Άσκηση 7 Προσομοίωση 3D Δομών Βιομορίων μέσω Ομολογίας & Threading
Προσομοίωση 2ταγούς δομής πρωτεϊνών Δευτεροταγής Δομή: Η 2ταγής δομή των πρωτεϊνών είναι σταθερή τοπική διαμόρφωση της πολυπεπτιδικής Αλυσίδας. Είναι καθοριστικής σημασίας για την 3D δομή κάθε πρωτεΐνης. Τα πιο κοινά στοιχεία της 2ταγούς δομής είναι η α-έλικα και η β-πτυχωτή επιφάνεια. Υπολογίζεται ότι τουλάχιστον το 50% του συνολικού αριθμού των αμινοξέων στις γνωστές πρωτεϊνικές δομές συμμετέχει σε αυτά τα δύο είδη 2ταγούς δομής. Προβλέπεται ως εξής (ΑΣΚΗΣΗ 3, Σελίδα 50, Μοριακή Προσομοίωση ): ab initio πρόβλεψη η 2ταγής δομής προβλέπεται λαμβάνοντας υπ όψιν την τάση του κάθε αμινοξέος να στρέψει τον πεπτιδικό σκελετό (σε επίπεδο φ και ψ δίεδρων γωνιών που ορίζονται από τα τέσσερα άτομα του σκελετού N-Cα-C=O). Παράδειγμα ab initio πρόβλεψης αποτελούν τα πρωτόκολλα Chou-Fasman και Garnier, Osguthorpe, Robson (GOR) Πρόβλεψη μέσω Ομολογίας Συνδυάζει ab initio μεθόδους πρόβλεψης 2ταγούς δομής και στοιχεία που βασίζονται στην ομολογία 2 ή >2 ακολουθιών αμινοξέων. Βασίζεται στην ιδέα είναι ότι οι ομόλογες ακολουθίες συνήθως υιοθετούν παρόμοια 2ταγή και 3ταγή δομή.
Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Το μεγαλύτερο άλυτο πρόβλημα της Δομικής Βιολογίας είναι το λεγόμενο «πρόβλημα της αναδίπλωσης των πρωτεϊνών». Μετά από 40 χρόνια εξέλιξης στο πεδίο αυτό, η πρόβλεψη/προσομοίωση δομών πρωτεϊνών, συνεχίζει να αποτελεί ένα από τα πιο ενεργά ερευνητικά πεδία στη Δομική Βιοχημεία/Βιολογία και στο σχεδιασμό ενώσεων με βιολογικό και φαρμακευτικό/κλινικό ενδιαφέρον. Η ερευνητική δραστηριότητα στο συγκεκριμένο πεδίο, κατάφερε να επιτύχει την αποτελεσματική εφαρμογή νέων υπολογιστικών προσεγγίσεων για την προσομοίωση δομών πρωτεϊνών. Οι προσεγγίσεις αυτές μπορούν να τοποθετηθούν σε τρεις άξονες: Προσομοίωση μέσω ομολογίας Συγκριτική Προσομοίωση, Προσομοίωση μέσω Threading, Προσομοίωση ab initio, ή de novo προσομοίωση. Και οι τρεις μέθοδοι είναι προσεγγιστικές προβλέψεις, με την έννοια ότι οι δομές οι οποίες προκύπτουν είναι δομικά μοντέλα και όχι δομές οι οποίες βασίζονται σε πειραματικά δεδομένα, όπως αυτά προκύπτουν από την Κρυσταλλογραφία Ακτίνων-Χ καιαπότηνφασματοσκοπίαnmr.
Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Σχηματική απεικόνιση της ποιότητας και ακρίβειας των δομικών μοντέλων ανάλογα με την μέθοδο μοριακής προσομοίωσης, Προσομοίωση μέσω Ομολογίας (ή Συγκριτική Προσομοίωση), Threading και de novo (ή ab initio) προσομοίωση. Τα παραδείγματα της συγκριτικής προσομοίωσης βασίζονται σε περίπου 60% (Α), 40% (B) και 30% (C) ταυτότητα αμινοξικής ακολουθίας. Τα παραδείγματα της de novo (ab initio) προσομοίωσης παρουσιάζονται στο (D) και (Ε). Οι δομές που προβλέφθηκαν είναι με κόκκινο και οι πραγματικές δομές με μπλε.
Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Προσομοίωση μέσω ομολογίας (Συγκριτική Προσομοίωση Homology Modeling Η προσομοίωση μέσω ομολογίας αποδίδει σχετικά υψηλής ακρίβειας 3D μοντέλα πρωτεϊνών, οι οποίες βασίζονται σε ομοιότητες στην αμινοξική ακολουθία τις οποίες εμφανίζει κάποια διαθέσιμη 3ταγή δομή στην βάση PDB. Οι πρωτεΐνες οι οποίες εμφανίζουν το μεγαλύτερο βαθμό ταυτότητας ή ομολογίας είναι αυτές για τις οποίες επιτυγχάνεται με μεγαλύτερη ακρίβεια και αξιοπιστία η προσομοίωσή τους. Σαν ένας γενικός κανόνας, η επιτυχία στην προσομοίωση μπορεί να οριστεί ως η μέση συμφωνία των συντεταγμένων μεταξύ της πρωτεΐνης της οποίας η δομή προσομοιάζεται και της δομής η οποία χρησιμοποιείται ως εκμαγείο (η γνωστή πειραματικά υπολογισμένη δομή, η οποία μέσω της ομολογίας θα κατευθύνει την αναδίπλωση της πρωτεΐνης με άγνωστη δομή). Είναι η σύγκλιση κατά 0,3 Å για κάθε 10% αύξηση της ταυτότητας/ομολογίας ανάμεσα στις δύο ακολουθίες. Η προσομοίωση μέσω ομολογίας δεν μπορεί να εφαρμοστεί με αποτελεσματικότητα και αξιοπιστία για την προσομοίωση και την πρόβλεψη δομών πρωτεϊνών οι οποίες εμφανίζουν <25-30% ταυτότητα αμινοξικής ακολουθίας (ανάμεσα στην ακολουθία της πρωτεΐνης με τη μη διαθέσιμη δομή και της πρωτεΐνης με τη γνωστή δομή διαθέσιμη στη PDB).
Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Τα βασικά στάδια της Προσομοίωσης μέσω ομολογίας είναι: Αντιστοίχιση της ακολουθίας αμινοξέων της πρωτεΐνης με την άγνωστη δομή στην ακολουθία της πρωτεΐνης με τη γνωστή δομή και επιλογή της πρωτεϊνικής δομής διαθέσιμης στην PDB. Χρήση της αντιστοίχισης των ακολουθιών για την επιλογή & αντικατάσταση τμημάτων του σκελετού (συνήθως θηλιές, οι δομές των οποίων είναι συγκεντρωμένες και διαθέσιμες σε ειδικές βιβλιοθήκες ακολουθιών γνωστές για το σχηματισμό θηλιών), τα οποία χρειάζεται να υποστούν διαμορφωτικές τροποποιήσεις κατά την προσομοίωση. Αυτό συμβαίνει όταν μεταξύ των δύο υπό σύγκριση ακολουθιών υπάρχουν τμήματα τα οποία εμφανίζονται ή απουσιάζουν σεκάποιααπότιςδύοακολουθίες Αντικατάσταση των πλευρικών αλυσίδων αμινοξέων τα οποία διαφέρουν ανάμεσα στις δύο ακολουθίες. Βελτιστοποίηση του μοντέλου που προκύπτει από την προσομοίωση, με χρήση πρωτοκόλλων Μοριακής Μηχανικής/Δυναμικής για την ελαχιστοποίηση της ενέργειας του συστήματος (μήκη/γωνίες δεσμών, στερεοχημικές αλληλεπιδράσεις, δεσμοί-η, κ.λ.π.) Έλεγχος της ποιότητας, σε επίπεδο ανάλυσης και ορθότητας, των μοριακών δομών με χρήση λογισμικού μοριακής απεικόνισης και αποτίμησης μοριακών δομών (λογισμικό PROCHECK).
Σχηματική απεικόνιση των βασικών σταδίων της προσομοίωσης δομών πρωτεϊνών μέσω ομολογίας. Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών
Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Τα πιθανά σφάλματα της Προσομοίωσης μέσω ομολογίας είναι: Σφάλματα στη διάταξη/πακετάρισμα των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων (παρατηρούνται μεγαλύτερες διαφορές ανάμεσα στις πλευρικές αλυσίδες των αμινοξέων της πρωτεΐνης-στόχου και της πρωτεΐνης αναφοράς σε σχέση με τον πεπτιδικό σκελετό, τα άτομα του οποίου παραμένουν ίδια). Σφάλματα και αποκλίσεις από την πρωτεΐνη-αναφοράς ακόμα και σε σωστά αντιστοιχισμένες περιοχές της ακολουθίας ως επακόλουθο της διαφοράς στη συγκεκριμένη περιοχή ανάμεσα στην πρωτεΐνη-αναφοράς και στην πρωτεΐνη-στόχο. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε στο μέσο, διάλυμα ή στερεά κατάσταση και στον τρόπο υπολογισμού της δομής, είτε στα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων που διαφέρουν ανάμεσα σε πρωτεΐνη-στόχο και αναφοράς. Σφάλματα στην περιοχή όπου δεν υπάρχει διαθέσιμη δομή-αναφοράς (εκμαγείο), και συνήθως οφείλεται σε απουσία πεπτιδικών τμημάτων στη δομή αναφοράς Σφάλματα λόγω μη ακριβής ή παραπλανητικής αντιστοίχισης των ακολουθιών της πρωτεΐνης-στόχου και της πρωτεΐνης-αναφοράς. Σφάλματα τα οποία οφείλονται σε λάθος επιλογή της πρωτεΐνης αναφοράς, ένα πρόβλημα το οποίο είναι συχνό όταν μακρινές (<25% ταύτιση αμινοξικών ακολουθιών) μεταξύ τους πρωτεΐνες συγκρίνονται (μέσω MOLMOL).).
Προσομοίωση μέσω Threading Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Τί είναι το Threading ; ο O όρος threading σημαίνει διασχίζω, διαγραμμίζω, διαπερνώ, διαπερνώ ένα σύρμα μέσα σε ένα σωλήνα. Η κεντρική ιδέα της προσέγγισης αυτής βασίζεται στη διαπίστωση ότι ενώ υπάρχουν εκατομμύρια γνωστών πρωτεϊνικών ακολουθιών αμινοξέων, ο αριθμός των γνωστών μέχρι τώρα διαφορετικών τύπων αναδίπλωσης είναι κατά πολύ μικρότερος (~1.100). Ως γνωστόν, οι πρωτεϊνικές δομές είναι περισσότερο συντηρημένες από τις πρωτεϊνικές ακολουθίες. Συνεπώς πολλές πρωτεΐνες μοιράζονται έναν κοινό τύπο αναδίπλωσης της πολυπεπτιδικής τους αλυσίδας ακόμα και χωρίς να εμφανίζουν ομοιότητες στην ακολουθία των αμινοξέων τους. Η προσέγγιση αυτή επιχειρεί να προβλέψει την τρισδιάστατη δομή της πρωτεΐνης ξεκινώντας από την αμινοξική της ακολουθία και βασίζεται στην ιδέα ότι η ακολουθία της πρωτεΐνης-στόχου διασχίζει κατά μήκος και σταδιακά, αμινοξύ προς αμινοξύ, τον σκελετό μιας οικογένειας πρωτεϊνικών δομών-εκμαγείων (η οικογένεια των δομών αυτό αποτελεί τη βιβλιοθήκη τύπων αναδίπλωσης). Γιαναγίνειαυτόπρέπει...
Προσομοίωση μέσω Threading Για να γίνει αυτό πρέπει... Προσομοίωση 3ταγούς δομής πρωτεϊνών Για κάθε μοτίβο αναδίπλωσης αναζητείται η καλύτερη στοίχιση της αλληλουχίας στόχου ώστε να είναι συμβατή με το μοτίβο. Τα υδρόφοβα αμινοξέα πρέπει να βρίσκονται στον πυρήνα, τα πολικά στην επιφάνεια και τα στοιχεία 2ταγούς δομής να στοιχίζονται. Για να ταιριάζει μια αμινοξική ακολουθίαμεέναγνωστόμοτίβοαναδίπλωσης δημιουργείται ένα 3D προφίλ, όπου το περιβάλλον κάθε αμινοξέος καθορίζεται από: (1) εμβαδό επιφάνειας πλευρικής αλυσίδας (2) κλάσμα επιφάνειας πλευρικής αλυσίδας που καλύπτεται από πολικά άτομα (3) δευτεροταγή δομή, όπως α-έλικα, β-πτύχωση, στροφή Δημιουργούνται έξι τάξεις με βάση τις ιδιότητες 1 & 2 και με βάση την ιδιότητα 3 γίνονται 18 τάξεις. Κάθε αμινοξύ εμφανίζει διαφορετική προτίμηση για κάθε μία από τις 18 τάξεις. Στην συνέχεια η 3D δομή ανάγεται σε 1D αλληλουχία με βάση αυτές τις ιδιότητες προτιμήσεων κάθε αμινοξέος και ταιριάζεται με την αλληλουχία της πρωτεΐνης-στόχου για την οποία επίσης προβλέπονται οι ιδιότητες των αμινοξέων της. Κάθε αμινοξύ ταιριάζεται βήμα-βήμα με τα αμινοξέα των πρωτεϊνών με γνωστή 3D δομή καιγνωστότύποαναδίπλωσης, αποδίδοντας την επιτυχία της στοίχισης ώς μια παράμετρο, γνωστή ως Score-Z.