ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Συγκριτική διερεύνηση της ανευπλοειδογόνου δράσης των φαρμακευτικών ενώσεων nocodazole, paclitaxel & griseofulvin σε τρία κυτταρικά συστήματα in vitro ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ζαχαράκη Πολυξένη Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Φεβρουάριος 2011 ~ 141 ~

Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστημίου Πατρών Εξεταστική Επιτροπή Αλαχιώτης Σταμάτης Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστημίου Πατρών Δημόπουλος Νικόλαος Καθηγητής, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστημίου Πατρών Στεφάνου Γεωργία Καθηγήτρια, Τομέας Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης, Πανεπιστημίου Πατρών ~ 142 ~

Σ όλους αυτούς που έκαναν ένα μικρό όνειρο ένα μεγάλο ταξίδι ~ 143 ~

Πρόλογος Η παρούσα Διατριβή πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Γενετικής του Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, στο πλαίσιο του Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος Βιολογίας με Ειδίκευση στη Βιολογική Τεχνολογία. Η ολοκλήρωση των Προπτυχιακών σπουδών μου και η εκπόνηση Διπλωματικής Εργασίας στον ίδιο εργαστηριακό χώρο, αποτέλεσαν αφετηρία για την περαιτέρω ενασχόληση μου με το συγκεκριμένο γνωστικό αντικείμενο με ιδιαίτερο ενδιαφέρον και ζήλο. Δίχως άλλο, στην επίτευξη των στόχων μου συνετέλεσαν και οι άνθρωποι που με εμπιστεύτηκαν και με υποδέχτηκαν με αγάπη στην «οικογένεια» του Εργαστηρίου τους, η Καθηγήτρια του Τμήματος Βιολογίας κ. Στεφάνου Γεωργία και ο Καθηγητής του Τμήματος Βιολογίας κ. Δημόπουλος Νικόλαος. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την Καθηγήτρια κ. Στεφάνου Γεωργία, η οποία είχε την κύρια επίβλεψη της παρούσας εργασίας, για την άριστη συνεργασία μας. Οι εποικοδομητικές συζητήσεις συνέβαλαν σ ένα σωστό προγραμματισμό των πειραμάτων, ενώ οι πάντα χρήσιμες και απαραίτητες καθοδηγήσεις της, βοήθησαν στο συντονισμό της συγγραφής της Διατριβής. Οι πάντα ουσιαστικές παρατηρήσεις, προτάσεις και συμβουλές του Καθηγητή κ. Δημόπουλου Νικόλαου, καθ όλη τη διάρκεια της Διατριβής στάθηκαν επιτακτικές και για το λόγο αυτό αξίζουν θερμά ευχαριστήρια. Παράλληλα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Αλαχιώτη Σταμάτη για τη συμμετοχή του ως μέλους της τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής, αλλά και το ενδιαφέρον και τις πολύτιμες συμβουλές του για την τελική εικόνα του παρόντος κειμένου. Ολόψυχα ευχαριστώ τη Διδάκτορα Ευθυμίου Μαρία για την άριστη συνεργασία μας και την ηθική συμπαράσταση καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής, καθώς και την Υποψήφια Διδάκτορα Alakhras Raghda για την κατανόηση και το πάντα ευχάριστο κλίμα του Εργαστηρίου που επικρατούσε. ~ 144 ~

Πολύτιμοι αρωγοί της ολοκλήρωσης της παρούσας Διατριβής στάθηκαν, ο Καθηγητής κ. Γεωργίου Χρήστος και ιδιαίτερα ο υποψήφιος Διδάκτωρ Γκρίντζαλης Κωνσταντίνος, τους οποίους και ευχαριστώ για την πολύ καλή συνεργασία που είχαμε. Τέλος, θα ήταν παράλειψη μου να μην αφιερώσω λίγες γραμμές για όλα εκείνα τα αγαπημένα πρόσωπα του οικογενειακού και φιλικού περιβάλλοντος μου που στάθηκαν πλάι μου, δείχνοντας στον υπέρτατο βαθμό σεβασμό στις αποφάσεις μου, συμπαράσταση και αγάπη. Πάτρα, 2011 Ζαχαράκη Πολυξένη ~ 145 ~

Περιεχόμενα Εισαγωγή...1 1. Κυτταρικός Κύκλος...1 2. Μιτωτική Άτρακτος..6 2.1. Γενικά.....6 2.2. Μικροσωληνίσκοι: δομικό και δυναμικό στοιχείο της μιτωτικής ατράκτου...6 2.3. Κεντροσώματα: κύρια πηγή πυρήνωσης μικροσωληνίσκων για το σχηματισμό της ατράκτου 12 2.3.1. Το κεντρόσωμα στη G 1 /S μετάβαση......16 2.3.2. Το κεντρόσωμα στη G 2 /Μ μετάβαση....16 2.3.3. Ανωμαλίες του κεντροσώματος στους όγκους.17 2.4. Χρωμοσώματα: ενεργά στοιχεία της Μίτωσης......20 2.4.1. Κεντρομέρος.. 21 2.4.2. Κινητοχώροι......22 2.4.2.1. Η γενική οργάνωση του κινητοχώρου...24 2.4.2.2. Ο ρόλος των πρωτεϊνών του σημείου ελέγχου της Μίτωσης στους κινητοχώρους.25 3. Σημεία Ελέγχου του Κυτταρικού Κύκλου......28 3.1. Σημείο ελέγχου της αντιγραφής του DNA... 29 3.2. Σημείο ελέγχου βλάβης του DNA.. 30 3.3. Σημείο ελέγχου της Μίτωσης......31 3.4. Σημείο ελέγχου καθορισμού της θέσης της ατράκτου....34 3.5. Προ-Μιτωτικό G1 σημείο ελέγχου. 35 4. Ανευπλοειδία... 37 4.1. Μικροπυρήνες...39 4.2. Μέθοδοι μελέτης ανευπλοειδίας...41 4.3. Ανευπλοειδία και χρωμοσωματική αστάθεια...45 4.4. Ανευπλοειδία και Καρκίνος 46 5. Aurora Κινάσες....48 ~ 146 ~

5.1. Aurora A.....51 5.2. Aurora B..57 5.3. Aurora C....62 5.4. Aurora Κινάσες, Ανευπλοειδία και Καρκίνος..63 6. Χημικοί παράγοντες που αλληλεπιδρούν με τους μικροσωληνίσκους..68 6.1. Κατηγορίες φαρμάκων που αλληλεπιδρούν με την άτρακτο 71 6.2. Κυτταρική ευαισθησία στα αντιμιτωτικά φάρμακα....74 6.3. Σημείο ελέγχου της Μίτωσης και αντιμιτωτικά φάρμακα....75 6.4. Nocodazole......77 6.5. Griseofulvin... 81 6.6. Paclitaxel.....84 7. Σκοπός της διατριβής.87 Υλικά & Μέθοδοι.89 8. Κυτταρικές Καλλιέργειες-Κυτταρικές Σειρές...89 8.1. Κυτταρικές Καλλιέργειες...89 8.2. Κυτταρικές Σειρές....93 8.2.1. Μυοβλαστική Κυτταρική Σειρά Ποντικού, C2C12. 93 8.2.1.1. Κατάψυξη κυττάρων και διατήρηση τους σε υγρό άζωτο...94 8.2.1.2. Απόψυξη Κυττάρων-Έναρξη Καλλιέργειας..95 8.2.1.3. Ανακαλλιέργεια Κυττάρων..96 8.2.1.4. Επίδραση με τις χημικές ενώσεις.97 8.2.1.5. Έλεγχος βιωσιμότητας κυττάρων-μέθοδος Trypan blue...100 8.2.2. Εμβρυϊκή Ινοβλαστική Κυτταρική Σειρά Ανθρώπου, HFFF2 101 8.2.2.1. Επίδραση με τις χημικές ενώσεις.. 102 8.2.2.2. Έλεγχος βιωσιμότητας κυττάρων.103 8.2.3. Επιθηλιακή Κυτταρική Σειρά Μαστού Ανθρώπου, MCF-7.103 8.2.3.1. Επίδραση με τις χημικές ενώσεις.. 105 8.2.3.2. Έλεγχος βιωσιμότητας κυττάρων....106 ~ 147 ~

9. Μελέτη συχνότητας μικροπυρήνων και έλεγχος χρωμοσωματικής καθυστέρησης.107 9.1. Μέθοδος διπλού ανοσοφθορισμού α-τουμπουλίνης και πρωτεϊνών του κινητοχώρου (CREST) 107 9.1.1. Πειραματική Πορεία Μεθόδου CREST... 110 10. Μελέτη ακεραιότητας μιτωτικής συσκευής..114 10.1. Μέθοδος διπλού ανοσοφθορισμού β- και γ-τουμπουλίνης. 114 10.1.1. Πειραματική Πορεία....116 10.2. Μέθοδος διπλού ανοσοφθορισμού της πρωτεϊνικής κινάσης Aurora A και της β-τουμπουλίνης 119 10.2.1. Πειραματική Πορεία....120 11. Μελέτη έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην οργάνωση της μιτωτικής ατράκτου.124 11.1. Προετοιμασία δειγμάτων.. 125 11.2. Ποσοτικοποίηση πρωτεϊνών με την υπερευαίσθητη μέθοδο Bradford 127 11.3. Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT)..128 11.4. Ανοσοαποτύπωση.... 132 11.5. Αποδέσμευση των αντισωμάτων και επαναχρησιμοποίηση των ανοσοαποτυπωμάτων 136 11.6. Προσδιορισμός μοριακού βάρους πρωτεϊνών με τη χρήση ημιλογαριθμικού χαρτιού.138 11.6.1. Υπολογισμός μοριακού βάρους. 140 11.7. Ποσοτικοποίηση των ανοσοαποτυπωμάτων..141 12. Μικροσκοπική Παρατήρηση....142 13. Στατιστική Ανάλυση...143 Αποτελέσματα 144 14. Μελέτη γενετικής δράσης nocodazole...144 14.1. Προκαταρκτικά πειράματα-επιλογή των προς μελέτη συγκεντρώσεων και του χρόνου επίδρασης... 144 14.2. Μελέτη επαγωγής μικροπυρήνων και μηχανισμού προέλευσης...150 ~ 148 ~

15. Μελέτη κυτταρικού κύκλου και οργάνωσης μιτωτικής συσκευής.. 158 15.1. Μέθοδος διπλής ανοσοσήμανσης CREST και α-τουμπουλίνης. 158 15.2. Μέθοδος διπλού ανοσοφθορισμού β- και γ-τουμπουλίνης 164 15.3. Μέθοδος διπλής ανοσοσήμανσης β-τουμπουλίνης και Aurora A...170 16. Μελέτη ποσοτικής έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην οργάνωση της μιτωτικής ατράκτου...181 16.1. Μελέτη ποσοτικής έκφρασης πρωτεϊνών β-, γ-τουμπουλίνης και Aurora A σε καλλιέργειες μάρτυρα κυττάρων C2C12, HFFF2 και MCF- 7...181 16.2. Μελέτη ποσοτικής έκφρασης πρωτεϊνών β-, γ-τουμπουλίνης και Aurora A σε καλλιέργειες επίδρασης nocodazole. 185 17. Μελέτη γενετικής δράσης των ενώσεων paclitaxel και griseofulvin 194 17.1. Μελέτη επαγωγής μικροπυρήνων και μηχανισμού προέλευσης 194 18. Μελέτη κυτταρικού κύκλου και οργάνωσης μιτωτικής συσκευής 202 19. Μελέτη ποσοτικής έκφρασης πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην οργάνωση της μιτωτικής ατράκτου..212 Παράρτημα Εικόνων 223 20. Συζήτηση...232 Συμπεράσματα.......265 Περίληψη..... 267 Abstract 269 Βιβλιογραφία.271 ~ 149 ~

Εισαγωγή ~ 150 ~

1. Κυτταρικός Κύκλος Η ανακάλυψη, κατά το δέκατο ένατο αιώνα, ότι τα κύτταρα αναπαράγονται με διαίρεση ήταν το σημαντικότερο επίτευγμα της βιολογίας κυττάρου. Σήμερα η έρευνα στη κυτταρική διαίρεση ευδοκίμησε εξαιτίας της κατανόησης αυτού του μηχανισμού, οδηγώντας προς την προσπάθεια θεραπείας πολλών ασθενειών, μεταξύ των οποίων ο καρκίνος (Scholey et al., 2003). Τα περισσότερα κύτταρα υφίστανται μία σειρά γεγονότων τα οποία οδηγούν στο διπλασιασμό των συστατικών τους και στη συνέχεια στη διαίρεση τους σε δύο πανομοιότυπα κύτταρα. Αυτός ο κύκλος των γεγονότων καλείται κυτταρικός κύκλος. Η αξιοπιστία και ακρίβεια του κυτταρικού κύκλου παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση του κυττάρου, ιδιαίτερα στους πολυκύτταρους οργανισμούς, γι αυτό θα πρέπει να ρυθμίζεται. Η απώλεια ελέγχου οδηγεί σε ανώμαλη ανάπτυξη και ακόμα και στην πρόκληση καρκίνου. Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων περιλαμβάνει τέσσερα στάδια. Τα δύο πιο κρίσιμα στάδια, που αφορούν στην αντιγραφή του DNA και στην κυτταρική διαίρεση, καλούνται S φάση και Μίτωση (Μ). Το στάδιο προτού το κύτταρο ξεκινήσει τη διαδικασία της αντιγραφής του DNA, καλείται G 1 φάση. Ακολούθως, μετά την S φάση, το κύτταρο περνά από ένα στάδιο προτού διαιρεθεί, τη G 2 φάση. Η Μίτωση αποτελείται από τη διαδικασία της πυρηνικής διαίρεσης (χρωμοσωματικός αποχωρισμός) και της κυτταροπλασματικής διαίρεσης (κυτταροκίνηση). Οι φάσεις G 1, S και G 2 συνιστούν τη Μεσόφαση. Όταν τα κύτταρα σταματούν να διαιρούνται, περνούν σε μια αδρανή κατάσταση, τη G 0 φάση, και συνήθως είναι διαφοροποιημένα κύτταρα. Κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, όπως παραγωγή αυξητικού παράγοντα, τα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να εξέλθουν της G 0 φάσης και να διαιρεθούν ξανά (Αλαχιώτης, 2005). G 1 φάση: Είναι το στάδιο που συντίθενται οι απαραίτητες πρωτεΐνες για την αντιγραφή του DNA. Παρ όλα αυτά, κατά το στάδιο αυτό το κύτταρο πρέπει να «εποπτεύει» εάν όλα είναι φυσιολογικά για τη διεξαγωγή του ~ 151 1 ~

επόμενου σταδίου. S φάση: Είναι το στάδιο που λαμβάνει χώρα ο διπλασιασμός του DNA. Αυτή η φάση του κυτταρικού κύκλου είναι η μεγαλύτερη και διαρκεί 10-12 ώρες σε ένα ευκαρυωτικό κυτταρικό κύκλο 24 ωρών. G 2 φάση: Είναι το στάδιο που το κύτταρο συνθέτει τις πρωτεΐνες οι οποίες απαιτούνται για τη διεκπεραίωση του χρωμοσωματικού αποχωρισμού και κατ επέκταση της κυτταρικής διαίρεσης σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Όπως η G 1 φάση, έτσι και η G 2 φάση διασφαλίζει την αξιόπιστη αντιγραφή του DNA και τις κατάλληλες συνθήκες για την κυτταροκίνηση. Μ φάση: Είναι το στάδιο που οδηγεί στο σωστό προσανατολισμό και αποχωρισμό των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων, τα οποία καλούνται αδελφά χρωματίδια. Η Μίτωση διακρίνεται στην Πρόφαση, στην Προμετάφαση, στη Μετάφαση, στην Ανάφαση και στην Τελόφαση. Ωστόσο, η κυτταροκίνηση όπου το πατρικό κύτταρο διαιρείται στα δύο θυγατρικά, ξεκινά κατά την Ανάφαση. Ο χρόνος διεξαγωγής της Μίτωσης διαρκεί μόνο 1-2 ώρες, συγκριτικά με την S φάση (Αλαχιώτης, 2005). Σχήμα 1.1.: Ο κυτταρικός κύκλος. [Προσαρμογή από http://themedicalbiochemistrypage.org/cell-cycle.html] Κατά τη Μεσόφαση εκτός από το DNA, διπλασιάζεται και το κεντρόσωμα (φάση S). Τα δύο νέα κεντροσώματα διαχωρίζονται κατά τη Μίτωση για το σχηματισμό των δύο πόλων της μιτωτικής ατράκτου, ενώ τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα που αποτελούνται από ένα ζεύγος ~ 152 2 ~

χρωματιδίων, συμπυκνώνονται (Πρόφαση). Η πυρηνική μεμβράνη αποικοδομείται και τα χρωμοσώματα προσδένονται στους μικροσωληνίσκους της ατράκτου μέσω των κινητοχώρων τους (Προμετάφαση). Η αλληλεπίδραση κινητοχώρων/μικροσωληνίσκων κατευθύνει τα αδελφά χρωματίδια στους αντίθετους πόλους, ενώ τα χρωμοσώματα τοποθετούνται στο ισημερινό επίπεδο της ατράκτου (Μετάφαση). Η έναρξη του χρωμοσωματικού αποχωρισμού κατά την Ανάφαση, συνδέεται με το σημείο ελέγχου της Μίτωσης για την ολοκλήρωση των σωστών συνδέσεων των χρωμοσωμάτων με τους μικροσωληνίσκους κατά τη Μετάφαση. Στη συνέχεια, οι μικροσωληνίσκοι που συνδέονται με τους κινητοχώρους συρρικνώνονται, κι έτσι οδηγούν στο διαχωρισμό των πόλων και στο συγχρονισμένο αποχωρισμό των αδελφών χρωματιδίων, σχηματίζοντας δύο ομόλογα χρωμοσώματα (Ανάφαση). Τα ομόλογα χρωμοσώματα καταφθάνουν στους πόλους αποσυμπυκνωμένα, σχηματίζοντας νέα πυρηνική μεμβράνη (Τελόφαση). Κατά την κυτταροκίνηση, σχηματίζονται δέσμες μικροσωληνίσκων στο χώρο μεταξύ των δύο πυρήνων (ενδιάμεσο σώμα), ενώ δημιουργείται μία συμπαγής δομή από μικροσωληνίσκους και πρωτεΐνες για τη δημιουργία μεμβράνης στην περιοχή της αύλακας και την ολοκλήρωση της κυτταροκίνησης (Mollinedo & Gajate, 2003). Κατά τη Μίτωση, η μιτωτική άτρακτος χρησιμοποιεί τους μικροσωληνίσκους και πρωτεΐνες-κινητήρες για τη κατανομή πανομοιότυπων αντιγράφων του γενετικού υλικού στα προϊόντα κάθε διαίρεσης. Πιο συγκεκριμένα, κατά την Πρόφαση πραγματοποιείται μετακίνηση των διπλασιασμένων κεντροσωμάτων γύρω από την πυρηνική μεμβράνη. Στα αρχικά στάδια της Ανάφασης τα δύο αδελφά χρωματίδια διαχωρίζονται και κινούνται στους αντίθετους πόλους της ατράκτου (Ανάφαση Α), καθώς οι δύο πόλοι απομακρύνονται ακόμα περισσότερο (Ανάφαση Β). Στην Ανάφαση, η άτρακτος μεταδίδει ένα σήμα στο φλοιό του κυττάρου, το οποίο καθορίζει τη θέση και τον προσανατολισμό του δακτυλίου, της μηχανής που χρησιμοποιεί την ακτίνη και τη μυοσίνη ΙΙ οδηγώντας στην κυτταροκίνηση. Η σύσπαση του δακτυλίου προκαλεί το σχηματισμό της αύλακας καθώς επανασχηματίζεται η πυρηνική μεμβράνη, ενώ τέλος η αύλακα «κλείνει» ολοκληρώνοντας το ~ 153 3 ~

διαχωρισμό των δύο θυγατρικών κυττάρων (Scholey et al., 2003). Η θέση της μιτωτικής ατράκτου κατά την Ανάφαση καθορίζει την τοποθεσία της αύλακας. Φυσιολογικά η άτρακτος τοποθετείται στο κέντρο του κυττάρου, με τον άξονα πόλου προς πόλο να είναι παράλληλος στο μακρύ άξονα του κυττάρου, αλλά μερικές φορές η άτρακτος τοποθετείται ασύμμετρα οδηγώντας σε αναπτυξιακά σημαντικές ασύμμετρες διαιρέσεις. Είναι πιθανό μια ισορροπία δυνάμεων να είναι υπεύθυνη για τη θέση της ατράκτου στο κέντρο του κυττάρου και μια αλλαγή να οδηγεί σε ασύμμετρη τοποθέτηση της ατράκτου (Scholey et al., 2003). Η διαδικασία της κυτταροκίνησης ξεκινά λίγα λεπτά μετά την έναρξη της Ανάφασης. Η συσσώρευση της ακτίνης και της μυοσίνης ΙΙ στην περιοχή της αύλακας λαμβάνει χώρα κατά την Ανάφαση με έναν άγνωστο μηχανισμό (Scholey et al., 2003). Σχήμα 1.2.: Τα στάδια του κυτταρικού κύκλου και οι αλλαγές στην οργάνωση των μικροσωληνίσκων κατά την κυτταρική διαίρεση. [Προσαρμογή από Mollinedo & Gajate, 2003] Η επιτυχής ολοκλήρωση της κυτταροκίνησης απαιτεί τη συμμετοχή ενός αριθμού διαφορετικών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τους μικροσωληνίσκους στο ενδιάμεσο σώμα. Αυτές οι πρωτεΐνες περιλαμβάνουν: α) πρωτεΐνες-κινητήρες, όπως οι κινεσίνες CHO1/MKLP1, XKLP1, KLP3A, ~ 154 4 ~

CENP-E, β) πρωτεΐνες-επιβάτες (passenger proteins), όπως η κεντρομερική πρωτεΐνη (inner centromere protein, INCENP) και η TD-60 (telophase disc antigen), η οποία μεταφέρεται από τη χρωματίνη στο κέντρο της ατράκτου στην Ανάφαση, γ) κινάσες της ενδιάμεσης ζώνης, όπως οι οικογένειες κινασών Polo και Aim-1, δ) GTPases, όπως οι Rho, Rac και η οικογένεια πρωτεϊνών cdc42. Απώλεια της λειτουργίας κάποιας από τις παραπάνω πρωτεΐνες οδηγεί σε αποτυχία ολοκλήρωσης της κυτταροκίνησης. Η διαίρεση του κυτταροπλάσματος ολοκληρώνεται με το τέλος της κυτταροκίνησης, με τον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα κάθε θυγατρικού κυττάρου να επιστρέφει στο στάδιο της Μεσόφασης, σηματοδοτώντας το τέλος της Μίτωσης (Mollinedo & Gajate, 2003). ~ 1555 ~

2. Μιτωτική άτρακτος 2.1. Γενικά Κατά τη Μίτωση, το κύτταρο πρέπει να διαχωρίσει με ακρίβεια τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα στα δύο θυγατρικά κύτταρα, διαδικασία η οποία διεξάγεται από μία συσκευή μικροσωληνίσκων που καλείται μιτωτική άτρακτος. Στην αρχή της Μίτωσης, κατά την Πρόφαση, το μεσοφασικό δίκτυο των μικροσωληνίσκων αποδιοργανώνεται και αρχίζει να σχηματίζεται η άτρακτος. Παρ όλο που η δημιουργία της ατράκτου διαφέρει και εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο, σε όλες τις περιπτώσεις η τελική της δομή έχει κοινά χαρακτηριστικά (Walczak & Heald, 2008). Γενικά, η μιτωτική άτρακτος κατά τη Μετάφαση, μπορεί να μελετηθεί ως μία διπολική δομή μικροσωληνίσκων οι οποίοι εκτείνονται από τους πόλους της ατράκτου στα χρωμοσώματα, δηλαδή στο κέντρο της ατράκτου. Λόγω της περίπλοκης λειτουργίας της μιτωτικής συσκευής, υπάρχει μία σειρά από μονοπάτια που ρυθμίζουν το σχηματισμό και τη δράση της κατά τη διάρκεια της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Τα γεγονότα σχηματισμού και λειτουργίας της ατράκτου στα περισσότερα ανθρώπινα κύτταρα περιλαμβάνουν, την αποικοδόμηση της πυρηνικής μεμβράνης, τον αποπολυμερισμό των μεσοφασικών μικροσωληνίσκων, τη ρυθμιζόμενη πυρήνωση νέων μικροσωληνίσκων με τη βοήθεια των κεντροσωμάτων, τον κεντροσωματικό αποχωρισμό, τη συμπύκνωση και κίνηση των χρωμοσωμάτων, καθώς και την κυτταροκίνηση (Pihan & Doxsey, 1999). 2.2. Μικροσωληνίσκοι: δομικό και δυναμικό στοιχείο της μιτωτικής ατράκτου Οι μικροσωληνίσκοι είναι γραμμικά, πολικά πολυμερή, τα οποία ~ 156 6 ~

σχηματίζονται από δεκατρία πρωτοϊνίδια ετεροδιμερών α- και β- τουμπουλίνης (Scholey et al., 2003). Η α- και β-τουμπουλίνη είναι 50% ταυτόσημες, όσον αφορά το επίπεδο της αμινοξικής τους αλληλουχίας, ενώ η καθεμία έχει μοριακό βάρος περίπου 50kDa (Zhou & Giannakakou, 2005). Τα πρωτοϊνίδια συνδέονται ετερόπλευρα για να σχηματίσουν την κυλινδρική δομή των μικροσωληνίσκων (Walczak & Heald, 2008). Τα πολυμερή έχουν τη δυνατότητα να ωθούν και να έλκουν, καθώς αυξάνονται και συρρικνώνονται, με προσθήκη και απώλεια των υπομονάδων τους από τα άκρα, αντίστοιχα. Ακόμα, μπορούν να χρησιμοποιούνται και ως θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών-κινητήρων οι οποίες μέσω υδρόλυσης του ATP παράγουν δύναμη και κινητικότητα (Scholey et al., 2003). Το αργά αναπτυσσόμενο άκρο (αρνητικό άκρο) των μικροσωληνίσκων καταλήγει στους δύο πόλους, ενώ το γρήγορα αναπτυσσόμενο άκρο (θετικό άκρο) αλληλεπιδρά με τα χρωμοσώματα στον ισημερινό, δημιουργώντας την τυπική μορφή κατά τη Μετάφαση. Η αλληλεπίδραση των μικροσωληνίσκων με τους κινητοχώρους, μέσω ειδικών πρωτεϊνικών συμπλόκων στην περιοχή του κεντρομέρους κάθε αδελφού χρωματιδίου, είναι απαραίτητη προϋπόθεση για τη σωστή ευθυγράμμιση των χρωμοσωμάτων κατά τη Μετάφαση και για τον αποχωρισμό τους στους αντίθετους πόλους. Επίσης, η λειτουργία της ατράκτου, αποσκοπεί στον καθορισμό της θέσης που θα πραγματοποιηθεί η διαδικασία της κυτταροκίνησης. Λανθασμένος χρωμοσωματικός αποχωρισμός μπορεί να οδηγήσει σε ανευπλοειδία, η οποία με τη σειρά της μπορεί να προκαλέσει γονιδιακή αστάθεια και εμφάνιση καρκίνου. Για την αποφυγή λαθών, η μιτωτική συσκευή έχει μηχανισμούς ελέγχου, οι οποίοι παρακολουθούν εάν όλα τα χρωμοσώματα έχουν προσδεθεί κατάλληλα στην άτρακτο προτού επιτραπεί στο κύτταρο να προχωρήσει στην Ανάφαση. Επομένως, η μιτωτική συσκευή μπορεί να μελετηθεί ως μία μακρομοριακή συσκευή, η οποία ελέγχει τη διαδικασία της κυτταρικής διαίρεσης (Walczak & Heald, 2008). Η άτρακτος των μικροσωληνίσκων παρέχει το δομικό πλαίσιο για πολλές διαδικασίες που πραγματοποιούνται κατά τη Μίτωση. Για παράδειγμα, οι μικροσωληνίσκοι των κινητοχώρων που προέρχονται από τα ~ 157 ~ 7

κεντροσώματα και συνδέονται με τα χρωμοσώματα παρέχουν τη βάση για τον αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων κατά τη Μίτωση. Οι πολικοί μικροσωληνίσκοι που αλληλεπιδρούν με τους δύο πόλους της ατράκτου μέσω παράπλευρων αλληλεπιδράσεων στο κέντρο της μιτωτικής συσκευής, συμμετέχουν στην κίνηση διαχωρισμού των πόλων της ατράκτου κατά την Ανάφαση. Οι ελεύθεροι μικροσωληνίσκοι αλληλεπιδρούν με τον κυτταρικό σκελετό και εμπλέκονται στον προσανατολισμό της ατράκτου στο κυτταρόπλασμα. Οι περισσότερες από αυτές τις αλληλεπιδράσεις των μικροσωληνίσκων είναι δυναμικές, επακόλουθο της έμφυτης δυναμικής φύσης των άκρων τους και της δράσης πρωτεϊνών-κινητήρων που συνδέονται μαζί τους (Pihan & Doxsey, 1999). Πρωτοϊνίδιο Σχήμα 2.1.: Δομή μικροσωληνίσκων. [Προσαρμογή από Jordan et al., 1998] Οι δυναμικές ιδιότητες των μικροσωληνίσκων τους επιτρέπουν να αυξάνονται και να συρρικνώνονται με την προσθήκη ή απώλεια διμερών τουμπουλίνης στα άκρα των πολυμερών. Οι μικροσωληνίσκοι τροποποιούνται ανάλογα, από τη φάση της αύξησης στη φάση της συρρίκνωσης, μια διαδικασία που αποτελείται από τέσσερις παραμέτρους: το ρυθμό αύξησης, το ρυθμό συρρίκνωσης και τις συχνότητες μετάβασης από την αύξηση στη συρρίκνωση και το αντίθετο. Οι απομονωμένοι μικροσωληνίσκοι μπορούν να υποβληθούν σε δυναμική αστάθεια in vitro, ενώ οι μικροσωληνίσκοι in vivo είναι πιο δυναμικοί, υποδεικνύοντας την ύπαρξη κυτταρικών παραγόντων οι οποίοι ρυθμίζουν τη δυναμική τους. Υπάρχουν ~ 158 ~ 8

πρωτεΐνες που είναι συνδεδεμένες με τους μικροσωληνίσκους (Microtubule- Associated Proteins, MAPs) και ενισχύουν τη σταθερότητα τους (Walczak & Heald, 2008). Εκτός από τις MAPs υπάρχουν κι άλλες πρωτεΐνες που προσδένονται στους μικροσωληνίσκους, οι οποίες καλούνται πρωτεΐνες-κινητήρες και είναι κρίσιμες για τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων. Οι πρωτεΐνες-κινητήρες προσδένονται στους μικροσωληνίσκους και χρησιμοποιούν την προερχόμενη από την υδρόλυση του ATP ενέργεια για τη σταθερή κίνηση τους. Έχουν τη δυνατότητα να μεταφέρουν μεμβρανικά οργανίδια, όπως μιτοχόνδρια, αλλά και να προκαλούν ολίσθηση των ινιδίων του κυτταροσκελετού κατά την κυτταρική διαίρεση. Δύο μεγάλες κατηγορίες πρωτεϊνών-κινητήρων αποτελούν οι κινεσίνες και οι δυνεΐνες (Mollinedo, 2003). Η πολικότητα των μικροσωληνίσκων είναι μια άλλη σημαντική ιδιότητα για τη μορφογένεση της ατράκτου. Επειδή οι υπομονάδες της τουμπουλίνης είναι ασύμμετρες, τα αρνητικά και θετικά άκρα των μικροσωληνίσκων έχουν διαφορετικές δυναμικές ιδιότητες, με αποτέλεσμα να δημιουργείται μία δομική πολικότητα του δικτύου των μικροσωληνίσκων. Οι πρωτεΐνεςκινητήρες που συνδέονται με τους μικροσωληνίσκους, αναγνωρίζουν την επιφάνεια του δικτύου των μικροσωληνίσκων και την πολικότητα τους, μετακινώντας το φορτίο τους ανάλογα. Τα φορτία που κινούνται κατά μήκος των μικροσωληνίσκων περιλαμβάνουν, χρωμοσώματα, μικροσωληνίσκους και άλλα πρωτεϊνικά σύμπλοκα, τα οποία για να δράσουν πρέπει να μεταφερθούν στο κατάλληλο σημείο της ατράκτου (Walczak & Heald, 2008). Οι περισσότερες από τις κινεσίνες (KIFs) κατέχουν συγκεκριμένους ρόλους στο σχηματισμό της μιτωτικής ατράκτου και στο χρωμοσωματικό αποχωρισμό κατά την κυτταρική διαίρεση και τη μεταφορά οργανιδίων, ενώ κατευθύνονται προς το θετικό άκρο των μικροσωληνίσκων. Ωστόσο, κινεσίνες με καρβοξυτελικό άκρο (KIFCs), οδηγούνται προς το αρνητικό άκρο των μικροσωληνίσκων. Οι δυνεΐνες είναι μία οικογένεια πρωτεϊνών-κινητήρων των μικροσωληνίσκων που κατευθύνονται προς το αρνητικό άκρο και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταφορά και τοποθέτηση ενδοκυτταρικών οργανιδίων. Οι κινεσίνες και δυνεΐνες γενικά κινούνται προς αντίθετες ~ 159 9 ~

κατευθύνσεις κατά μήκος των μικροσωληνίσκων κι έτσι ρυθμίζουν τη μεταφορά και προς τις δύο κατευθύνσεις (Mollinedo & Gajate, 2003). Υπάρχουν έξι ισομορφές α-τουμπουλίνης και άλλες τόσες β- τουμπουλίνης. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της τουμπουλίνης περιλαμβάνουν διαδικασίες φωσφορυλίωσης, ακετυλίωσης και γλουταμινιλίωσης, οι οποίες ενδέχεται να επηρεάσουν τον πολυμερισμό των διμερών της τουμπουλίνης. Για το σχηματισμό πολικών ινιδίων των μικροσωληνίσκων, ο πολυμερισμός των διμερών α- και β-τουμπουλίνης λαμβάνει χώρα πιο γρήγορα στο θετικό άκρο συγκριτικά με το αρνητικό άκρο, προκαλώντας την πολικότητα των αυξανόμενων μικροσωληνίσκων. Με τη διαδικασία της πυρήνωσης που ακολουθεί, οι μικροσωληνίσκοι αυξάνονται σε μήκος με το συνεχή πολυμερισμό τους στο θετικό άκρο, με την εναλλαγή φάσεων μεταξύ αργής αύξησης του μήκους των μικροσωληνίσκων και γρήγορη συρρίκνωση, φαινόμενο το οποίο καλείται δυναμική αστάθεια. Κατά τη Μίτωση, αυτό το φαινόμενο επιτρέπει στους μικροσωληνίσκους να επιμηκυνθούν και να διαμορφώσουν τη μιτωτική άτρακτο, όπου το θετικό άκρο των μικροσωληνίσκων συνδέεται με τα χρωμοσώματα μέσω των κινητοχώρων (Bhalla, 2003). Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι το θετικό άκρο ενός μικροσωληνίσκου είναι μία μοριακή μηχανή που μετατρέπει τη χημική ενέργεια σε μηχανική και μ αυτό τον τρόπο οι δυνάμεις των μικροσωληνίσκων μπορούν και παράγουν μεγάλη ισχύ. Την ενέργεια την παρέχει η υδρόλυση του GTP, ενώ η τουμπουλίνη είναι μια πραγματική GTPase που πολυμερίζεται με την παρουσία GTP, σχηματίζοντας σταθερούς μικροσωληνίσκους. Το μόριο που προκαλεί την υδρόλυση του GTP είναι η α- τουμπουλίνη. Οι μικροσωληνίσκοι με GDP είναι ασταθείς, γι αυτό και η υδρόλυση του GTP συνοδεύεται από τη διαδικασία πολυμερισμού των μικροσωληνίσκων στο θετικό άκρο. Επομένως ο πολυμερισμός των διμερών τουμπουλίνης επηρεάζεται από πολλαπλούς παράγοντες, περιλαμβάνοντας τις συγκεντρώσεις των ισομορφών της τουμπουλίνης-gtp (προώθηση πολυμερισμού) και του Ca + (αναστολή πολυμερισμού). Η φύση των άκρων των μικροσωληνίσκων και η ρύθμιση των δυνάμεών τους είναι κρίσιμες για ~ 160 10 ~

το σχηματισμό και τη λειτουργία της μιτωτικής ατράκτου κατά τη Μίτωση (Bhalla, 2003). Οι ιδιότητες δυναμικής των μικροσωληνίσκων είναι κρίσιμες για πολλές κυτταρικές λειτουργίες, ειδικά για τη σωστή λειτουργία της ατράκτου κατά τη Μίτωση. Στην πραγματικότητα, οι μικροσωληνίσκοι που δομούν την άτρακτο είναι δέκα με εκατό φορές πιο δυναμικοί συγκριτικά με τους μικροσωληνίσκους των μεσοφασικών κυττάρων, για την αποτελεσματικότερη χρωμοσωματική σύνδεση και διάταξη, αλλά και το χρωμοσωματικό αποχωρισμό (Zhou & Giannakakou, 2005). Οι μικροσωληνίσκοι είναι απαραίτητοι για τη λειτουργία της μιτωτικής ατράκτου. Φάρμακα που δρουν στο σχηματισμό των μικροσωληνίσκων, επιφέρουν σημαντικά αποτελέσματα στη θεραπεία του καρκίνου. Τέτοια φάρμακα αναστέλλουν αποτελεσματικά τη Μίτωση κι έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Σε μοριακό επίπεδο, αυτοί οι παράγοντες δρουν αποπολυμερίζοντας τους μικροσωληνίσκους ή τροποποιώντας τη δυναμική τους. Αναλογικά, κυτταρικά συστατικά τα οποία επηρεάζουν τον πολυμερισμό, τη δυναμική και τη σταθερότητα των μικροσωληνίσκων, μπορούν να συνεισφέρουν στη δυσλειτουργία της ατράκτου. Ως αποτέλεσμα, ακόμα και μικρές αλλαγές σ αυτές τις ιδιότητες των μικροσωληνίσκων μπορούν να οδηγήσουν σε μη σωστό αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων και σε ανευπλοειδικά φαινόμενα (Pihan & Doxsey, 1999). Η συνεισφορά των ανωμαλιών που μπορεί να πραγματοποιούνται στη δομή και λειτουργία των μικροσωληνίσκων, φαίνεται να επιβεβαιώνεται από διάφορες μελέτες. Για παράδειγμα, πολλές χημικές ενώσεις που επηρεάζουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων προκαλούν ανευπλοειδία. Επίσης, αλλαγές στην έκφραση της τουμπουλίνης, την υπομονάδα των μικροσωληνίσκων, ή/και μεταλλάξεις στο γονίδιο της, μπορούν να οδηγήσουν σε λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό (Pihan & Doxsey, 1999). ~ 11 161 ~

2.3. Κεντροσώματα: κύρια πηγή πυρήνωσης μικροσωληνίσκων για το σχηματισμό της ατράκτου Οι πρώτοι οργανωτές της ατράκτου που παρατηρήθηκαν ήταν δύο ζεύγη κεντριολίων που δομούσαν τα κεντροσώματα, κέντρα οργάνωσης των μικροσωληνίσκων. Τα κεντροσώματα είναι ορατά εδώ και εκατό χρόνια ως τοπικές περιοχές αύξησης των ελεύθερων μικροσωληνίσκων που προσδιορίζουν τους πόλους της ατράκτου στα ζωικά κύτταρα, εκτός από τα ωοκύτταρα ποντικού (Walczak & Heald, 2008). Ωστόσο, εκτός από το σχηματισμό ατράκτων με κεντριόλια, υπάρχουν και άτρακτοι χωρίς κεντριόλια που δημιουργούνται στα ανώτερα φυτά και άτρακτοι με πολικά σωμάτια σε ορισμένα πρωτόζωα και μύκητες (Schmit, 2002, Μαρμάρας & Λαμπροπούλου-Μαρμάρα, 2005). Κάθε κεντριόλιο δομείται συνήθως από εννέα τριπλέτες μικροσωληνίσκων. Ωστόσο, παρεκκλίσεις αυτής της δομής εμφανίζονται σε έμβρυα Drosophila melanogaster με εννέα διπλέτες και σε γεννητικά κύτταρα και πρώιμα έμβρυα του Caenorhabditis elegans, με εννέα μονούς μικροσωληνίσκους (Delattre & Gonczy, 2004, Quarmby & Parker, 2005, Leidel et al., 2005). Οι πρώτες παρατηρήσεις των κεντροσωμάτων, περίπου έναν αιώνα πριν, αποκάλυψαν μία μικροσκοπική δομή περιτριγυρισμένη από μία ακτινωτή σειρά κυτταροπλασματικών ινών. Αυτές οι ίνες δεν ήταν τίποτε άλλο πάρα μικροσωληνίσκοι και αυτή η μικροσκοπική δομή, τα κεντροσώματα. Πιο πρόσφατα στοιχεία υποδεικνύουν ότι, το κεντρόσωμα εκτός από το ρόλο του στην οργάνωση των μικροσωληνίσκων, φαίνεται να δρα ως ικρίωμα για την πρόσδεση μεγάλου αριθμού ρυθμιστικών πρωτεϊνών. Ανάμεσα σ αυτές περιλαμβάνονται ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, η σύνδεση των οποίων με τα κεντροσώματα αποτελεί ένα σημαντικό βήμα στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου. Μελέτες δείχνουν ότι το κεντρόσωμα απαιτείται για πολλές μεταβάσεις φάσεων κατά τον κυτταρικό κύκλο, περιλαμβάνοντας τη G 1 /S μετάβαση, τη G 2 /M μετάβαση και τη μετάβαση από τη Μετάφαση στην Ανάφαση (Doxsey et al., 2005). Γενικότερα, το κεντρόσωμα είναι ένα μεγάλο οργανίδιο (με διάμετρο ~ 162 12 ~

1μm) που αποτελείται από ένα ζεύγος κεντριολίων. Το ζεύγος αυτό περιβάλλεται από άμορφη περικεντριολική ύλη (PCΜ), περιοχή στην οποία λαμβάνει χώρα η πυρήνωση, με αποτέλεσμα πολωμένους μικροσωληνίσκους με το θετικό τους άκρο να επεκτείνεται (Walczak & Heald, 2008). Απ την άλλη μεριά, τα κεντριόλια παίζουν ρόλο στην οργάνωση της κεντροσωματικής ύλης (Pihan & Doxsey, 1999). Στα περισσότερα κύτταρα σπονδυλωτών τα κεντροσώματα είναι τα μόνα οργανίδια χωρίς μεμβράνη, πλησίον του κέντρου του κυττάρου και κοντά στην περιοχή του πυρήνα (Doxsey, 2001). Σχήμα 2.2.: Η βασική δομή του κεντροσώματος. [Προσαρμογή από: http://www.irbbarcelona.org/files/image/luders_fig3.jpg] Αν και ακόμη δεν είναι ξεκάθαρος ο ρόλος των κεντριολίων στη λειτουργία του κεντροσώματος, φαίνεται να υφίστανται δικό τους κύκλο αντιγραφής, γεγονός που συνδέεται στενά με την ικανότητα του κεντροσώματος να διπλασιάζεται. Μόρια με σημαντική συμμετοχή στον κύκλο διπλασιασμού του κεντριολίου είναι οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs) και οι Αurora Ipl-like κινάσες (Brinkley et al., 2001). Όπως συμβαίνει με την αντιγραφή του DNA, ο διπλασιασμός των κεντριολίων ρυθμίζεται από μοριακά επίπεδα των cdk2/cycline κινασών και του μεταγραφικού παράγοντα Ε2F. Η διαδικασία ξεκινά λίγο νωρίτερα από τη G 1 /S μετάβαση, πριν την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Προτού ολοκληρωθεί η S φάση, υπάρχουν τέσσερα κεντριόλια που σχηματίζουν δύο ~ 13 163 ~

μη-διαχωρισμένα κεντροσώματα (Dutertre et al., 2002). Η απενεργοποίηση του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53 μαζί με την υπερέκφραση ενός ή περισσοτέρων κινασών, όπως η BTAK/aurora2 (Breast- Tumor-Amplified Kinase), φαίνεται ότι ενεργοποιούν πολλαπλούς κεντροσωματικούς διπλασιασμούς μέσα σε ένα κυτταρικό κύκλο (Brinkley, 2001). Ένα σημαντικό συστατικό της περικεντριολικής ύλης είναι μία ειδική τουμπουλίνη, που καλείται γ-τουμπουλίνη και η οποία συγκεντρώνεται ως υπομονάδα σε ένα σύμπλοκο γ-τουμπουλίνης (γ-turc, γ-tubulin Ring Complex), σχηματίζοντας κλειστούς δακτυλίους από δεκατρία μόρια γ- τουμπουλίνης και λειτουργώντας ως μήτρα πυρήνωσης των μικροσωληνίσκων. Κατά τη Μίτωση η ικανότητα πυρήνωσης των κεντροσωμάτων αυξάνεται λόγω της ανάκτησης περισσοτέρων γ-turcs και άλλων υλικών. Αυτό επιτρέπει στην άτρακτο να αυξάνει ταχέως τον αριθμό των μικροσωληνίσκων που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη σύνδεση χρωμοσωμάτων και για το σχηματισμό της δομής της ατράκτου (Walczak & Heald, 2008). Το κεντρόσωμα εκτός από τη δυνατότητα να σχηματίζει διπολική άτρακτο, διασφαλίζει την ισότιμη κατανομή του διπλασιασμένου γενετικού υλικού σε κάθε θυγατρικό κύτταρο (Brinkley, 2001). Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όπου στρατολογούνται σύμπλοκα κινασών για το διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων κατά τη Μεσόφαση και για άλλες διαδικασίες, απαραίτητες για την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (Walczak & Heald, 2008). Ο ουσιαστικός αριθμός των ρυθμιστικών μορίων που τοποθετούνται στο κεντρόσωμα των θηλαστικών προϋποθέτει την παρουσία ρυθμιστικών δικτύων αποτελούμενων από σύμπλοκα στην περιοχή αυτή. Για παράδειγμα, πρωτεΐνες-ικριώματα, όπως η Nud1p/Cdc11p της ζύμης βοηθά την πρόσδεση πολλαπλών σηματοδοτικών μορίων στο πολικό σώμα της ατράκτου (το αντίστοιχο κεντρόσωμα της ζύμης) για τον έλεγχο της εξόδου από τη Μίτωση και την κυτταροκίνηση (Doxsey et al., 2005). Μετά την κυτταροκίνηση, ένα φυσιολογικό διπλοειδές κύτταρο ~ 164 ~ 14

κληρονομεί ένα κεντρόσωμα με δύο κεντριόλια, το οποίο διπλασιάζεται κατά την S φάση, ενώ ο αποχωρισμός των δύο κεντροσωμάτων λαμβάνει χώρα κατά τη G 2 /M μετάβαση. Οι μοριακές λεπτομέρειες όσον αφορά τον διπλασιασμό του κεντροσώματος δεν είναι ξεκάθαρες. Παρ όλα αυτά, οι περισσότεροι ερευνητές συμφωνούν ότι ο διπλασιασμός αρχίζει κατά τη G 1 /S μετάβαση και συμπίπτει με την εξαρτώμενη από την Cdk2 φωσφορυλίωση των υποστρωμάτων του κεντροσώματος. Τα θυγατρικά κεντριόλια στη συνέχεια εμφανίζονται σε κάθε κεντρόσωμα, στην ή κοντά στην περικεντριολική ύλη και καταλήγουν ως ώριμες δομές στο τέλος της G 2 φάσης. Μέχρι τη Μίτωση και τα δύο κεντροσώματα έχουν αποκτήσει το μέγιστο ποσό της περικεντριολικής ύλης (Doxsey et al., 2005). Μετά το διπλασιασμό, τα κεντροσώματα πρέπει να αποχωριστούν και να μεταναστεύσουν περιφερειακά της πυρηνικής μεμβράνης, ώστε στην Πρόφαση να βρίσκονται σε αντίθετες θέσεις, αντιστοιχώντας στους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Αυτή η κίνηση εξαρτάται από την παρουσία μικροσωληνίσκων και βρίσκεται υπό τον έλεγχο μοριακών κινητήρων (Dutertre et al., 2002). Σχήμα 2.3.: Ο κεντροσωματικός κύκλος. [Προσαρμογή από: Lukasiewicz & Lingle, 2009] ~ 165 15 ~

2.3.1. Το κεντρόσωμα στη G 1 /S μετάβαση Η απομάκρυνση των κεντροσωματικών συστατικών έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία κέντρων οργάνωσης μικροσωληνίσκων (MTOCs) χωρίς κεντριόλια, περιλαμβάνοντας πολλές πρωτεΐνες της PCM, παρόμοιες μ αυτές ανώτερων φυτών. Τα ζωικά κύτταρα που περιλαμβάνουν MTOCs χωρίς κεντριόλια διαμορφώνουν λειτουργικές μιτωτικές ατράκτους, αλλά σχεδόν τα μισά αποτυγχάνουν να διαχωριστούν σε δύο θυγατρικά κύτταρα κατά την κυτταροκίνηση. Όλα τα κύτταρα με MTOCs χωρίς κεντριόλια, ανεξαρτήτως του εάν έχουν ολοκληρώσει την κυτταροκίνηση ή όχι, δεν προβαίνουν σε αντιγραφή του DNA. Επιπλέον, αφαίρεση του ενός ή και των δύο κεντροσωμάτων σε προμεταφασικά κύτταρα, έχει ως αποτέλεσμα τη παραγωγή ενός κυττάρου με ένα κεντρόσωμα που συνεχίζει τον κύκλο και ενός κυττάρου με MTOC χωρίς κεντριόλια, το οποίο δεν μπορεί να εισέλθει στην S φάση. Σε αντίθεση, η εμφάνιση επιπλέον κεντροσωμάτων ως αποτέλεσμα κυτταρικής σύντηξης ή αναστολής της κυτταροκίνησης με τη χρήση φαρμάκων, δεν οδηγεί σε αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου. Επίσης, η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου δεν φαίνεται να απαιτεί μικροσωληνίσκους συνδεδεμένους με το κεντρόσωμα. Φυσιολογικά διπλοειδή κύτταρα οδηγούνται στη G 1 φάση χωρίς μικροσωληνίσκους μετά την επίδραση με nocodazole, υποδεικνύοντας ότι δεν είναι απαραίτητοι γι αυτήν τη μετάβαση. Αντίθετα, κύτταρα συλλαμβάνονται στη G 1 φάση με την παρουσία paclitaxel ή nocodazole, μετά την αποτυχία κυτταροκίνησης (Doxsey et al., 2005). 2.3.2. Το κεντρόσωμα στη G 2 /Μ μετάβαση Η λειτουργία του κεντροσώματος με την είσοδο του κυττάρου στη Μίτωση πραγματοποιείται όταν στα κεντροσώματα είναι παρούσες μιτωτικές κινάσες και κυκλίνες. Ο Lukas και οι συνεργάτες (2004) χρησιμοποίησαν μία στρατηγική στόχευσης των κεντροσωμάτων για να αποδείξουν ότι η είσοδος στη Μίτωση απαιτεί την τοποθέτηση της Cdk1 και των ρυθμιστών της στο ~ 166 ~

κεντρόσωμα. Πιο συγκεκριμένα έδειξαν ότι η κινάση 1 (Chk1), που παίρνει μέρος στο σημείο ελέγχου της Μίτωσης, ήταν παρούσα στα κεντροσώματα της Μεσόφασης, αλλά όχι στα μιτωτικά κύτταρα, δρώντας ως αναστολέας της λειτουργίας της Chk1. Στην πραγματικότητα, χημική αναστολή της δράσης της Chk1, ενεργοποιεί την Cdk1, επάγοντας πρόωρη είσοδο στη Μίτωση και πρόωρο κεντροσωματικό αποχωρισμό (Doxsey et al., 2005). Αναστολή της δράσης της Cdk1 από την Chk1 δεν συμβαίνει άμεσα, αλλά μέσω αναστολής της δράσης της φωσφατάσης Cdc25B, η οποία ενεργοποιεί την Cdk1. Ενεργοποίηση της Cdk1 μέσω της Cdc25B φαίνεται να συμβαίνει μέσω της τοποθέτησης της Chk1 στο κεντρόσωμα. Λόγω του ότι η απομάκρυνση των κεντροσωμάτων/κεντριολίων δεν εμποδίζει την είσοδο στη Μίτωση, η κεντροσωματική ρύθμιση ενεργοποίησης της Cdk1 από την Chk1 μπορεί να είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την είσοδο στη Μίτωση (Doxsey, 2001, Doxsey et al., 2005). 2.3.3. Ανωμαλίες του κεντροσώματος στους όγκους Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι ανωμαλίες του κεντροσώματος μπορούν να οδηγήσουν σε δυσλειτουργίες της ατράκτου, σε ανευπλοειδία και ανάπτυξη όγκου. Πάνω από εκατό χρόνια πριν, ο Boveri (1914) υπέθεσε ότι ανωμαλίες του κεντροσώματος υποδεικνύουν αρχικές μορφές καρκίνου. Πρόσφατες μελέτες υποστηρίζουν αυτή την υπόθεση. Με τη χρήση αντισωμάτων για τις πρωτεΐνες περικεντρίνη και γ-τουμπουλίνη, έχει δειχθεί ότι ένας μεγάλος αριθμός κακοήθων όγκων παρουσιάζουν ανωμαλίες στα κεντροσώματα, όπως καρκινώματα στον προστάτη, στο στήθος, στον πνεύμονα, στο κόλον και στον εγκέφαλο. Οι κεντροσωματικές ανωμαλίες περιελάμβαναν, υπεράριθμα κεντροσώματα, κεντροσώματα χωρίς κεντριόλια και κεντροσώματα με ανώμαλο μέγεθος και σχήμα. Ωστόσο, υπήρχαν και μερικά καρκινικά κύτταρα που δεν εμφάνιζαν κεντροσώματα. Οι κεντροσωματικές ανωμαλίες συνοδεύονταν από δραματικές αλλαγές στον αριθμό και στην κατανομή των μικροσωληνίσκων. Πιο συγκεκριμένα, εκπορεύονταν από πολλαπλές κυτταρικές περιοχές αντί για μία (αυτή του ~ 17 167 ~

κεντροσώματος) και αθροιστικά συνιστούσαν ένα πολύ μεγαλύτερο αριθμό σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα (Pihan & Doxsey, 1999). Τα υπεράριθμα κεντροσώματα λειτουργούν ως επιπλέον MTOCs και οδηγούν σε ανώμαλο σχηματισμό της ατράκτου, προς δημιουργία τριών και περισσοτέρων πόλων. Οι πολυπολικές άτρακτοι είναι ανταγωνιστικές στη βιωσιμότητα και την αύξηση του κυττάρου, με αποτέλεσμα την έξοδο από τη Μίτωση ή την παραγωγή θυγατρικών κυττάρων με γενετική αστάθεια. Ωστόσο, κάποια κύτταρα μπορεί να επιζήσουν και τυχαία να αποκτήσουν χρωμοσωματικό πλεόνασμα, οδηγώντας σε νεοπλασία. Είναι γενικά γνωστό ότι τα καρκινικά κύτταρα χαρακτηρίζονται ως «μιτωτικές μηχανές» που έχουν τη δυνατότητα να διαιρούνται ακατάπαυστα. Επομένως, δεν πλεονεκτούν μόνο εκφράζοντας μερικά γονίδια επιπλέον, αλλά αντισταθμίζουν μια κατάσταση πολλαπλών κεντροσωμάτων, τα οποία φυσιολογικά θα προκαλούσαν πολυπολικές ατράκτους και κυτταρικό θάνατο (Brinkley, 2001). Οι κεντροσωματικές ανωμαλίες στους όγκους και στις προερχόμενες από όγκο κυτταρικές σειρές προκαλούν δύο φαινόμενα τα οποία μπορούν να οδηγήσουν σε ογκογένεση. Πρώτον, όλα τα κεντροσώματα, ανεξαρτήτως μεγέθους, σχήματος ή αριθμού, συμμετέχουν στο σχηματισμό ανώμαλων μιτωτικών ατράκτων, από δομικής και λειτουργικής πλευράς. Δεύτερον, κύτταρα με ανώμαλα κεντροσώματα, προκαλούν λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό, παράγοντας ανευπλοειδικά κύτταρα με δραματικά διαφορετικό χρωμοσωματικό αριθμό. Βάσει αυτών των παρατηρήσεων, προτάθηκε ένα μοντέλο με το οποίο κεντροσωματικές ανωμαλίες προκαλούν δυσλειτουργίες της ατράκτου και οδηγούν σε λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό και σε ανευπλοειδικά φαινόμενα (Pihan & Doxsey, 1999). Οι μηχανισμοί με τους οποίους προκαλούνται οι κεντροσωματικές ανωμαλίες στους κακοήθεις όγκους δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί ακόμη. Είναι πιθανό ότι τα αυξημένα επίπεδα περικεντρίνης και γ-τουμπουλίνης που παρατηρούνται στα καρκινικά κύτταρα να οδηγούν σε εκτοπική συγκέντρωση των πρωτεϊνών, σε ανώμαλες και υπεράριθμες δομές. Σύμφωνη ~ 168 18 ~

μ αυτή την ιδέα είναι η παρατήρηση ότι, καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα αυτών των πρωτεϊνών σχηματίζουν υπεράριθμα και γιγάντια κεντροσώματα. Αντίθετα, καρκινικά κύτταρα με χαμηλά πρωτεϊνικά επίπεδα εμφανίζονται εντελώς ανίκανα να σχηματίσουν κεντροσώματα (Pihan & Doxsey, 1999). Πρέπει να τονιστεί ότι πολλά από τα κύτταρα που υπερεκφράζουν την περικεντρίνη σχηματίζουν δομικά φυσιολογικές διπολικές ατράκτους, οι οποίες παρ όλα αυτά προκαλούν λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό. Ένας δεύτερος πιθανός μηχανισμός για την πρόκληση κεντροσωματικών ανωμαλιών στα καρκινικά κύτταρα είναι μέσω απορρύθμισης του κεντροσωματικού διπλασιασμού. Τα κεντροσώματα διπλασιάζονται μία και μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου στα φυσιολογικά κύτταρα και τα δύο κεντροσώματα που προκύπτουν σχηματίζουν τους πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Ανώμαλος κεντροσωματικός διπλασιασμός δεν θα μπορούσε να παράγει δομές χωρίς κεντριόλια που να λειτουργούν ως πυρήνες των μικροσωληνίσκων και να σχηματίσει κεντροσώματα τα οποία να είναι δομικά και λειτουργικά, όπως αυτά που παρατηρούνται στα καρκινικά κύτταρα. Ένας άλλος μηχανισμός με τον οποίο ο αριθμός των κεντροσωμάτων μπορεί να αυξηθεί στα καρκινικά κύτταρα είναι μέσω αποτυχημένης κυτταροκίνησης. Αποτυχία των κυττάρων να διαχωριστούν μπορεί να δημιουργήσει τετραπλοειδικά κύτταρα με διπλό αριθμό κεντροσωμάτων. Παρ όλα αυτά, όσον αφορά το διπλασιασμό του κεντροσώματος, αποτυχία της κυτταροκίνησης μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα κύτταρα με δομικά φυσιολογικά κεντροσώματα με κεντριόλια, ένας φαινότυπος που παρατηρείται στα καρκινικά κύτταρα (Pihan & Doxsey, 1999). Η συνάθροιση πολλαπλών κεντροσωμάτων σε ένα ή δύο μεγάλα συσσωματώματα μειώνει τον αριθμό των MTOCs σ έναν αριθμό του ενός ή των δύο ανά κύτταρο. Ερευνητές υπογραμμίζουν τη χαμηλή συχνότητα των ανώμαλων μιτώσεων σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού, καταλήγοντας στο ότι τα πολλαπλά κεντριόλια μπορούν να παραμείνουν συνδεδεμένα μαζί, λειτουργώντας ως ένα μεγάλο κεντρόσωμα στη Μεσόφαση ~ 169 19 ~

και υποθετικά ως δύο κεντροσώματα στη Μίτωση (Brinkley, 2001). Ωστόσο, οι πολυπολικές άτρακτοι εμφανίζονται στα καρκινικά κύτταρα και σε άλλους παθολογικούς ιστούς, αλλά στους φυσιολογικούς ιστούς απομακρύνονται με απόπτωση, εκτός και αν αποκτήσουν περαιτέρω επιλεκτικό πλεονέκτημα (Brinkley, 2001). Πολλά ρυθμιστικά μόρια που συνδέονται με τα κεντροσώματα φαίνεται να εμπλέκονται στη λειτουργία του κεντροσώματος. Αυτά περιλαμβάνουν κινάσες που πιστεύεται ότι ρυθμίζουν το σχηματισμό και την ακεραιότητα του κεντροσώματος, όπως η Polo (Plk), η ανθρώπινη ομόλογη πρωτεΐνη της Drosophila Αurora (Αurora2/Stk15) και η ΝΕΚ 2. Επίσης, υπερέκφραση της Αurora2 είναι ικανή να μετασχηματίσει ινοβλάστες in vitro και να παράγει όγκους in vivo. Πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι ο διπλασιασμός του κεντροσώματος ρυθμίζεται από το συνδεόμενο με το κεντρόσωμα πρωτεϊνικό σύμπλοκο cdk2-cyclin E. Υπεράριθμα κεντροσώματα σε κύτταρα ελλειμματικά για το p53 (p53 - / - ), υποδηλώνουν ότι αυτό το ρυθμιστικό μόριο μπορεί να επηρεάσει το διπλασιασμό του κεντροσώματος. Ωστόσο, κεντροσωματικές ανωμαλίες μπορούν επίσης να συμβούν και σε κύτταρα με άγριο τύπο p53, αποδεικνύοντας ότι η απώλεια της λειτουργίας του p53 δεν ταυτίζεται απόλυτα με τα υπεράριθμα κεντροσώματα. Οι Aurora2, Plk, άλλες κινάσες και ρυθμιστικά μόρια φαίνεται να εμπλέκονται επίσης στη ρύθμιση του κεντροσωματικού διπλασιασμού (Pihan & Doxsey, 1999). 2.4. Χρωμοσώματα: ενεργά στοιχεία της Μίτωσης Τα χρωμοσώματα αναγνωρίζονται ως μόρια-κλειδιά στη Μίτωση. Αν και ο σχηματισμός της μιτωτικής συσκευής παρατηρήθηκε και με την απουσία χρωμοσωμάτων, είναι ξεκάθαρο ότι τα χρωμοσώματα συνεισφέρουν στην πυρήνωση και σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων κατά τη δημιουργία της ατράκτου. Επιπλέον, κάθε αδελφό χρωματίδιο ενός διπλασιασμένου χρωμοσώματος περιέχει έναν κινητοχώρο, ένα μεγάλο μακρομοριακό σύμπλοκο το οποίο συνιστά την κρίσιμη περιοχή αλληλεπίδρασης των μικροσωληνίσκων της ατράκτου για τη χρωμοσωματική κίνηση και αποχωρισμό. ~ 170 20 ~

Σχήμα 2.4.1.: Απεικόνιση της δομής ενός χρωμοσώματος στη Μετάφαση. [Προσαρμογή από: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/class/mlacourse/original8hour/genetics/chromosome.g if] 2.4.1. Κεντρομέρος Το κεντρομέρος είναι μία χρωμοσωματική περιοχή, η οποία διασφαλίζει τη μεταφορά ενός αντίγραφου από κάθε χρωμόσωμα, σε κάθε θυγατρικό κύτταρο κατά την κυτταρική διαίρεση. Η χρωμοσωματική κίνηση στη μιτωτική άτρακτο κατά τη Μίτωση και τη μείωση ρυθμίζεται από το κεντρομέρος, ενώ τα όρια του εκτείνονται μεταξύ της περιοχής σχηματισμού του κινητοχώρου (Cleveland et al., 2003). κεντρομέρος Σχήμα 2.4.2.: Σχηματική απεικόνιση του κεντρομέρους του χρωμοσώματος. [Προσαρμογή από: http://media-2.web.britannica.com/eb-media/36/72136-035- 1248D03C.jpg] ~ 171 21 ~

Μερικές πρωτεΐνες θηλαστικών που αλληλεπιδρούν με το κεντρομέρος συνδέονται άμεσα με αυτό, όπως οι CENP-A, CENP-B και CENP-C, ενώ άλλες, όπως οι CENP-Ε, CENP-F και η έσω κεντρομερική πρωτεΐνη INCENP, γνωστές και ως χρωμοσωματικές πρωτεΐνες-επιβάτες, εντοπίζονται παροδικά στην περιοχή του κεντρομέρους κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων σταδίων του κυτταρικού κύκλου. Κατά την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου στη Μετάφαση, η INCENP συγκεντρώνεται στα κεντρομέρη. Με τη μετάβαση στην Ανάφαση η πρωτεΐνη INCENP παραμένει εντός του ισημερινού πεδίου, ενώ τα αδελφά χρωματίδια μεταναστεύουν στους πόλους της ατράκτου. Στην Τελόφαση εντοπίζεται στο ενδιάμεσο σώμα, ενώ αποικοδομείται μετά την κυτταροκίνηση. Ο χρόνος έκφρασης και η κατανομή της INCENP μοιάζει μ αυτή της Aurora1, μέλος της Aurora/Ipl1p οικογένειας κινασών σερίνηςθρεονίνης. Επιπλέον, υπερέκφραση της απενεργοποιημένης κινάσης Aurora1 διασπά το σχηματισμό της αύλακας, συνεπάγοντας την αποτυχία της διαδικασίας της κυτταροκίνησης με παρόμοιο τρόπο μ αυτόν της INCENP, όταν υπερεκφράζεται. Επομένως, η INCENP και η Aurora1 ενδέχεται να έχουν παρόμοιους ρόλους κατά τη Μίτωση (Uren et al., 2000). 2.4.2. Κινητοχώροι Οι κινητοχώροι είναι πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα, τα οποία συγκεντρώνονται γύρω από συγκεκριμένες περιοχές των χρωμοσωμάτων (κεντρομέρη) και διαδραματίζουν πολλούς και σημαντικούς ρόλους κατά τη Μίτωση (Pihan & Doxsey, 1999). Κατά μήκος των κινητοχώρων προσδένονται πρωτεΐνες-κινητήρες, οι οποίες απαιτούνται για την κίνηση των χρωμοσωμάτων από και προς τους πόλους της ατράκτου. Επίσης, προσδένονται πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται στο σημείο ελέγχου της Μίτωσης, το οποίο διασφαλίζει ότι η Ανάφαση λαμβάνει χώρα μόνο εάν όλα τα χρωμοσώματα έχουν δημιουργήσει διπολικές συνδέσεις στην άτρακτο. Από τα παραπάνω, γίνεται σαφές ότι δυσλειτουργία του κινητοχώρου μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένο αποχωρισμό των χρωμοσωμάτων (Pihan & Doxsey, 1999). ~ 172 22 ~

Ο κινητοχώρος σε όλους τους οργανισμούς ρυθμίζει το σημείο ελέγχου της Μίτωσης, το οποίο εποπτεύει την πρόσδεση των χρωμοσωμάτων στην άτρακτο και σταματά τη Μίτωση μέχρι όλα τα χρωμοσώματα να είναι κατάλληλα συνδεδεμένα στην άτρακτο, με τα αδελφά χρωματίδια να προσανατολίζονται στους αντίθετους πόλους της ατράκτου (Walczak & Heald, 2008). Η ικανότητα των χρωμοσωμάτων να επιτύχουν διπολικές συνδέσεις με την άτρακτο είναι στοιχείο-κλειδί για τον ακριβή αποχωρισμό τους. Στην αρχή της Μίτωσης, οι γρήγορα αυξανόμενοι και συρρικνούμενοι μικροσωληνίσκοι εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα για την εύρεση κινητοχώρων. Όταν οι κινητοχώροι των αδελφών χρωματιδίων συνδεθούν στους μικροσωληνίσκους που προέρχονται από αντίθετους πόλους, το χρωμόσωμα υφίσταται μία σειρά από ταλαντευτικές κινήσεις που το οδηγούν κατ ευθείαν στο ισημερινό επίπεδο. Αυτές οι ταλαντευτικές κινήσεις υποκινούνται από τη συγχρονισμένη αύξηση και συρρίκνωση των μικροσωληνίσκων. Η χρωμοσωματική κίνηση βασίζεται στη μοναδική ικανότητα του κινητοχώρου να αλληλεπιδρά με τα δυναμικά άκρα των μικροσωληνίσκων. Επομένως, ο κινητοχώρος είναι μία αρκετά περίπλοκη μηχανή, η οποία δεν επηρεάζει μόνο τη δυναμική των προσδενόμενων μικροσωληνίσκων, αλλά προσφέρει ρυθμιστικούς μηχανισμούς, οι οποίοι ανιχνεύουν και επιδιορθώνουν ανώμαλες ή μη-παραγωγικές αλληλεπιδράσεις (Chan et al., 2005). Η συνάφεια των διπλασιασμένων αδελφών χρωματιδίων ρυθμίζεται μέσω αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης, λαμβάνει χώρα κατά το διπλασιασμό των χρωμοσωμάτων και δεν χάνεται μέχρι τη μετάβαση από τη Μετάφαση στην Ανάφαση. Μεταλλάξεις σε πολλά γονίδια της ζύμης, προκαλούν πρώιμη αποικοδόμηση της συνάφειας αυτής, οδηγώντας σε λανθασμένο χρωμοσωματικό αποχωρισμό και κατ επέκταση σε ανευπλοειδία και ογκογένεση (Pihan & Doxsey, 1999). ~ 173 23 ~

2.4.2.1. Η γενική οργάνωση του κινητοχώρου Ο κινητοχώρος των σπονδυλωτών εμφανίζεται ως ένα σύνολο δίσκων που συνιστούν τρεις στοιβάδες και εμφανίζεται σε θέσεις της κεντρομερικής ετεροχρωματίνης των χρωμοσωμάτων. Στην απουσία συνδέσεων των μικροσωληνίσκων ένα σύνολο από ίνες, που καλείται ινώδης στεφάνη (fibrous corona), μπορεί να επεκταθεί εξωτερικά του δίσκου. Η ινώδης στεφάνη και ο εξώτερος δίσκος περιέχουν την πλειοψηφία των γνωστών, αλληλεπιδρουσών με τους μικροσωληνίσκους πρωτεϊνών (CENP-E, dynein κ.ά.), όπως και πρωτεΐνες του σημείου ελέγχου της Μίτωσης (Bud1, BubR1, Bub3, Mad1, Mad2 κ.ά.), οι οποίες επιβλέπουν την ακεραιότητα των συνδέσεων των κινητοχώρων. Ο εσώτερος δίσκος είναι άμεσα παρακείμενος στο κεντρομέρος και αποτελείται επίσης από κεντρομερική χρωματίνη και την πρωτεΐνη CENP-A (Chan et al., 2005). Μοριακά στοιχεία που προέρχονται από μελέτες σε HeLa κύτταρα, υποστηρίζουν ότι κατά το σχηματισμό του κινητοχώρου εμφανίζονται συγκεκριμένες πρωτεΐνες σε κάθε στάδιο. Μερικές πρωτεΐνες, όπως η CENP-F, μία πρωτεΐνη του εξώτερου κινητοχώρου, τοποθετείται στους κινητοχώρους στο τέλος της G2 φάσης και της Πρόφασης, ενώ άλλες, όπως η CENP-E και η δυνεΐνη (πρωτεΐνες-κινητήρες), εμφανίζονται μόνο μετά τη θραύση της πυρηνικής μεμβράνης. Ωστόσο, μία λεπτομερέστερη μελέτη πρότεινε το ακόλουθο πρότυπο τοποθέτησης πρωτεϊνών: hbub1--> CENP-F--> hbubr1--> CENP-E. Οι πρωτεΐνες Bub1 και BubR1 είναι πρωτεϊνικές κινάσες του σημείου ελέγχου της Μίτωσης, οι οποίες τοποθετούνται στον κινητοχώρο στο τέλος της G2 φάσης του κυτταρικού κύκλου. Η σειρά αυτή εμφάνισης με την οποία οι πρωτεΐνες εμφανίζονται στους κινητοχώρους αντανακλά, εν μέρει, την ιεραρχική σχέση μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών. Για παράδειγμα, η Bub1 σε ανθρώπινα κύτταρα φαίνεται να απαιτείται για την τοποθέτηση των BubR1, CENP-F, CENP-E και Mad2. Παρ όλα αυτά, αυτές οι πρωτεΐνες δεν επιδεικνύουν γραμμική σχέση, αφού η τοποθέτηση της Mad2 και της CENP-E δεν εξαρτάται απ αυτήν της CENP-E και της CENP-F, αντίστοιχα (Chan et al., 2005). ~ 174 24 ~

Οι κινητοχώροι των μεταζώων περιέχουν τις πρωτεΐνες-κινητήρες CENP-E, δυνεΐνη/δυνακτίνη και την κινεσίνη MCAK. Επιπρόσθετα, ο κινητοχώρος περιέχει πρωτεΐνες που προσδένονται στους μικροσωληνίσκους και περιλαμβάνει τις CLIP170, CLASP/Orbit, EB1, Sgo1 και APC (Αdenomatous Polyposis Coli). Αυτές μπορούν να διαχωριστούν περαιτέρω, σ αυτές στις οποίες η εμφάνισή τους στους κινητοχώρους εξαρτάται απ τους μικροσωληνίσκους (APC και EB1) και σ αυτές που είναι ανεξάρτητες (CLIP170, CLASP, hsgo1) (Chan et al., 2005). Σχήμα 2.4.3.: Σχηματική απεικόνιση της περιοχής του κινητοχώρου του ανθρώπου. μικροσωλη νίσκοι [Προσαρμογή από: http://www.flileibniz.de/images/groups/diekmann/human_kinetochore1.jpg] Πρωτεΐνες σημείου ελέγχου Μίτωσης 2.4.2.2. Ο ρόλος των πρωτεϊνών του σημείου ελέγχου της Μίτωσης στους κινητοχώρους Οι μηχανικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ κινητοχώρου και ατράκτου εποπτεύονται από τις πρωτεΐνες Mad1, Mad2, Mad3, Bub1, Bub3 και Mps1, μία εξελικτικά διατηρημένη ομάδα πρωτεϊνών οι οποίες αρχικά ~ 175 ~ 25