντίστοιχη ανθρώπινη πρωτείνη είναι τριμερής (PCA, proliferating cell nuclear antigen) Σύνοψη 19
Συνοπτική εικόνα της αντιγραφής του DA Αναγνώριση του σημείου έναρξης και διαχωρισμός των κλώνων (DA Α,Β ελικάση), δέσμευση SSB και διατήρηση της μονόκλωνη δομής. Η τοπο-ισομεράση προηγείται και απελευθερώνει τη τάση που δημιουργείται. Διορθώστε!!! Η DA εκκινητάση συνθέτει RA primers, επιμήκυνση του DA Τα τμήματα kazaki στον καθυστερούντα κλώνο, μετά την υδρόλυση του εκκινητή RA και την κάλυψη των κενών από την DA πολ. Ι συνδέονται από την DA λιγάση Το «τύλιγμα» του καθυστερούντος κλώνου επιτρέπει τη συντονισμένη και παράλληλη αντιγραφή και των δυο κλώνων DA, από την ίδια DA πολ. και την ανάπτυξη της διχάλας αντιγραφής προς μια κατεύθυνση 20 Ευκαρυωτες
Η σύνθεση του DA είναι πιο σύνθετη στα ευκαρυωτικά κύτταρα Μεγάλο μέγεθος DA ( E. Coli 4.8 10 6 bp vs Human 6 10 9 bp), πολλαπλά χρωμοσώματα, χρωματίνη. Πέντε DA πολυμεράσες, α, β, γ, δ, ε. (β: repair, γ: mitochondrial) Πολλαπλά σημεία έναρξης ενεργοποιούνται ασύγχρονα στην S φάση του κυτταρικού κύκλου. Μηχανισμοί έγκρισης (licensing factors) επιτρέπουν κάθε ρεπλικόνιο να αντιγράφεται μια φορά ανά κυτταρικό κύκλο. Τα χρωμοσώματα είναι γραμμικά και τα άκρα (τελομερή) θα «μίκραιναν» σε κάθε κύκλο αντιγραφής!! 21 ARS cloning
Απομόνωση ρεπλικονίων (ARS: Autonomously replicating sequence) από το γονιδίωμα του σακχαρομήκυτα Eισαγωγή των πλασμιδίων σε κύτταρα ζύμης Τυχαία θραύσματα DA φορέας Ανασυνδυασμένο DA Επιλογή His+ αποικιών + Θραύσμα DA-ARS His γονίδιομάρτυρας 22 Acyclovir
Η ακυκλοβίρη (Gertrude Elion) αναστέλλει ισχυρά την Ιική DA πολυμεράση και χρησιμοποιείται στη αντιμετώπιση του έρπη (HSV) Η αζιδοθυμιδίνη (ΑΖΤ) αναστέλλει την ρετρο-ιική αντίστροφη μεταγραφάση και χρησιμοποιείται στην αντιμετώπιση του HIV thymidine azidothymidine (AZT) 23 tελομερή
Η διατήρηση του μήκους των τελομερών και η λειτουργία της τελομεράσης (telomerase) Διχάλα αντιγραφής Σύμφωνα με το μηχανισμό αντιγραφής που συζητήσαμε, τα χρωμοσωμικά άκρα (τελομερή) θα «μίκραιναν» σε κάθε κύκλο αντιγραφής!!! 24 Τελομεράση
H τελομεράση επιμηκύνει το άκρο αποκαθιστώντας το μήκους του άκρου H τελομεράση φέρει δικό της εκμαγείο RA Ποια η προέλευση αυτού του RA?? 25 Χ ανασυνδυασμός
Ανασυνδυασμός του DA (DA Recombination) H αμοιβαία ανταλλαγή αλληλουχιών μεταξύ δύο μορίων DA μόλογος ανασυνδυασμός Ο ομόλογος ανασυνδυασμός συντελείται κατά τη διάρκεια της σύναψης στη μείωση, του γενικού ανασυνδυασμού στα βακτήρια και κατά την ανταλλαγή γενετικού υλικού στους ιούς Προϋποθέτει ομολογία DA μεταξύ των δυο γονικών μορίων Ο μοριακός μηχανισμός προτάθηκε από τους Holliday and Whitehouse (1964). 26
Heteroduplex DA Mπορεί να κινηθεί είτε μέχρι το τέλος του μορίου, είτε μέχρι το επόμενο ick, δημιουργώντας ένα τμήμα ανασυνδυασμένης αλληλουχίας 27
Holliday structure 28 Μταλλάξεις Επιδιόρθωση
Μεταλλάξεις 1. Απάλειψη (deletion) ενός ή περισσοτέρων ζευγών βάσεων 2. Εισδοχή (insertion) ενός ή περισσοτέρων ζευγών βάσεων 3. Αντικατάσταση (substitution) ενός ζεύγους βάσεων από ένα άλλο : Μετάπτωση (transition) Pu->Pu, Py->Py Μεταστροφή (transversion) Pu->Py, Py->Pu Επιδιόρθωση του DA ` Η διεργασία απομάκρυνσης των αταίριαστων βάσεων που: 1. Διαφεύγουν (αν και σπάνια) από τους μηχανισμούς «ορθής επανάληψης» της αντιγραφής του DA 2. Συμβαίνουν φυσιολογικά ως αυθόρμητες χημικές μεταβολές 3. Επάγονται από περιβαλλοντικούς μεταλλαξογόνους παράγοντες (Χημικά, UV, X-rays) i μεταλλάξεις βραχυπρόθεσμα δεν είναι επιθυμητές!!! 29 H2
1. Xημικά μεταλλαξογόνα τροποποιούν το DA αλλάζοντας την συμπληρωματικότητα των βάσεων H 2 H 2 H Α H Τ H CH 3 G C H ΗΝΟ 2 H 2 Μe Υ H H Υποξανθίνη C H ΜG Ο 6 ΜeG H Τ H CH 3 Μετάλλαξη Τ -> C Μετάλλαξη G->A -To ΗΝΟ 2 αντιδρά με βάσεις που περιέχουν αμινο-ομάδες: H αδενίνη απαμινώνεται οξειδωτικά προς υποξανθίνη, η κυτοσίνη προς ουρακίλη και η γουανίνη προς ξανθίνη -Αλκυλιωτικοί παράγοντες μεθυλιώνουν βάσεις πχ το Ο 6 γουανίνης, ή την 3 θέση αδενίνης (3Me-A) 30 Πώς
I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I Πώς η χημική τροποποίηση μιας βάσης οδηγεί σε μετάλλαξη? οκ I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I C G Τ CH3-G Me Aντιγραφή CH3-G C C G + ups!!! Aντιγραφή CH 3 Τ ΜG H CH3-G Τ Α Τ + H Ο 6 ΜeG Μετάλλαξη G->A C to U 31 II I I I I I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
2. Αυθόρμητη απαμίνωση Κυτοσίνης σε Ουρακίλη in vivo H 2 C H H 2 H G H ξειδωτική απαμίνωση H 2 H 3 C H Τ = H U H H Α H Η U αναγνωρίζεται από το σύστημα επιδιόρθωσης και αφαιρείται Η Τ δεν αναγνωρίζεται από το σύστημα επιδιόρθωσης και έτσι υποκαθιστά την U DA 32 υπεριόδες
3. Το UV δημιουργεί διμερή πυριμιδινών, ασύμβατα με την αρχιτεκτονική της διπλής έλικας μελάνομα Τ Τ UV μελάνομα 33 Ταυτομερίωση
4. Ταυτομερείωση και αυθόρμητη εμφάνιση μεταλλάξεων Ταυτομερείωση: Aλληλομετατροπή ισομερών που διαφέρουν ως προς τη θέση πρωτονίων/διπλών δεσμών. Μεταβατικές ταυτομερείς μορφές σχηματίζονται συχνότερα από ανάλογα βάσεων π.χ. 5-Br-ουρακίλη H 2 Κετο- > C= Br BrU H H Α H H 5-Br-ουρακίλη είναι ένα χημικό μεταλλαξογόνο που ενσωματώνεται στη θέση της θυμίνης ενολ- C-H H Br BrU* H H 2 H G H Μετάλλαξη A ->G 34 ακριδίνες
Aρωματικά μόρια πχ οι χρωστικές ακριδίνες είναι χημικά μεταλλαξογόνα που προκαλούν μεταλλάξεις απάλειψης και ένθεσης Μερικές αδρανείς ενώσεις μετατρέπονται σε εξαιρετικά δραστικά μεταλλαξογόνα μέσω ενζύμων αποτοξίκωσης (μονοξυγενάσες CYΡ450) 35 Ames
Η δοκιμασία Ames Η μεταλλαξογόνος δράση ενός χημικού παράγοντα έλέγχεται με βάση τη συχνότητα πρόκλησης μετάλλάξεων σε βακτήρια, πχ η ανάστροφη μετάλλαξη που επανακαθιστά τα βακτήρια πρωτότροφα για ιστιδίνη His - His + Σε ορισμένες περιπτώσεις, η μεταλλαξογόνος δράση ανιχνεύεται μόνο με προ-επώαση του χημικού παράγοντα με ηπατικά εκχυλίσματα His- His+ 36 επιδιόρθωση
Χρησιμοποιούνται ποικίλες πορείες επιδιόρθωσης του DA 1. Άμεση επιδιόρθωση (direct repair) 2. Εκτομή βάσης 3. Εκτομή νουκλεοτιδίου Άμεση επιδιόρθωση 1. Άμεση επιδιόρθωση: -- Φωτοχημική διάσπαση διμερών πυριμιδινών: Η DA φωτολυάση προσδένεται στη παραμορφωμένη περιοχή του DA και με την ενέργεια του φωτός διασπά το διμερές πυριμιδινών στις αρχικές του βάσεις (E.coli, yeast) -- Η Μεθυλ-μεταφοράση Ο 6 MeG αφαιρεί την Μe oμάδα απο τη γουανίνη 37 C->U Εκτομή βάσης
2. Εκτομή βάσης Αυθόρμητη απαμίνωση Κυτοσίνης σε Ουρακίλη H 2 C H ξειδωτική απαμίνωση H 2 H G H 2 H Η γλυκοσιλάση ουρακίλης «ψάχνει» και απομακρύνει ουρακίλες (προιόντα συχνής απαμίνωσης κυτοσίνης) Η Ρ-ριβόζη απομακρύνεται και οι DA-pol και λιγάση αποκαθιστούν το κενό Η εξέλιξη αυτού του συστήματος επιδιόρθωσης εξηγεί / είναι συμβατό με το ό,τι το DA χρησιμοποιεί θυμίνη αντι για ουρακίλη!! U H Α H H 38 Εκτομή νουκλεοτιδίων
3. Εκτομή νουκλεοτιδίου -- Εκτομή διμερούς πυριμιδινών Ανίχνευση της παραμόρφωσης της διπλής έλικας και υδρόλυση φωσφοδιεστερικών δεσμών στις θέσεις -8, +4 Απομάκρυνση της αλλοιωμένης αλυσίδας από την εκτομάση (excinuclease) και επανασύνθεση από DA πολ. Ι και λιγάση Η μελαγχρωματική ξηροδερμία (xeroderma pigmentosum) προκαλείται από μεταλλαγές στο σύστημα απομάκρυνσης διμερών πυριμιδινών (ατέλειες στη λειτουργία εκτομάσης) 39 Lynch
--- Εκτομή αταίριαστων βάσεων (mismatch repair) Ελαττωματική επιδιόρθωση αταίριαστων ζευγών προκαλεί μη πολυποδικό καρκίνο του παχέος εντέρου (σύνδρομο Lynch 1:200!!!) Mεταλλάξεις στα γονίδια hmsh1 hmsh2 ευθύνονται για τις περισσότερες περιπτώσεις προδιάθεσης Τα γονίδια hmsh1 hmsh2 είναι τα ανθρώπινα αντίστοιχα των MutS, MutL της E. coli 40 huntigtine
Huntigton s disease Επέκταση επαναλήψεων CAG (polyq) --- CAG CAG --- GTC GTC ---- CAG CAG CAG CAG ---- ---- CAG CAG CAG CAG ---CAG CAG CAG CAG ---- Οι επαναλήψεις τείνουν να επεκτείνονται από τη μια γενιά στην επόμενη Επίσπευση/πρόβλεψη (αnticipation): Οι απόγονοι ενός προσβεβλημένου γονέα έχουν τη τάση να εμφανίζουν συμπτώματα της ασθένειας σε νεώτερη ηλικία από ό,τι ο γονέας 6-30 Q 35-80Q 41
Ασκήσεις Stryer Σελ. 876-877 1, 3, 6, 7, 11, 15. Lehninger Kεφ. 26 2, 5, 6, 9. 42
Η ενεργοποίηση ρεπλικονίων και η εξέλιξη της αντιγραφής παρακολουθούνται με πειράματα μικροσυστοιχειών 43 Χ ARS cloning
Η δίκλωνη δομή του DA επανασχηματίζεται αυθόρμητα 44 Β Α Ζ
Το DA μπορεί να βρίσκεται σε διάφορες διαμορφώσεις αύλακες B-DA: Το πιο κοινό, 10 bp ανά δεξιόστροφη έλικας A-DA: 11 bp ανά στροφή, RA/DA and RA/RA. Z-DA: Αριστερόστροφη έλικα. Τριπλή έλικα: πολυ Pu-πολυ Py-πολυ Py 45
Η κάθε αύλακα (μεγάλη ή μικρή) περιέχει διαφορετικά άτομα που μπορεί να είναι δότες ή δέκτες δεσμών υδρογόνου και επιτρέπει διαφορετκές αλληλεπιδράσεις με πρωτείνες 46 Κυτταρική διαίρεση
5. Το τοπικό ξετύλιγμα των δύο κλώνων οδηγεί σε έντονο υπερτύλιγμα των γύρω περιοχών Ειδικές τοποϊσομεράσες εισάγουν αρνητικά υπερσπείράματα και ευνοούν τον διαχωρισμό των κλώνων παρεμποδίζοντας τις τάσεις που αναπτύσσονται Τοποισομεράσες τύπου ΙΙ : Εισαωγή αρνητικών υπερσπειραμάτων, κατανάλωση ΑΤΡ, Διάσπαση και των δυο κλώνων του DA Τοποισομεράσες τύπου Ι : Μερική χαλάρωση υπερπειρωμένου DA, θερμοδυναμικά ευνοϊκή διεργασία με διάσπαση του ενός κλώνου DA Η βακτηριακή τοποισομεράση (DA γυράση) είναι στόχος αντιβιοτικών 47 ri C
Ταυτομερείωση και αυθόρμητη εμφάνιση μεταλλάξεων Ταυτομερείωση: Aλληλομετατροπή ισομερών που διαφέρουν ως προς τη θέση πρωτονίων (ή και διπλών δεσμών) H 2 Άμινο- -ΝΗ2 H Α H Τ H CH 3 10-4 Ίμινο- =ΝΗ H H Α* H H 2 C H Μετάλλαξη Τ -> C 48 Br-U