Ο Κυτταρικός Κύκλος The Cell Cycle
H ζωή του κυττάρου Θυγατρικά Κύτταρα Γήρανση (Senescence) Κυτταρικός Κύκλος Αντιγραφή του DNA και Κυτταρική αύξηση Κυτταρική ιαίρεση Κυτταρικός θάνατος
Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου ιαχωρισμός χρωμοσωμάτων G2 M Κυτταροπλασματική ιαίρεση (Κυτταροκίνηση) S G1
ΗφάσηG 0 Z Ζ Ζ Ζ Quiescence M G 0 G2 S G1 Είναι περίοδος στην οποία το κύτταρο ευρίσκεται «έξω» απότονκυτταρικόκύκλο, σε κατάσταση ληθάργου (quiescent), δηλαδή δεν διπλασιάζει το DNA και δεν διαιρείται, επιτελεί όμως άλλες λειτουργίες (μεταβολισμός, επικοινωνία, κίνηση, κ.α.) Σε συνθήκες κυτταροκαλιέργειας, τα κύτταρα πηγαίνουν από τη G 1 στη G 0 όταν οι θρεπτικές ουσίες δεν επαρκούν, έως ότου υπάρξουν πάλι προϋποθέσεις να πολλαπλασιαστούν οπότε επιστρέφουν στην G 1 και συνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο Στον οργανισμό, τα διαφοροποιημένα κύτταρα (ποια είναι?) είναι μόνιμα σε φάση G 0
Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2 και M) πρέπει να διαδραματίζονται: Με τη σωστή σειρά Στον κατάλληλο χρόνο Μόνομίαφοράσεκάθεκύκλο
Ta σύμπλοκa κινaσών Cdk/Cyclin είναι υπεύθυνα για το συντονισμό των γεγονότων του κυτταρικού κύκλου cyclin Cyclin-dependent kinase (Cdk)
Ενεργοποίηση/ απενεργοποίηση συμπλόκων Cdk/Cyclin ρυθμίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου M Cdk/Cyclin Anaphase onset G2 Cdk/Cyclin G2 M No Cdk activity Growth factors Mitogens S G1 G1 Cdk/Cyclin S Cdk/Cyclin G1/S Cdk/Cyclin
Ποιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν την ενεργότητα των Cdks?
1. Ενεργοποίηση των Cdks μέσω πρόσδεσης κυκλινών και φωσφορυλίωσης Cyclin Cdk-activating kinase (CAK) Cyclin AT AT AT Cdk active site T-loop activating phosphorylation T161 INACTIVE ACTIVE
2. Αναστολή της ενεργότητας των Cdks μέσω φωσφορυλίωσης cyclin Inhibitory phosphorylations T14 & Y15 Wee1 kinase Cdk Cdc25 phosphatases Activating phosphorylation T161 ACTIVE INACTIVE
3. Αναστολή της ενεργότητας των Cdks από Cdk inhibitor proteins (CKI) CKI cyclin CKI family Members p15 INK4B Targets Cdk INK4 p16 INK4A 19 INK4D G1 Cdks ACTIVE INACTIVE Cip/ Kip p21 cip/waf1 p27 kip1 All Cdks p57
Μηχανισμοί ρύθμισης της ενεργότητας των Cdks Cyclin Cyclin T- Y- Cdk -T p Wee1 T- Y- Cdk -T p CAK (Cdk7/ CycH) T- Y- Cyclin Cdk -T p CDC25 ACTIVE CKI Cyclin T- Y- Cdk -T p T- Y- Cdk -T p CKI
4. Ρύθμιση της ενεργότητας των Cdks μέσω πρωτεόλυσης εξαρτώμενης από το Πρωτεάσωμα
To Πρωτεάσωμα (roteasome) Είναι μια ενδοκυτταρική πρωτεάση και η δράση της απαιτεί υδρόλυση AT Ρόλος του πρωτεασώματος είναι η αποικοδόμηση πρωτεϊνών λόγω βλαβών, λαθών κατά τη σύνθεσή τους ή αναγκών του κυτταρικού κύκλου Αποτελείται από ένα κεντρικό «κούφιο» κυλινδρικό τμήμα και από δύο υπομονάδες (caps) στα άκρα του κυλίνδρου caps Adapted from MBC, Alberts et al, 4 th Edition
Για να δράσει το πρωτεάσωμα πρέπει η πρωτεΐνη-στόχος να «σημανθεί» με αλυσίδα μορίων ubiquitin Ubiquitin Υδρόφοβο σφαιρικό τμήμα Ubiquitin: μικρή πρωτεΐνη 76 αα. Προσδένεται σε πλευρικές αλυσίδες Lysine των πρωτεϊνών-στόχων από ubiquitination ένζυμα και σχηματίζει αλυσίδες polyubiquitin NH 2 HOOC Πρόσδεση σε Lysine Adapted from MBC, Alberts et al, 4 th Ed
Λειτουργία του Πρωτεασώματος misfolded protein normal protein misfolded protein AT poly-ubiquitin chain poly-ubiquitin chain proteasome
Ubiquitination Ένζυμα Γιατοσχηματισμόαλυσίδωνpoly-ubiquitin χρειάζονται ubiquitination ένζυμα Κατηγορίες Ubiquitination ενζύμων : Ubiquitin Υδρόφοβο σφαιρικό τμήμα NH 2 E1: ubiquitin activating enzyme E2: ubiquitin conjugating enzyme E3: ubiquitin ligase Υπάρχουν περισσότερα από 300 σύμπλοκα Ε2- Ε3 τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικά σήματα αποικοδόμησης πρωτεϊνών-στόχων (ειδικές αμινοξικές αλληλουχίες, φωσφορυλιώσεις, κ.ά.) HOOC Πρόσδεση σε Lysine Adapted from MBC, Alberts et al, 4 th Ed
Ουμπικιτινίωση πρωτεϊνών (protein ubiquitination) protein kinase protein p E2 E3 protein p Misfolded protein to be degraded hosphorylation targets protein for ubiquitination E2 E3 E2 protein p protein E1 SH Ub COO- AT E1 SC=O E2 E1 E3 oly-ub protein is targeted for degradation by the proteasome E3
ύο κατηγορίες συμπλόκων με ενεργότητα E3 ubiquitin ligase ρυθμίζουν την ενεργότητα των Cdks SCF (Τέλος G1, S, G2) AC/C (M και αρχή G1)
Το σύμπλοκο SCF Είναι σύμπλοκο πρωτεϊνών (Skp1/CUL1/F-Box protein) με ενεργότητα Ε3 ubiquitin ligase Αναγνωρίζει φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες-στόχους στόχους, τις ουμπικιτινιώνει και τις σημαίνει για πρωτεόλυση από το πρωτεάσωμα Συμμετέχει στη ρύθμιση της ενεργότητας των Cdks κατά τις G1, S και G2 μέσω αναγνώρισης και ουμπικιτινίωσης CKI και Κυκλινών
Ρύθμιση της ενεργότητας των Cdks από το σύμπλοκο SCF Cdk inhibitor protein (CKI) active SCF poly-ubiquitin chain kinase proteasome INACTIVE ubiquitin, E1 + E2 enzymes active Cdk cyclin kinase active SCF Cdk proteasome ACTIVE ubiquitin, E1 + E2 enzymes inactive Cdk
Μηχανισμοί ρύθμισης της ενεργότητας των Cdks Πρόσδεση Κυκλινών και φωσφορυλίωση ενεργοποίησης στην Thr161 Φωσφορυλιώσεις απενεργοποίησης στις Thr14 & Tyr15 Πρόσδεση πρωτεϊνών CDK-inhibitors (CKI) Αποικοδόμηση Κυκλινών από το πρωτεάσωμα Αποικοδόμηση CKI απότοπρωτεάσωμα
Τα κυριότερα σύμπλοκα Cdk/Cyclin σε κύτταρα σπονδυλοζώων Cdk/Cyclin Cdk Cyclin G1 Cdk4, Cdk6 Cyclin D G1/S Cdk2 Cyclin E S Cdk2 Cyclin A G2 Cdk1 (Cdc2) Cyclin A M Cdk1 (Cdc2) Cyclin B
Μεταβολές στην ενεργότητα συμπλόκων Cdk/Cyclin ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο Cdk1/ Cyclin Β Anaphase onset Cdk1/ Cyclin Α G2 M No Cdk activity Growth factors Mitogens S G1 Cdk4,6/ Cyclin D Cdk2/ Cyclin Α Cdk2/ Cyclin E
Η ολοκλήρωση της G1 και η έναρξη της S ρυθμίζεται από τις Cdks Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F G2 M No Cdk activity Growth factors Mitogens S G1 Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Cdk2/ Cyclin E
Η πρωτεΐνη του Ρετινοβλαστώματος (Retinoblastoma protein, Rb) Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Απενεργοποίηση και των δύο αλληλομόρφων του γονιδίου προκαλεί καρκίνο του ρετινοβλαστώματος στον άνθρωπο Εκφράζεται σταθερά αλλά μεταβάλλονται τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης κατά τον κυτταρικό κύκλο Φωσφορυλιώνεται στη G1 από τις CDK4, CDK6 και CDK2. Η μη φωσφορυλιωμένη μορφή της Rb προσδένει και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα E2F O ενεργός E2F προσδένεται σε αλληλουχίες υποκινητών και επάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων του E2F
Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F Rb active Rb No Cdk activity Inactive E2F No expression of E2F target genes E2F Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Growth factoractivated signaling pathways (mitogens) Low E2F activity Low expression of E2F target genes E2F Rb partially inactive Rb Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Cdk2/ Cyclin E High E2F activity High expression of E2F target genes E2F Rb inactive Rb
Ο μεταγραφικός παράγοντας E2F ΠροσδένειτημηφωσφορυλιωμένηπρωτεΐνηRb Απουσία προσδεδεμένης Rb εντοπίζεται σε ειδικές αλληλουχίες στον υποκινητή και επάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων Προσελκύει ένζυμα που προκαλούν «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνης ώστε αυτή να είναι μεταγραφικά ενεργή Rb E2F Rb CDKs HAT Ε2F Closed chromatin Transcriptional inactive Open chromatin Gene expression
Ο μεταγραφικός παράγοντας E2F Οι μεταγραφικοί του στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια: Κυτταρικού κύκλου (Cdk2, Cyclin Ε, Cyclin A, E2F) Αντιγραφής DNA (CNA, MCM2-7, RA, H2A, DNA polα, δ) Επιδιόρθωσης DNA (BRCA1,2, FANC, RAD51) Απόπτωσης (AAF1, CASases 3,7,8)
Η ολοκλήρωση της G1 και η έναρξη της S ρυθμίζεται από τις Cdks Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F G2 M No Cdk activity Growth factors Mitogens S G1 Cdk4,Cdk6/ Cyclin D Cdk2/ Cyclin E
Ενεργότητα των CDKs κατά την G1 και αρχή της S inactive Rb + active Cdk2/ CycE No Cdk activity active Rb inactive E2F Growth factors Mitogens Cdk4, 6/ CycD active E2F + p27 Ubiquitination by SCF & degradation by proteasome Gene expression Cdk2, CycE G1/S restriction point active Cdk2/ CycE Cdk2/ Cyclin E Active Cdk4,6/ Cyclin D G1 S G1/S restriction point
Ρύθμιση των CDKs κατά την G1 - αρχή της S Στην αρχή της G1 η συνολική ενεργότητα Cdk είναι χαμηλή Η Rb προσδένει και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγοντα E2F Μιτογόνες ουσίες ενεργοποιούν τις Cdk4,6/ Cyclin D και Cdk2/ Cyclin Ε Φωσφορυλίωση του Rb οδηγεί σε ενεργοποίηση του E2F και μεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται σε περεταίρω ενεργοποίηση CDK συμπλόκων και έναρξη της αντιγραφής του DNA
Έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης Cdk1/ Cyclin Β Anaphase onset G2 M Ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk1/ Cyclin B S G1
Ενεργότητα της Cdk1/ Cyclin B είναι αναγκαία για την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης Cdk1/ Cyclin B ιάλυση πυρηνικού φακέλου Σχηματισμός μιτωτικής ατρακτου ιάταξη χρωμοσωμάτων
Ενεργοποίηση της Cdk1/ Cyclin B και έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης Cyclin B inhibitory phosphorylation Cdc25 Cdk-activating phosphatase + Cdk1 Wee1 Cdk-inhibitory kinase activating phosphorylation active Cdk1 Mitotic entry Cdk1/ Cyclin B G2 M
Εναρξη της μιτωτικής διαίρεσης Για να μπούμε στη φάση της μιτωτικής διαίρεσης απαιτείται ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk1/CyclinΒ ΗφωσφατάσηCdc25 αποφωσφορυλιώνει τις Υ14 και Τ15 της Cdk1 και την ενεργοποιεί ΗενεργήCdk1/ CyclinB ενισχύει την ενεργότητα της Cdc25 ΗενεργήCdk1/ CyclinB φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την κινάση Wee1
Πώς μπορούμε να διακρίνουμε σε ποια φάση του κυτταρικού κύκλου βρίσκεται το κύτταρο;
ιάκριση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου Ανοσοφθορισμός (immunofluorescence) Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)
Μελέτη των φάσεων του κυτταρικού κύκλου με ανοσοφθορισμό Μονιμοποίηση των κυττάρων και χρώση με ουσίες οι οποίες φθορίζουν μετά την πρόσδεσή τους στο DNA (DAI, ropidium Iodide) Ανίχνευση επιτόπων ειδικών για τη συγκεκριμένη φάση του κυτταρικού κύκλου (markers), με χρήση αντισωμάτων συνδεδεμένων σε φθορίζων μόριο Μικροσκοπία φθορισμού Φθορίζων μόριο Ab S-phase G1-phase ξέπλυμα S-ειδική πρωτεΐνη Φθορισμός
Ανίχνευση κυττάρων στη φάση διπλασιασμού του DNA Παράδειγμα S- phase marker: CNA CNA phase contrast
Ανίχνευση κυττάρων στη φάση της μιτωτικής διαίρεσης Παράδειγμα Μ- phase marker: φωσφορυλιωμένη Ιστόνη Η3 στη Σερίνη 10 (ph3) ph3 I ph3 I
Μελέτη των φάσεων του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής (flow cytometry) Μέθοδος ανάλυσης πληθυσμού κυττάρων η οποία δείχνει το ποσοστό κυττάρων που έχουν συγκεκριμένη ποσότητα DNA Μονιμοποίηση κυττάρων Χρώση με ropidium Iodide (I). Η χρωστικήi φθορίζει (στο κόκκινο) όταν προσδεθεί στο DNA και η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA κάθε κυττάρου Η ποσότητα του DNA (2N, 4N ή ενδιάμεση) είναι χαρακτηριστική της φάσης του κυτταρικού κύκλου (G1, G2 ή S) Ανάλυση φθορισμού των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής μας δείχνει το ποσοστό αυτών στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου flow Analyse histogram FACS: fluorescence-activated cell sorter
Κυτταρομετρία ροής- I profiles I Μικροσκόπιο φθορισμού Flow cytometer Fraction ercentage (%) Events (number of cells) Sub-G1 (dead) G1 S G2+M polyploid Sub-G1 1.8 G1 S G2+M 40.1 32.4 21.3 2N 4N DNA (I fluorescence) polyploid 4.4
I profiles: Quiz 1 Κυτταρική σειρά 1 Κυτταρική σειρά 2 είχνονται καλλιέργειες δύο κυτταρικών σειρών σε τυπικό θρεπτικό μέσο Ποιες διαφορές εντοπίζετε στα I profiles των δύο σειρών? ώστε πιθανή εξήγηση
I profiles: Quiz 2 Κάντε τις αντιστοιχίες A B C D 1. Τυπική καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο 2. παρουσία αναστολέα της μιτωτικής διαίρεσης (nocodazole) για 12 hrs 3. Καλλιέργεια κυττάρων παρουσία αναστολέα της αντιγραφής του DNA (hydroxyurea) για 12 hrs 4. Καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (FBS) για 24 hrs
Molecular Biology of The Cell, Alberts et al, 4 th Ed, Chapter 17