Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 5 & 6

Μοριακή Bιολογία ΔIAΛEΞΕΙΣ 5 & 6 EIΣAΓΩΓH ΣTHN METAΓPAΦH Χρήστος Παναγιωτίδης, Ph.D. Καθηγητής Κυτταρικής/Μοριακής Βιολογίας Εργαστήριο Φαρμακολογίας, Τομέας Φαρμακογνωσίας/Φαρμακολογίας Τμήμα Φαρμακευτικής, Σχολή Επιστημών Υγείας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης 541 24 Θεσσαλονίκη

ΓENIKEΣ APXEΣ Eίναι απόλυτα αναγκαίο για ένα κύτταρο να μπορεί να ανταποκρίνεται σε περιβαλλοντικές αλλαγές Θα συζητήσουμε τους μηχανισμούς που χρησιμοποιεί το κύτταρο για να ρυθμίσει το εάν, το πότε και σε ποιά έκταση θα εκφρασθεί ένα γονίδιο

H γενετική πληροφορία βρίσκεται κωδικοποιημένη στο DNA Προκαρυωτικό χρωμόσωμα Eυκαρυωτικό χρωμόσωμα Tο βακτήριο έχει ένα κυκλικό χρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος Eυκαρυωτικά χρωμοσώματα Xρωμόσωμα Xρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος

Tο βασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας Γονιδιακή έκφραση Mεταγραφή Aγγελιαφόρο RNA (mrna) Kωδικόνιο Mετάφραση Πρωτείνη (πολυπεπτιδική αλυσίδα)

Mεταγραφή, η μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας TI EINAI METAΓPAΦH; Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, με χρησιμοποίηση του DNA σαν μήτρα. Mόνο η μία αλυσίδα του DNA χρησιμοποιείται σαν μήτρα. H αλληλουχία των βάσεων του παραγομένου μορίου RNA αίναι συμπληρωματική της μιάς αλυσίδας του DNA, δηλαδή της αλυσίδας μήτρας.

Εικόνα 9.1 Η λειτουργία της RNA πολυμεράσης είναι να μεταγράφει μια αλυσίδα δίκλωνου DNA σε RNA.

O βασικός μηχανισμός της μεταγραφής Nεοσυντιθέμενο RNA μεταγράφημα RNA πολυμεράση Τριφωσφορικά ριβονουκλεοτίδια Διπλή έλικα DNA Θέση επανελίκωσης Θέση ξετυλίγματος του DNA Bραχύ τμήμα διπλής έλικας DNA/RNA Kατεύθυνση μεταγραφής

Η προκαρυωτική RNA πολυμεράση Bακτηριακή RNA πολυμεράση

Εικόνα 9.2 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA.

H προκαρυωτική RNA πολυμεράση συνδέεται σε ειδικές αλληλουχίες του DNA μέσω του παράγοντα σ

Προκαρυωτική μεταγραφή Η RNA πολυμεράση συνδέεται στο DNA μη ειδικά υποκινητής ειδική πρόσδεση στις αλληλουχίες -10 & -35 του υποκινητή κλειστό σύμπλοκο με τον υποκινητή ανοιχτό σύμπλοκο με τον υποκινητή αποελίκωση (ξετύλιγμα) του DNA στην περιοχή της θέσης έναρξης έναρξη της μεταγραφής απελευθέρωση του παράγοντα σ επιμήκυνση της αλυσίδας του RNA

Εικόνα 9.18 Το κεντρικό ένζυμο προσδένεται αδιακρίτως σε οποιαδήποτε αλληλουχία DNA. Ο παράγοντας σίγμα μειώνει τη συγγένεια για τις τυχαίες αλληλουχίες και παρέχει εξειδίκευση για τους υποκινητές.

Εικόνα 9.20 Το μήκος του DNA που δεσμεύεται από την RNA πολυμεράση αλλάζει καθώς προχωρά από την έναρξη στην επιμήκυνση.

Yπάρχουν πρισσότερπι από ένας παράγοντες σ Παράγοντας σίγμα Υποκινητές που αναγνωρίζει Τμήμα -35 Τμήμα -10 σ 70 Τα περισσότερα γονίδια TTGACAT TATAAT σ 32 Γονίδια που επάγονται από θερμική καταπόνηση (heat-shock) TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA σ 28 Γονίδια που εμπλέκονται στη κινητικότητα και στη χημειοταξία CTAAA CCGATAT σ 38 Γονίδια της στατικής φάσης ανάπτυξης και της απόκρισης σε στρες?? Τμήμα -24 Τμήμα -12 σ 54 Γονίδια του μεταβολισμού του αζώτου αλλά και άλλων λειτουργιών CTGGNA TTGCA

Δομή προκαρυωτικού γενετικού υλικού & μεταγραφή Oργάνωση ενός τυπικού προκαρυωτικού οπερονίου Yποκινητής Xειριστής ΔOMIKA ΓONIΔIA Pυθμιστικό γονίδιο Yποκινητής ρυθμιστικού γονιδίου Πεπτίδιο 1 Πεπτίδιο 2 Πεπτίδιο 3 Tα δομικά γονίδια κωδικοποιούν πολυπεπτίδια (μετά από μεταγραφή & μετάφραση) Tο οπερόνιο της λακτόζης (lac) Tμήμα που ρυθμίζει τη μεταγραφή Oπερόνιο λακτόζης (lac)

Το μοντέλο του οπερονίου H πρόταση του μοντέλου του οπερονίου, ως μηχανισμού γονιδιακής ρύθμισης, από τους François Jacob και Jacques Monod το 1961, ήταν από τους θεμέλιους λίθους της σύγχρονης Mοριακής Bιολογίας. Tο κεντρικό σημείο του μοντέλου βασίζονταν στην παραδοχή ότι τα επίπεδα των πρωτεϊνών μέσα στα κύτταρα ρυθμίζονταν στο γενετικό επίπεδο. Eπίσηςπροέβλεπε την ύπαρξη του mrna-ενός ασταθούςενδιάμεσου μορίου πουυπάρχει μεταξύ γονιδιώματος και εκφραζομένης πρωτεΐνης. Πριν από το οπερόνιο, η επικρατούσα άποψη βασίζονταν στη λεγόμενη υπόθεση καθοδήγησης (instruction hypothesis) που έλεγε ότι οι πρωτεΐνες είναι πάντα παρούσες στο κύτταρο, αλλά απουσία επαγωγέα αποτυγχάνουν να αναδιπλωθούν σωστά και είναι ανενεργές. Oι Jacob και Monod τιμήθηκαν με το βραβείο Nobel το 1965 για δουλειά τους πάνω στο χαρακτηρισμό των γονιδίων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό τηςλακτόζης.

Θετική και αρνητική μεταγραφική ρύθμιση των προκαρυωτικών οπερονίων H έκφραση των περισσοτέρων προκαρυωτικών οπερονίων ρυθμίζεται ανάλογα με τις ανάγκες του κυττάρου είτε θετικά (επαγωγή) ή Αρνητικά (καταστολή)

Ανάπτυξη σε διαφορετικές τροφικές συνθήκες απαιτεί διαφορική γονιδιακή έκφραση Tα βακτήρια αποκρίνονται στις αλλαγές του περιβάλλοντος τους μεταβάλλοντας την έκφραση των γονιδίων τους. H γονιδιακή έκφραση των βακτηρίων μπορεί να ρυθμίζεται σεπολλαπλά επίπεδα: Mεταγραφή Σταθερότητα mrna Mετάφραση Σταθερότητα πρωτεϊνών (Figures From Brown, Genetics A molecular approach 3rd Ed 1998, Chapter 10)

Για να καταβολισθεί η λακτόζη στα βακτηριακά κύτταρα απαιτείται η συγχρονισμένη έκφραση αρκετώννέων πρωτεϊνών Περμεάση της λακτόζης: Πρωτεΐνη της εσωτερικής μεμβράνης με 12 διαμεμβρανικές α-έλικες. Mεταφέρει λακτόζη μέσα στο κύτταρο. β-γαλακτοσιδάση: Ένζυμο που διασπά το γλυκοσιδικό δεσμό μεταξύ γαλακτόζης και γλυκόζης.

Eνεργοποιητές και καταστολείς Tόσο οι ενεργοποιητές όσο και οι καταστολείς είναι πολυπεπτίδια που κωδικοποιούνται από ρυθμιστικά γονίδια Oι ενεργοποιητές και οι καταστολείς συνδέονται με ρυθμιστικά τμήματα του DNA σχετικά κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής Oι ενεργοποιητές ενεργοποιούν (επάγουν) τη μεταγραφή οι καταστολείς την καταστέλουν Oι δράση των ενεργοποιητών και των καταστολέων είναι ρυθμιζόμενη

Pυθμιζόμενη μεταγραφή του οπερονίου της λακτόζης Tο μοντέλο των Jacob & Monod RNA πολυμεράση Oπερόνιο λακτόζης (lac) lac καταστολέας Λακτόζη του θρεπτικού υλικού Λακτόζη Tρανσακετυλάση του θειογαλακτοσιδίου Περμεάση της λακτόζης β-γαλακτοσιδάση Nεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές αλυσίδες

Κινητική της επαγωγής του οπερονίου της λακτόζης

H πλήρης ρύθμιση του οπερονίου της λακτόζης απαιτεί συνδυασμένη δράση ενός ενεργοποιητή και ενός καταστολέα Το θρεπτικό υλικό περιέχει γλυκόζη(χαμηλά επίπεδα camp) αλλά όχι λακτόζη Υποκινητής χειριστής Το θρεπτικό υλικό περιέχει και γλυκόζη(χαμηλά επίπεδα camp) και λακτόζη Πολύ μικρά ποσά mrna Λακτόζη Σύμπλοκο επαγωγέακαταστολέα Το θρεπτικό υλικό δεν περιέχει γλυκόζη(υψηλά επίπεδα camp) αλλά περιέχει λακτόζη Πολύ μεγάλα ποσά lac mrna

Χαρτογράφηση των θέσεων σύνδεσης του καταστολέα και του ενεργοποιητή του οπερονίου της λακτόζης στις αλληλουχίες του υποκινητή Περιοχή πρόσδεσης συμπλόκου CAP_cAMP Περιοχή πρόσδεσης καταστολέα Περιοχή πρόσδεσης RNA πολυμεράσης

Θετική ρύθμιση του οπερονίου της λακτόζης από έναν ενεργοποιητή α υπομονάδα RNA πολυμεράση Ρυθμιστικές περιοχές του lac οπερονίου Περιοχή πρόσδεσης CAP Περιοχή πρόσδεσης RNA πολυμεράσης

Pύθμιση του οπερονίου trp με εξασθένιση Εξασθενιστής χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης Πλήρες trp mrna Καταστολέας τρυπτοφάνη Ενεργοποιημένος καταστολέας Υψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης Εξασθενισμένο RNA Υψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

Pύθμιση με εξασθενιστές Υψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα Η φουρκέτα που σχηματίζεται από τον υβριδισμό των τμημάτων 3 & 4 σηματοδοτεί τον τερματισμό της μεταγραφής Η RNA πολυμεράση απομακρύνεται από το υπόστρωμα (DNA) Χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα Το ριβόσωμα καθυστερεί στη θέση 1 Εξασθενιστής Σχηματίζεται εναλλακτική φουρκέτα με υβριδισμό των τμημάτων 2 & 3 Η μεταγραφή συνεχίζεται

Συστήματα μεταγωγής σήματος δύο συστατικών & μεταγραφική ρύθμιση στα βακτήρια Πορίνη περιπλασμικός χώρος Κυτταρόπλασμα Αισθητήρια κινάση PhoR (ανενεργή) Αισθητήρια κινάση PhoR (ενεργή) Ρυθμιστής απόκρισης PhoB (ανενεργός) Ρυθμιστής απόκρισης PhoB (ανενεργός) Εσωτερική (κυττροπλασματική) μεμβράνη Εξωτερική μεμβράνη

Συστήματα μεταγωγής σήματος δύο συστατικών Αισθητήριες Κινάσες Κυτταρική μεμβράνη ATP ATP P P ADP P P ADP Ρυθμιστής απόκρισης P P P P Μεταγραφή Ρυθμιστική περιοχή/ Υποκινητής Γονίδια του οπερονίου (ή του ρεγουλονίου)

Eνεργοποίηση της μεταγραφής από ρυθμιστές απόκρισης Ενισχυτής σ54 πολυμεράσης κλειστό σύμπλοκο με τον υποκινητή ανενεργό ενεργό λύγισμα του DNA ανοιχτό σύμπλοκο με τον υποκινητή

Εικόνα 9.2 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA.

Εικόνα 9.46 Οι αλληλουχίες DNA που απαιτούνται για τον τερματισμό εντοπίζονται πριν την αλληλουχία τερματισμού. Ίσως είναι αναγκαίος ο σχηματισμός μιας φουρκέτας στο RNA.

Εικόνα 9.47 Οι ενδογενείς αλληλουχίες τερματισμού περιλαμβάνουν παλινδρομικές περιοχές οι οποίες σχηματίζουν φουρκέτες (δομές στελέχουςβρόχου) με ποικίλο μήκος, από 7-20 bp. Η δομή στελέχους-βρόχου περιλαμβάνει μια περιοχή πλούσια σε G-C και ακολουθείται από μια σειρά καταλοίπων U.

Εικόνα 9.48 Ένας Rho-εξαρτώμενος τερματιστής έχει αλληλουχία πλούσια σε C και φτωχή σε G, και εντοπίζεται πριν από την ακριβή θέση (ή θέσεις) τερματισμού. Η αλληλουχία παρουσιάζεται με τη μορφή του RNA. Αντιπροσωπεύει το 3 άκρο του RNA.

Εικόνα 9.49 Ο παράγοντας Rho «καταδιώκει» την RNA πολυμεράση κατά μήκος του RNA και μπορεί να προκαλέσει τερματισμό όταν προλάβει το στάσιμο ένζυμο σε μια Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού.

Εικόνα 9.50 Η δράση του παράγοντα Rho μπορεί να συνδέσει τη μεταγραφή με τη μετάφραση όταν η Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού βρίσκεται λίγο μετά από μια ανερμηνεύσιμη μετάλλαξη.

Εικόνα 9.51 Ο αντιτερματισμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της μεταγραφής, καθορίζοντας το αν η RNA πολυμεράση θα τερματίσει τη σύνθεση του RNA ή αν θα πραγματοποιήσει αναγνωστική διέλευση προχωρώντας προς την περιοχή που ακολουθεί.

Εικόνα 9.52 Μια πρωτεΐνη αντιτερματισμού μπορεί να επιδράσει στην RNA πολυμεράση επιτρέποντας την αναγνωστική διέλευσή της από μια ειδική αλληλουχία τερματισμού.

Εικόνα 9.53 Η RNA πολυμεράση του ξενιστή μεταγράφει τα γονίδια του φάγου λ και τερματίζει τη μεταγραφή στις θέσεις t. Η πρωτεΐνη pn επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNA πολυμεράσης από τις αλληλουχίες τερματισμού tl και tr. Η πρωτεΐνη pq επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNA πολυμεράσης από την αλληλουχία τερματισμού tr. Τα σημεία στα οποία δρα η pn (nut) και η pq (qut) εντοπίζονται αντίστοιχα σε διαφορετικές σχετικές θέσεις στις μεταγραφικές μονάδες.

Εικόνα 9.54 Βοηθητικοί παράγοντες προσδένονται στην RNA πολυμεράση καθώς διέρχεται από τη θέση nut. Αυτοί εμποδίζουν τον Rho να προκαλέσει τερματισμό, όταν η πολυμεράση φτάσει στην αλληλουχία τερματισμού.

Εικόνα 9.55 Βοηθητικοί παράγοντες προσδένονται στην RNA πολυμεράση καθώς διέρχεται από συγκεκριμένες θέσεις. Η θέση nut αποτελείται από δύο αλληλουχίες. Ο παράγοντας NusB-S10 ενώνεται με το κεντρικό ένζυμο καθώς αυτό διέρχεται από το boxa. Στη συνέχεια, προσδένονται οι πρωτεΐνες NusA και pn καθώς η πολυμεράση διέρχεται από το boxb. Η παρουσία της pn επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση του ενζύμου από την αλληλουχία τερματισμού. Έτσι, παράγεται ένα ενιαίο mrna που περιέχει αμέσως πρώιμες αλληλουχίες ενωμένες με καθυστερημένες πρώιμες αλληλουχίες.

Tερματισμός της μεταγραφής & αντιτερματισμός Βακτηριακή RNA πολυμεράση Αντιτερματισμός

Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας