Άσκηση 9: Διαφοροποίηση - Εμβρυογένεση Σύνοψη Σκοπός της άσκησης είναι να γνωρίσουν οι εκπαιδευόμενοι τη γονιμοποίηση του ωαρίου, τις πρώτες διαιρέσεις του ζυγωτού και την απαρχή των κυτταρικών διαφοροποιήσεων στα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται οι γαμέτες και το ζυγωτό του αχινού λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων στον πειραματικό χειρισμό (ευκολία λήψης γαμετικού υλικού, ευκολία in vitro γονιμοποίησης ωαρίου, ευμέγεθες και ισολεκιθικό ωάριο, ευκολία μικροσκοπικής παρατήρησης των πρώτων διαιρέσεων). Η άσκηση δίνει τη δυνατότητα να παρατηρηθεί «ζωντανά» με το μικροσκόπιο η γονιμοποίηση του ωαρίου από τα σπερματοζωάρια και (με κατάλληλη εκ των προτέρων προετοιμασία) τα στάδια των δύο, τεσσάρων, οκτώ, δεκάξι, τριανταδύο (βλαστίδιο) και εξηντατεσσάρων κυττάρων (γαστρίδιο). Επίσης, επιτρέπει να συζητηθούν τα φαινόμενα της ολοδυναμίας των βλαστικών κυττάρων και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Προαπαιτούμενη γνώση Από το βιβλίο των Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010), Βιολογία (τόμος IIΙ), Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης, ISBN: 978-960-524-328-9, συνιστάται ο φοιτητής να ανατρέξει στο Κεφάλαιο 46: Η αναπαραγωγή των ζώων και στο Κεφάλαιο 47: Η ανάπτυξη των ζώων. 1. Εισαγωγικό μέρος 1.1. Γονιμοποίηση Διαφοροποίηση Μορφογένεση Η εμβρυϊκή ανάπτυξη είναι μια πορεία πολυσταδιακή και πολύπλοκη αλλά και ιδιαίτερα εντυπωσιακή. Σ αυτή τη διεργασία, ένα και μοναδικό κύτταρο, το ωάριο, γονιμοποιείται και στη συνέχεια αρχίζει να διαιρείται διαδοχικά. Απ αυτές τις διαδοχικές διαιρέσεις προκύπτει τελικώς το έμβρυο. Από το έμβρυο θα προκύψει εν συνεχεία το νεαρό άτομο που με τη σειρά του θα ωριμάσει και θα παραχωρήσει τη θέση του στον ενήλικο οργανισμό. Όλες αυτές οι μεταβολές γίνονται μέσω των διεργασιών της ανάπτυξης, οι οποίες μετατρέπουν ένα μικροσκοπικό κύτταρο σε ένα αναπαραγωγικά ώριμο ζώο, το οποίο αποτελείται από πολλά εκατομμύρια ή και δισεκατομμύρια κύτταρα, με μεγάλο βαθμό διαφοροποίησης μεταξύ τους. Θεμελιώδες χαρακτηριστικό των αναπτυξιακών διεργασιών είναι το γεγονός ότι κάθε τμήμα του οργανισμού αναπτύσσεται σύμφωνα με ένα αυστηρά καθορισμένο σχέδιο. Εάν ένα κύτταρο διπλασιαστεί σε μέγεθος, τα διάφορα μέρη του (πυρήνας, οργανίδια, κυτταροπλασματική μεμβράνη κ.λπ.) αυξάνονται και αυτά σε μέγεθος αλλά με τρόπο καθορισμένο. Κατά ανάλογο τρόπο, όταν αυξάνεται το μέγεθος του εμβρύου ή του νεαρού ατόμου, τα όργανα του σώματος αυξάνονται αρμονικά μεταξύ τους. Τα ζώα, είτε είναι μεγάλα είτε μικρά, αποτελούνται από όργανα και ιστούς που συνυπάρχουν και συλλειτουργούν με έναν θαυμαστό σχεδιασμό. Προϊόν αυτού του σχεδιασμού είναι, εκτός από την ιδιαίτερη εσωτερική οργάνωση (δηλαδή τον ελεγχόμενο τρόπο αλληλεπίδρασης των ιστών και των οργάνων), και η ιδιαίτερη μορφή που έχει κάθε είδος και μας επιτρέπει να το διακρίνουμε από άλλα. Η πραγμάτωση αυτού του σχεδιασμού στα έμβρυα των ειδών συνιστά την πορεία της μορφογένεσης. Όπως καταλαβαίνουμε και από την ίδια τη λέξη, η μορφογένεση είναι η διεργασία με την οποία ένας οργανισμός αποκτά την εσωτερική και την εξωτερική του ανατομία, και σε τελευταία ανάλυση και τη χαρακτηριστική του λειτουργία. Είναι προφανές, ότι η πορεία της μορφογένεσης προκαλεί μεταβολές στη δομή του αναπτυσσόμενου οργανισμού οι οποίες είναι καθοριστικές. Από ένα γονιμοποιημένο ωάριο προκύπτουν δισεκατομμύρια νέα κύτταρα, που όμως διαφέρουν στη δομή και τη λειτουργία τους από το αρχικό ζυγωτό. Μερικά θα εξειδικευτούν σε νευρικά ή μυϊκά κύτταρα (βλέπε Εικ. 3.12 και 3.13). Κάποια άλλα σε κύτταρα της επιδερμίδας ή κύτταρα των εσωτερικών οργάνων, όπως το ήπαρ, οι νεφροί κ.λπ. Καθένα από αυτά τα διαφορετικά κύτταρα είναι προορισμένο να εκτελεί ένα συγκεκριμένο σύνολο λειτουργιών. Ορισμένες από αυτές είναι παρόμοιες με εκείνες όλων των άλλων κυττάρων (όπως π.χ. ο βασικός κυτταρικός μεταβολισμός είναι σχεδόν απαράλλακτος στα περισσότερα κύτταρα). Ορισμένες άλλες, ωστόσο, είναι πολύ διαφορετικές, και μπορούμε να πούμε μοναδικές, σε σχέση με εκείνες των υπολοίπων κυττάρων. Για παράδειγμα, τα μυϊκά κύτταρα αν και έχουν μεταβολισμό που είναι σε μεγάλο βαθμό παρόμοιος με εκείνον των υπολοίπων κυττάρων, είναι εξειδικευμένα - 118 -
στη συστολή, κάτι που χαρακτηρίζει μόνο αυτά και κανένα άλλο είδος κυττάρου στο σώμα των ζώων. Παρομοίως, τα νευρικά κύτταρα, παρότι είναι και αυτά κύτταρα και έχουν έναν βασικό μεταβολισμό εν πολλοίς παρόμοιο με εκείνον των υπολοίπων κυττάρων, είναι ωστόσο εξειδικευμένα στη μετάδοση ηλεκτρικών παλμών. Κατ αναλογία, τα ηπατικά είναι εξειδικευμένα στην προστασία του οργανισμού από ξένες ουσίες, όπως και στην παραγωγή ειδικών ορμονών και άλλων ουσιών. Τα κύτταρα του εντερικού επιθηλίου είναι εξειδικευμένα στην απορρόφηση θρεπτικών ουσιών, τα κύτταρα της επιδερμίδας στην προστασία των υποκείμενων ιστών και την άδηλη αναπνοή κ.λπ. Αυτή η πορεία της κυτταρικής εξειδίκευσης ονομάζεται διαφοροποίηση. Η διαφοροποίηση είναι μέρος της εμβρυϊκής ανάπτυξης, δεδομένου ότι τα περισσότερα κύτταρα αποκτούν τη βασική τους διαφοροποίηση ήδη κατά τα πρώτα στάδια της εμβρυογένεσης (π.χ. τα νευρικά, τα μυϊκά κ.λπ.). Ένα από τα μεγαλύτερα ερωτήματα της σύγχρονης βιολογίας είναι να καθορίσει το πώς, δηλαδή το ποιοι παράγοντες ωθούν ένα κύτταρο στο να διαφοροποιηθεί προς μια κατεύθυνση και όχι κάποια άλλη. Μέχρι στιγμής, το συμπέρασμα από αυτές τις έρευνες είναι ότι η διαφοροποίηση των κυττάρων οφείλεται σε πληροφορίες που ενυπάρχουν στο γενετικό υλικό των κυττάρων, οι οποίες όμως εκφράζονται αναλόγως της θέσης που καταλαμβάνει κάθε κύτταρο στο νεοσχηματιζόμενο έμβρυο. Ωστόσο, η δυνατότητα διαφοροποίησης δεν περιορίζεται μόνο κατά την εμβρυογένεση (βλέπε και θεωρητικό μέρος της Άσκησης 7). Όταν, για παράδειγμα, τραυματιζόμαστε σε κάποιον μυ, τότε με την κυτταρική διαίρεση κατάλληλων κυττάρων (που ζουν μέσα στους μυς μας σε αδιαφοροποίητη κατάσταση) αναδημιουργούνται νέα μυϊκά κύτταρα, τα οποία έχουν ιδιότητες ίδιες με εκείνες των τραυματισθέντων κυττάρων. Ένα άλλο παράδειγμα εκ νέου κυτταρικής διαφοροποιήσεως είναι τα κύτταρα του αίματος, τα οποία έχουν περιορισμένο κύκλο ζωής (τα ερυθρά αιμοσφαίρια παραμένουν στην κυκλοφορία για ~120 ημέρες). Προκειμένου να αντικατασταθούν όσα ερυθρά αιμοσφαίρια πεθαίνουν, υπάρχουν ειδικά κύτταρα που ονομάζονται πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (ενίοτε αναφέρονται και ως αρχέγονα βλαστικά κύτταρα) και ενδιαιτούν στον μυελό των οστών, από τα οποία προκύπτουν νέα κύτταρα που διαφοροποιούνται σε νέα ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκοκύτταρα και αιμοπετάλια. Επομένως, η διαφοροποίηση είναι μια δυναμική βιολογική διεργασία που δίνει τη δυνατότητα στους οργανισμούς να παράγουν εξειδικευμένα κύτταρα, όπου και όταν τα χρειάζονται. 1.2. Η γονιμοποίηση και η διαφοροποίηση στον θαλάσσιο εχίνο Σ αυτήν την άσκηση θα παρατηρήσετε και θα μελετήσετε τη γονιμοποίηση το ωαρίου του θαλάσσιου εχίνου (του είδους Arbacia punctulata), καθώς και την εμβρυική ανάπτυξη του ζώου μέχρι το στάδιο του πλουτέα. 1.2.1. Δομή του εχίνου Ο εχίνος ανήκει στη συνομοταξία των εχινόδερμων (όπου ανήκουν και οι αστερίες). Καλύπτεται εξωτερικώς από αγκάθια, τα οποία είναι κινητά, δεδομένου ότι στη βάση τους στηρίζονται επάνω σε ειδικά επάρματα. Στους εχίνους, η έδρα και οι γεννητικοί πόροι βρίσκονται στο άνω μέρος του ζώου (Εικ. 9.1 και 9.2). Εικόνα 9.1 Απεικόνιση, ραχιαία άποψη (κέντρο) και κοιλιακή άποψη (δεξιά) του ώριμου θαλάσσιου εχίνου. - 119 -
Στους γεννητικούς πόρους εκβάλλουν οι γονάδες (Εικ. 9.2). Μέσα από τους γεννητικούς πόρους ελευθερώνονται οι γαμέτες (τόσο των αρσενικών όσο και των θηλυκών ατόμων) απευθείας στη θάλασσα. Αυτό σημαίνει ότι στα εχινόδερμα, η γονιμοποίηση είναι εξωτερική, δηλαδή δεν γίνεται μέσα σε κάποια σωματική κοιλότητα (π.χ. του θηλυκού, όπως συμβαίνει στον άνθρωπο) αλλά στο θαλάσσιο περιβάλλον. Στους εχίνους, το στόμα βρίσκεται στην κοιλιακή πλευρά, εντός μιας ιδιαίτερης δομής που ονομάζεται «λύχνος του Αριστοτέλη» (Εικ. 9.1 και 9.2). Το στόμα των εχίνων διαθέτει πέντε δόντια που χρησιμοποιούν οι αχινοί για να τεμαχίζουν τα φύκη με τα οποία τρέφονται. Εικόνα 9.2 Σχηματική παράσταση της εσωτερικής ανατομίας του θαλάσσιου εχίνου και φωτογραφίες των γονάδων ενός θηλυκού (επάνω) και ενός αρσενικού (κάτω) ατόμου. 1.2.2. Αναπτυξιακά στάδια του εχίνου Το πρωταρχικό στάδιο δημιουργίας των ζωικών οργανισμών είναι η γονιμοποίηση. Στις διάφορες τάξεις ζωικών οργανισμών, η γονιμοποίηση και η δημιουργία του ζυγωτού μπορεί να εμφανίζουν διαφορές αλλά υπάρχουν ορισμένα γενικά χαρακτηριστικά που είναι λίγο-πολύ κοινά σε όλους τους ζωικούς οργανισμούς. Σε ό,τι αφορά τον θαλάσσιο εχίνο, η διεργασία της γονιμοποίησης παρουσιάζεται στην Εικόνα 9.3. Εικόνα 9.3 Σχηματική παράσταση της γονιμοποίησης του ωαρίου του εχίνου. - 120 -
Η μεμβράνη του ωαρίου, πριν γονιμοποιηθεί, περιβάλλεται από τη λεκιθική στιβάδα και βρίθει από υποδοχείς σύνδεσης των σπερματοζωαρίων. Γύρω απ αυτό το περίβλημα υπάρχει επιπλέον μια ζώνη εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, που ονομάζεται ζελατινώδης χιτώνας (και τον οποίον θα μπορέσετε να διακρίνετε στη σημερινή άσκηση). Αμέσως κάτω από την κυτταροπλασματική μεμβράνη υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός από φλοιικά κοκκία (Εικ. 9.3). Μόλις ένα σπερματοζωάριο έρθει σε επαφή με τον ζελατινώδη χιτώνα, ενεργοποιείται ένα ειδικό οργανίδιο στο πρόσθιο άκρο του σπερματοζωαρίου που ονομάζεται ακρόσωμα (βλέπε Εικ. 9.3). Πρακτικώς αυτό σημαίνει ότι: πρώτον, απελευθερώνονται ένζυμα που υδρολύουν τον ζελατινώδη χιτώνα και, δεύτερον, επιτρέπουν την προσέγγιση της ακροσωματικής απόφυσης στο ωάριο (η ακροσωματική απόφυση είναι μια δομή του σπερματοζωαρίου που αρχίζει να επιμηκύνεται μόνον όταν ενεργοποιηθεί το ακρόσωμα). Στο άκρο της ακροσωματικής απόφυσης υπάρχουν ειδικές πρωτεΐνες οι οποίες προσδένονται στους υποδοχείς σύνδεσης του ωαρίου που προεξέχουν από τη λεκιθική στιβάδα. Η πρόσδεση των πρωτεϊνών του σπερματοζωαρίου στους υποδοχείς σύνδεσης του ωαρίου είναι τόσο εξειδικευμένη ώστε θυμίζει την εξειδίκευση που χαρακτηρίζει ένα κλειδί με την αντίστοιχη κλειδαριά. Αυτή η υψηλή εξειδίκευση εξασφαλίζει ότι το ωάριο δεν πρόκειται να γονιμοποιηθεί από σπερματοζωάρια άλλων ειδών παρά μόνο από σπερματοζωάρια του ίδιου ζωικού είδους. Η σύνδεση των πρωτεϊνών του σπερματοζωαρίου με τους υποδοχείς της κυτταροπλασματικής μεμβράνης του ωαρίου οδηγεί στη σύντηξη των κυτταροπλασματικών μεμβρανών του σπερματοζωαρίου και του ωαρίου και ακολούθως στην είσοδο του πυρήνα του σπερματοζωαρίου στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου. Αυτό με τη σειρά του πυροδοτεί το επόμενο στάδιο της γονιμοποίησης που είναι η φλοιική αντίδραση, δηλαδή η σύντηξη των φλοιικών κοκκίων του ωαρίου με την κυτταροπλασματική μεμβράνη. Αυτό το συμβάν προκαλεί ραγδαία μεταβολή των χαρακτηριστικών της κυτταροπλασματικής μεμβράνης του ωαρίου καθώς οδηγεί στο να αποκοπούν από τη λεκιθική στιβάδα όλοι οι υποδοχείς σύνδεσης των σπερματοζωαρίων. Εξαιτίας αυτού του βήματος, είναι πρακτικώς αδύνατον να εισέλθει στο ωάριο κάποιο άλλο σπερματοζωάριο, πέραν εκείνου που έχει ήδη εισέλθει. Παράλληλα, η λεκιθική στιβάδα αποσπάται από την κυτταροπλασματική μεμβράνη και σκληραίνει, δημιουργώντας το περίβλημα γονιμοποίησης που καθιστά εντελώς αδύνατη την προσέγγιση και είσοδο άλλων σπερματοζωαρίων στο ωάριο. Το περίβλημα γονιμοποίησης σχηματίζεται δύο περίπου λεπτά μετά την είσοδο του σπερματοζωαρίου στο ωάριο. Περίπου 20 λεπτά μετά, ο πυρήνας του σπερματοζωαρίου συντήκεται με τον πυρήνα του ωαρίου και περίπου 70 λεπτά αργότερα, αρχίζει η 1 η κυτταρική διαίρεση του ζυγωτού, γεγονός που σηματοδοτεί το πέρας της διεργασίας της γονιμοποίησης και την έναρξη των επομένων σταδίων της εμβρυϊκής ανάπτυξης. Τα επόμενα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης είναι η αυλάκωση, η γαστριδίωση και η οργανογένεση. Η αυλάκωση είναι το 1 ο στάδιο μετά τη γονιμοποίηση και χαρακτηρίζεται από πολλές διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις. Τα κύτταρα που δημιουργούνται δεν συσσωρεύουν πρώτες ύλες, αλλά καταναλώνουν όσα υλικά έχουν κληρονομήσει από το κυτταρόπλασμα του ωαρίου (με βάση την ορολογία του κυτταρικού κύκλου που μάθατε στις Ασκήσεις 7 και 8, τα κύτταρα που δημιουργούνται από τις αυλακώσεις παρακάμπτουν τις φάσεις G 1 και G 2 και διέρχονται κατευθείαν τις φάσεις S και M, δηλαδή τη φάση σύνθεσης του DNA και τη φάση της μίτωσης.) Κοντολογίς, δεν αυξάνονται σε μέγεθος. Εκείνο που πρακτικώς συμβαίνει σ αυτές τις διαιρέσεις είναι να διαμοιράζεται το κυτταρόπλασμα του ζυγωτού στα σχηματιζόμενα κύτταρα. Από τις αποθηκευμένες θρεπτικές ύλες αυτού του κυτταροπλάσματος προέρχονται τα υλικά που είναι απαραίτητα για όλες τις διαιρέσεις μέχρι την ολοκλήρωση του σταδίου της αυλάκωσης. Έτσι, το έμβρυο αποκτά ολοένα και περισσότερα κύτταρα, αλλά το μέγεθός του παραμένει σταθερό, ενώ αντιθέτως, το μέγεθος των κυττάρων που προκύπτουν από κάθε νέα διαίρεση είναι σχεδόν το μισό των προηγουμένων κυττάρων (Εικ. 9.4). Τα κύτταρα που δημιουργούνται από την αυλάκωση ονομάζονται βλαστομερίδια. Σχηματίζουν μια σφαίρα που στο εσωτερικό της είναι «κενή», δηλαδή δεν περιέχει κύτταρα. Αυτή η κοιλότητα ονομάζεται βλαστική κοιλότητα και το έμβρυο σ αυτό το στάδιο ονομάζεται βλαστίδιο (Εικ. 9.4). Ένα πολύ σημαντικό χαρακτηριστικό του βλαστιδίου σε ό,τι αφορά τη διαφοροποίηση και τη μορφογένεση είναι η πολικότητά του, δηλαδή ότι δεν είναι εντελώς όμοιοι οι πόλοι της σφαίρας του βλαστιδίου. Για να ερμηνευθεί αυτή τη διαφορά, πρέπει να ανατρέξουμε στο ωάριο. Το κυτταρόπλασμά του ωαρίου δεν είναι ομοιογενές. Ορισμένες ουσίες βρίσκονται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση στη μια πλευρά του ωαρίου και κάποιες άλλες στην άλλη. Η πιο εμφανής ανισοκατανομή αφορά τη λέκιθο, δηλαδή την περιοχή του ωαρίου με τις αποθηκευμένες πρώτες ύλες. Έτσι, όταν αρχίσουν οι κυτταρικές διαιρέσεις της αυλάκωσης, τα νέα κύτταρα δεν περιέχουν όλα τα ίδια ακριβώς συστατικά. - 121 -
Η 1 η διαίρεση του ζυγωτού γίνεται κατά τον μεσημβρινό του ωαρίου και δίνει δύο κύτταρα που είναι μεταξύ τους πανομοιότυπα. Ομοίως, και από τη 2 η διαίρεση (που επίσης γίνεται στο μεσημβρινό επίπεδο αλλά κάθετα προς το επίπεδο της 1 ης διαίρεσης) προκύπτουν συνολικώς τέσσερα κύτταρα που και αυτά είναι μεταξύ τους πανομοιότυπα. Όμως η επόμενη διαίρεση γίνεται στο επίπεδο του ισημερινού (βλέπε αντίστοιχο στάδιο στη σχηματική παράσταση της Εικ. 9.4) και πλέον δίνει δύο τετράδες κυττάρων που διαφέρουν μεταξύ τους. Η λέκιθος (αλλά και άλλες ουσίες) που διαμοιράζονταν ισομερώς στα τέσσερα πρώτα κύτταρα του εμβρύου, τώρα, με την 3 η διαίρεση αρχίζει και διαφέρει σε κάθε ήμισυ του βλαστιδίου. Καθώς οι διαιρέσεις συνεχίζονται, τα κύτταρα κάθε πόλου του βλαστιδίου έχουν διαφορετικό περιεχόμενο και τελικά διαφορετικές ιδιότητες από τα κύτταρα του άλλου πόλου. Έτσι, τα εμβρυικά κύτταρα που δημιουργούνται στην πλευρά που βρισκόταν η λέκιθος του ωαρίου σχηματίζουν τον «φυτικό πόλο» του εμβρύου, ενώ τα κύτταρα της περιοχής που βρίσκεται στη διαμετρικώς αντίθετη πλευρά σχηματίζουν τον επονομαζόμενο «ζωικό πόλο» του εμβρύου. Έχουμε με άλλα λόγια την πρώτη εκδήλωση διαφοροποίησης, η σημασία της οποίας θα γίνει κατανοητή στη γαστριδίωση, δηλαδή στο επόμενο στάδιο εμβρυικής ανάπτυξης. Ας επανέλθουμε όμως στις κυτταρικές διαιρέσεις της αυλάκωσης. Το περίβλημα γονιμοποίησης δεν είναι ορατό, αλλά εξακολουθεί να υπάρχει. Όταν διαρραγεί το περίβλημα, τότε τερματίζεται το στάδιο της αυλάκωσης. Τώρα, το βλαστίδιο ονομάζεται ελεύθερο βλαστίδιο και πλέον κολυμπά ελεύθερο στο νερό. Με το πέρας της αυλάκωσης και τον σχηματισμό του ελευθέρου βλαστιδίου, οι κυτταρικές διαιρέσεις επιβραδύνονται πάρα πολύ και αρχίζει η επόμενη αναπτυξιακή φάση που ονομάζεται γαστριδίωση. Σ αυτήν τη φάση, τα κύτταρα του εμβρύου αρχίζουν να συσσωρεύουν πρώτες ύλες. Επιπλέον, αρχίζουν να μεταναστεύουν από την αρχική τους θέση και να οδηγούνται σε νέες θέσεις όπου πλέον θα συμμετάσχουν στο σχηματισμό των οργάνων. Η μετανάστευση των κυττάρων καθορίζεται από τη θέση τους, δηλαδή από το αν βρίσκονται στον φυτικό ή τον ζωικό πόλο του εμβρύου. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, το έμβρυο ονομάζεται γαστρίδιο (Εικ. 9.4). Προκειμένου να σχηματιστεί το γαστρίδιο, τα κύτταρα του βλαστιδίου αναδιατάσσονται με τρόπο ώστε να σχηματίσουν τρεις διακριτές στιβάδες, το ενδόδερμα, το μεσόδερμα και το εξώδερμα, ενώ παράλληλα σχηματίζεται το αρχέντερο, δηλαδή ο αρχέγονος εντερικός σωλήνας. Τα κύτταρα κάθε στιβάδας αλληλεπιδρούν με συγκεκριμένο τρόπο με τα κύτταρα των άλλων στιβάδων και αρχίζει πλέον η δημιουργία των οργάνων του σώματος (οργανογένεση) (βλέπε π.χ. το σχηματισμό του μεσοδέρματος στην Εικόνα 9.4, από όπου θα σχηματιστεί ο σκελετός του πλουτέα). Από τη στιγμή που γονιμοποιείται το ωάριο μέχρι την πλήρη ωρίμανση του εχίνου μεσολαβούν περίπου 3 εβδομάδες. Τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια του είδους Arbacia punctulata κατά την καλλιέργεια σε ελεγχόμενο εργαστηριακό περιβάλλον (σε θερμοκρασία 23 ο C) αναγράφονται στον Πίνακα 9.1 και παρουσιάζονται σχηματικά στην Εικόνα 9.4. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι εχίνοι απελευθερώνουν τους γαμέτες τους κατά την πανσέληνο. Στο εργαστήριο όμως μπορούμε να επάγουμε με τεχνητό τρόπο την απελευθέρωση των γαμετικών κυττάρων (βλέπε πρακτικό μέρος της άσκησης). Χρόνος 0 1-2 λεπτά 50-70 λεπτά 80-110 λεπτά 5-6 ώρες 7-8 ώρες 12-15 ώρες 24 ώρες 3 εβδομάδες Στάδιο ανάπτυξης Γονιμοποίηση Σχηματισμός περιβλήματος γονιμοποίησης 1 η αυλάκωση 2 η αυλάκωση Βλαστίδιο Ελευθέρωση βλαστιδίου (καταστροφή του περιβλήματος γονιμοποίησης) Γαστρίδιο Πλουτέας Μεταμόρφωση Πίνακας 9.1 Αναπτυξιακά στάδια στον θαλάσσιο εχίνο Arbacia punctulata. - 122 -
Εικόνα 9.4 Αναπτυξιακά στάδια του θαλάσσιου εχίνου. Διαγραμματική απεικόνιση (επάνω) και μικροσκοπική παρατήρηση (400Χ) των κυριότερων σταδίων (κάτω). 2. Πρακτικό μέρος 2.1. Κατάλογος εφοδίων 2.1.1. Συσκευές οπτικό μικροσκόπιο ή/και στερεοσκόπιο. 2.1.2. Υλικά ζωντανοί εχίνοι αμφοτέρων των φύλων, αντικειμενοφόροι πλάκες, καλυπτρίδες, τρυβλία Petri, δοχεία ζέσεως των 100 ml και 250 ml, ογκομετρικοί κύλινδροι των 100 ml, σταγονόμετρα με φαρδύ στόμιο, σύριγγες των 5 ml (με βελόνα μικρού διαμετρήματος), πλαστικά δοχεία, παραφίνη. 2.1.3. Διαλύματα θαλασσινό νερό (~3 λίτρα), διάλυμα 0,5Μ KCl. - 123 -
2.2. Πειραματική διαδικασία 2.2.1. Επαγωγή της απελευθερώσεως των γαμετών από τον θηλυκό και τον αρσενικό εχίνο Η απελευθέρωση των γαμετών από τον εχίνο (δηλαδή των ωαρίων από τα θηλυκά άτομα και των σπερματοζωαρίων από τα αρσενικά άτομα) επιτυγχάνεται με ένεση διαλύματος KCl στην περιοχή γύρω από το στόμα. Για τον σκοπό αυτό θα κάνετε ένεση 2-3 ml διαλύματος 0,5Μ KCl, χρησιμοποιώντας μία σύριγγα των 5 ml. Επειδή η ένεση γίνεται στην περιστοματική περιοχή διευκολύνει να κρατάτε το ζώο ανεστραμμένο, δηλαδή με το στόμα προς τα επάνω (συμβουλευτείτε την Εικ. 9.5). Εικόνα 9.5 Διαδραστική απεικόνιση του τρόπου επαγωγής της απελευθέρωσης και συλλογής γαμετών στον θαλάσσιο εχίνο. Μετά την ένεση του διαλύματος ανατοποθετήστε το ζώο με το στόμα προς τα κάτω και παρακολουθήστε πότε θα αρχίσει η έκκριση των γαμετών από τους γονοπόρους, οι οποίοι βρίσκονται στη ραχιαία επιφάνεια, δίπλα από την έδρα. Στα θηλυκά άτομα, τα ωάρια που εκκρίνονται έχουν πορτοκαλί χρώμα (βλέπε Εικ. 9.2). Μόλις εκκινήσει η έκκριση των ωαρίων, τοποθετήστε τον θηλυκό εχίνο ανεστραμμένο πάνω σε ένα δοχείο ζέσεως των 100 ml γεμάτο με θαλασσινό νερό (Εικ. 9.5 και 9.6). Στα αρσενικά άτομα, τα σπερματοζωάρια έχουν λευκό-υποκίτρινο χρώμα (βλέπε Εικ. 9.2). Μόλις δείτε ότι αρχίζει η έκκριση των γαμετών, αναποδογυρίστε και πάλι τον αρσενικό εχίνο ώστε τα σπερματοζωάρια να πέφτουν μέσα σε ένα στεγνό τριβλύο Petri (Εικ. 9.6). Σημειωτέον ότι τα σπερματοζωάρια απαιτούν λίγο μεγαλύτερο χρόνο για να απελευθερωθούν, σε σχέση με τα ωάρια. Σκεπάστε το τριβλύο και αποθηκεύστε τα σπερματοζωάρια σε ψυγείο ή σε άλλο ψυχρό μέρος, μέχρι να τα χρησιμοποιήσετε στη συνέχεια. Τα ωάρια μέσα στο ποτήρι με το θαλασσινό νερό μετά από λίγο καθιζάνουν. Μόλις συμβεί αυτό, χύστε προσεκτικά το υπερκείμενο θαλασσινό νερό. Επαναλάβετε τη διαδικασία αυτή άλλες δύο φορές χρησιμοποιώντας κάθε φορά φρέσκο θαλασσινό νερό (καθαρισμός των ωαρίων). Χρησιμοποιώντας ένα σταγονόμετρο με φαρδύ στόμιο, πάρτε 5-6 σταγόνες από τα εκπλυμένα ωάρια και αραιώστε τα σε 10 ml θαλασσινό νερό. - 124 -
Εικόνα 9.6 Τρόπος συλλογής των ωαρίων και των σπερματοζωαρίων του θαλάσσιου εχίνου. 2.2.2. Γονιμοποίηση των ωαρίων Πάρτε μια μικρή ποσότητα (μια σταγόνα) από το αιώρημα των ωαρίων που φτιάξατε προηγουμένως και μεταφέρετέ την επάνω σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα (ή σε ένα καθαρό τρυβλίο Petri) προκειμένου να τα παρατηρήσετε. ΠΡΟΣΟΧΗ! Επειδή τα ωάρια του εχίνου έχουν μεγάλο μέγεθος, ΜΗΝ τοποθετήσετε καλυπτρίδα απευθείας επάνω στο δείγμα των ωαρίων στην αντικειμενοφόρο γιατί θα τα καταστρέψετε! Συνήθως τα ωάρια τα παρατηρούμε αφού τα τοποθετήσουμε σε μία ειδική αντικειμενοφόρο πλάκα που έχει κοιλότητα. Εναλλακτικά, τα τοποθετούμε σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα στην οποία κατασκευάζουμε τέσσερα σημεία στήριξης από παραφίνη, επάνω στα οποία μπορούμε στη συνέχεια να τοποθετήσουμε την καλυπτρίδα (Εικ. 9.7). Τα τέσσερα άκρα της παραφίνης προσθέτουν ένα μικρό ύψος στα σημεία στήριξης της καλυπτρίδας έτσι ώστε να μην θέτει σε κίνδυνο την ακεραιότητα των ωαρίων. Εικόνα 9.7 Αντικειμενοφόρος και καλυπτρίδα με παραφινωμένα άκρα. Παρατηρήστε τα ωάρια και προσπαθήστε να μετρήσετε τη διάμετρό τους. Πώς θα το επιτύχετε αυτό; Από το τρυβλίο Petri στο οποίο έχετε αποθηκεύσει τα σπερματοζωάρια, πάρτε μια μικρή σταγόνα και αραιώστε την σε 10 ml θαλασσινό νερό. Απ αυτό το εναιώρημα, πάρτε στη συνέχεια μια σταγόνα και τοποθετήστε την σε αντικειμενοφόρο με υπερυψωμένη καλυπτρίδα, δηλαδή με παραφινωμένα άκρα στήριξης της καλυπτρίδας (βλέπε Εικ. 9.7). Πάρτε ακολούθως και μια σταγόνα από το εναιώρημα των ωαρίων και αναμίξτε την στην ίδια αντικειμενοφόρο με τα σπερματοζωάρια. Σημειώστε τον χρόνο που έλαβε χώρα η ανάμιξη των γαμετών και ονομάστε τον χρόνο t0. - 125 -
Τοποθετήστε την αντικειμενοφόρο στο μικροσκόπιο και παρατηρήστε (με αντικειμενικό φακό 10Χ). Μπορείτε να παρατηρήσετε την κίνηση των σπερματοζωαρίων; Η είσοδος των σπερματοζωαρίων στο ωάριο δεν γίνεται εύκολα αντιληπτή, αλλά η γονιμοποίηση μπορεί να γίνει αντιληπτή από τον σχηματισμό της διαφανούς μεμβράνης γονιμοποίησης. Σημειώστε παρακάτω τον χρόνο που θα σχηματιστεί η μεμβράνη γονιμοποίησης και συγκρίνετέ την με την τιμή του Πίνακα 9.1. Χρόνος σχηματισμού της μεμβράνης γονιμοποιήσεως: min 2.2.3. Παρατήρηση των σταδίων των αυλακώσεων Συμβουλευτείτε τον Πίνακα 9.1 για το πότε περίπου θα λάβει χώρα η 1 η αυλάκωση του γονιμοποιημένου ωαρίου, δηλαδή πότε θα σχηματιστεί το στάδιο των δύο κυττάρων. Συγκρίνατε την τιμή αυτή με εκείνη που βρίσκετε εσείς. Χρόνος που εμφανίστηκε η 1 η αυλάκωση: min ΕΡΩΤΗΣΗ: Γιατί χρειάζεται τόσο χρόνο για να συμβεί αυτή η 1 η κυτταρική διαίρεση (συμβουλευτείτε την Άσκηση 7); Αν απομακρύνουμε το ένα από τα δύο κύτταρα, τι πιστεύετε ότι θα συμβεί; Συγκρίνετε με τον Πίνακα 9.1 τον χρόνο εμφάνισης της 2 ης αυλάκωσης και σχεδιάστε παρακάτω το αποτέλεσμα των δύο αυλακώσεων. Χρόνος που εμφανίστηκε η 2 η αυλάκωση: min ΕΡΩΤΗΣΗ: Πόσος χρόνος χρειάζεται για να συμβεί η 2 η διαίρεση (αυλάκωση); Οι αυλακώσεις θα μπορούσαν να λάβουν χώρα σε αποσταγμένο νερό (αντί του θαλασσινού); Πόσα κύτταρα έχει τώρα το έμβρυο του εχίνου; Αν απομακρύνουμε ένα από τα κύτταρα που προκύπτουν από τη 2 η αυλάκωση, τι πιστεύετε ότι θα συμβεί; 1 η αυλάκωση 2 η αυλάκωση Στη συνέχεια, επειδή τα επόμενα στάδια της εμβρυικής ανάπτυξης του εχίνου χρειάζονται περισσότερες ώρες απ ό,τι προβλέπεται για την εργαστηριακή άσκηση (βλέπε Πίνακα 9.1), θα σας δοθούν από τους υπεύθυνους του εργαστηρίου τα στάδια του βλαστιδίου, του ελεύθερου βλαστιδίου, του γαστριδίου και - 126 -
του πλουτέα, τα οποία θα έχουν προετοιμαστεί νωρίτερα. Παρατηρήστε μικροσκοπικά τα στάδια αυτά και ζωγραφίστε τις εικόνες που βλέπετε. Στάδιο βλαστιδίου Στάδιο ελεύθερου βλαστιδίου Στάδιο γαστριδίου Στάδιο πλουτέα 2.3. Παρατηρήσεις - 127 -
Συνιστώμενη βιβλιογραφία 1. Campbell, N. A., & Reece, J. B. (2010). Βιολογία (τόμος IIΙ). Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης. ISBN: 978-960-524-328-9. 2. Καλιάφας, Α., & Κατσώρης, Π. (1991). Γενική Βιολογία: Από τη θεωρία στο πείραμα. Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα. - 128 -