Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ macroh2a ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΟΥ ΕΠΑΓΟΝΤΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΙΚΗ ΜΟΛΥΝΣΗ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΙΣΤΟΝΗΣ macroh2a ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΠΟΥ ΕΠΑΓΟΝΤΑΙ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΙΙΚΗ ΜΟΛΥΝΣΗ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΙΩΑΝΝΗΣ ΒΑΤΣΕΛΛΑΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. Χατζοπούλου Κλαδαρά Μαργαρίτα, Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 2. Μόσιαλος Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 3. Θάνος Δημήτριος, Ερευνητής Α, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 4. Αρσενάκης Μηνάς, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 5. Γιάγκου Μηνάς, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 6. Θάνος Δημήτριος, Ερευνητής Α, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών 7. Λάζου Αντιγόνη, Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 8. Μόσιαλος Γεώργιος, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 9. Σκούρας Ζαχαρίας, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 10. Χατζοπούλου Κλαδαρά Μαργαρίτα, Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής από το Tμήμα Βιολογίας της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα. Ν. 5343/1932, άρθρο 202 1

Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε κατά: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαικη Ενωση-Ευρωπαικό Κοινοτικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο-Υπουργείο Ανάπτυξης-Γενική Γραμματεί Ερευνας και Τεχνολογίας Και από τον Ιδιωτικό Τομέα Στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα-Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης 2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η κατάκτηση ενός στόχου όπως η ολοκλήρωση μιας ερευνητικής διδακτορικής διατριβής είναι μια δύσκολη και εξουθενωτική υπόθεση. Η πορεία είναι γεμάτη στροφές και εμπόδια, εναλλασσόμενα όμως με όμορφα τοπία και εκθαμβωτική θέα. Όπως και να έχει όμως είναι αρκετά μεγάλη και απαιτητική, με συνέπεια η ολοκλήρωση της να απαιτεί την καθοδήγηση και την συμπαράσταση των κοντινών σου ανθρώπων. Αυτών που είχες ήδη, αλλά και αυτών που απέκτησες κατά την πορεία αυτή. Σε όλους αυτούς λοιπόν που βρέθηκαν πλάι μου αυτά τα 7 χρόνια και κυρίως σε αυτούς που δε θα αναφερθώ προσωπικά παρακάτω, ένα μεγάλο ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ και ελπίζω να φάνηκα αντάξιος της στήριξης και της συμπαράστασης τους. Ιδιαίτερη μνεία οφείλω να κάνω στον κόσμο του εργαστηρίου. Τον Δρ. Θάνο, που μου παρείχε το χώρο και τα εφόδια, υλικά και πνευματικά, για να πραγματοποιήσω αυτό το διδακτορικό. Τα παιδιά με υποδέχτηκαν ως ψαρά στο εργαστήριο, από την εποχή του Αλ. Φλεμινγκ. Το Γιώργο Κουτρούμπα, τον Άγγελο Μπανό, τον Αλέξανδρο Bro κουμπάρο Πολύζο, την Ευτυχία Αρσενάκη Αποστόλου, τον Πάνο ΝΤΖ Ντζιαχρήστο, τον Ηλία γρήγορο Νόλη, την Αθηνά Αντωνάκη, το Μάριο Αγγελόπουλο και τη Ντέπυ Παπαδοπούλου. Στην πορεία κάποιοι ήρθαν και κάποιοι έφυγαν, αλλά όλοι προσέθεσαν το λιθαράκι τους στο εργαστήριο-τρελοκομείο. Ο Γιώργος Σιανίδης, Ο Ethan Oh no Ford, το γαλλάκι ο Mathieu Lavigne, η Εύα Μαντούβαλου, ο Γιάννης Μαραζιώτης, ο Στέφανος Τσιφτσσσόγλλλου, η Χρύσα Νικοπούλου, η Μαρία Παπαθανασίου και φυσικά ο Αντωνάκης Λουκάς Βύντρα - Σίλβα Κλέιτον Κόκκαλης και ο Θοδωρής GM Γεωργομανώλης. Περαιτέρω, οφείλω να ευχαριστήσω το Δρ. Μόσιαλο, τη Δρ. Χατζοπούλου-Κλαδαρά και τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, τους καθηγητές Δρ. Γιάγκου, Δρ. Σκούρα, Δρ. Αρσενάκη και Δρ. Λάζου. Σε όσους όμως και να αναφερθώ, όσα και να πω είναι λίγα σε αυτά που χρωστάω στους αφανείς ήρωες όλης αυτής της ιστορίας, τους γονείς μου. Σε αυτούς και τη Μαριλένα είναι αφιερωμένη η διδακτορική αυτή διατριβή για τα 7 αυτά χρόνια κατανόησης και στήριξης και τα υπόλοιπα 23 ανατροφής και παίδευσης. Ελπίζω να είναι υπερήφανοι 3

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ......... 9 SUMMARY.......13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ..16 Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑ ΣΤΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΕΠΙΠΕΔΟ...17 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ......18 ΕΠΙΠΕΔΑ ΟΡΓΑΝΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ DNA...... 20 Το νουκλεόσωμα......21 Από τη χρωματίνη στο χρωμόσωμα.....22 Ευχρωματίνη και ετεροχρωματίνη...24 Η οργάνωση του πυρήνα....... 25 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ.... 27 Επίπεδα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης......28 Μεταγραφικός έλεγχος.......30 In cis ρυθμιστικές αλληλουχίες.. 31 Μεταγραφικοί παράγοντες..........34 Συνεργατική πρόσδεση........35 Μεταγραφική συνέργεια.....37 Παρεμπόδιση του RNA και ρετρό-ιοί...... 38 ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ..... 40 Κυτταρική απόκριση στη ιϊκή μόλυνση Ο ιός Sendai.....42 ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΚΑΙ ΣΗΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF-κB...44 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ....49 Μετά-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών.....51 Μηχανισμοί αναδόμησης της χρωματίνης...... 54 Ιστονικές ποικιλομορφές.... 57 Κατανομή των νουκλεοσωμάτων στο γονιδίωμα... 59 Ρύθμιση της επαγόμενης έκφρασης της Ιντερφερόνης β (IFNβ).. 63 ΔΟΜΗ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΚΑΙ ΙΣΤΟ-ΕΙΔΙΚΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΑ 4

ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ.....71 Η ΙΣΤΟΝΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΜΟΡΦΗ macroh2a... 72 Ο ρόλος της macroh2a στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης......76 Ο ρόλος της macroh2a στην ιστό-ειδική ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της Ιντερλευκίνης 8 (IL-8)....... 80 ΣΤΟΧΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΗΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ: Η macroh2a ΚΑΙ Η ΙΣΤΟ-ΕΙΔΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΩΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ......83 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΩΝ ΘΕΣΕΩΝ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ NF-κΒ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑ 86 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ......90 ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ.......91 Μόλυνση με ιό Sendai.......92 ΤΟ ΛΕΝΤΙ-ΙΪΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ pll3.7... 92 Σχεδιασμός των shrna αλληλουχιών...... 94 Κλωνοποίηση των shrna στους φορείς plentilox3.7 (pll3.7)....... 96 Κατασκευή των φορέων υπερ-έκφρασης της macroh2a1............97 Παραγωγή των λέντι-ιών και παροδική διαμόλυνση........98 Μόλυνση των κυττάρων και τιτλοδότηση των λέντι- ιών......99 Επιλογή μολυσμένων κυττάρων με FACS......101 ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ DNA..... 103 Το πλακάκι μικροσυστοιχιών HG-U133 plus 2.0.. 104 Πειραματικός σχεδιασμός.... 105 Απομόνωση, ανάλυση και αντίστροφη μεταγραφή του RNA.... 106 Υβριδοποίηση του cdna στα πλακάκια έκφρασης HG-U133 plus 2.0 και μορφοποίηση των αποτελεσμάτων... 108 Επεξεργασία και στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων.... 109 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΡΥΘΜΟΥ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ...112 ΜΕΤΡΗΣΗ ΤΟΥ ΒΑΘΜΟΥ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΠΛΗΘΥΣΜΩΝ...... 113 ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ ΚΑΤΑ WESTERN.. 114 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΥ... 115 ΑΝΟΣΟ-ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ.....116 5

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ ΚΑΙ ΜΟΝΟΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΩΝ...... 119 ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΒΑΚΤΗΡΙΑ E. Coli.. 122 Έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένου NF-κB..122 Έκφραση και καθαρισμός ανασυνδυασμένων ιστονών... 124 H2A, H2B, H3, H4... 124 macroh2a1...... 126 ΣΥΓΚΡΟΤΗΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑΤΩΝ IN VITRO...128 ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ IN VITRO....129 ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ IN VITRO.... 130 Ραδιοσήμανση εκκινητή.......133 ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΜΕΤΑΒΟΛΗΣ ΤΗΣ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗΣ ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ.....133 ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ LUC ΚΑΙ LacZ.......134 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ, ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ ΚΑΙ ΒΑΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ... 135 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ..... 139 I. ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΠΑΓΩΓΗΣ ΜΕΤΑ ΑΠΟ ΜΟΛΥΝΣΗ ΜΕ ΙΟ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΕΣ ΣΕΙΡΕΣ...140 Προσδιορισμός των ιό-επαγόμενων γονιδίων σε κύτταρα HeLa και NAMALWA στις 6 και στις 12 ώρες μετά τη μόλυνση με ιό.....141 Διαφορετικά πρότυπα απόκρισης των δυο κυτταρικών σειρών στη μόλυνση με ιό.....144 Ομοιότητες στη γονιδιακή επαγωγή μεταξύ των δυο κυτταρικών σειρών διαμόρφωση ενός αντί-ιϊκού πυρήνα γονιδίων....149 Ιστό-ειδική γονιδιακή επαγωγή των δυο κυτταρικών σειρών.....155 ΙΙ. Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ macroη2α ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ...... 159 Δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών με μακροχρόνια και λειτουργική καταστολή της έκφρασης της macroh2a1... 160 Προσδιορισμός των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται 6

από τη macroh2a1 στα κύτταρα HeLa και NAMALWA...164 Ιστό-ειδική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από τη macroh2a1 166 Η ελαττωμένη έκφραση της macroh2a1 προκαλεί επαγωγή της απόπτωσης στα B-λεμφοκύτταρα (NAMALWA)....... 170 Σχετιζόμενα με την απόπτωση γονίδια που επάγονται μετά τη μείωση της έκφρασης της macroh2a1 στις δυο κυτταρικές σειρές..175 Επαλήθευση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών DNA με PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR)....177 Στους υποκινητές των υπό εξέταση γονιδίων εντοπίζονται macroh2a1 νουκλεοσώματα.......180 Η macroh2a1 καθορίζει ιστό-ειδικά προγράμματα επαγόμενης από ιό γονιδιακής έκφρασης......183 Η γονιδιακή απόκριση στην ιϊκή μόλυνση ρυθμίζεται σε μεγαλύτερο βαθμό από τη macroh2a1 στα NAMALWA, από ότι στα HeLa...186 Προσδιορισμός των ρυθμιζόμενων από τη macroh2a1 γονιδίων που επάγονται μετά από μόλυνση με ιό σε κύτταρα αγρίου τύπου...... 189 Η επαγωγή πραγματοποιείται μετά από αναδόμηση των macroh2a1 νουκλεοσωμάτων..... 195 Μοτίβα ιστό-ειδικής δράσης της macroh2a1 στη ρύθμιση της επαγόμενης γονιδιακής έκφρασης.. 197 Τα HeLa περιέχουν μεγαλύτερη ποσότητα macroh2a1 από τα NAMALWA, παρά την αντιστρόφως ανάλογη σημαντικότητα της στους δυο κυυταρικούς τύπους...199 Δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών με μακροχρόνια και λειτουργική υπέρ-έκφραση macroh2a1.....200 Η υπέρ-έκφραση της macroh2a1 επηρεάζει τη γονιδιακή έκφραση μόνο στα κύτταρα HeLa... 204 ΙΙΙ. ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΕΩΝ ΘΕΣΕΩΝ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΤΟΥ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ NF-κB, ΕΝΤΟΣ ΜΕΤΑΘΕΤΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΗΣ ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑΣ Alu, ΜΕ ΕΥΡΕΙΑ ΓΕΝΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ.....206 Η ιϊκή μόλυνση επάγει την ευρεία πρόσδεση του NF-κB στο ανθρώπινο γονιδίωμα.206 Η in vivo προτίμηση πρόσδεσης του NF-κB σε συγκεκριμένες αλληλουχίες, 7

αποκαλύπτει ένα νέο στοιχείο πρόσδεσης..209 Στρατολόγηση των πρωτεϊνών NF-κB σε πολλαπλές θέσεις DNA in vivo και in vitro... 213 Προσδιορισμός των επαγόμενων από ιό γονιδίων που ρυθμίζονται από τον NF-κB. 218 Ιδιότητες μεταγραφικής ενεργοποίησης των θέσεων πρόσδεσης του NF-κΒ 221 ΣΥΖΗΤΗΣΗ.. 227 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ.. 258 ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΗ 273 8

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ικανότητα διαφορετικών κυττάρων να προγραμματίζουν το, κατά τα άλλα ταυτόσημο, γονιδίωμα τους και να επιλέγουν τα κατάλληλα γονίδια που θα εκφραστούν σε κάθε χρονική στιγμή και μετά από συγκεκριμένα ερεθίσματα, είναι ζωτικής σημασίας για τους ανώτερους πολυκύτταρους οργανισμούς. Για το σκοπό αυτό, οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί έχουν αναπτύξει ποικίλους μηχανισμούς, οι οποίοι βασίζονται σε γενετικούς όσο και επιγενετικούς παράγοντες. Η αρχιτεκτονική της χρωματίνης αποτελεί ένα κρισιμότατο τέτοιο παράγοντα ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Κάθε είδους τροποποίηση των νουκλεοσωμάτων που τη συγκροτούν προσδίδει δυναμικά χαρακτηριστικά στη χρωματίνη, τα οποία όντας κληρονομούμενα και με επίδραση στη μεταγραφή των γονιδίων, έχουν σημαντικό ρόλο στον καθορισμό της κυτταρικής ταυτότητας. Οι μέχρι στιγμής γνωστοί μηχανισμοί που χρησιμοποιούνται από τα κύτταρα για την αυστηρή ρύθμιση των δυναμικών χαρακτηριστικών των νουκλεοσωμάτων είναι οι μετά-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, η αναδόμηση των νουκλεοσωμάτων και η ανταλλαγή ιστονικών ποικιλομορφών. Οι τελευταίες είναι μη αλληλικές ισομορφές των κανονικών ιστονών, οι ξεχωριστές βιοφυσικές ιδιότητες των οποίων επιφέρουν σημαντικές τροποποιήσεις στη δομή και τις ιδιότητες της χρωματίνης, μετά από την ανταλλαγή τους με τις ισοδύναμες τους κανονικές ιστόνες. Η macroh2a είναι μια ασυνήθιστη ποικιλομορφή της κανονικής Η2Α, υψηλά συντηρημένη μεταξύ των σπονδυλωτών, η οποία φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης, παρεμποδίζοντας την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων σε γειτονικές in cis ρυθμιστικές περιοχές και προσδίδοντας στα νουκλεοσώματα ανθεκτικότητα στην ενζυμική αναδόμηση τους. Επιπλέον, η macroh2a εντοπίζεται κυρίως σε μεταγραφικά ανενεργές χρωματινικές περιοχές. Πρόσφατα διαλευκάνθηκε στο εργαστήριο μας ο ρόλος της macroh2a1 στο μηχανισμό της ρύθμισης της ιστό-ειδικής επαγωγικής ενεργοποίησης του γονιδίου της IL-8 στα επιθηλιακά κύτταρα HeLa, καθώς αποδείχτηκε ότι η φυσική παρουσία της macroh2a1 στην περιοχή υποκινητή/ενισχυτή του γονιδίου αυτού στα Β-λεμφοκύτταρα NAMALWA αποτρέπει την επαγωγή του σε αυτά. Στόχοι της παρούσης εργασίας είναι η ταυτοποίηση του συνόλου των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τη macroh2a1, ο προσδιορισμός των διαφορετικών χώρο-χρονικών προγραμμάτων γονιδιακής επαγωγής σε απόκριση στην ιϊκή μόλυνση και κυρίως η διερεύνηση ενός πιθανού ευρύτερου ρόλου της macroh2a1 στον επιγενετικό καθορισμό ιστό-ειδικών προγραμμάτων συνεχούς ή επαγόμενης από ιό γονιδιακής 9

έκφρασης. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκαν νέες σταθερές κυτταρικές σειρές HeLa και NAMALWA με μειωμένη έκφραση της macroh2a1, με την ενεργοποίηση του κυτταρικού μονοπατιού της παρεμπόδισης του RNA με την τεχνολογία των λέντι-ιών, ή αυξημένη ποσότητα με τη σταθερή έκφραση σε αυτά ανασυνδυασμένης macroh2a1. Κάνοντας χρήση της τεχνολογίας FACS, αποκτήθηκαν κυτταρικές σειρές με αμιγείς πληθυσμούς κυττάρων. Ακολούθησε η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης των κυτταρικών πληθυσμών, πριν και μετά από τη μόλυνση με ιό Sendai, με ολιγονουκλεοτιδικές μικροσυστοιχίες έκφρασης της Affymetrix. Τα αποτελέσματα των μικροσυστοιχιών συγκρίθηκαν και επεξεργάστηκαν έτσι ώστε να προκύψουν βιολογικά συμπεράσματα, τα οποία επιβεβαιώθηκαν, τόσο με πειράματα μέτρησης της γονιδιακής έκφρασης με RT PCR, όσο και με πειράματα εντοπισμού της macroh2a σε συγκεκριμένες γενομικές θέσεις με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης. Με τη στρατηγική αυτή προσδιορίστηκε και στους δυο κυτταρικούς τύπους το σύνολο των γονιδίων, η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τη macroh2a1, το σύνολο των γονιδίων που επάγονται μετά από μόλυνση με ιό και τέλος το σύνολο των γονιδίων που η επαγωγή τους μετά από μόλυνση με ιό ρυθμίζεται από την macroh2a1. Από τις κατάλληλες συγκρίσεις των γονιδιακών λιστών προέκυψε μια σειρά από άκρως ενδιαφέροντα συμπεράσματα. Φάνηκε ότι η μόλυνση με ιό επαναπρογραμματίζει το γονιδίωμα του ξενιστή προξενώντας μεγάλες μεταβολές στην έκφραση των γονιδίων. Τα κύτταρα NAMALWA ενεργοποιούν τους μηχανισμούς ανοσοαπόκρισης νωρίτερα από ότι τα επιθηλιακά HeLa και μάλιστα διατηρούν την ενεργοποίηση στον ίδιο βαθμό και σε επόμενες χρονικές στιγμές, σε συμφωνία με την εξειδίκευση των κυττάρων αυτών για την άμυνα του οργανισμού. Αντίθετα τα HeLa εμφάνισαν μια τάση μεταβολής του προφίλ γονιδιακής ενεργοποίησης, με μια άναρχη αρχική απόκριση στη μόλυνση με ιό, σε ένα πιο συγκροτημένο προφίλ, πιο όμοιο με αυτό των NAMALWA, στα αργότερα χρονικά στάδια. Προσδιορίστηκε ένας κοινός αντί-ιικός πυρήνας γονιδίων που επάγονται και στους δυο κυτταρικούς τύπους και σε διαφορετικές χρονικές στιγμές μετά τη μόλυνση, η πλειοψηφία των οποίων σχετίζονται με μηχανισμούς ανοσοαπόκρισης. Παρόλα αυτά, κατέστη προφανές ότι οι διαφορετικοί τύποι κυττάρων ανταποκρίνονται διαφορετικά στην ιική μόλυνση ενεργοποιώντας διαφορετικές ομάδες γονιδίων, με διαφορετικά επίπεδα επαγωγής και διαφορετική κινητική επαγωγικής ενεργοποίησης. Καταδείχτηκε ότι και στις δυο κυτταρικές σειρές η macroh2a1 συντελεί στην ρύθμιση της έκφρασης περίπου 8 φορές περισσότερων επαγόμενων μετά από μόλυνση με ιό γονιδίων, από ότι μη επαγόμενων, καθιστώντας φανερή την μεγαλύτερη βαρύτητα του 10

ρόλου της macroh2a1 στη ρύθμιση της επαγόμενης γονιδιακής έκφρασης, από ότι τον αντίστοιχο ρυθμιστικό της ρόλο απουσία ερεθίσματος. Επιπλέον κατέστη εμφανές ότι ο ρόλος της macroh2a1 στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης, συνεχούς και κυρίως επαγόμενης, είναι ευρύτερος και πιο εξειδικευμένος στα NAMALWA, από ότι στα HeLa. Στα NAMALWA συμβάλει στη ρύθμιση τέσσερις φορές περισσότερων γονιδίων, τόσο όσον αφορά την επαγόμενα έκφραση, όσο και τη συνεχή, με σημαντικότερες και καθοριστικότερες βιολογικές λειτουργίες. Μάλιστα, η μείωση της ποσότητας της macroh2a1 στα κύτταρα NAMALWA έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της απόπτωσης. Επιπλέον, τα συμπεράσματα από τις συγκρίσεις μεταξύ των κυττάρων των δυο τύπων που υπέρ-εκφράζουν ανασυνδυασμένη macroh2a1 υπονοούν λοιπόν ότι οι μηχανισμοί ελέγχου της εναπόθεσης της macroh2a1 ή/και της ανταλλαγής της με την κανονική της ισομορφή είναι πολύ πιο αυστηρά καθορισμένοι στα NAMALWA από ότι στα HeLa. Με την πραγματοποίηση των κατάλληλων συγκρίσεων προσδιορίστηκε και ένας αριθμός γονιδίων τα οποία επάγονται μεν σε αγρίου τύπου κύτταρα, κάτω από το ρυθμιστικό έλεγχο όμως της macroh2a1, τονίζοντας περαιτέρω τη ρυθμιστική δράση της macroh2a1 στον καθορισμό της δεξαμενής των γονιδίων που θα επαχθούν μετά από τη μόλυνση με ιό Μεταξύ αυτών προφανώς περιέχονται τα γονίδια εκείνα τα οποία επάγονται μετά από ιϊκή μόλυνση σε κύτταρα αγρίου τύπου, μόνο όμως μετά από κάποιου τύπου αναδιοργάνωση της macroh2a1 στις ρυθμιστικές τους περιοχές. Ακόμα, ο προσδιορισμός των γονιδίων αυτών οφείλεται και στο γεγονός ότι η έκφραση των γονιδίων μέσα σε ένα πληθυσμό κυττάρων είναι στοχαστική. Έτσι, η απομάκρυνση του περιοριστικού παράγοντα (macroh2a1) πριν την επίδραση του ερεθίσματος έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή των γονιδίων που φυσιολογικά ρυθμίζει, σε περισσότερα κύτταρα του πληθυσμού. Η πραγματοποίηση πειραμάτων RT-PCR για έναν αριθμό επιλεγμένων γονιδίων η έκφραση των οποίων ρυθμίζεται από τη macroh2a1, επιβεβαίωσε πλήρως το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης που προέκυψε από την ανάλυση των μικροσυστοιχιών, τόσο την αύξηση της έκφρασης τους μετά από τη μείωση της ποσότητας της macroh2a1, όσο και το ιστό-ειδικό πρότυπο. Επιπλέον, φάνηκε ότι τα περισσότερα γονίδια που ελέγχθηκαν δεν είναι πλήρως κατασταλμένα στα αγρίου τύπου κύτταρα, αλλά εκφράζονται σε μικρό βαθμό. Και αυτό το αποτέλεσμα συνηγορεί στο ότι η macroh2a1 πιθανότατα δεν επιβάλει την πλήρη καταστολή των γονιδίων, αλλά κατά κάποιο τρόπο συμμετέχει σε μηχανισμούς λεπτής ρύθμισης της έκφρασης τους. Η παράλληλη πραγματοποίηση αντιδράσεων ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης έδειξε ότι στους υποκινητές της πλειοψηφίας των γονιδίων αυτών εντοπίζεται macroh2a1, με το ιστό-ειδικό πρότυπο που προκύπτει από την 11

ανάλυση των μικροσυστοιχιών DNA. Επιπλέον, οι αντιδράσεις αυτές έδειξαν την απώλεια της macroh2a1 από την αρχική της θέση μετά από τη μόλυνση με ιό, σε όσα από τα γονίδια αυτά επάγονται μετά από το ερέθισμα αυτό. Αντίθετα, σε αυτά που δεν επάγονται, η macroh2a1 παραμένει στη θέση της, υποστηρίζοντας ότι αυτή είναι ο περιοριστικός για την επαγωγή τους παράγοντας. Προκρίνεται λοιπόν και από τις αντιδράσεις ChIP πως ο η macroh2a1 έχει κατά βάση ένα λεπτό ρυθμιστικό ρόλο, παρά κατασταλτικό, στον καθορισμό της γονιδιακής επαγωγικής ενεργοποίησης Συνδυάζοντας όλα τα παραπάνω δεδομένα που ανακτήθηκαν από τα πειράματα μικροσυστοιχιών, με τα πειράματα RT-PCR και με τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης, προέκυψε μια σειρά από διαφορετικά μοτίβα επαγόμενης γονιδιακής έκφρασης, τα οποία καθορίζονται από τη φυσική παρουσία macroh2a1 στην περιοχή του υποκινητή των γονιδίων, καταδεικνύοντας το σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο της ιστονικής αυτής ποικιλομορφής στον καθορισμό ιστό-ειδικών προγραμμάτων γονιδιακής έκφρασης. 12

SUMMARY The ability of genetically identical cells to program their genome and select the appropriate set of genes for expression at a given time and under a specific stimulus is of crucial importance for multicellular organisms. Eukaryotes have evolved methodical means to regulate the expression of genes, attributed to genetic, epigenetic and chromatinassociated factors. Chromatin architecture is a crucial factor. Modulation of the fundamental nucleosome units contributes to the dynamic structural characteristics of chromatin, which are inheritable and impact on transcription and, therefore, cellular identity. Multiple mechanisms are utilized by cells to tightly regulate chromatin dynamics, including posttranslational histone modifications, chromatin remodeling and histone variant incorporation. Histone variants are non-allelic isomorphs of the canonical histones and their distinct biophysical characteristics alter the chromatin structure and dynamics, upon their incorporation in the nucleosomes as replacements of their canonical counterparts. MacroH2A is an unusual variant that is restricted, but highly preserved, amongst vertebrates. MacroH2A is considered to be implicated in transcriptional repression, due to its inhibitory structure and genomic distribution. Recent experiments conducted in our laboratory have shown that macroh2a1 is responsible for the cell-specific repression of the IL-8 gene transcriptional activation in NAMALWA cells, since its localization on the promoter/enhancer region is the repressing factor. In contrast, the same gene regulatory region in HeLa cells is nucleosome free and IL-8 is expressed upon virus induction. The aim of this work is to identify the global battery of genes whose expression is regulated by macroh2a1 in distinct cell types, to identify distinct spatiotemporal programs of virus inducible gene expression and most importantly to investigate a potential global role of macroh2a1 in the epigenetic determination of cell-specific gene expression programs, both constant and inducible. To accomplish that, novel, stable cell lines of both HeLa and NAMALWA cells have been established, in which macroh2a is either stably knocked-down by the cellular RNAi pathway, via the use of lentivirus-based technologies, or recombinant macroh2a1 is stably over-expressed. The utilization of FACS technology, allowed the isolation of pure novel cell populations. Global gene expression of the cell populations prior and upon Sendai virus induction was analyzed with Affymetrix whole human genome expression arrays. The raw data were statistically manipulated, extensively analyzed and compared, in order to produce biological conclusions. Finally, the findings 13

were verified with the conduction of RT-PCRs and ChIP reactions, in order to locate macroh2a1 genomic positions. Microarray analysis revealed the total number of genes that are repressed by macroη2α1, the total number of virus inducible genes and the total number of genes whose virus inducible expression is regulated by macroh2a1, in both cell lines HeLa and NAMALWA. Comparison of the virus induced genes between the 2 cell lines, at both 6 and 12 hours after infection, revealed extensive cell-specific differences in the transcriptional response, primarily at the earlier time-point (6 hours), which coincides with the activation of IFNβ transcription. At the later time point (12 hours), those differences alleviate, while the overall transcriptional profile (number of genes and gene ontology) of the epithelial cells inclines to that of the more immediate responsive to virus infection B-cells, a result indicating that prior to the exert of IFNβ signaling in promoting antiviral response, different cell types response variably to the same external signal (virus infection). Apart from the cellspecific differences, a number of 66 genes expressed in every case have been identified, presumably forming a core of antiviral-response genes common in all cell-types. The biggest part of this antiviral core consists of many known antiviral genes, but it also includes several genes with different functions. However, the majority of the identified inducible genes exhibits tissue specific activation pattern, stating that different cell types respond differently to the same stimulus, by activating distinct sets of genes, at different induction levels and with different activating kinetics. The study showed that macro H2A1 plays a crucial role in orchestrating those tissuespecific activation patterns. Firstly, it was discovered that in each cell type a relatively small number of genes are up-regulated when the concentration of macroh2a is reduced, by the sirna method. However the huge difference between the number and the biological functions of these genes in the two cell lines, strongly suggests that macroh2a plays a role in establishing cell specific gene expression programs. Remarkably, the virus-inducible expression of eight times more genes is regulated by macroh2a in both cell lines, implying a much bigger role of this histone variant in the regulation of virus-inducible gene expression than in not inducible expression. Again, tissue specificity is obvious, since only a small number of virus-inducible genes are found to be common in both cell types. Furthermore, comparison of the genes up-regulated in each cell line before and after virus infection revealed again an important difference between the two cell types. In each comparison, differences in the cellular functions affected by the de-repressed genes, emanating from Gene Ontology analysis, further highlight the cell-specific role of macroh2a1. Moreover, all 14

the aforementioned comparisons clearly indicated that macroh2a1 has a much wider regulatory role and its loss has a much greater impact in NAMALWA B-cells than in epithelial HeLas. This is also strongly supported by the fact that knockdown of macroh2a1 induces apoptosis only in NAMALWA cells. Remarkably, it was discovered that overexpression of macroh2a1 has a huge effect in gene expression in HeLas and almost no effect at all in NAMALWAs, even though the total amount of the protein deposited on chromatin is much less in MAMALWAs, than in HeLas. The sum of the above findings imply a tighter control of macroh2a1-containing nucleosomes deposition along the genome of B-cell lines than in epithelial cells. Finally, the comparison between the number of virusinduced genes in WT and macroh2a1 knock down cells, revealed a number of genes in HeLas and a much larger number of genes in NAMALWAs that are induced in both WT and macroh2a1 knock down cells. These genes are either induced after loss of macroh2a1 from their regulatory region upon virus infection, or they come up in the analysis due to the stochastic nature of gene expression within a cell population. A number of identified in the microarray analysis genes, namely the apoptosisrelated genes that were up-regulated in both cell types, were chosen for further investigation. RT-PCR experiments verified their expression profiles as provided by the microarray data and also showed that macroh2a1 does not completely suppress these genes, rather that it regulates their level of expression. Furthermore, ChIP assays verified the physical presence of macroh2a1-containing nucleosomes on the promoter of the majority of these genes in HeLa and/or NAMALWA cells, according to the profile provided by the microarray data. ChIP experiments also corroborated the loss of macroh2a1 from the promoter of these genes that are virus-induced in WT cells, while showing that macroh2a1 persists in the genes that are not induced, thus preventing their transcriptional activation. Notably all of the above experiments again demonstrate the cell-specific role of macroh2a1 in fine-tuning inducible gene expression programs. The combinatory study of the microarray data, the RT-PCR and the ChIP results, provided a series of distinct gene expression patterns that are determined by the physical presence of macroh2a1 in the regulatory region of the genes. Taken together, the results and conclusions of this work, apart from providing a pool of genes regulated by macroh2a1, supply a series of evidence supporting a cell-specific role of macroh2a1 as an epigenetic regulator of global gene expression and thus a part in the complicated mechanisms determining the establishment of distinct cell types in multicellular organisms. 15

ΕΙΣΑΓΩΓΗ 16

Η ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑ ΣΤΟ ΜΟΡΙΑΚΟ ΕΠΙΠΕΔΟ Προκειμένου οι ζωντανοί οργανισμοί να επιτελούν το σύνολο των λειτουργιών που τους χαρακτηρίζουν, όπως το χτίσιμο δομών, η αναπαραγωγή, η ανάπτυξη και η οργάνωση μηχανισμώ, είναι υποχρεωμένοι να συντηρούν και να χρησιμοποιούν διαρκώς ένα μεγάλο όγκο πληροφορίας. Η γενετική αυτή πληροφορία αποθηκεύεται σε μόρια νουκλεϊκών οξέων με τη μορφή μιας καθορισμένης και εξειδικευμένης για κάθε είδος αλληλουχίας νουκλεοτιδικών βάσεων. Στη συντριπτική πλειοψηφία των ζωντανών οργανισμών, το μόριο που αποθηκεύει, μεταβιβάζει και εκφράζει τη γενετική πληροφορία είναι το DNA (Δεοξυριβονουκλεϊκό Οξύ - DeoxyriboΝucleic Acid). Εξαίρεση αποτελούν μόνο οι RNA ιοί, οι οποίοι έχουν ως γενετικό υλικό το έτερο μόριο νουκλεικού οξέος, το RNA (Ριβονουκλεϊκό Οξύ - Ribonucleic Acid). Το DNA λοιπόν είναι το γενετικό υλικό (γονιδίωμα), που καθορίζει τα χαρακτηριστικά του κάθε οργανισμού και κυττάρου (Lorenz and Wackernagel, 1994). Το σύνολο της εκφραζόμενης πληροφορίας εντοπίζεται σε συγκεκριμένες μονάδες/περιοχές του DNA, τα γονίδια. Κάθε γονίδιο είναι υπεύθυνο για την κωδικοποίηση, ή αλλιώς περιέχει την πληροφορία για την κατασκευή, μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας ή ενός ενζυμικού ή δομικού μορίου RNA. Η ακρίβεια της αλληλουχίας και της θέσης που καταλαμβάνουν τα γονίδια μέσα στο γονιδίωμα ακολουθεί το πρότυπο ενός τοπογραφικού χάρτη. Τα γονίδια βρίσκονται διασκορπισμένα και καταλαμβάνουν ένα μικρό μόνο τμήμα του γενομικού αυτού χάρτη, με την πλειονότητα του να ποτελείται από περιοχές DNA που δεν αντιστοιχούν σε λειτουργικά γονίδια (πίνακας 1). Κάθε ζωντανός οργανισμός, εκτός των κλώνων, περιέχει το δικό του μοναδικό γενετικό υλικό και κατά συνέπεια διαφορετική γενετική πληροφορία από όλους τους άλλους. Παρά όμως την τεράστια ποικιλότητα της γενετικής πληροφορίας, οι μηχανισμοί αξιοποίησης και μεταβίβασης της είναι ιδιαίτερα συντηρημένοι από τους κατώτερους μονοκύτταρους οργανισμούς μέχρι και τα ανώτερα θηλαστικά. Οι μηχανισμοί αυτοί, δηλαδή η αντιγραφή του γενετικού υλικού και η γονιδιακή έκφραση (μεταγραφή και μετάφραση), είναι καθολικοί και καλά συντηρημένοι, καθώς εξυπηρετούν κοινούς στόχους, σε διαφορετικά είδη. Η αυξανόμενη, σε αντστοιχία με την εξέλιξη των οργανισμών, πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν οι μηχανισμοί της αντιγραφής, της μεταγραφής και της μετάφρασης της γενετικής πληροφορίας, δεν οδηγεί σε απόκλιση από τους κοινούς αυτούς στόχους, που είναι η διαιώνιση και η χώρο-χρονικά ορθή έκφραση της γενετικής πληροφορίας (εικόνα 1). 17

Εικόνα 1. Το Κεντρικό Δόγμα της Βιολογίας (Crick, 1970). Το DNA έχει την ικανότητα να αυτοδιπλασιάζεται, δίνοντας πολλά πανομοιότυπα μόρια DNA, μία διαδικασία γνωστή ως αντιγραφή του DNA. Επίσης, το DNA μεταγράφεται σε RNA και το RNA μεταφράζεται τελικά σε πρωτεΐνες. Η αντίστροφη πορεία δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί με εξαίρεση κάποιους ιούς που από RNA μπορούν να παράγουν DNA (αντίστροφη μεταγραφή). Figure 1. The Central Dogma of Biology (Crick, 1970). DNA can be copied to DNA, with a process termed DNA replication. Furthermore, it can be transcribed into RNA (transcription), which thereinafter can be translated to protein (translation). The later courses cannot be reversed, with the exception of RNA viruses, that are able of transcribing RNA into DNA (reverse transcription). ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ Το νουκλεϊκά οξέα είναι πολυμερή νουκλεοτιδίων ενωμένων μεταξύ τους με φωσφοδιεστερικό δεσμό. Τα νουκλεοτίδια συντίθεται από μια πεντόζη (ριβόζη στο RNA, δεοξυριβόζη στο DNA), ένα έως τρία μόρια φωσφορικού οξέος και μια αζωτούχο βάση [αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G) και στα δυο, κυτοσίνη (C) μόνο στο DNA και ουρακίλη (U) μόνο στο RNA]. Στη βιοχημική σύσταση του DNA εντοπίζεται το σύνολο των πληροφοριών που αυτό περιέχει. Πέραν από τις εκφραζόμενες αλληλουχίες (γονίδια), οι πληροφορίες αυτές μπορεί να αφορούν και διάφορα λειτουργικά στοιχεία, όπως τα σημεία έναρξης της αντιγραφής του DNA (Origins of DNA replication Ori), τα τελομερή, τα κεντρομερή, τα σημεία σύνδεσης με τον κυτταρικό σκελετό (Matrix Attachment Regions MARs) και τις θέσεις αναγνώρισης και πρόσδεσης δομικών πρωτεϊνών, μεταγραφικών παραγόντων, αλλά και ρυθμιστικών ενζύμων τροποποίησης της βιοχημικής σύστασης του DNA (π.χ. μεθυλίωση, γλυκοσυλίωση κ.α.). Περαιτέρω, και ιδίως στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, μεγάλο ποσοστό του γονιδιώματος αποτελείται από επαναλαμβανόμενο (repetitive) DNA του οποίου η λειτουργία παραμένει σε μεγάλο βαθμό αδιευκρίνιστη (πίνακας 1). Ενώ το RNA συναντάται συνήθως σα μονόκλωνο μακρομόριο (υπάρχει ωστόσο και σε δίκλωνη μορφή), το DNA αποτελείται πάντα από δύο συμπληρωματικές αλυσίδες πολυνουκλεοτιδίων, η φυσική κατάσταση των οποίων είναι μια διπλή έλικα (Watson and 18

Crick, 1953). Η ελικοειδής δομή μοιάζει με μια δεξιόστροφη σπειροειδή κλίμακα στην οποία οι δυο αλυσίδες έχουν αντίθετες κατευθύνσεις αλλά συγκρατούνται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ συγκεκριμένων αζωτούχων βάσεων της κάθε μιας (δυο δεσμοί υδρογόνου μεταξύ Α και Τ και τρεις μεταξύ G και C) (εικόνα 2). Η δίκλωνη δομή του DNA είναι υπεύθυνη για πολλές από τις ιδιότητες του, με κυριότερη αυτή του ημισυντηρητικού αυτοδιπλασιασμού (εικόνα 2), που εξασφαλίζει την ακριβή σύνθεση νέων ζευγών συμπληρωματικών αλυσίδων σύμφωνα με την αλληλουχία του αρχικού μορίου-προτύπου (template). Με παρόμοιο τρόπο, η συμπληρωματικότητα των βάσεων επιτρέπει την επιδιόρθωση βλαβών στο μόριο του DNA, με τη συνδρομή κατάλληλων ενζύμων, όποτε αυτό είναι απαραίτητο. Πίνακας 1. Το DNA του ανθρώπινου γονιδιώματος. Table 1. DNA of the Human genome. Εικόνα 2. Η διπλή έλικα του DNA και ο ημισυντηρητικός τρόπος αντιγραφής του. Η χαλάρωση της έλικας και η αποδιάταξη των 2 αλυσίδων πραγματοποιούνται είτε φυσικά (επίδραση Θερμοκρασίας), είτε χημικά (επίδραση ph, ουρίας κ.α.), είτε με τη δράση κατάλληλων ενζύμων (τοποϊσομεράσες, ελικάσες κ.α.). Figure 2. The double stranded DNA structure and its semi-conservative replication. The relaxation and/or the denaturation of the double helix can occur by physical means (temperature), chemical means (ph, urea etc.), or enzymatic activity (topoisomerase, helicase, etc.). Η τρισδιάστατη αναδίπλωση του γενετικού υλικού αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό όλων των ζωντανών οργανισμών, αν και σε ένα μικρό ποσοστό έχουν καταγραφεί περιπτώσεις που το DNA αποκλίνει από το αυστηρά χαρακτηρισμένο μοντέλο της 19

δεξιόστροφης διπλής έλικας (Α-DNA, Z-DNA, H-DNA) (Sinden, 1994). Παρά τη σταθερή του σύσταση και στερεοδιάταξη όμως, η οργάνωση του στο χώρο διαφέρει χαρακτηριστικά ανάμεσα στους ιούς, στους προκαρυωτικούς και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, με το βαθμό οργάνωσης να αυξάνεται ακολουθώντας την πολυπλοκότητα των ειδών. Το γεγονός όμως ότι οι πληροφορίες περιέχονται αυστηρά στην εναλλαγή των νουκλεοτιδικών βάσεων δείχνει πως η οργάνωση του γενετικού υλικού δεν επηρεάζει τόσο την αποθήκευση των πληροφοριών, όσο σχετίζεται με τη ρύθμιση των μηχανισμών διαιώνισης και έκφρασης τους. ΕΠΙΠΕΔΑ ΟΡΓΑΝΩΣΗΣ ΤΟΥ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΟΥ DNA Το γονιδίωμα των ευκαρυωτικών οργανισμών ποικίλει σε μέγεθος από 10 8 bp (C. elegans) μέχρι και 5,4 10 9 bp (Z. mays), ενώ το απλοειδές γονιδίωμα ενός ανθρώπινου (H. sapiens) κυττάρου αποτελείται από 3 10 9 ζεύγη βάσεων (bp), μέγεθος που αντιστοιχεί σε μήκος περίπου ενός μέτρου. Παρά το τεράστιο αυτό μέγεθος, το γονιδίωμα συγκεντρώνεται (πακετάρεται) μέσα στον πυρήνα του κυττάρου, ένα χώρο με διάμετρο περίπου 10-5 μέτρα. Διπλή έλικα του DNA Μορφή νήματος με χάντρες της χρωματίνης Ινίδιο 30 nm χρωματίνης Τμήμα χρωμοσώματος σε έκταση Συμπυκνωμένο τμήμα χρωμοσώματος Μιτωτικό χρωμόσωμα Εικόνα 3. Η χωροταξική οργάνωση του γενετικού υλικού στον ευκαρυωτικό πυρήνα καθορίζεται από τα διαδοχικά στάδια οργάνωσης της χρωματίνης. Figure 3. Succesive levels of chromatin organization inside the eukaryotic cell nucleus. 20

Η χωροταξική οργάνωση (εικόνα 3) του γενετικού υλικού βασίζεται σε ένα μηχανισμό βαθμιαίας συμπύκνωσης, με τη συμβολή ποικίλων πρωτεϊνών που διακρίνονται σε ιστόνες και μη ιστόνες. Το DNA περιελίσσεται γύρω από διαδοχικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα ιστονών πρωτεϊνών προς μια συσπειρωμένη νουκλεοπρωτεϊνική δομή που ονομάζεται χρωματίνη. Περαιτέρω συμπύκνωση της χρωματίνης επιτυγχάνεται προς μια ελικοειδή, δευτεροταγή δομή (ινίδιο 30 nm), από την οποία προκύπτει εν τέλει το χρωμόσωμα. ΤΟ ΝΟΥΚΛΕΟΣΩΜΑ Οι βασικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αναδίπλωση της χρωματίνης ονομάζονται ιστόνες και η μεγάλη σημασία τους πιστοποιείται από τον υψηλότατο βαθμό εξελικτικής συντήρησης που τις χαρακτηρίζει. Είναι μικρές σε μέγεθος πρωτεΐνες (11 έως 14 kda) που σε φυσιολογικό ph παρουσιάζουν θετικό φορτίο εξαιτίας της παρουσίας πολλών βασικών αμινοξέων (π.χ. λυσίνη, αργινίνη) στο εσωτερικό του μορίου τους. Οι κύριες ιστόνες (core histones) είναι οι H2A, H2B, H3 και H4, ενώ υπάρχει και μια πληθώρα ποικιλομορφών (variants) τους, καθώς και οι συνδετικές ιστόνες (linker histones) Η1 και Η5 (με την τελευταία να βρίσκεται μόνο στα πτηνά). Δυο αντίγραφα από κάθε μια από τις ιστόνες Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4 συγκροτούν ένα πρωτεϊνικό οκταμερές, γύρω από το οποίο περιελίσσονται 146 ζεύγη βάσεων (1,7 στροφές) δίκλωνου DNA. Η δομική μονάδα που περιλαμβάνει το οκταμερές των ιστονών και το περιελιγμένο γύρω από αυτό DNA, ονομάζεται νουκλεόσωμα (Oudet et al., 1975) (εικόνα 4). Η ανακάλυψη του νουκλεοσώματος (Kornberg, 1974) και ο χαρακτηρισμός του ως βασική μονάδα οργάνωσης της χρωματίνης (Noll, 1974) οδήγησε στην εκτεταμένη μελέτη της σύστασης και των ιδιοτήτων του. Η κεντρική μοίρα του νουκλεοσώματος (core nucleosome δηλαδή μόνο το ιστονικό οκταμερές) εμφανίζει υδρόφοβο χαρακτήρα, με τα θετικά φορτισμένα αμινοτελικά άκρα των ιστονών να προεκβάλλουν στην εξωτερική επιφάνεια του συμπλόκου. Τα μόρια των ιστονών εμφανίζουν πανομοιότυπο δομικό πρότυπο που αποτελείται από 3 α-έλικες ενωμένες με 2 βρόγχους, ενώ τα μόρια Η2Α-Η2Β και Η3-Η4 αντίστοιχα σχηματίζουν ετεροδιμερή. Η κρυσταλλογραφική απεικόνιση της δομής του νουκλεοσώματος (Luger et al., 1997) (εικόνα 4) δείχνει πως η διπλή έλικα του DNA βρίσκεται σε επαφή με το οκταμερές κάθε 10 ζεύγη βάσεων, ενώ η αλληλεπίδραση σε ορισμένα σημεία επαφής είναι ισχυρότερη. 21

Εικόνα 4. Σχηματική απεικόνιση (αριστερά) και κρυσταλλογραφική ανάλυση της δομής (δεξιά) του νουκλεοσώματος. Figure 4. Schematic representation (left) and crystallographic analysis (right) of the nucleosome structure. ΑΠΟ ΤΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗ ΣΤΟ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑ Η παρατήρηση χρωματίνης στην απλούστερη μορφή οργάνωσής της, στο μικροσκόπιο, θυμίζει πολύ την εικόνα που έχουν οι χάντρες επάνω σε ένα κομπολόι (beads on a string) (εικόνα 5A) (Olins and Olins, 1974), εξαιτίας της σχεδόν περιοδικής παρουσίας νουκλεοσωμάτων μεταξύ παρεμβαλλόμενων τμημάτων DNA που ονομάζεται συνδετικό DNA (linker DNA). Τα νουκλεοσώματα μπορούν να προσεγγίζουν μεταξύ τους αυξάνοντας έτσι το βαθμό συμπύκνωσης και δημιουργώντας μια δομή γνωστή ως ινίδιο 30 nm (30nm fiber) (εικόνα 5) η οποία και σταθεροποιείται με την πρόσδεση της συνδετικής ιστόνης Η1 (ή της Η5 στα πτηνά) (Hansen, 2002). Εναλλακτικά μοντέλα έχουν διατυπωθεί για να εξηγήσουν το πώς τα νουκλεοσώματα πακετάρονται στο ινίδιο διαμέτρου 30nm. Το μοντέλο του σωληνοειδούς (solenoid) (Finch and Klug, 1976) περιγράφει την προσέγγιση γειτονικών, διαδοχικών νουκλεοσωμάτων. Εκείνο ωστόσο που συμφωνεί με τα περισσότερα πειραματικά δεδομένα είναι το μοντέλο ζιγκ-ζαγκ (zigzag model) (Bednar et al., 1998) (εικόνα 5B). Στην πραγματικότητα η δομή των ινιδίων διαμέτρου 30nm που βρίσκεται στα περισσότερα χρωμοσώματα μπορεί πιθανώς να αποτελεί ένα μωσαϊκό διαφορετικών ζιγκ-ζαγκ παραλλαγών. Γνωρίζουμε ότι το συνδετικό DNA που συνδέει τα γειτονικά νουκλεοσώματα μπορεί να ποικίλει σε μέγεθος, οπότε αυτές οι διαφορές στο μήκος του συνδετικού DNA πιθανώς να εισάγουν επιπρόσθετες τοπικές αλλαγές που να ευνοούν την ζιγκ-ζαγκ 22

διαμόρφωση. Τέλος, η παρουσία και άλλων πρωτεϊνών με ικανότητα σύνδεσης στο DNA, καθώς και η παρουσία ακολουθιών DNA που δύσκολα αναδιπλώνονται σε νουκλεοσώματα, μας παραπέμπουν στο ινίδιο χρωματίνης διαμέτρου 30nm με ακανόνιστα χαρακτηριστικά (Woodcock et al., 2006). Στο σχηματισμό του ινιδίου 30nm από γειτονικά νουκλεοσώματα δρουν πιθανότατα πολλοί μηχανισμοί μαζί. Αρχικά, ένα μόριο της ιστόνης Η1 προσδένεται (με άγνωστο μέχρι στιγμής μηχανισμό) σε κάθε νουκλεόσωμα και έρχεται σε επαφή τόσο με το DNA όσο και με διάφορες πρωτεΐνες, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα να αλλάζει ο τρόπος με τον οποίο εξέρχεται το DNA από το νουκλεόσωμα. Φαίνεται ότι η αλλαγή αυτή παίζει καθοριστικό ρόλο στη συμπύκνωση των νουκλεοσωμάτων. Ένας δεύτερος μηχανισμός για το σχηματισμό του ινιδίου χρωματίνης διαμέτρου 30nm αφορά τα προεξέχοντα αμινοτελικά άκρα των βασικών ιστονών, για τα οποία πιστεύεται ότι βοηθούν γειτονικά νουκλεοσώματα να έρχονται σε επαφή μεταξύ τους και με τη βοήθεια της ιστόνης Η1 να συμπυκνώνονται ακόμη περισσότερο. A. B. 30 nm 10 nm 50 nm Εικόνα 5. A. Εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, όπου φαίνεται η χρωματίνη στη διαμόρφωση χάντρες σε κομπολόι (αριστερά) και ινίδιο 30 nm (δεξιά). Στο μέσο φαίνονται μεμονωμένα νουκλεοσώματα. Β. Δύο τρόποι αναδίπλωσης νουκλεοσωμάτων για τη δημιουργία του ινιδίου των 30 nm. Αριστερά η διάταξη Zigzag και δεξιά η διάταξη του σωληνοειδούς. Figure 5. A. Eletron microscopy images depicting the characteristic beads on a string chromatin conformation (left), the 30nm chromatin fiber (right) and single nucleosomes (center). B. Two proposed means of nucleosome packaging into the 30 nm fiber, the ZigZag (left) and the solenoid (right) arrangements. Κατά την περιέλιξή του γύρω από τα ιστονικά οκταμερή, το DNA συμπυκνώνεται λίγο περισσότερο από 5 φορές σε σχέση με το αρχικό του μέγεθος. Από το επίπεδο 23

οργάνωσης των ινιδίων 30 nm μέχρι το τελικό στάδιο της μιτωτικής χρωματίνης πραγματοποιείται μερικές εκατοντάδες φορές περαιτέρω συμπύκνωση, για το μηχανισμό της οποίας γνωρίζουμε λίγα πράγματα (Woodcock et al., 2006). Φαίνεται πως η διαδικασία εξελίσσεται με κατανάλωση ενέργειας με τη μορφή του ATP και κατευθύνεται σε μεγάλο βαθμό από τα ενζυμικά σύμπλοκα της τοποϊσομεράσης ΙΙ (topoisomerase II) και της κοντενσίνης (condhensin), οι οποίες και είναι υπεύθυνες για τη σταθεροποίηση της χρωματίνης στη συμπαγή, μιτωτική της μορφή (Swedlow and Hirano, 2003, Belmont 2006). Επιπλέον, σημαντικό ρόλο φαίνεται ότι παίζουν και αλληλουχίες του DNA που διαμεσολαβούν την πρόσφυση της χρωματίνης σε ειδικές θέσεις του πυρηνικού σκελετού (Matrix/Scaffold attachment regions, MARs/SARs). ΕΥΧΡΩΜΑΤΙΝΗ ΚΑΙ ΕΤΕΡΟΧΡΩΜΑΤΙΝΗ Αν και όλο το DNA ενός ευκαρυωτικού κυττάρου οργανώνεται σε νουκλεοσώματα και κατά μέσο όρο αντιστοιχεί ένα νουκλεόσωμα για κάθε 200 περίπου bp (Kornberg, 1974), η αναλογία αυτή δεν είναι σταθερή σε όλο το μήκος του γονιδιώματος. Έτσι, υπάρχουν περιοχές ετεροχρωματίνης στις οποίες η κατανομή των νουκλεοσωμάτων τείνει να είναι ομοιόμορφη και πυκνή (Sun et al., 2001, Grewal and Elgin, 2002) και περιοχές ευχρωματίνης στις οποίες τείνει να είναι ακανόνιστη και πιο αραιή. Οι πρώτες παρουσιάζονται μεταγραφικά ανενεργές (Richard-Foy and Hager 1987, Wolffe 2001), σε αντιδιαστολή με τις δεύτερες που χαρακτηρίζονται μεταγραφικά ενεργές περιοχές (Svaren and Chalkley 1990, Kireeva et al., 2002). Λόγω της συμπαγούς της οργάνωσης, η ετερορωματίνη παρουσιάζει μεγαλύτερη ικανότητα χρώσης και ευκολία πέψης με περιοριστικά ένζυμα και άλλες νουκλεάσες (DNAse I, μικροκοκκική νουκλεάση), σε σχέση με την χαλαρότερης δομής ευχρωματίνη. Επίσης, η ευχρωματίνη τείνει να αντιγράφεται νωρίς κατά τη φάση διπλασιασμού του DNA και να περιλαμβάνει ως επί το πλείστον μοναδιαίες αλληλουχίες DNA με μεγαλύτερο αριθμό μεταγραφικά ενεργών γονιδίων. Τα αντίθετα ισχύουν για την ετεροχρωματίνη (Henikoff, 2000), αλλά καμία από αυτές τις ιδιότητες δεν αποτελεί κανόνα χωρίς εξαίρεση. Η ετεροχρωματίνη διακρίνεται επιπλέον σε συστατική (constitutive) και δυνητική (facultative). Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν περιοχές οι οποίες σε όλους τους κυτταρικούς τύπους και σε κάθε κυτταρική γενιά παραμένουν ετεροχρωματινοποιημένες. Κλασικά παραδείγματα αποτελούν η περιοχή των κεντρομερών, τα τελομερή και γενικότερα περιοχές πλούσιες σε επαναλαμβανόμενες 24

αλληλουχίες DNA. Τη δυνητική ετεροχρωματίνη σχηματίζουν περιοχές που υπόκεινται επιλεκτικά σε μεταγραφική αποσιώπηση, ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο. Η ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΤΟΥ ΠΥΡΗΝΑ Τα χρωμοσώματα, οι μεγαλύτερες μονάδες οργάνωσης του ευκαρυωτικού γονιδιώματος, αποτελούν διακριτές πυρηνικές δομές που χωρίζονται σε πυρηνικά διαμερίσματα (Cremer et al., 2006). Τόσο τα χρωμοσώματα, όσο και οι διάφορες περιοχές του γονιδιώματος αλλά και τα γονίδια, δεν είναι τυχαία τοποθετημένα μέσα στον πυρήνα, αλλά δείχνουν μια προτίμηση προς συγκεκριμένες θέσεις σε σχέση με το χώρο του πυρήνα (κέντρο ή περιφέρεια), ή με άλλα γονίδια (Takizawa et al., 2008). Οι αλλαγές στα πρότυπα εμφάνισης του γονιδιώματος μέσα στον πυρήνα κατά τα στάδια της διαφοροποίησης και της ανάπτυξης ενός οργανισμού, υποδηλώνουν ισχυρή σχέση εξάρτησης μεταξύ συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος, με τη λειτουργικότητάς τους (Parada et al., 2004, Cremer et al., 2006). Επιπλέον, η σχετική θέση των χρωμοσωμάτων μέσα στο γονιδίωμα διαφέρει μεταξύ των διαφόρων κυτταρικών σειρών και φαίνεται να επηρεάζει την ικανότητα κάθε χρωμοσώματος να αλληλεπιδρά in trans με άλλες θέσεις πάνω στο γονιδίωμα, όπως έδειξαν πειράματα που εξέταζαν τη συχνότητα ειδικών χρωμοσωμικών μετατοπίσεων (Bickmore et al., 2002, Parada et al., 2004). Παράλληλα με τα χρωμοσώματα, φαίνεται ότι και οι διάφοροι κυτταρικοί παράγοντες που διαβάζουν, αντιγράφουν και συντηρούν το γενετικό υλικό, οργανώνονται σε περίπλοκα πρότυπα μέσα στον πυρήνα του κυττάρου (Lamond and Spector, 2003). Πολλοί μεταγραφικοί παράγοντες συγκεντρώνονται σε διακριτές πυρηνικές περιοχές (διαμερισματοποίηση), ενώ ειδικές πυρηνικές διαδικασίες, όπως η μεταγραφή και η αντιγραφή, γίνονται σε χωροταξικά καθορισμένες θέσεις μέσα στον πυρήνα (Tolhuis et al., 2002, Osborne et al., 2004). Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι παρά την παρατηρούμενη διαμερισματοποίηση, όλες αυτές οι διαφορετικές, αλλά κεφαλαιώδους σημασίας, πυρηνικές διαδικασίες φαίνεται πως οργανώνονται από κοινούς μηχανισμούς. Έτσι, μεταγραφικά ενεργά γονίδια τείνουν να εντοπίζονται σε διακριτές εστίες, τα επονομαζόμενα εργοστάσια της μεταγραφής (transcription factories) (Jackson et al., 1993, Wansink et al., 1993, Osborne et al., 2004) (εικόνα 6), στα οποία εντοπίζεται τέτοια ποσότητα μεταγραφικών παραγόντων και μορίων RNA πολυμεράσης II, που θα μπορούσαν να εξυπηρετούν ταυτόχρονα πολλά διαφορετικά γονίδια (Cook et al., 1999). Φαίνεται ότι 25

κάποιου είδους φυσική επαφή μεταξύ των γονιδίων και των εργοστασίων μεταγραφής είναι απαραίτητη για να πραγματοποιηθεί η μεταγραφή, καθώς τα προς μεταγραφή αλληλόμορφα βρίσκονται πάντα μέσα σε τέτοια εργοστάσια, ενώ εκείνα που δεν μεταγράφονται, εντοπίζονται μακριά από αυτά, υποδηλώνοντας ότι η κινητικότητα ή/και η τοποθέτηση ενός γονιδίου μέσα στον πυρήνα είναι σημαντικός παράγοντας για τον έλεγχο της μεταγραφής (Osborne et al., 2004). Η οργάνωση της μεταγραφής σε δομές που περιέχουν πολλαπλές μηχανές μεταγραφής έρχεται σε συμφωνία με το γεγονός ότι μέσα στον πυρήνα των ανθρώπινων κυττάρων, αν και υπάρχουν περίπου 65.000 ενεργά μόρια RNA πολυμεράσης ΙΙ, εντοπίζονται λιγότερες από 10,000 θέσεις μεταγραφής (κυτταρική σειρά HeLa). Έτσι, κάθε «εργοστάσιο» μεταγραφής θα μπορούσε να περιέχει έξι με οκτώ ενεργά μόρια της RNA πολυμεράσης ΙΙ και να μεταγράφει πολλά γονίδια ταυτόχρονα (Cook et al. 1999). Εικόνα 6. Συνεντοπισμός των γονιδίων μέσα στον πυρήνα. Ενεργά γονίδια που βρίσκονται σε χρωματινικούς βρόγχους, οι οποίοι εκτείνονται πέρα από τον κύριο άξονα των χρωμοσωμάτων, μπορούν να συνεντοπίζονται in cis και in trans σε εργοστάσια μεταγραφής του πυρήνα ή σε περιοχές πλούσιες σε παράγοντες ματίσματος. Επιπρόσθετα, in trans αλληλεπιδράσεις ανάμεσα σε ρυθμιστικά στοιχεία και γονίδια μπορεί να οδηγήσουν στη συντονισμένη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης αυτών των γονιδίων. Figure 6. Actively transcribed genes that are located in chromatin loops protruding from the main chromosome axis can be co-localized, both in cis and in trans, in nuclear transcription factories, or in splicing-factor enriched speckles. Furthermore, interactions in trans between regulatory elements and genes can promote the coordinated regulation of the expression of those genes. 26

ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Οι διαφορετικοί κυτταρικοί τύποι σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό ποικίλουν, τόσο στη δομή όσο και στη λειτουργία τους, παρά το γεγονός ότι όλα σχεδόν τα κύτταρα ενός οργανισμού περιέχουν το ίδιο (ποσοτικά και ποιοτικά) DNA, εκτός από ορισμένες εξαιρέσεις (π.χ. τα απλοειδή γαμετικά κύτταρα, τα ώριμα ερυθροκύτταρα και τα λεμφοκύτταρα). Επομένως, η κυτταρική διαφοροποίηση δεν οφείλεται σε διαφορές στην ακολουθία ή στην ποσότητα του γενετικού υλικού. Η πιο αδιαμφισβήτητη απόδειξη για αυτό προέρχεται από πειράματα κλωνοποίησης θηλαστικών, στα οποία πυρήνες γονιμοποιημένων ωαρίων αντικαθίσταται από πυρήνες πλήρως διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων και το νέο ζυγωτό που προκύπτει αναπτύσσεται φυσιολογικά (στη μήτρα ανάδοχης μητέρας), σχηματίζοντας όλους τους ιστούς του νέου οργανισμού. Αντίθετα, η κυτταρική διαφοροποίηση εξαρτάται από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση. Αυτό σημαίνει ότι τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης αρχίζουν να διαφοροποιούνται γιατί συνθέτουν και συσσωρεύουν διαφορετικές ομάδες μορίων RNA και πρωτεϊνών. Φυσικά, οι διάφοροι κυτταρικοί τύποι, παρά τις έντονες μορφολογικές και λειτουργικές διαφορές τους, δεν διαφέρουν σε ολόκληρη τη σύσταση των μακρομορίων τους. Γενικά, για την κυτταρική διαφοροποίηση ισχύουν τα εξής: Ορισμένες θεμελιώδεις κυτταρικές λειτουργίες είναι κοινές σε όλα τα κύτταρα. Επομένως, οι δομικές πρωτεΐνες (χρωμοσωμάτων, ριβοσωμάτων και κυτταρικού σκελετού), τα ριβοσωμικά RNA και τα διάφορα ένζυμα (πολυμεράσες, επιδιορθωτικά, μεταβολικά, κ.α.) που συμμετέχουν σε αυτές, είναι παρόντα σε κάθε κύτταρο, ανεξάρτητα από τον τύπο του. Ορισμένες πρωτεΐνες είναι ουσιώδεις μόνο σε ορισμένους κυτταρικούς τύπους, όπως π.χ. η αιμοσφαιρίνη μόνο στα ερυθρά αιμοσφαίρια. Επομένως, εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα μόνο στα ειδικά κύτταρα, ενώ δεν ανιχνεύονται καθόλου σε άλλους κυτταρικούς τύπους. Πειράματα βασισμένα σε cdna (copy DNA μονόκλωνο DNA μόριο που προκύπτει από συγκεκριμένο RNA μόριο με τη δράση του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση) βιβλιοθήκες διαφορετικών ανθρώπινων κυτταρικών τύπων έδειξαν ότι κάθε κύτταρο εκφράζει περίπου 10.000-20.000 διαφορετικά αγγελιοφόρα RNA (messenger RNA mrna), από το σύνολο των περίπου 35.000 γνωστών γονιδίων. Εκτός από το είδος των mrnas που εκφράζονται σε κάθε περίπτωση, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης είναι αυτά που καθορίζουν τελικά την κατεύθυνση της διαφοροποίησης. 27

Τα προαναφερόμενα διαφορετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης, πάντως, αποκαλύπτουν μόνο ένα μέρος της αλήθειας, καθώς συγκρίνουν μόνο τα επίπεδα των mrna, κι όχι των πρωτεϊνών που αυτά παράγουν. Όπως θα δούμε παρακάτω, η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να γίνει και σε επίπεδα που έπονται της μεταγραφής. Επιπλέον, είναι δυνατόν ο ίδιος κυτταρικός τύπος να διαφοροποιεί την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων, ως απόκριση σε εξωκυτταρικά ερεθίσματα. Παραδείγματος χάριν, η μόλυνση κυττάρων με RNA ιό προκαλεί την άμεση ενεργοποίηση των γονιδίων των ιντερφερονών τύπου Ι, που με τη σειρά τους οδηγούν στην έκφραση μιας ομάδας αντί-ιϊκών πρωτεϊνών. Έτσι, το εξωτερικό ερέθισμα του ιού τροποποιεί τελικά το πρότυπο γονιδιακής έκφρασης με τέτοιο τρόπο, ώστε να προσαρμοστεί ή/και να αντιμετωπίσει την εξωτερική μεταβολή χωρίς όμως να διαφοροποιηθεί η ταυτότητα του κυττάρου. Η κυτταρική ταυτότητα μάλιστα, διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στο είδος των γονιδίων που τελικά θα αλλάξουν την έκφρασή τους, ως απόκριση στον ιό, όπως θα δούμε εκτενώς παρακάτω με τη διαφορετική απόκριση επιθηλιακών κυττάρων και Β-λεμφοκυττάρων του ανθρώπου (Αgelopoulos and Thanos, 2006). ΕΠΙΠΕΔΑ ΡΥΘΜΙΣΗΣ ΤΗΣ ΓΟΝΙΔΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ Είναι προφανές από τα προαναφερόμενα ότι το χώρο-χρονικό πρότυπο της γονιδιακής έκφρασης ενός κυττάρου μεταβάλλεται κατά τη διαφοροποίηση ή/και κατά την απόκριση σε εξωκυτταρικά σήματα. Αυτή η υπό συνθήκες μεταβολή, υποδηλώνει την ύπαρξη κάποιου μηχανισμού ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Για την ακρίβεια, ο μηχανισμός αυτός είναι πολυεπίπεδος και πολύπλοκος, όπως ακριβώς και η ίδια η διαδικασία της γονιδιακής έκφρασης (εικόνα 7). Δυο επίπεδα ελέγχου εντοπίζονται στη διαδικασία της έκφρασης της πληροφορίας που κωδικοποιείται σε ένα γονίδιο, πρώτα μέσω της μεταγραφής σε mrna και έπειτα μέσω της μετάφρασης σε πρωτεΐνη. Στην περίπτωση των ευκαρυωτικών γονιδίων, διακρίνονται δύο ακόμη επίπεδα. Συγκεκριμένα, επειδή τα περισσότερα ευκαρυωτικά γονίδια είναι ασυνεχή ή διακεκομμένα (περιέχουν ιντρόνια), μεταξύ μεταγραφής και μετάφρασης μεσολαβεί ένα ακόμη επίπεδο, η λεγόμενη ωρίμανση του mrna, κατά την οποία αποκόπτονται τα ιντρόνια και συρράπτονται τα διαδοχικά εξόνια. Τέλος, οι πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα, μετά τη σύνθεσή τους, συνήθως υφίστανται επιπλέον τροποποιήσεις (μετά-μεταφραστικές) προκειμένου να γίνουν πλήρως λειτουργικές. Σε κάθε ένα από τα επίπεδα αυτά υπάρχει ένας ή περισσότεροι ρυθμιστικοί 28