Αναδιάπλαση της Χρωματίνης. Chromatin Remodeling

Transcript

1 Αναδιάπλαση της Χρωματίνης Chromatin Remodeling

2 ομική οργάνωση του νουκλεοσώματος Η2Α Η2Β octameric histone core nucleosome 11 nm Η3 Η4 146nt DNA beads on a string chromatin Adapted from the Molecular Biology of The Cell, Alberts et al, 4 th Ed 50 nm

3 Οργάνωση της χρωματίνης σε ινίδια 30 nm beads on a string chromatin 30 nm fiber histone H1 30 nm Adapted from the Molecular Biology of The Cell, Alberts et al, 4 th Ed 50 nm

4 Οργάνωση της χρωματίνης σε «θηλειές» 30 nm 700 nm Adapted from the Molecular Biology of The Cell, Alberts et al, 4 th Ed 0.1 mm

5 Χαλάρωση της δομής της χρωματίνης για: έκφραση των γονιδίων; επιδιόρθωση βλαβών; nucleus Συμπύκνωση χρωμοσωμάτων κατά την κυτταρική διαίρεση; Πώς επιτυγχάνεται η αναδιάπλαση της χρωματίνης;

6 ομή της χρωματίνης κατά τη μεσόφαση: ευχρωματίνη (E) και ετεροχρωματίνη (H)

7 Η χρωματίνη «αναπνέει»: Αναδιάπλαση της χρωματίνης κατά την έκφραση γονιδίων γονίδια που εκφράζονται συμπυκνωμένη χρωματίνη (ετεροχρωματίνη) αποσυμπύκνωση χρωματίνης (ευχρωματίνη)

8 Αναδιάπλαση της χρωματίνης επιτυγχάνεται μέσω επιγενετικών τροποποιήσεων

9 Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Είναι τροποποιήσεις της χρωματίνης οι οποίες δεν περιλαμβάνουν αλλαγές στη αλληλουχία του DNA Ο όρος «επιγενετικές αλλαγές» περιγράφει την ιδέα ότι το περιβάλλον μπορεί να επηρεάσει τη συμπεριφορά γονιδίων χωρίς να αλλάξουν οι αλληλουχίες αυτών των γονιδίων ύνανται να διατηρηθούν και να κληρονομηθούν κατά την κυτταρική διαίρεση και από γενιά σε γενιά Παραδείγματα επιγενετικής ρύθμισης γονιδίων: σχηματισμός ετεροχρωματίνης στα κεντρομερή, απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος, ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων κατά τον κυτταρικό κύκλο, αποσιώπηση (silencing) γονιδίων από καρκινογόνες ουσίες, κ.ά.

10 Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Τροποποιήσεις Ιστονών Μεθυλίωση του DNA

11 Οι «ουρές» των Ιστονών συμμετέχουν στο πακετάρισμα των νουκλεοσωμάτων νουκλεόσωμα H2Β tail H2Β tail H4 tail H2Α tail H3 tail H4 tail H2Α tail H3 tail ινίδια 30 nm

12 Επιγενετικές τροποποιήσεις στις «ουρές» των Ιστονών επιφέρουν αλλαγές στη δομή της χρωματίνης H2A H2B H2A tail H2B tail H2B tail H4 H4 tail DNA H3 tail H4 tail H2A tail H3 tail H3 Adapted from the Molecular Biology of The Cell, Alberts et al, 4 th Ed

13 Επιγενετικές τροποποιήσεις στις «ουρές» των Ιστονών P Α Α Α Α Μ Μ Α P Α Μ Α Α Α P Μ Α Α Α Α Α Α U U Α Acetylation P Phosphorylation Μ Methylation U Ubiquitination

14 Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Τροποποιήσεις Ιστονών Ακετυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση του DNA

15 Ακετυλίωση Ιστονών Μεταφορά ακετυλικής ομάδας σε αμινοξικό κατάλοιπο Λυσίνης ή Αργινίνης και δημιουργία ε-ν ακέτυλο-λυσίνης ή ε-ν-ακέτυλο-αργινίνης HDAC HAT

16 Ακετυλιώσεις Ιστονών διευκολύνουν τη χαλάρωση της δομής της χρωματίνης συμπυκνωμένη χρωματίνη, δεν ευνοεί τη μεταγραφή Χ ΗΑΤ ΗDΑC χαλαρή χρωματίνη, επιτρέπει τη μεταγραφή Α Α Α Α

17 Ακετυλίωση Ιστονών Μεταφορά ακετυλικής ομάδας εξουδετερώνει το θετικό φορτίο των αμινοξέων Λυσίνης ή Αργινίνης. Έτσι, χαλαρώνουν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των «ουρών» των ιστονών Ακετυλίωση Ιστονών σχετίζεται με ενεργοποίηση ενώ απoακετυλίωση με καταστολή της μεταγραφής Υποακετυλίωση του DNA παρατηρείται στην ετεροχρωματίνη και σχετίζεται με καταστολή της γονιδιακής έκφρασης Οι πιο καλά μελετημένες ακετυλιώσεις Ιστονών αφορούν στις Η3Κ9 και Η3Κ14 Οι Histone AcetylTransferases (HATs) ακετυλιώνουν Λυσίνη/ Αργινίνη. Οι Histone Deacetylases (HDACs) αποακετυλιώνουν Λυσίνη/ Αργινίνη

18 Πρωτεΐνες-Μεταφορείς Ακετυλίων σε Ιστόνες (Histone Acetyltransferases, HATs) Οικογένεια GNAT (GCN5, PCAF) hgcn5 P300 και CBP P300 Οικογένεια MYST (MOZ, SAS2, Tip60) ysas2 Λειτουργικές περιοχές (domains) Acetyl-transferase domain (HAT) Bromodomain (πρόσδεση σε ακετυλιωμένα αμινοξέα Zn fingers (πρόσδεση στο DNA) Αλληλεπίδραση με παράγοντες μεταγραφής

19 Ακετυλιώσεις Ιστονών στην περιοχή του υποκινητή γονιδίων διευκολύνουν την προσέλκυση πρωτεϊνών που επάγουν τη μεταγραφή AP1 HAT E2F-1 HAT Other transcription factors Α Α Α Α Chromatin remodeling enzymes Πρωτεΐνες που προσδένονται σε ενισχυτές της μεταγραφής γονιδίων Μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται σε υποκινητές γονιδίων Μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται απευθείας σε υποκινητές Περαιτέρω χαλάρωση της χρωματίνης

20 Ο ρόλος της Ακετυλίωσης Ιστονών Ακετυλίωση Ιστονών ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων, με τους ακόλουθους τρόπους: 1. Ακετυλίωση Ιστονών από τις HATs επιφέρει αλλαγή του φορτίου αυτών, χαλάρωση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των «ουρών» των Ιστονών και «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνης Η «ανοιχτή» χρωματίνη είναι ευκολότερα προσβάσιμη σε παράγοντες της μεταγραφής και RNA πολυμεράση 2. Οι HATs προσδένονται στις ακετυλιωμένες Ιστόνες μέσω του Bromodomain και προσελκύουν μεταγραφικούς παράγοντες σε ενισχυτές ή υποκινητές γονιδίων 3. Μεταγραφικοί παράγοντες και Chromatin remodeling enzymes συνδέονται απευθείας στις ακετυλιωμένες Ιστόνες, μέσω των δικών τους Bromodomains και επάγουν μεταγραφή γονιδίων ή περαιτέρω χαλάρωση της χρωματίνης αντίστοιχα

21 Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Τροποποιήσεις Ιστονών Ακετυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση του DNA

22 Μεθυλίωση Ιστονών Τροποποίηση αμινοξικών καταλοίπων Λυσίνης ή Αργινίνης με προσθήκη ενός, δύο ή τριών μεθυλικών ομάδων CH 3 ΝΗ3 + ΝΗ2 + CH 3 H 3 C ΝΗ + CH 3 H 3 C Ν + CH 3 HDM HDM HDM HMT HMT HMT Lysine Mono-methyl lysine Di-methyl lysine Tri-methyl lysine

23 Μεθυλίωση Ιστονών Μεθυλιώσεις Ιστονών αλλάζουν τις αλληλεπιδράσεις του νουκλεοσώματος με πρωτεΐνες οι οποίες προσδένονται σε Ιστόνες Μεθυλιώσεις Ιστονών σχετίζονται με ενεργοποίηση ή καταστολή της μεταγραφής, ανάλογα με το αμινοξικό κατάλοιπο Οι Histone Methyltransferases (HMTs) μεθυλιώνουν αμινοξικά κατάλοιπα Ιστονών Οι Histone Demethylases (HDMs) απομεθυλιώνουν αμινοξικά κατάλοιπα Ιστονών

24 Μεθυλίωση VS Απομεθυλίωση Ιστονών Suv39h PRMT6 Suv(ar)3-9 SET-1 SET-9 Clr4 G9a SET-2 PRMT1 SET-9 HMTs R2 K4 K9 K27 K36 histone H3 R3 K20 histone H4 JMJD6 JMJD3 JMJD6 LSD1 JARID1A LSD1 JMJD1A JMJD2A JMJD2B HDMs JARID1B JMJD1B JMJD2C JARID1C JMJD2A FBXL10 JARID1D JMJD2B FBXL11 JMJD2C JMJD2D

25 Μεθυλίωση των H3-K4 και Η3-Κ9 Suv39h PRMT6 SET-1 SET-9 Suv(ar)3-9 Clr4 G9a SET-2 HMTs K9 R2 K4 K9 K27 K36 histone H3 histone H3 K4 Μεταγραφή

26 Πρωτεΐνες-Μεταφορείς Μεθυλίων σε Ιστόνες (HMTs) Protein domains Suv39h SET-9 Methyl-transferase domain Chromodomain (πρόσδεση σε μεθυλιωμένα αμινοξέα) Zn fingers (πρόσδεση στο DNA)

27 Mεθυλίωση της Η3-Κ9 σχετίζεται με το σχηματισμό ετεροχρωματίνης Α HMT HP1 M HP1 M M HP1 M HDAC ευχρωματίνη ετεροχρωματίνη

28 Η heterochromatin protein 1 (HP1) HP1 chromodomain chromoshadow domain M M

29 H HP1 συμμετέχει στη συμπύκνωση της χρωματίνης Α HMT HP1 M M HP1 M M HP1 HDAC ευχρωματίνη συμπυκνωμένη χρωματίνη Μειωμένη πρόσβαση σε μεταγραφικούς παράγοντες και RNA πολυμεράση και καταστολή της μεταγραφής

30 Ο ρόλος της Μεθυλίωσης Ιστονών Μεθυλίωση της Η3-Κ9: απενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων ΗπρωτεΐνηHP1 προσδένεται στη μεθυλιωμένη Η3-Κ9 μέσω του chromodomain Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των chromoshadow domains των HP1 οδηγούν σε συμπύκνωση της χρωματίνης Η συμπυκνωμένη χρωματίνη δεν είναι προσβάσιμη σε μεταγραφικούς παράγοντες και RNA πολυμεράση -> καταστολή της γονιδιακής έκφρασης Μεθυλίωση της Η3-Κ4 ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίων Πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων και chromatin remodeling enzymes στην μεθυλιωμένη Κ4

31 Επιγενετικές τροποποιήσεις της χρωματίνης Τροποποιήσεις Ιστονών Ακετυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση Ιστονών Μεθυλίωση του DNA

32 Mεθυλίωση του DNA Προσθήκη μεθυλικής ομάδας στο DNA, για παράδειγμα στον 5 C του πυριμιδινικού δακτυλίου της Κυτοσίνης και δημιουργία 5-μεθυλκυτοσίνης cytosin 5-methylcytosin ( 5m C) μεθυλίωση

33 Mεθυλίωση του DNA Παρατηρείται συνήθως σε δινουκλεοτίδια CpG Έως 90% των δινουκλεοτιδίων CpG είναι μεθυλιωμένα σε κύτταρα θηλαστικών Υπερμεθυλίωση του DNA παρατηρείται στην ετεροχρωματίνη και σχετίζεται με καταστολή της γονιδιακής έκφρασης Μη μεθυλιωμένα δινουκλεοτίδια CpG σχηματίζουν ομάδες στην 5 ρυθμιστική περιοχή ενεργών γονιδίων (CG νησίδες -CG islands) Σε καρκινικά κύτταρα εμφανίζεται υπερμεθυλίωση (απενεργοποίηση) υποκινητών ογκο-κατασταλτικών γονιδίων

34 Πρωτεΐνες-Μεταφορείς Μεθυλίων σε DNA (DNA Methyltransferases, DNMTs) Τρεις DNA methyltranferases στα θηλαστικά, DNMT1, DNMT3a, DNMT3b DNMT3a και DNMT3b κάνουν de novo μεθυλίωση DNMT1 συντηρεί την μεθυλίωση (maintenance DNMT) DNMTs: Έχουν μία ρυθμιστική περιοχή στο Ν-τελικό και μια καταλυτική περιοχή στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης

35 Μεθυλίωση του DNA σχετίζεται με σχηματισμό ετεροχρωματίνης και καταστολή της μεταγραφής Α m m m m m m MeCP2 MeCP2 HDAC Chromatin remodeling καταστολή της μεταγραφής

36 Ο ρόλος της Μεθυλίωσης του DNA Μεθυλίωση του DNA (σχηματισμός νησίδων 5m CpG) οδηγεί σε απενεργοποίηση της έκφρασης γονιδίων Πρωτεΐνες HDAC προσελκύονται μέσω πρωτεϊνών που προσδένονται σε μεθυλιωμένο DNA και αποακετυλιώνουν αμινοξέα Η3-Κ9 Επίσης, πρωτεΐνες που αλλάζουν τη στερεοδομή του DNA προσελκύονται μέσω πρωτεϊνών που προσδένονται σε μεθυλιωμένο DNA και προκαλούν συμπύκνωση της χρωματίνης και καταστολή της μεταγραφής

37 Σύγκριση Ευχρωματίνης με Ετεροχρωματίνη Η Ευχρωματίνη είναι χρωματίνη με γονίδια που εκφράζονται Έχει λιγότερο συμπυκνωμένη τριτοταγή δομή Μη μεθυλιωμένο DNA (CpG) Όχι Η3-Κ9 μεθυλίωση. Ναι Η3-Κ4 μεθυλίωση Ναι Η3-Κ9 Ακετυλίωση

38 Παραδείγματα εφαρμογής επιγενετικών μηχανισμών (Ι) ημιουργία ετεροχρωματίνης στα κεντρομερή

39 Το κεντρομερές (centrosome) χρωμόσωμα κεντρομερές (centromere) κινητοχώρος (kinetochore) ΜΣ χρωματίδη Το κεντρομερές αποτελείται από πολλαπλά επαναλαμβανόμενες μικρές αλληλουχίες DNA (μικροδορυφορικό DNA)

40 ημιουργία ετεροχρωματίνης στα κεντρομερή Μικροδορυφορικό DNA Μεθυλίωση του DNA Προσέλκυση HMTs HP1 Εκτεταμένη μεθυλίωση περικεντρικής Η3-Κ9 Υποακετυλίωση περικεντρικής Η3-K9 Υπομεθυλίωση περικεντρικής Η3-Κ4 M HP1 HP1 M HP1 M M M M HP1M M HP1 HP1 M M m m M M M MHP1 M HP1 HP1 M mm M m HP1 M M M HP1 HP1 m m HP1M HP1 M MHP1 HP1 m HP1 M m m m M M m M HP1 M m m m m M m m m m m m Περικεντρική ετεροχρωματίνη

41 Παραδείγματα εφαρμογής επιγενετικών μηχανισμών (ΙΙ) ημιουργία ετεροχρωματίνης στα κεντρομερή Απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος σε κύτταρα θηλαστικών

42 Εξισορρόπηση δόσης (Dosage compensation) Το φύλο του ατόμου καθορίζεται από τα φυλετικά χρωμοσώματα Σε πολλά είδη τα δύο φύλα έχουν διαφορετικό αριθμό Χ χρωμοσωμάτων Θα περίμενε κανείς σε άτομα με γονότυπο ΧΧ τα γονίδια του Χ χρωμοσώματος να εκφράζονται σε διπλάσια ποσότητα από ό,τι σε άτομα με γονότυπο ΧΥ Υπάρχουν μηχανισμοί γονιδιακής ρύθμισης για την εξισορρόπηση φαινοτυπικών χαρακτηριστικών που καθορίζονται από γονίδια του Χ χρωμοσώματος (Εξισορρόπηση δόσης)

43 Εξισορρόπηση δόσης σε Drosophila και C. elegans 200% homogametic heterogametic 150% 100% 50% Drosophila 0% X X female X Y male 200% homogametic heterogametic 100% C. elegans 0% X X X 0 hermaphrodite male

44 Εξισορρόπηση δόσης στα θηλαστικά: απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος mammals 100% 50% 0% homogametic X X heterogametic X Y female male

45 Σχηματισμός χρώματος στις πολύχρωμες γάτες Ο χρωματισμός του τριχώματος στις γάτες είναι πολύπλοκος και περιλαμβάνει πολλά γονίδια. Ένα από αυτά ευρίσκεται στο Χ χρωμόσωμα Χ Ο : επικρατές (πορτοκαλί) Χ ο : υπολειπόμενο (μαύρο) Μία ετερόζυγη γάτα θα έχει γονότυπο Χ Ο Χ ο Η απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος γίνεται κατά την αρχή της εμβρυογένεσης (βλαστοκύστη) και είναι τυχαία. Σε κάποια κύτταρα θα είναι ενεργό το γονίδιο Χ Ο (σημεία με πορτοκαλί τρίχωμα) και σε άλλα το γονίδιο Χ ο (μαύρο τρίχωμα) Έτσι σχηματίζονται κομμάτια τριχώματος διαφορετικού χρώματος

46 Τυχαία απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος Πολύχρωμες γάτες Μαύρη γάτα

47 Χ inactivation centre (XIC) Μηχανισμός απενεργοποίησης του Χ χρωμοσώματος Χ Χ Χ inactivation centre (XIC) Χi Xi HMT HDAC Χa Χi Χ inactivation specific transcript (Xist)- nonencoding RNA regional H3-K9 methylation Η3-Κ9 hypoacetylation DNA methylation Incorporation of histone macroh2a (mh2a) active inactive (Xist not required to maintain X inactivation)

48 Ιστόνη macroh2a (mh2a) H2A mh2a H2A region nonhistone region mh2a tail H2A tail SWI/ SNF SWI/ SNF Chromatin remodeling factors H2A tail nucleosome mh2a tail Xi nucleosome Xi chromatin

49 Aπενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος σε κύτταρα θηλαστικών Απαιτείται για να εξισορροπηθεί η έκφραση γονιδίων του Χ χρωμοσώματος σε άτομα των δύο φύλων Απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος μητρικής ή πατρικής προέλευσης γίνεται τυχαία Στο Χ χρωμόσωμα που προορίζεται για απενεργοποίηση έχουμε έκφραση του γονιδίου XIC και μεταγραφή μη κωδικού RNA Το μη κωδικό RNA καλύπτει το Χ χρωμόσωμα που προορίζεται για απενεργοποίηση Ακολουθούν μεθυλίωση της Η3-Κ9, αποακετυλίωση της Η3-Κ9, μεθυλίωση του DNA και ενσωμάτωση της ειδικής Ιστόνης mη2α

50 Παραδείγματα εφαρμογής επιγενετικών μηχανισμών (ΙΙΙ) ημιουργία ετεροχρωματίνης στα κεντρομερή Απενεργοποίηση του Χ χρωμοσώματος σε κύτταρα θηλαστικών Ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων της ευχρωματίνης: Cyclin E

51 Έκφραση της Κυκλίνης Ε στον κυτταρικό κύκλο G2 M S G1 Cyclin E

52 Η ενεργοποίηση/ απενεργοποίηση των Cdk/Cyclin συμπλόκων ρυθμίζει την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου G2 M S G1 Cdk2/ Cyclin E

53 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της Κυκλίνης Ε Rb HDAC1 HDAC1 Rb E2F ΗΜΤ HP1 M M Cdk4,6/ Cyclin D E2F HAT Α Χ μη ενεργός υποκινητής αρχή G1 ενεργός υποκινητής G1/S

54 Επιγενετικές τροποποιήσεις και καρκίνος Η υπερμεθυλίωση υποκινητών αποτελεί μηχανισμό απενεργοποίησης ογκοκατασταλτικών γονιδίων 1 2 normal unmethylated CpG promoter region of tumour-suppressor gene Χ methylated CpG 1 2 tumour

55 Υπερμεθυλίωση γονιδίων σε σποραδικούς καρκίνους στον άνθρωπο Gene Function Tumour type Rb P14/ARF Cell cycle regulation Cell cycle regulation Retinoblastoma Colorectal p15 p16 Cell cycle regulation Cell cycle regulation Various Various BRCA1 hmlh1 DNA repair DNA repair Breast Colorectal, gastric

56 Το γενετικό μοντέλο καρκινογένεσης: Γενετικές διαταραχές (μεταλλάξεις, απαλείψεις, μετατοπίσεις γονιδίων) οδηγούν στην καρκινογένεση Το επιγενετικό μοντέλο καρκινογένεσης: Επιγενετικές διαταραχές στην έκφραση γονιδίων συμμετέχουν στην καρκινογένεση

57 5-aza-2 deoxycytidine Είναι χημικό ανάλογο της δεόξυ-κυτιδίνης (κυτοσίνη + δεοξυριβόζη) Ενσωματώνεται στο DNA και προσδένεται ομοιοπολικά σε DNMTs τις οποίες απενεργοποιεί Προκαλεί υπομεθυλίωση και απομεθυλίωση του DNA και επάγει (σε κάποιο βαθμό) επανέκφραση γονιδίων τα οποία είχαν αποσιωπηθεί με επιγενετικούς μηχανισμούς Χρησιμοποιείται με σχετική επιτυχία στη θεραπεία λευχαιμιών από το 2004

58 Fischle W et al. Current Opinion in Cell Biology 15: , 2003 Peterson CL and Laniel MA. Current Biology 14: R546-R551, 2004